KONTROLA MIKROBIOLOGICZNA

ULTRASZYBKIE ROZWIĄZANIA

BEZPIECZEŃSTWO ŻYWNOŚCI

DOŚWIADZCZENIE W MIKROBIOLOGII

Diagnostykaźródłem dobrego zdrowia

AktualnościbioMérieuxIN

DU

STRY 17

listopad2015

2

Spis treści

2 od wydawcy

3 10 lat Tempo – zautomatyzowanej metody liczenia wskaźników czystości mikrobiologicznej

produktów żywnościowych

5 Normy metodyczne w badaniach mikrobiologicznychpróbek z łańcucha żywnościowego

11 Aktualne zagrożenia mikrobiologiczne w żywności – enterotoksyny gronkowcowe

14 Elementy kontroli czystości mikrobiologicznej środowiska produkcji

18 Monitorowanie temperatury i innych parametrów fizycznych w laboratorium

od wydawcy

wydawca: bioMérieux Polska Sp. z o.o.

Osoba odpowiedzialna: Dorota Pawluch

Osoby biorące udział w przygotowaniu nr 17:Dorota Pawluch Artur GąsiorCzesław MitekJacek Charliński

Adres redakcji i wydawcy:bioMérieux Polska01-518 Warszawa, ul. Gen. Józefa Zajączka 9tel. (22) 569 85 00 • fax (22) 569 85 54www.biomerieux.pl

opracowanie graficzne i druk:Agencja Wydawnicza SOWAwww.agencja-sowa.com.pl

Szanowni Państwo,

Mam nadzieję, że artykuły, które zamieściliśmy w numerze17 „Aktualności Industry” spełnią Państwa oczekiwania.

Bardzo prosimy o opinie, które będą dla nas wskaźnikiemco powinniśmy zmienić w przyszłości i jakie tematy są dlaPaństwa ważne.

W tym roku mija 10 lat od wprowadzenia na rynek systemuTempo. Firma bioMérieux opracowała zautomatyzowanąmetodę liczenia wskaźni-ków jakości czyli ogólnejliczby drobnoustrojów, bak-terii z grupy coli, Enterobac-teriaceae, Escherichia coli,Bacillus cereus, gronkow-ców koagulazo-dodatnich,drożdży i pleśni. Wskaźnikijakości odgrywają istotnąrolę przy stosowaniu sys-temu HACCP oraz zapew-nieniu handlowej jakościproduktów żywności odchwili zejścia ich z linii pro-dukcyjnej zakładu, aż doupływu terminu ich przydat-ności do spożycia.W 2015 roku sukcesem jest oficjalne wyróżnienie uzyskanedla systemu TEMPO, zintegrowane z MLG (oficjalna instruk-cja USDA) i potwierdzone przez NCIMS (oficjalny organ kon-troli produktów mlecznych w USA).System Tempo zyskał uznanie również na naszym rynku.Obecnie 30 aparatów Tempo pracuje w laboratoriach bada-jących żywność.

W numerze 17 znajdą Państwo również artykuły poświę-cone normom metodycznym w badaniach mikrobiologicz-nych próbek z łańcucha żywnościowego, kontroli środowiskaprodukcyjnego oraz więcej informacji na temat enteroto-ksyny gronkowcowej jako zagrożenia mikrobiologicznegożywności.

Przedstawiamy Państwu nową generację systemu do monito-rowania parametrów fizycznych w laboratorium – Labguard 3D.

Dorota Pawluch

Dyrektor ds. SprzedażyMikrobiologia Przemysłowa

3

W końcu ubiegłego wieku na rynku dostępnychbyło wiele metod do wykrywania patogenów(Listeria, Salmonella, ...). Z drugiej strony, do licze-nia wskaźników jakości (QI) istniały tylko żmudnemetody manualne, które były powtarzalne i bardzoczasochłonne.

Firma bioMérieux postanowiła opracować zautomatyzo-waną metodę liczenia tych wskaźników (ogólnej liczbydrobnoustrojów, bakterii z grupy coli, drożdży i pleśni, ...).Temu trudnemu przedsięwzięciu poświęcił się zespół R&DbioMérieux Industry. Po krótkim okresie prób i błędów, nowy zespół zdecydo-wał się wykorzystać mocne strony kart VITEK® z jedno-czesnym dostosowaniem do ograniczeń w matrycachspożywczych.Po realizacji projektu karty, zostały opracowane podłoża,a także aparaty: czytnik i napełniarka kart. Eksperci i kliencina całym świecie zostali poproszeni o pracę nad ergono-mią TEMPO.

W 2005 roku został uruchomiony System TEMPO z 3 pa-rametrami: - TVC (ogólna liczba bakterii), - TC (bakterii grupy coli), - EC (Escherichia coli) oraz zestaw TEMPO do kontroli jakości (karty QC ).

Kolejne, wprowadzone na rynek testy to :- W 2006 roku, TEMPO EB (Enterobacteriaceae),- W 2007 roku, TEMPO CC (Bakterie z grupy coli);

TEMPO LAB (bakterie kwasu mlekowego) i TEMPO STA (Staphylococcus aureus),

- W 2008 roku, TEMPO YM (drożdże i pleśnie). W tym też roku, TEMPO zostało przyjęte jako oficjalnametoda badań żywności podczas Igrzysk Olimpijskichw Pekinie.

W 2009 roku zainstalowanych było 300 aparatów TEMPO.Od tego czasu, TEMPO umocniło swoją pozycję na świecie,włączając sukces na kongresie w Urugwaju na COLMIC

now

e te

chno

logi

e

10 lat Tempo – zautomatyzowanej metody liczenia wskaźników czystościmikrobiologicznej produktów żywnościowych

4

(Congresso Latino Americano de Mikrobiologia e Higienede Alimentos) w 2009 roku, gdzie użytkownicy przed-stawili uczestnikom kongresu główne zalety metody, lubw Szanghaju, w 2010 roku, podczas wystawy światowej.

Ze względu na wzrost wielkości produkcji, zdecydowano,że produkcja zliofilizowanych podłoży zostanie przenie-siona z Craponne do La Balme; po przeprowadzeniu licz-nych walidacji, projekt ten został skutecznie zrealizowanyw 2011 roku.

Zespół TEMPO w 2013 roku przygotował druga generacjętestu do liczenia ogólnej liczby drobnoustrojów TEMPO AC,

który zastąpił test TEMPO TVC .Ta zmiana zwiększyła nasząsprzedaż, o 5 milionów kart rocznie.

W 2014 roku do już szerokiej oferty dodano nowy testTEMPO BC (Bacillus cereus).

Zachęcony sukcesem, zespół TEMPO pracuje nad pro-jektem kolejnego testy zwanego TEMPO EVO. Dziękinowej wersji, będziemy mieli możliwość przedstawieniakart „combo”, która da 2 wyniki liczenia dwóch różnychgatunków bakterii, przy użyciu tylko jednego odczynnika,przynosząc istotne korzyści wydajności dla naszychklientów. Co więcej, możemy przetestować większe ilo-ści próbek, zmniejszając jednocześnie minimalny prógdla liczenia (co umożliwia liczenie bardzo małych ilościbakterii). Projekt został zaakceptowany przez NicolasCartier i jest obecnie realizowany. Pod koniec 2014roku przekroczono liczbę 1000 klientów, użytkownikówTEMPO!

W 2015 roku sukcesem jest oficjalne wyróżnienie uzys-kane dla systemu TEMPO, zintegrowane z MLG (oficjalnainstrukcja USDA) i potwierdzone przez NCIMS (oficjalnyorgan kontroli produktów mlecznych w USA).

W tym roku obchodzimy 10-lecie TEMPO bioMérieux. Uroczystości zaplanowano najpierw we Florencji, gdzieprodukowane są aparaty, następnie w Marcy, dla kluczo-wych klientów oraz w Portland na kongresie IAFP. I na koniec,będziemy świętować w La Balme, w miejscu, w którymsą produkowane odczynniki.

Dziś TEMPO® reprezentuje ponad 1000 klientów, któ-rzy zużywają 7 mln kart dla 9 zatwierdzonych przez ISOi AOAC parametrów.

lat

5

Obecnie obowiązujące prawo żywnościowe Unii Europej-skiej (UE) dotyczy wszystkich ogniw łańcucha żywnościo-wego i ma na celu utrzymanie na jak najniższym poziomiewystępowania czynników zagrożeń, będących przedmio-tem kontroli laboratoryjnej prowadzonej w ramach nad-zoru producenckiego i urzędowego. Dotyczy to równieżczynników zagrożeń typu mikrobiologicznego występują-cych w łańcuchu żywnościowym. W ramach przyjętychkryteriów z zakresu bezpieczeństwa dla produktu finalnegostwierdza się, że nie tylko środki spożywcze, ale i paszenie powinny zawierać mikroorganizmów, ich toksyn animetabolitów w ilościach stanowiących zagrożenie dlazdrowia ludzi i zwierząt. Warunek ten znajduje obecnieswoje umocowanie prawne dla żywności, w uchwalonym,a następnie nowelizowanym Rozporządzeniu Komisji(WE) nr 2073/2005 z dnia 15 listopada 2005 r. w spra-wie kryteriów mikrobiologicznych dotyczących środkówspożywczych. Wśród zawartych w tym rozporządzeniu pa-rametrów jakości mikrobiologicznej wyróżnić można pa-rametry stanowiące o bezpieczeństwie żywności orazkryteria o charakterze jakościowym i parametrycznym ma-jące charakter wskaźników higieny. W grupie kryteriów mikrobiologicznych służących jako pa-rametr bezpieczeństwa żywności wymienić należy: kryte-rium obecności drobnoustrojów patogennych dlaczłowieka tj.: Listeria monocytogenes, Salmonella spp.,Enterobacter sakazaki i E. coli jako wskaźnik zanieczysz-czenia kałowego. W grupie tej znalazły się również toksynytj. enterotoksyna gronkowcowa i histamina. W zakresiekryteriów mikrobiologicznych o charakterze parametrycz-nym, określającej poziom higieny wyróżnić należy ogólnąliczbę bakterii tlenowych, liczbę bakterii z rodziny Entero-bacteriaceae, pałeczkę Salmonella, E. coli i koagulazo-do-datnie szczepy Stahylococcus aureus. W odniesieniu dopasz istnieje zapis w Rozporządzeniu Parlamentu Euro-pejskiego i Rady nr 183/2005 stwierdzający, że podmiotydziałające na rynku pasz powinny przestrzegać zgodnościze szczególnymi kryteriami mikrobiologicznymi. W badaniach mikrobiologicznych żywności i pasz oraz in-nych matryc łańcucha żywnościowego coraz większą rolęodgrywają metodyczne normy międzynarodowe (ISO)i europejskie (EN), które w zdecydowanej większości są

przyjmowane w naszym kraju jako normy polskie (PN)zharmonizowane z tymi normami. W związku z powy-ższym celowym wydaje się omówienie zakresu stosowa-nia aktualnych wydań polskich norm (PN), które sązalecane do stosowania w badaniach mikrobiologicznych.Należy też dodać, że w ostatnim okresie przyjęty zostałnowy ogólny tytuł norm ISO opracowywanych w ramachPodkomitetu SC9 w brzmieniu: „Mikrobiologia łańcuchażywnościowego” (Microbiology of the food chain) w za-mian za „Mikrobiologia żywności i pasz” (Microbiology offood and animal feedingstuffs). Podobnie dotyczy to ty-tułu norm EN opracowanych w ramach CEN/TC 275„Analiza żywności. Metody horyzontalne”. Oznacza to roz-szerzenie zakresu badań i stosowania tych dokumentówo brakujące dotąd matryce oraz ogniwa łańcucha żywno-ściowego. W związku z tym celem opracowania jest takżezwrócenie uwagi na poszerzanie się zakresu badanychmatryc przy stosowaniu norm metodycznych używanychdotychczas głównie w analizie mikrobiologicznej żywnościi pasz.

Normy określające ogólne zasady badania mikrobiologicznego

Konieczność ujednolicenia warunków laboratoryjnychmających istotny wpływ na powtarzalność wynikówbadań i możliwie jak najwyższą ich jakość znalazła od-zwierciedlenie w znowelizowanej ostatnio międzynarodo-wej normie EN-ISO 7218:2007/A1:2013 „Microbiologyof food and feedingstuffs. General requirements and gui-dance for microbiological examinations”. Na poziomie kra-jowym norma ta została zharmonizowana i oznaczonajako PN-EN ISO 7218:2008/A1:2013-10 „Mikrobiologiażywności i pasz. Ogólne wymagania i zasady badań mi-krobiologicznych”. W nowej normie bardziej szczegółowookreślono sposób wykonywania badań mikrobiologicz-nych żywności i pasz, zgodnie z wymaganiami i potrze-bami systemu zapewnienia wiarygodności wyników

Normy metodyczne w badaniach mikrobiologicznych próbek z łańcucha żywnościowegoKrzysztof KwiatekZakład Higieny Pasz, Państwowy Instytut Weterynaryjny – Państwowy Instytut Badawczy, Puławy

kont

rola

żyw

nośc

i

badań. W roku 2014 rozpoczęto w ramach prac PKN tłu-maczenie tej normy na język polski.W obrębie grupy polskich norm (PN) zharmonizowanychz normami ISO/EN, określających ogólne zasady i metodybadań mikrobiologicznych należy wymienić, w pierwszejkolejności, te dotyczące przygotowania próbek żywnoścido badania w laboratorium. Pierwszą z tej grupy jestnorma PN-EN ISO 6887-1:2000 „Mikrobiologia żywnościi pasz. Przygotowanie próbek, zawiesiny wyjściowej i roz-cieńczeń dziesięciokrotnych do badań mikrobiologicz-nych. Ogólne zasady przygotowania zawiesiny wyjścioweji rozcieńczeń dziesięciokrotnych”. Określony zakres tejnormy wskazuje na ogólne zastosowanie na etapie przy-gotowania próbek do analiz mikrobiologicznych. Drugaczęść omawianego dokumentu to norma PN-EN ISO6887-2:2005 „Mikrobiologia żywności i pasz. Przygoto-wanie próbek, zawiesiny wyjściowej i rozcieńczeń dziesię-ciokrotnych do badań mikrobiologicznych. Część 2.Specyficzne zasady przygotowywania mięsa i przetworówmięsnych”. Norma powyższa ma zastosowanie do bada-nia świeżego, surowego i przetworzonego mięsa, drobiuoraz przetworów drobiowych. Kolejny arkusz normatywnyz tego zakresu to norma PN-EN ISO 6887-3:2005 „Mikro-biologia żywności i pasz. Przygotowanie próbek, zawiesinywyjściowej i rozcieńczeń dziesięciokrotnych do badań mi-krobiologicznych. Część 3: Specyficzne zasady przygoto-wywania ryb i przetworów rybnych”. Opisane tu zostałytylko te metody przygotowania próbek, które można wy-korzystać głównie przy badaniu wielokierunkowym.Norma ma zastosowanie do badania surowych, przetwo-rzonych, gotowanych lub mrożonych ryb, skorupiaków imięczaków oraz produktów pochodnych. Czwarty arkuszto norma PN-EN ISO 6887-4/A1:2011 „Mikrobiologiażywności i pasz. Przygotowanie próbek, zawiesiny wyjścio-wej i rozcieńczeń dziesięciokrotnych do badań mikrobio-logicznych. Część 4: Specyficzne zasady przygotowaniaproduktów innych niż mleko i przetwory mleczne, mięsoi przetwory mięsne oraz ryby i przetwory rybne”. Powyższydokument ma zastosowanie w badaniach takich produk-tów jak: margaryna, mąka, produkty zbożowe, pasze, ma-kuchy, żelatyna, produkty mleczne, jaja, produkty jajeczne,produkty fermentowane i produkty piekarnicze. Piąty ar-kusz to norma PN-EN ISO 6887-5:2010 „Mikrobiologiażywności i pasz. Przygotowanie próbek, zawiesiny wyjścio-wej i rozcieńczeń dziesięciokrotnych do badań mikrobio-logicznych. Część 5: Specyficzne zasady przygotowaniamleka i przetworów mlecznych”. Niniejsza norma ma sze-rokie zastosowanie w badaniach mikrobiologicznychmleka i jego przetworów. Szósty arkusz to norma PN-ENISO 6887-6:2013-06 „Mikrobiologia łańcucha żywnościo-wego. Przygotowanie próbek, zawiesiny wyjściowej i roz-

cieńczeń dziesięciokrotnychdo badań mikrobiologicznych.Część 6: Specyficzne zasadyprzygotowywania próbek po-branych na etapie produkcjipierwotnej”. Próbki do badańmikrobiologicznych pobraneze środków transportowychi/lub liczenie drobnoustrojów

pochodzących od żywych zwierząt lub z ich środowiskasą w zakresie niniejszej normy, wyłączone są natomiastpróbki pobierane do oceny jakości higienicznej mięsa. Ni-niejsza część ISO 6887, jako przykład poszerzania się za-kresu badanych matryc, ma zastosowanie wprzedmiotowej analizie laboratoryjnej próbek pobranych znarzędzi, gospodarstwa rolnego, ze środków transportuzwierząt lub z tusz zwierzęcych w ubojniach, jako wskaźnikstanu mikrobiologicznego.

Mikrobiologiczne normy metodyczne o charakterzehoryzontalnym

Prowadzone od szeregu lat prace normalizacyjne na po-ziomie zarówno europejskim jak i międzynarodowymmają również na celu ujednolicanie norm metodycznychdotyczących wykrywania drobnoustrojów patogennych,które w swoim zakresie rozciągają się na cały łańcuch żyw-nościowy. Czołowym zagadnieniem w tym obszarze jestmetodyka wykrywania pałeczki Salmonella. Obecnie dowykrywania tego patogenu stosuje się powszechnie me-todę opisaną w normie PN-EN ISO 6579:2003 „Mikro-biologia żywności i pasz. Horyzontalna metoda wykrywaniaSalmonella spp.”. Norma ta podaje metodę wykrywaniapałeczek Salmonella, łącznie z Salmonella Typhi i Salmo-nella Paratyphi. Omawiana norma ma zastosowanie doproduktów przeznaczonych do spożycia przez ludzi i paszdla zwierząt oraz próbek środowiskowych z obszarów pro-dukcji żywności i obrotu żywnością. Metoda ta jednak niezapewnia wykrycia wszystkich szczepów Salmonella Typhii Paratyphi. Z uwagi na zagrożenie osób wykonujących ba-dania ważnym jest, aby wykrywanie Salmonella było pro-wadzone jedynie przez właściwie wyposażone laboratoria,pod kierunkiem wykwalifikowanych mikrobiologów i przyzachowaniu odpowiedniej ostrożności w czasie prowa-dzenia badań. W 2007 roku opublikowano załącznik norma-tywny „D” do normy ISO 6579:2002/Amd. 1:2007, któryzostał oznaczony jako PN EN-ISO 6579:2003/A1:2007„Wykrywanie Salmonella spp. w kale zwierząt i próbkachśrodowiskowych z etapu produkcji pierwotnej”. Proceduratu opisana ma zastosowanie do wykrywania Salmonellaspp. w kale zwierząt (drobiu) i próbkach pobranych napoziomie produkcji pierwotnej. Warto dodać, że od kilkujuż lat trwa proces nowelizacji tej normy z podziałem na3 arkusze metodyczne poświęcone wykrywaniu, oznacza-niu liczby i serotypizacji Salmonella.Kolejnym ważnym, problemem badawczym w badaniumatrycy żywnościowej, paszowej oraz próbek środowisko-wych jest wykrywanie i oznaczanie liczby Listeria mono-cytogenes. Aktualnie w laboratoriach do wykrywaniaListeria monocytogenes stosuje się normę PN-EN ISO11290-1:1999/A1:2005„Mikrobiologia żywności i pasz.Horyzontalna metoda wykry-wania obecności i oznaczanialiczby Listeria monocytogenes.Metoda wykrywania obecno-ści”. Nowelizacja metody z2005 roku wprowadziła mo-dyfikację pożywki do izolacji

6

7

tego patogenu i testu na hemolizę, łącznie z precyzją wy-ników. Do oznaczania liczby bakterii z tego gatunku sto-suje się obecnie drugą część normy PN-EN11290-2:2000/A1:2005 „Mikrobiologia żywności i pasz.Horyzontalna metoda wykrywania obecności i oznaczanialiczby Listeria monocytogenes. Metoda oznaczania liczby”.Uwzględniając ograniczenia omówione we wprowadze-niu, norma ma zastosowanie do badania wszystkich ro-dzajów żywności i pasz oraz próbek środowiskowych, apróg wykrywalności metody wynosi 10 lub 100 jtk, od-powiednio: w 1 ml lub 1 g próbki. Ważnym problemem w badaniu żywności jest równieżwykrywanie i oznaczanie liczby gronkowca złocistego -Staphylococcus aureus. Obecnie w badaniach mikrobio-logicznych żywności i pasz stosowana jest norma PN-ENISO 6888-1:2001/A1:2004 „Mikrobiologia żywności i pasz.Horyzontalna metoda oznaczania liczby gronkowców koa-gulazo-dodatnich (Staphylococcus aureus i innych gatun-ków). Część 1. Metoda z zastosowaniem pożywkiagarowej Baird-Parkera”. Do oznaczania liczby Staphylo-coccus aureus można również stosować normę PN-ENISO 6888-2:2001/A1:2004 „Mikrobiologia żywności i pasz.Horyzontalna metoda oznaczania liczby gronkowców koa-gulazo-dodatnich (Staphylococcus aureus i innych gatun-ków). Część 2. Metoda z zastosowaniem pożywkiagarowej z plazmą króliczą i fibrynogenem”. Dla próbek,w których spodziewany jest niski poziom kontaminacjiprzez gronkowce chorobotwórcze, zalecana jest normaPN-EN ISO 6888-3:2004/AC:2005 „Mikrobiologia żyw-ności i pasz. Horyzontalna metoda oznaczania liczby gron-kowców koagulazo-dodatnich. Część 3. Wykrywanieobecności i oznaczanie małych liczb metodą NPL”. Metodata ma zastosowanie w badaniach próbek produktów żyw-nościowych, próbek pobranych ze środowiska zakładówprodukujących żywność i zajmujących się obrotem żyw-nością. Do oznaczania liczby Bacillus cereus w żywności i paszachdedykowana jest norma PN-EN ISO 7932:2005 „Mikro-biologia żywności i pasz. Horyzontalna metoda oznaczanialiczby przypuszczalnych Bacillus cereus. Metoda liczeniakolonii w temperaturze 30°C”, w której stosowane jestpodłoże MYP.Badania ukierunkowane na wykrywanie i oznaczanieliczby bakterii z rodziny Enterobacteriaceae są stosowanedo oceny stanu sanitarno-higienicznego oraz stopnia za-nieczyszczenia kałowego badanej matrycy. Do badań wtym zakresie ma obecnie zastosowanie norma PN-ISO21528-1:2005 „Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzon-talna metoda wykrywania i oznaczania liczby Enterobac-teriaceae. Część 1. Wykrywanie i oznaczanie liczby metodąNPL z przednamnażaniem”. Zawarta w normie procedura

postępowania badawczegoma zastosowanie do produk-tów spożywczych i pasz orazpróbek środowiskowych po-branych z obszaru produkcjii obrotu żywnością. Oznacza-nie stopnia zanieczyszczeniawykonywane jest metodąNPL po inkubacji płynnej po-

żywki w temperaturze 30°C lub 37°C. Metoda powinnabyć stosowana w przypadku, gdy poszukiwane drobnou-stroje wymagają ożywienia poprzez przednamnażanieoraz gdy szacowana liczba drobnoustrojów mieści się wzakresie od 1 do 100 jtk/gram (ml) badanej próbki. Ogra-niczenie zastosowania niniejszej części normy wynika zfaktu dużego zakresu rozrzutu wyników otrzymywanychopisaną metodą. Drugi arkusz tego dokumentu to normaPN-ISO 21528-2:2005 „Mikrobiologia żywności i pasz.Horyzontalna metoda wykrywania i oznaczania liczby En-terobacteriaceae. Część 2. Metoda płytkowa”. W niniej-szym arkuszu normy opisano metodę oznaczania liczbyEnterobacteriaceae bez etapu przednamnażania. Ma onazastosowanie w badaniu produktów spożywczych i paszoraz próbek środowiskowych z obszaru produkcji i obrotużywnością. Warto dodać, że trwają prace nad nowelizacjąnorm dotyczących Enterobacteriaceae, które wprowadząm.in. podłoże Glucose OF Medium służące do badań po-twierdzających.W dniu 9 września 2004 r. Komisja Naukowa do sprawZagrożeń Biologicznych (Komisja BIOHAZ) EuropejskiegoUrzędu ds. Bezpieczeństwa Żywności (EFSA) wydała opi-nię na temat czynników zagrożeń typu mikrobiologicznegowystępujących w odżywkach dla niemowląt i preparatachpochodnych. W opinii stwierdzono, że mikroorganizmamiwymagającymi największej uwagi w przypadku odżywekdla niemowląt, preparatów specjalnego przeznaczeniamedycznego oraz preparatów pochodnych są Salmonellaspp. i Enterobacter sakazakii (Cronobacter sakazaki).Obecność tych czynników chorobotwórczych stanowiznaczne ryzyko, jeśli warunki po przygotowaniu odżywkido spożycia umożliwiają ich namnażanie. Jako wskaźnikdo oceny poziomu ryzyka mogą być wykorzystywaneczęściej występujące w tych produktach drobnoustrojez rodziny Enterobacteriaceae. Ponadto, EFSA zaleciła mo-nitorowanie i badanie obecności Enterobacteriaceae za-równo w środowisku produkcyjnym jak i w gotowymprodukcie. Ponieważ w rodzinie Enterobacteriaceae,oprócz gatunków chorobotwórczych, występują gatunkisaprofityczne często obecne w środowisku produkcji żyw-ności i nie stanowiące zagrożenia dla zdrowia, rodzinaEnterobacteriaceae może być wykorzystywana do ruty-nowych badań, a w razie wykrycia ich obecności możnarozpocząć badania w kierunku wykrywania obecności wy-branych patogenów, w tym Cronobacter sakazakii. W chwiliobecnej do wykrywania obecności tego zarazka propo-nuje się normę PKN/ISO/TS 22964:2008 „Mleko i prze-twory mleczne. Wykrywanie Enterobacter sakazaki”. W zakresie wykrywania i oznaczania liczby E. coli jakodrobnoustroju wskaźnikowego poziomu higieny w pro-dukcji żywności może być stosowana norma PN-ISO7251:2006 „Mikrobiologia żywno-ści i pasz. Horyzontalna metodawykrywania obecności i oznaczanialiczby przypuszczalnych Escheri-chia coli. Metoda najbardziej praw-dopodobnej liczby”. W niniejszejnormie oznaczanie liczby wykony-wane jest z zastosowaniem inkuba-cji płynnej pożywki w temperaturze

8

35°C lub 37°C. Kolejną normą metodyczną w tym zakre-sie jest PN-ISO 16649-1:2004 „Mikrobiologia żywności ipasz. Horyzontalna metoda oznaczania liczby beta-gluko-ronidazo-dodatnich Escherichia coli. Część 1. Metoda płyt-kowa w temperaturze 44°C z zastosowaniem membrani 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-ß-D-glukoronidu”. W opisa-nej metodyce stosuje się pożywkę stałą zawierającą skład-nik chromogenny w celu wykrycia beta-glukoronidazy orazspecjalne membrany. Drugi arkusz tej normy to PN-ISO16649-2:2004 „Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzon-talna metoda oznaczania liczby beta-glukuronidazo-dodat-nich Escherichia coli. Część 2. Metoda płytkowa wtemperaturze 44°C z zastosowaniem 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-ß-D-glukuronidu”. Do wykrywania patogennychszczepów E. coli ma również zastosowanie norma PN-ENISO 16654:2002 „Mikrobiologia żywności i pasz. Hory-zontalna metoda wykrywania Escherichia coli 0157”. Opi-sana w normie metoda badania ma zastosowanie przedewszystkim w badaniu żywności.Kolejną grupą drobnoustrojów ważną z punktu widzeniaoceny stanu higienicznego w produkcji żywności i pasz sąpałeczki z grupy coli. Warto dodać, że ten rodzaj badańbył w przeszłości dosyć powszechnie prowadzony w pro-dukcji i obrocie żywnością. Aktualnie do wykrywania i ozna-czania liczby bakterii z grupy coli mogą być wykorzystywanedwie normy polskie zharmonizowane z normami ISO.Pierwsza z nich to PN-ISO 4831:2007 „Mikrobiologiażywności i pasz. Ogólne zasady oznaczania liczby bakteriiz grupy coli. Metoda najbardziej prawdopodobnej liczby”.W niniejszej normie określono horyzontalną metodęoznaczania liczby bakterii z grupy coli techniką najbardziejprawdopodobnej liczby po inkubacji płynnej pożywki wtemperaturze 37°C. Niniejsza norma ma zastosowanie dobadania produktów przeznaczonych do spożycia przezludzi lub zwierzęta. Druga z nich to norma PN-ISO4832:2007 „Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzontalnametoda oznaczania liczby bakterii z grupy coli. Metodapłytkowa”. Norma opisuje metodę oznaczania liczby bak-terii z grupy coli poprzez liczenie kolonii wyrosłych na sta-łych pożywkach po inkubacji w warunkach tlenowych.Norma może być stosowana do badania produktów prze-znaczonych do spożycia przez ludzi i zwierzęta. Stale rosnąca liczba przypadków kampylobakteriozy ludziwiąże się z licznymi badaniami nad bakteriami z rodzajuCampylobacter. Służą do tego obecnie dwie normy, a mia-nowicie: PN-EN ISO 10272-1:2007 (AP1:2008) „Mikro-biologia żywności i pasz. Horyzontalna metoda wykrywaniaobecności i oznaczania liczby Campylobacter spp. Część1: Metoda wykrywania” oraz PKN-ISO/TS 10272-2:2008„Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzontalna metoda wy-krywania obecności i oznaczania liczby Campylobacter

spp. Część 2: Metoda liczeniakolonii”. Ważną grupę drobnoustrojóww higienie żywności i paszstanowią tzw. beztlenowe la-seczki przetrwalnikujące ro-dzaju Clostridium. W obrębietego rodzaju znajduje się ga-tunek Clostridium botulinumodpowiedzialny za produkcję

toksyn botulinowych oraz Clostridium perfringens ważnyz punktu widzenia toksoinfekcji zwierząt i zatruć pokarmo-wych człowieka. Do norm metodycznych stosowanych wtym obszarze należą dwie normy, a mianowicie: PN-ISO15213:2005 „Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzon-talna metoda oznaczania liczby bakterii redukujących siar-czany (IV) rosnących w warunkach beztlenowych” iPN-EN ISO 7937:2005 „Mikrobiologia żywności i pasz.Horyzontalna metoda oznaczania liczby Clostridium per-fringens. Metoda płytkowa”. Obydwie normy mają zasto-sowanie do badania produktów spożywczych i pasz orazpróbek środowiskowych w obszarze produkcji i obrotużywnością.Do oznaczania ogólnej liczby drobnoustrojów zaleca sięobecnie nową normę dwuarkuszową. Pierwszy arkusz tonorma PN-EN ISO 4833-1:2013-12 „Mikrobiologia łań-cucha żywnościowego. Horyzontalna metoda oznaczanialiczby drobnoustrojów. Część 1. Oznaczanie liczby metodąposiewu zalewowego w temperaturze 30°C” jest stoso-wany gdy w badanej próbce spodziewana jest niska liczbadrobnoustrojów lub są obecne drobnoustroje rosnące za-lewowo, co może utrudniać liczenie wyrosłych kolonii.Drugi arkusz to norma PN-EN ISO 4833-2:2013-12„Mikrobiologia łańcucha żywnościowego. Horyzontalnametoda oznaczania liczby drobnoustrojów. Część 2. Ozna-czanie liczby metodą posiewu powierzchniowego w tem-peraturze 30°C”, która jest przeznaczona do badaniapróbek zawierających obligatoryjne tlenowce lub licznąpopulację drobnoustrojów wrażliwych na podwyższonątemperaturę pożywki agarowej. Ponadto ma zastosowaniedo badania produktów, których cząstki lub zabarwieniemogą utrudniać liczenie kolonii, a także w sytuacji gdy po-trzebne jest różnicowanie kolonii dla oceny jakości pro-duktu. Normy mają zastosowanie do wszystkich matrycłańcucha żywnościowego.Od 2009 roku obowiązuje w Polsce dwuczęściowanorma metodyczna do oznaczania grzybów w żywnościi paszach tj. PN-ISO 21527-1:2009 „Mikrobiologia żyw-ności i pasz. Horyzontalna metoda oznaczania liczby droż-dży i pleśni. Część l: Metoda liczenia kolonii w produktacho aktywności wody wyższej niż 0,95” i PN-ISO 21527-2:2009 „Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzontalna me-toda oznaczania liczby drożdży i pleśni. Część 2: Metodaliczenia kolonii w produktach o aktywności wody niższejlub równej 0,95”. Należy wskazać, że aktywność wody(aw) w produkcie spożywczym jest definiowana jako ilośćwody dostępnej dla drobnoustrojów. Wartość tę przyjętow celu dokładniejszego określenia zapotrzebowania okre-ślonych mikrorganizmów na wodę. Czysta chemiczniewoda posiada aw = 1. Wraz z wzrostem stężenia związkówrozpuszczalnych aktywność wody spada poniżej wartości 1.Większość drobnoustrojówmoże rosnąć w środowiskach,których aktywność wody wy-nosi powyżej 0,95, jednakwzrost niektórych z nichstwierdza się w środowis-kach o aktywności wody wy-noszącej nawet 0,6.Elementem różnicującym obaarkusze normy jest stosowana

9

pożywka. Wybór metodyki badawczej może tu budzićpewne wątpliwości, wynikające z nieznajomości bądź róż-nic w aw różnego rodzaju matryc badawczych trafiającychdo laboratorium. Ułatwieniem w wyborze metodyki jestZałącznik A zawarty w drugiej części normy, uzupełnionyprzez autorów artykułu o wartości aw najczęściej badanychpasz (tabela 1). Pomiary aw pasz wykonano urządzeniemAquaLab (Decagon Devices, USA). W zależności od stop-nia wysuszenia materiałów paszowych i warunków prze-chowywania aw może się wahać w dość szerokim zakresie.Przykładem mogą tu być chociażby nasiona kukurydzy,których aw mieści się w zakresie od 0,5 do 0,8. Zastosowanie drugiego arkusza normy do badania paszwyraźnie ogranicza zawarty w niej zapis brzmiący nastę-pująco: „Niniejsza część ISO 21527 nie ma zastosowa-nia do produktów w proszku o aktywności wody niższejlub równej 0,60 (zboża w proszku, produkty oleiste,przyprawy, rośliny strączkowe, nasiona, napoje w proszkuinstant, produkty w proszku dla zwierząt domowychitp.)”. W tej sytuacji metodą oznaczania liczby grzybóww paszach pozostaje metoda opisana w normie PN-R-64791:1994 „Pasze. Wymagania i badania mikrobiolo-giczne”, gdzie stosowane jest podłoże DRBC. Warto teżzaznaczyć, że wspomniana powyżej norma PN-R-64791:1994 jest nadal stosowana do badania mikro-biologicznego pasz, gdzie poza oznaczaniem liczbygrzybów, stosuje się ją jeszcze do oznaczania liczby bak-terii tlenowych mezofilnych i wykrywania beztlenowychlaseczek przetrwalnikujących.Do oznaczania liczby drobnoustrojów psychrotrofowychzaleca się obecnie normę PN-ISO 17410:2004 „Mikro-biologia żywności i pasz. Horyzontalna metoda oznacza-nia liczby drobnoustrojów psychrotrofowych”. Inkubacjaposiewów w tej metodzie prowadzona jest w tempera-turze 6,5°C.W ocenie jakości pasz coraz częściej jest oznaczana liczbabakterii probiotycznych, zarówno w gotowych mieszan-kach paszowych jak i dodatkach paszowych zootechnicz-nych, definiowanych jako stabilizatory flory jelitowej. Dotego celu laboratorium ma do dyspozycji następujące me-tody normy metodyczne w randze PN, które są zharmo-nizowane z normami europejskimi (EN): • PN-EN 15789:2009 „Pasze. Wykrywanie i oznaczanie

liczby szczepów drożdży probiotycznych”.• PN-EN 15788:2009 „Pasze. Wykrywanie i oznaczanie

liczby Enterococcus (E. faecium) spp.”• PN-EN 15784:2009E „Pasze. Wykrywanie i oznaczanie

liczby przypuszczalnych Bacillus spp.”• PN-EN 15785:2009E „Pasze. Wykrywanie i oznaczanie

liczby Bifidobacterium spp.”• PN-EN 15786:2009E „Pasze. Wykrywanie i oznaczanie

liczby Pediococcus spp.”• PN-EN 15787:2009E

„Pasze. Wykrywanie i ozna-czanie liczby Lactobacillusspp.”

Do oznaczania liczby Lacto-bacillus spp. w żywności i pa-szach oraz innych matrycachłańcucha żywnościowego ma

zastosowanie norma PN-ISO 15214:2002 „Mikrobiologiażywności i pasz. Horyzontalna metoda oznaczania liczbymezofilnych bakterii fermentacji mlekowej. Metoda płyt-kowa w temperaturze 30ºC”. W metodzie tej liczba ży-wych mezofilnych bakterii kwasu mlekowego wanalizowanej matrycy badana jest na stałej pożywce MRSinkubowanej w temperaturze 30°C przez 72h.Do kontroli czystości środowiska zakładów produkującychżywność i pasze przeznaczona jest norma PN-ISO18593:2005 „Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzon-talne metody pobierania próbek z powierzchni z użyciempłytek kontaktowych i wymazów”. W normie tej pod po-jęciem „środowisko” rozumie się wszystko, co ma kontaktz produktem żywnościowym czy paszą i może być źród-łem jego pierwotnego i/lub wtórnego zanieczyszczenia(np. materiały, pomieszczenia, personel).W badaniu parametrów higieny tusz zwierząt rzeźnychw przemyśle mięsnym stosowana jest norma PN ISO17604:2005 „Mikrobiologia żywności i pasz. Pobieraniepróbek z tusz do badań mikrobiologicznych”. W doku-mencie tym opisano metody próbobrania w celu wykryciai oznaczenia liczby mikroorganizmów na powierzchni tuszzwierząt rzeźnych bezpośrednio po uboju. W wyniku kil-kuletnich prac została opracowana znowelizowana wersjatej normy, która jest obecnie w dalszym ciągu procedo-wana i będzie zatwierdzona przez ISO do stosowaniaw 2015 roku.Wyrazem dążenia do dalszej optymalizacji wytwarzaniai harmonizacji metod kontroli jakości stosowanych poży-wek jest ostatnio opracowana i zatwierdzona norma ISO11133:2013 „Microbiology of food, animal feed andwater – Preparation, production, storage and performancetesting of culture media. (Mikrobiologia żywności, paszi wody. Przygotowywanie, wytwarzanie, przechowywaniei kontrola jakości pożywek). Norma ISO 11133 zawieraogólną terminologię odnoszącą się kontroli pożywek sto-sowanych w badaniach mikrobiologicznych żywności,pasz oraz wszystkich rodzajów wody. Ponadto podaje wsposób kompleksowy wytyczne systemu kontroli jakościi wymagań w procesie przygotowywania oraz stosowaniapożywek w badaniach laboratoryjnych w zakresie określo-nym w autorskim opracowaniu.W laboratorium kwestie przygotowania próbek do badańreguluje m.in. norma PN - ISO 6498:2012 „Pasze. Wska-zówki do przygotowania próbek do badań”. W niniejszejnormie polskiej zharmonizowanej z norma międzynaro-dową podano metody przygotowania próbek do badańz próbek laboratoryjnych pasz, w tym karmy dla zwierzątdomowych.Reasumując należy stwierdzić, że wszystkie grupy, rodzajei gatunki drobnoustrojów chorobotwórczych i wskaźniko-wych mogą być wykrywane i/lub oznaczane w żywności,paszach i innych matrycach łańcucha żywnościowego przyzastosowaniu polskich norm (PN), które są na ogół zhar-monizowane z normami europejskimi (EN) i/lub normamimiędzynarodowymi (ISO). Jednocześnie występuje silnatendencja do dalszej międzynarodowej harmonizacji i po-szerzania zakresu stosowania norm z zakresu mikrobiolo-gii łańcucha żywnościowego.

Piśmiennictwo u Autora

10

aktywność rodzaj matrycywody

Żywność pasze

> 0,95 owoce konserwowe, warzywa konserwowe, -

≥ O,95 świeże owoce, owoce konserwowe, warzywa, mięso, kiełbasy mleko dla zwierząt towarzyszących,gotowane, ryby, mleko, pieczywo, żywność zawierająca do 4% kiszonka z kukurydzysacharozy lub 7% NaCl,

≥ O,91 sery twarde (Cheddar, Szwajcarski), wędzone mięso, wędliny (szynka), sianokiszonkaniektóre koncentraty soków owocowych zawierające 55% sacharozy lub 12% NaCl,

≥ O,87 kiełbasy fermentowane (salami), sery suszone, margaryna, ciasta kiszonka z lucernybiszkoptowe, żywność zawierająca 65% sacharozy lub 15% NaCl,

≥ O,80 większość koncentratów soków owocowych, syropy: czekoladowy, nasiona kukurydzyowocowy, klonowy, ciasta o dużej zawartości cukru, ciasta owocowe, mleko zagęszczone, mąka, ryż, szynka wiejska, rośliny strączkowe o zawartości wody od 15% do 17%,

≥ O,75 dżemy, marmolady, owoce lukrowane, owoce kandyzowane, marcepan, nasiona kukurydzyptasie mleczko, miękkie cukierki, ciasta,

≥ O,65 płatki owsiane o zawartości wody 10%, galaretki, melasa, orzechy, nasiona soi, śruta sojowa, nasiona kukurydzy,suszone owoce, miękkie cukierki (np. krówki), mieszanki paszowe dla zwierząt domowych,nierafinowany cukier trzcinowy, sucha karma dla zwierząt towarzyszących

≥ O,60 suszone owoce o zawartości wody od 15% do 20%, karmel, toffi, miód, sucha karma dla zwierząt towarzyszących,batony zbożowe, żywność granulowana, zboża i produkty zbożowe, nasiona soi,

śruta sojowa, śruta kukurydzianakoncentraty dla zwierząt domowych

≥ O,50 makarony, spaghetti o wilgotności 15% - 20%, przyprawy o zawartości nasiona kukurydzy, karma dla ryb,wody 10%, zioła, koncentraty dla zwierząt domowych

≥ O,40 proszek jajeczny o zawartości wody 5%, nugaty, karma dla ryb

≥ O,30 ciastka, krakersy, suchary i pieczywo chrupkie o zawartości wody mączka z krwi drobiowej, mączka drobiowa,od 3% do 5%, podstawa sosów w proszku, mączka z piór, suszona plazma z krwi

≥ O,20 - suszona hemoglobina, mączka drobiowa,mączka z piór

≥ O,10 - mączka z krwi drobiowej

≥ O,03 mleko pełne w proszku o zawartości wody od 2% do 3%, preparaty mlekozastępczezupy w proszku, kawa instant,suszone owoce o wilgotności 5%, płatki kukurydziane o wilgotności 5%,

Tab. 1. Aktywność wody w zależności od rodzaju matrycy.

11

info

rmac

je o

pro

dukc

ie

Aktualne zagrożenia mikrobiologicznew żywności – enterotoksyny gronkowcoweJolanta G. Rola

W styczniu 2015 r. Europejski Urząd ds. BezpieczeństwaŻywności (EFSA), wspólnie z Europejskim Centrum Zwal-czania i Zapobiegania Chorób (ECDC), opublikował kolejnyraport dotyczący występowania chorób odzwierzęcych(zoonoz) oraz ich czynników etiologicznych, zarówno u ludzijak i u zwierząt, a także w żywności, obejmujący dane za2013 r. Dane zoonotyczne zawarte w raporcie pochodząz 28 krajów członkowskich UE oraz 4 krajów spoza UE.Obejmuje on 13 czynników i chorób zoonotycznych wtym Salmonella, Listeria monocytogenes, werotoksyczneE. coli czy Campylobacter. Zebrano również informacjedotyczące innych szkodliwych czynników w żywności takichjak koagulazo-dodatnie gronkowce i enterotoksyny gron-kowcowe, a także odnotowanych epidemii pokarmowych.Na podstawie prezentowanych w raporcie EFSA danych,zatrucia pokarmowe wywołane przez toksyny bakteryjneznajdują się na trzecim miejscu po zachorowaniach wy-wołanych przez bakterie z rodzaju Salmonella spp.(22,5% wszystkich epidemii) i wirusy (18,1%). W ostat-nich 6 latach zaobserwowano wyraźny wzrost ich liczbyz 525 do 834 ognisk choroby (59,8%). Ten sam raportstwierdza, że w 2013 r. niemal połowę (46,3%) zatruć po-karmowych wywołanych przez toksyny bakteryjne (Bacillus,Clostridium, Staphylococcus), spowodowanych było przezenterotoksyny gronkowcowe, co stanowi 7,4% wszystkichraportowanych epidemii pokarmowych. Wskaźnik zapa-dalności wyniósł 0,13 na 100 000 osób. Hospitalizacjiwymagało 6,6% osób wykazujących objawy gronkowco-wego zatrucia pokarmowego, natomiast nie odnotowanoprzypadków śmiertelnych. Najwyższy odsetek zatruć po-karmowych na tym tle, wywołany był spożyciem zanie-czyszczonej toksynami żywności mieszanej. Kolejnymikategoriami żywności powodującymi zatrucia pokarmowena tym tle były warzywa i soki oraz produkty je zawiera-jące, a następnie mięso wieprzowe i produkty z takimmięsem (Tabela 1). Gronkowcowe zatrucia pokarmowe (staphylococcal foodpoisoning – SFP) charakteryzują się krótkim okresem in-kubacji (do 8 godzin) oraz gwałtownym przebiegiem. Dogłównych objawów zalicza się nudności, wymioty i bólebrzucha. Objawy zwykle ustępują samoistnie po 24-48godzinach. Powikłania, rzadko występujące, odnotowujesię głównie u osób starszych i dzieci.Dotychczas opisano 23 enterotoksyny gronkowcowe. Ente-rotoksyny zdolne do wywołania wymiotów określa się jakowłaściwe (staphylococal enterotoxin – SEs) w odróżnieniu

od tych nie posiadających właściwości wymiotnych lubo nie potwierdzonych jeszcze właściwościach. Pięć naj-wcześniej odkrytych enterotoksyn gronkowcowych (SEA– SEE) określanych jest mianem klasycznych. Enteroto-ksyny gronkowcowe wykazują znaczną termostabilność,zachowując aktywność biologiczną nawet po przeprowa-dzeniu procesu pasteryzacji, który niszczy gronkowce znaj-dujące się w żywności. Charakteryzują się też dużąopornością na enzymy proteolityczne dzięki czemu nietracą aktywności w układzie pokarmowym. Parametry fi-zykochemiczne wpływające na wzrost Staphylococcus au-reus i produkcję enterotoksyn przedstawiono w tabeli 2.Intoksykację w przebiegu gronkowcowego zatrucia pokar-mowego u ludzi wywołują przede wszystkim enteroto-ksyny A i D oraz w mniejszym zakresie B i C. Odnotowano,że szczepy S. aureus izolowane z mleka i serów w Szwajcariii Włoszech posiadały głównie geny sed i sea odpowie-dzialne za produkcję enterotoksyn SED i SEA w odróżnie-niu od doniesień z Japonii, Austrii, Francji i Turcji, gdzieprzeważały izolaty z genem sec kodującym toksynę SEC.W Polsce od 14,3% do 26,3% szczepów S. aureus izo-lowanych z przypadków mastitis u bydła wytwarzało en-terotoksynę SEC, 10,8% – 71,4% enterotoksynę SEA,4,8% – 14,3% SED i 1,2%, SEB. W przypadku izolatów

12

z mleka surowego krowiego najczęściej identyfikowanogeny enterotoksyn SEC i SEA, odpowiednio 45% i 30%.Z drugiej strony, w innych badaniach dotyczących produkcjiserów z mleka surowego w Polsce potwierdzano u wyizo-lowanych koagulazo-dodatnich gronkowców występowaniegłównie genu enterotoksyny SED (60,7%). Zgodnie z rozporządzeniem Komisji (WE) nr 2073/2005(z późn. zm.) wskazaniem do badania produktów naobecność enterotoksyn gronkowcowych jest liczba gron-kowców koagulazo-dodatnich przekraczająca 105 jtk/g naróżnym etapie produkcji w zależności od rodzaju pro-duktu. Badaniami objęte są sery, mleko w proszku i ser-watka w proszku. Produkt uważa się za bezpieczny dlazdrowia konsumenta jeżeli w każdej z 5 badanych próbeko masie 25 g nie wykryto enterotoksyn gronkowcowych.Jednocześnie jako referencyjną metodę wykrywania en-terotoksyn gronkowcowych w tych produktach wskazanoEuropejską metodę skriningową opracowaną przez Labo-ratorium Referencyjne Unii Europejskiej ds. gronkowcówkoagulazododatnich w tym S. aureus (Reference Labora-tory for Coagulase Positive Staphylococci, including Stap-hylococcus aureus - EURL CPS). Obecnie trwają pracedotyczące standaryzacji i walidacji metody, prowadzącedo zatwierdzenia jej jako normy EN ISO. Krajowe labora-toria referencyjne ds. gronkowców koagulazo-dodatnich(Laboratorium Zakładu Bezpieczeństwa Żywności Naro-dowego Instytutu Zdrowia Publicznego – PaństwowegoZakładu Higieny i Laboratorium Zakładu Higieny ŻywnościPochodzenia Zwierzęcego Instytutu Weterynaryjnego w Pu-ławach) biorą udział w walidacji tej metody. Rutynowe bada-nia obecności enterotoksyn gronkowcowych na zgodnośćz rozporządzeniem Komisji (WE) nr 2073/2005 wyko-nują laboratoria urzędowe Inspekcji Sanitarnej i InspekcjiWeterynaryjnej. Potwierdzeniem kompetencji tych labora-toriów jest udział i pozytywny wynik uczestnictwa w bada-niach biegłości organizowanych przez krajowe laboratoriareferencyjne. Coraz częściej badania obecności enteroto-ksyn gronkowcowych dotyczą także produktów do żywie-nia psów i kotów.Dokument EURL CPS przedstawiający Europejską skrinin-gową metodę wykrywania enterotoksyn gronkowcowych,wersja 5 z września 2010 roku zawiera opis wykrywaniaenterotoksyn gronkowcowych typu od SEA do SEE w żyw-ności. Obejmuje ona dwa etapy. Pierwszym z nich jestekstrakcja i zagęszczanie próbki. Próbka jest mieszana z wodądestylowaną i homogenizowana. Toksyny dyfundują dowody i są odzyskiwane w supernatancie po 2 wirowa-niach. Faza wodna jest zagęszczana przez noc na drodzedializy. Kolejnym etapem jest detekcja metodą immuno-enzymatyczną (Vidas SET 2, bioMerieux lub RidascreenSET Total, R-Biopharm). Test Vidas SET 2 jest szybką i w pełni zautomatyzowaną,jakościową metodą wykrywania enterotoksyn gronkowco-wych typu A – E. W skład zestawu wchodzą pipetki SPR(Solid Phase Receptacle), których wnętrze opłaszczone jestprzeciwciałami specyficznymi dla enterotoksyn gronkowco-wych typu A, B, C, D i E. Kompleks immunologiczny po-wstaje między przeciwciałami opłaszczającymi wnętrzepipetki, enterotoksynami gronkowcowymi obecnymi w za-gęszczonym ekstrakcie i przeciwciałami anty – SE znakowa-nymi fosfatazą alkaliczną. Wszystkie odczynniki niezbędne

do wykonania testu znajdują się w szczelnie zamkniętychstudzienkach pasków testowych i są gotowe do użycia. Za-gęszczony ekstrakt lub próbki kontrolne są wprowadzanedo studzienek paska testowego i inkubowane w aparacieVidas lub miniVidas. Analizator wykonuje dwa fluorescencyjnepomiary (fluorescencja próbki, fluorescencja tła). Stosunek(Relative Fluorescent Value - RFV) między tymi dwoma po-miarami pozwala na interpretację wyniku i stwierdzenie czypróbka jest dodatnia czy ujemna.Zestaw Ridascreen SET Total jest jednym z handlowychtestów przydatnych do wykrywania enterotoksyn gron-kowcowych w żywności. Metoda wykrywania enteroto-ksyn gronkowcowych przy użyciu zestawu Ridascreen SETTotal oparta jest na teście sandwich EIA. Fazę stałą stano-wią studzienki opłaszczone przeciwciałami specyficznymidla enterotoksyn gronkowcowych. Kompleks immunolo-giczny powstaje w wyniku łączenia się przeciwciał opłasz-czających studzienki mikropłytki, enterotoksyn obecnychw badanej próbce i przeciwciał przeciw enterotoksyniegronkowcowej znakowanych peroksydazą. Obecność en-terotoksyn stwierdza się na podstawie reakcji kolorymet-rycznej przy długości fali 450/630 nm.Immunologiczne metody wykrywania enterotoksyn gron-kowcowych charakteryzują się wysoką specyficznością i czu-łością mają jednak pewne wady. Zaobserwowano niespe-cyficzne reakcje, które mogą być przypisane enzymom en-dogennym, takim jak fosfataza alkaliczna (Vidas SET 2) czylaktoperoksydaza (Ridascreen SET Total), pochodzącym z su-rowego mleka. W takim przypadku należy podjąć stosownedziałania aby wykluczyć ich wpływ na wynik badania. Przytoczone dane piśmiennictwa z walidacji metody i mię-dzylaboratoryjnych badań porównawczych wskazują naodpowiednio wysoką czułość i specyficzność testów immu-noenzymatycznych, pozwalającą z powodzeniem na ichwykorzystanie do wykrywania enterotoksyn gronkowco-wych w żywności. Automatyzacja analiz, zastosowanieanalizatora miniVidas/Vidas wydatnie upraszcza i skracaczasu trwania badania oraz zapewnia standaryzację wy-konanych badań i uzyskanych wyników (tabela 5).

Piśmiennictwo u Autora

Tabela 1. Żywność związana z gronkowcowymi zatruciami pokarmowymi w UE w 2013 r. (N=94) – wg raportu EFSA.

Rodzaje produktów Udział w SFP (%)

Produkty mieszane 19,1

Warzywa i soki 12,8

Mięso wieprzowe i produkty z mięsa wieprzowego 10,6

Mięso wołowe i produkty z mięsa wołowego 6,4

Sery 6,4

Ryby i produkty rybne 6,4

Wyroby piekarnicze 5,3

Mięso i produkty mięsne 6,4( inne, np.: innych gatunków, mieszane,)

Inne produkty, np.: wyroby garmażeryjne, produkty 26,6zbożowe, jaja i produkty jajeczne, mleko i produkty mleczne inne niż sery, inne)

13

Tabela 3. Czułość, specyficzność i dokładność europejskiej metody skriningowej – wykrywanie w mleku i produktach mlecznychwg raportu EU-RL CPS z 2011 r..

Tabela 4. Czułość, specyficzność i dokładność europejskiej metody skriningowej – wykrywanie w żywności innej niż mleko i produkty mleczne wg raportu EU-RL CPS z 2011 r..

Tabela 2. Parametry fizykochemiczne wpływające na wzrost Staphylococcus. aureus i produkcję enterotoksyn gronkowcowych – WE, 2003.

Tabela 5. Charakterystyka testów.

Parametr Wzrost S. aureus Produkcja enterotoksyn

Wartości optymalne Wartości graniczne Wartości optymalne Wartości graniczne

Temperatura (0C) 37 7 - 48 40 - 45 10 - 48

pH 6 - 7 4 - 10 7 - 8 4 – 9,6

NaCl (%) 0 0 - 20 0 0 - 10

Aktywność wody (aw) 0,98 0,83 - >0,991 0,98 0,85 - >0,992

Atmosfera tlenowa beztlenowa - tlenowa Tlenowa beztlenowa - tlenowa(5 – 20%

rozpuszczonego O2)

1 Atmosfera tlenowa (beztlenowa) 0,90 - >0,99 2 Atmosfera tlenowa (beztlenowa) 0,92 - >0,99

Test Technika badania Wykrywane enterotoksyn Czas badania LOD (ng/ml)

Vidas SET 2 ELFA* A - E 1 h 20 min ≥0,25 ng/ml

Ridascreen SET Total EIA** A - E 2 h 45 min 0,25 ng/ml

* – Enzyme Linked Fluorescent Assay ** – Enzyme Immuno Assay

Badania międzylaboratoryjneMatryca: ser z mleka krowiego naturalnie zanieczyszczony enterotoksyną D

Poziom zanieczyszczenia DC* + Ridascreen SET Total DC* + Vidas SET2

0 ng/g Specyficzność SP = 99% Specyficzność SP = 99%

0,04 ng/g Czułość SE = 52% Czułość SE = 99%

0,26 ng/g Czułość SE = 99% Czułość SE = 99%

Względna dokładność ACrelative = 84%

Badania wewnątrzlaboratoryjne

Dokładność AC = 97%

Względna specyficzność SPrelative = 97%

Względna czułość SErelative = 97%

*DC – dializa/zagęszczanie

Badania międzylaboratoryjneMatryca: ser z mleka krowiego naturalnie zanieczyszczony enterotoksyną E

Poziom zanieczyszczenia DC* + Ridascreen SET Total DC* + Vidas SET2

Poziom zerowy Specyficzność SP = 96% Specyficzność SP = 100%

Poziom niski 0,5 ng/g Czułość SE = 93% Czułość SE = 100%

Poziom wysoki 1,25 ng/g Czułość SE = 100% Czułość SE = 100%

Badania wewnątrzlaboratoryjne

DC* + Ridascreen SET Total DC* + Vidas SET2

Dokładność AC = 91% Dokładność AC = 96%

Względna specyficzność SPrelative = 89% Względna specyficzność SPrelative = 96%

Względna czułość SErelative = 97% Względna czułość SErelative = 97%

*DC – dializa/zagęszczanie

14

kont

rola

mik

robi

olog

iczn

a

Wprowadzenie

Zapewnienie prawidłowej czystości mikrobiologicznej śro-dowiska produkcji żywności jest jednym z podstawowychwarunków właściwego prowadzenia procesu produkcyj-nego. Procedury mycia i dezynfekcji linii technologicznejoraz utrzymywania odpowiedniego stanu higienicznegojej otoczenia obejmują monitorowanie nie tylko poziomumikroorganizmów saprofitycznych, ale również drobnou-strojów wskaźnikowych. Wykorzystywanie w produkcji wy-sokiej jakości surowców oraz wody technologicznej niejest gwarancją trwałego bezpieczeństwa mikrobiologicz-nego. Surowce stosowane do produkcji żywności są bo-gatym źródłem węglowodanów i białek, co w połączeniuzwykle z wysoką aktywnością wody tych matryc, stwarzadoskonałe warunki do rozwoju mikroorganizmów. Nawetduży ładunek drobnoustrojów nie musi nieść ze sobą wi-docznych makroskopowo objawów zepsucia surowców.Wizualne oznaki działalności bakterii i grzybów obserwujesię zazwyczaj przy ich namnożeniu do poziomu dziesiąteklub setek milionów komórek w jednym gramie lub mililitrze.Wniesione drobnoustroje są zwykle niszczone podczasoperacji technologicznych, a liczebność populacji mikro-organizmów zanieczyszczających maleje sekwencyjnie.Pojedyncze komórki stanowią jednak niebezpieczeństwotworzenia biofilmów na wewnętrznych i zewnętrznych po-wierzchniach instalacji. Bakterie, drożdże i spory pleśniw strukturze biofilmu wykazują wielokrotnie wyższą opornośćna niszczące czynniki fizyczne i chemiczne, w porównaniuz formami planktonicznymi tych samych szczepów. Szcze-gólnie niebezpieczne są drobnoustroje chorobotwórczelub potencjalnie chorobotwórcze. Bakterie chorobotwór-cze są nieodłącznym elementem każdego ekosystemuw środowisku naturalnym i mogą być wnoszone zarównoz surowcem, jak i przez personel produkcyjny. Niebezpie-czeństwo znacząco wzrasta w przypadku namnożenia ko-mórek do osiągniecia dawki infekcyjnej. Zagrożenie dlakonsumenta stanowią nawet pojedyncze komórki w jed-nostkowym opakowaniu produktu w przypadku bakteriiz rodzaju Salmonella, których dawka infekcyjna wynosi od 1do 100 komórek. Niskie dawki infekcyjne zostały okre-ślone również dla innych patogenów wnoszonych drogąpokarmową, np.: Escherichia coli O157 (2-2000 komó-rek), Campylobacter spp. (500-800 komórek), Listeria

monocytogenes lub Listeria ivanovii (100-1000 komó-rek dla osobników z grup podwyższonego ryzyka). Na in-fekcje narażone są głównie kobiety w ciąży, noworodki,niemowlęta oraz dorośli z osłabionym systemem immu-nologicznym.Należy także pamiętać, że jakiekolwiek drobnoustrojewniesione do zakładu cyrkulują w środowisku produkcyj-nym, a powietrze jest ośrodkiem gdzie nie tylko mogą oneczasowo przebywać, ale są też przenoszone na cząstkachpyłu i kurzu. Ze względu na dużą wilgotność powietrza naniektórych etapach produkcji tworzą się bioaerozole, coznacznie zwiększa przeżywalność komórek wegetatyw-nych w powietrzu.Produkcja żywności prowadzona jest zgodnie z zasadamiDobrej Praktyki Higienicznej (GHP, ang. Good HygienePractice), a kontrola jakości według ustalonych dla po-szczególnych zakładów i linii technologicznych procedurHACCP (ang. Hazard Analysis and Critical Control Points).Ten system kontroli, określany polską nazwą AnalizaZagrożeń i Krytyczne Punkty Kontroli, pozwala na identy-fikację ryzyka i zapobieganie zakłóceniom w produkcjiskutkującym obniżeniem jakości i bezpieczeństwa wytwa-rzanych produktów. Jako zagrożenie uznaje się cechęproduktu, powodującą że jego spożycie będzie niebez-pieczne dla ludzi, a jego przyczyną może być czynnik bio-logiczny, chemiczny lub fizyczny zaistniały w produkcji.System HACCP został uznany przez Komisję wspólną FAOi WHO Codex Alimentarius za najbardziej skuteczny spo-sób kontroli patogenów przenoszonych drogą pokar-mową. Prowadzone w zakładach przemysłu spożywczegomonitorowanie stanu higienicznego warunków produkcjiobejmuje: wewnętrzne i zewnętrzne powierzchnie ma-szyn, urządzeń oraz linii technologicznych; wodę stoso-waną do produkcji; powietrze w halach produkcyjnych;pracowników pozostających w bezpośrednim kontakciez produktem na wszystkich etapach jego wytwarzania.System kontroli wykracza poza zakład produkcyjny, wska-zując na konieczność nadzorowania całego łańcuchaprodukcji żywności, włączając produkcję pierwotną (wy-twarzanie surowców stosowanych w procesie technolo-gicznym), magazynowanie gotowego produktu i jegotransport, kończąc na sprzedaży. Określenie zagrożeń mi-krobiologicznych w systemie ciągłego monitoringu na każ-dym etapie wytwarzania żywności od pola czy obory do

Elementy kontroli czystości mikrobiologicznej środowiska produkcjiAlina Kunicka-StyczyńskaInstytut Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Politechniki Łódzkiej

15

stołu konsumenta wymaga stosowania wiarygodnychi nowoczesnych technik analizy mikrobiologicznej. Najczę-ściej wykorzystywane do oceny czystości mikrobiologicz-nej środowiska produkcji żywności i jej dystrybucji sątechniki stanowiące modyfikacje metod hodowlanych.Użyteczne testy powinny również umożliwiać szybkie i wy-godne pobranie próbek oraz bezpieczny transport do la-boratorium mikrobiologicznego.

Kontrola czystości mikrobiologicznej powierzchni

Zależnie od rodzaju produkcji i stosowanych surowców,wskazuje się grupy drobnoustrojów, których obecnośćświadczy o potencjalnym zagrożeniu dla bezpieczeństwai trwałości mikrobiologicznej produktu. Najważniejszewśród wskaźników jakości QI (ang. Quality Indicators) sąoznaczenia ogólnej liczby drobnoustrojów mezofilnych,liczby drożdży i pleśni, liczby bakterii z grupy coli, bakteriiEscherichia coli, bakterii z rodziny Enterobacteriaceae, pa-łeczek bakterii mlekowych z rodzaju Lactobacillus orazgronkowców koagulazo-dodatnich Staphylococcus au-reus. Standardowo, w przypadkach monitorowania dużejliczby punków krytycznych oznacza się ogólną liczbę drob-noustrojów mezofilnych oraz liczbę drożdży i pleśni. Mo-nitorowanie nawet tych podstawowych wskaźników QIzapewnia kontrolę mikrobiologiczną w czasie procesu pro-dukcji i ustalenie poziomu higieny produkcji. Istotny jestrównież dobór stosowanej w monitoringu mikrobiologicz-nym metody oznaczania poziomu mikroorganizmów za-nieczyszczających.Rutynową metodą określania liczby drobnoustrojów rezy-dujących na powierzchniach produkcyjnych jest technikawymazów (polegająca na przeniesieniu drobnoustrojówz badanej powierzchni do rozcieńczalnika), w połączeniuz wysiewem tej zawiesiny zwykle na pożywki agarowe.Chociaż metoda płytkowa jest złotym standardem analizmikrobiologicznych, nie jest ona pozbawiona wad. Posiewna pożywkach agarowych wykonuje się przynajmniej w 2powtórzeniach dla jednego rozcieńczenia, a rozcieńczeniapowinny być tak dobrane aby uzyskać od 30 do 300 kolo-nii na płytce. Często prognozowanie poziomu zanieczysz-czenia środowiska produkcji może być trudne, a uzyskaniedokładnego wyniku wymaga posiewu dwóch lub trzechkolejnych rozcieńczeń. Oznaczenia metodą płytkowąobarczone są błędem; i tak przy liczbie 2700 wyrosłychkolonii błąd wynosi 5%, dla 700 policzonych kolonii błądwzrasta do 10%, a dla 200 kolonii błąd metody wynosi20%. Stosowanie klasycznej techniki posiewu płytkowegojest również czaso- i pracochłonne, co przy koniecznościkontroli dużej liczby punktów krytycznych generujeznaczne koszty. Wprowadzenie płytek kontaktowych istot-nie usprawnia przeprowadzenie analizy, a zmniejszenieliczby operacji (pobranie próbki następuje przez bezpo-średnie zetknięcie powierzchni pożywki z badaną po-wierzchnią) redukuje błędy podczas rozcieńczania i wysiewu.Wykorzystanie płytek kontaktowych jest zgodne z normąPN-ISO 18593 dotyczącą badania powierzchni przemy-słowych.Bezpośrednie pobranie materiału do kontroli higieny po-wierzchni umożliwiają płytki Count-TactTM (bioMérieux).Płytki z pożywkami agarowymi mają menisk wypukły, co

ułatwia pobranie materiału. Wygodny w użyciu, ergono-miczny aplikator zapewnia standaryzację poboru próbki.Stosowanie aplikatora zapewnia pobór próbki przy na-cisku na powierzchnię 500 gram i 10-sekundowym cza-sie ekspozycji. Na podkreślenie zasługuje szeroki zakrespożywek.Do monitoringu higieny powierzchni w pomieszczeniachniejałowych przeznaczona jest pożywka Count-TactAgar zawierająca 4 neutralizatory (lecytynę, polisorbat80, L-histydynę i tiosiarczan sodu), co zapewnia równo-czesną inaktywację pozostałości większości stosowanychw przemyśle środków myjących i dezynfekcyjnych. Zależnieod sposobu higienizacji powierzchni, może być użyty Count-Tact GTS Agar bez neutralizatorów. Zakres wskaźników ja-kości QI uzupełnia Agar Count-Tact VRBG do wykrywaniaobecności i poziomu bakterii z rodziny Enterobacteria-ceae i Agar Count-Tact YGC do określania liczby drożdżyi pleśni.Monitoring higieny powierzchni w pomieszczeniach jało-wych można prowadzić z zastosowaniem pożywek AgarCount-Tact sterylizowanych radiacyjnie, również w pacz-kach potrójnie opakowanych. Trzy warstwy opakowaniapozwalają na zachowanie bezpieczeństwa sterylności po-mieszczeń podczas pobierania próbek. Do określanialiczby grzybów przeznaczona jest pożywka Agar Count-Tact Sabouraud Dekstroza Chloramfenikol z neutralizato-rami, sterylizowana radiacyjnie. Dostępne są też pożywkiCount-Tact i Trypcase Soy Agar z dodatkiem -laktamazy,neutralizującej antybiotyki. Uzupełnieniem systemu Count-Tact jest jałowy, plastikowy pojemnik BI-BOX, zapewniający

16

bezpieczny transport do laboratorium i przechowywaniepłytek po pobraniu materiału. Wykorzystanie pojemnikówBI-BOX znacznie ułatwia przeprowadzenie poboru mate-riału do badań, szczególnie gdy istnieje konieczność mo-nitorowania kilku lub kilkunastu punktów krytycznychrozmieszczonych w różnych miejscach zakładu produk-cyjnego.System Count-Tact może być z powodzeniem wykorzysty-wany do kontroli czystości mikrobiologicznej ubrania, rę-kawic i rąk personelu produkcyjnego. Flora rąk jestszczególnie bogata, a drobnoustroje tam bytujące prze-noszone są na powierzchnię rękawic, ubrania i następniewnoszone na powierzchnie produkcyjne stanowiąc zagro-żenie dla produktu. Mikroorganizmy znajdowane na po-wierzchni rąk klasyfikowane są w dwóch kategoriach: (i)przejściowe, występujące tylko okresowo na powierzchniskóry, niespecyficzne dla danego człowieka, charaktery-styczne dla otoczenia; (ii) osiadłe, które mają charakterosobniczy, są to zwykle ziarniaki i gronkowce koagulazo-dodatnie, występują na powierzchni i w szczelinach skóryoraz w zachyłkach gruczołów łojowych. Drobnoustroje za-liczane jako przejściowe można łatwo usunąć podczasmycia rąk, natomiast do usunięcia mikroorganizmówosiadłych konieczne jest mycie i szczotkowanie oraz sto-sowanie środków bakteriobójczych.Przykładowo, na powierzchniach w pokojach jałowychznajdowane były przede wszystkim gronkowce Staphy-lococcus epidermidis, Staphylococcus hominis i Stap-hylococcus haemolyticus i pleśnie z rodzaju Aspergillus.O ile wyniki badań czystości mikrobiologicznej środo-wiska produkcji zakładów spożywczych nie są ujawniane,to w literaturze znajdowane są opracowania dotyczącestanu higieny pomieszczeń i urządzeń w miejscach dys-trybucji żywności i ośrodkach żywienia zbiorowego.Dobry przykład stanowią badania przeprowadzone w sto-łówkach 120 brazylijskich szkół publicznych. Na podsta-wie poziomu mikroorganizmów saprofitycznych stołówki33% szkół sklasyfikowano jako środowiska o wysokimryzyku dla zdrowia konsumentów, a 64 i 3% odpowied-nio jako niosące średnie i niskie ryzyko. Interesujące jest,że poziom zanieczyszczenia mikrobiologicznego (TVC,ang. Total Viable Count) wyrażony jako mediana wynosił27,3 jtk/cm2 powierzchni blatów; 15 jtk/cm2 po-wierzchni desek do krojenia; 14,5 jtk/cm2 powierzchniwewnętrznej blenderów i 2 jtk/cm2 powierzchni umy-tych naczyń.Przy wyborze techniki wymazu, ważny jest dobór narzę-dzia służącego do zebrania drobnoustrojów z powierzchni.Polska norma PN-ISO 18593 definiuje wymazówkę jakołatwo łamiącą się pałeczkę z przędzą bawełnianą lubmateriałem syntetycznym, podając przykład materiałów:alginianu lub sztucznego jedwabiu. Materiał oraz sposóbjego naniesienia na pałeczkę determinuje zarówno efek-tywność zbierania komórek drobnoustrojów z powierzchni,jak i stopień ich odmycia do rozcieńczalnika. Główka wy-mazówki QUANTISWAB oferowanej przez firmę bioMe-rieux jest wytwarzana z nylonu i utworzona w kształcieszczoteczki. Takie rozwiązanie zapewnia odzysk 60% ko-mórek, trzykrotnie wyższy w porównaniu z tradycyjnągłówką wykonaną z bawełny. Dodatkowym udogodnie-niem jest załączona w zestawie probówka transportowa.

Badanie czystości mikrobiologicznej powietrza

System HACCP nakłada na producenta konieczność ba-dania czystości mikrobiologicznej powietrza w punktachkrytycznych, w których dochodzi do kontaktu produktuz powietrzem. Wiarygodna ocena jego stanu mikrobiolo-gicznego możliwa jest jedynie przy właściwym próbkowa-niu, zapewniającym zbadanie reprezentatywnej próbkio ściśle określonej objętości. Spośród dostępnych komer-cyjnie technik poboru, najczęściej wybierana jest metodazderzeniowa, polegająca na zderzeniu zdefiniowanej ob-jętości strumienia powietrza z powierzchnią pożywki ho-dowlanej. Ta wygodna w stosowaniu technika zapewniarównoczesny pobór próbki powietrza i posiew znajdują-cych się w nim mikroorganizmów i nie wymaga dodatko-wych wysiewów w laboratorium mikrobiologicznym.Do oceny poziomu mikroorganizmów znajdujących się w po-wietrzu firma bioMérieux proponuje próbnik air IDEAL 3PTM.Oznaczenie jest odmianą metody zderzeniowej. Dziękiwbudowanej turbinie, powietrze o określonej przez anali-tyka objętości, jest zasysane i po przejściu przez perforo-waną przegrodę zderza się z powierzchnią pożywki.Drobnoustroje niesione wraz ze strumieniem powietrzaprzyklejają się do powierzchni pożywki, a ich liczba odczy-tywana jest po inkubacji płytek, jako jednostki tworzącekolonie. Liczbę komórek zawartych w 1 m3 powietrza od-czytuje się z tablic dołączonych do aparatu. Zaletą aparatujest jego niska masa (1,2 kg) oraz pełna automatyzacjapoboru próbki (programowany czas pobrania i objętośćpowietrza), z możliwością opóźnienia startu do 60 minut.Pięć wymiennych ekranów, które mogą być sterylizowane,umożliwia pobór próbek z miejsc o zróżnicowanym za-nieczyszczeniu bez konieczności dezynfekcji pomiędzy ko-lejnymi pomiarami. Aparat wyposażony jest w ekran dopoboru próbek o średnicy 90 mm i 65/70 mm. Elastycz-ność, automatyzacja oraz łatwość obsługi pozwala naszybki i właściwy pobór próbki powietrza nawet przezosoby spoza laboratorium mikrobiologicznego. Próbnikcharakteryzuje się wysoką skutecznością fizyczną, definio-waną jako zdolność do pochłaniania znajdujących się wpowietrzu cząstek o różnej wielkości. Przeprowadzonaprzez Agencję Ochrony Zdrowia (Anglia) walidacja aparatupod kątem zgodności z wymaganiami normy ISO 14698-1stwierdza, że Air IDEAL 3P pochłania cząstki o wielkościpowyżej 5 µm ze skutecznością równą 100% w porów-naniu do metody referencyjnej. Ponadto, próbnik pochła-nia spory bakterii o wielkości równej i większej niż 2,1 µmze skutecznością 85-139% w porównaniu z metodą re-ferencyjną. Wskazano również, że próbnik zbiera bakterieStaphylococcus epidermidis ze skutecznością 92,1%. Po-wyższe parametry dowodzą nie tylko zgodności z wymo-gami normy ISO 14698, ale również stawiają aparat wczołówce komercyjnych próbników powietrza dostępnychna rynku.Skład jakościowy i ilościowy mikroorganizmów znajdują-cych się w powietrzu warunkowany jest wieloma czynni-kami środowiskowymi, takimi jak: klimat, pora roku,obecność roślinności i zwierząt, gleba, promieniowanieUV i IR oraz fizjologia mikroorganizmów (kształt komórki,zdolność do tworzenia form przetrwalnych, tolerancja ni-skiej aktywności wody, tworzenie pigmentów karotenoi-

17

dowych). Chociaż uznaje się, że w powietrzu przeważajązwykle konidia pleśni, to skład jakościowy mikroorganiz-mów powietrza może być znacznie zróżnicowany, zależ-nie od miejsca poboru próbki. W powietrzu najczęściejznajdowane są: ziarniaki z rodzajów Micrococcus, Sarcinai Staphylococcus; pałeczki z rodzajów Alcaligenes i Bacil-lus; konidia pleśni z rodzajów Cladosporium, Penicillium,Aspergillus, Alternaria, Botrytis, Rhizopus i Mucor. Wśródizolowanych drożdży najczęściej identyfikuje się gatunkiz rodzajów Rhodotorula, Torulopsis i Candida. W powietrzumogą być również przenoszone drobnoustroje chorobo-twórcze takie jak: Staphylococcus aureus, Pseudomonasaeruginosa, Enterococcus spp., Streptococcus spp., Sal-monella spp., Shigella spp., Clostridium spp.. Patogenymogą również cyrkulować w powietrzu na farmach ho-dowlanych i w ubojniach bydła. Bakterie SalmonellaTyphimurium oraz Listeria monocytogenes izolowanoz powietrza pobranego z obór dla bydła i owiec, a Salmo-nella Derby z chlewni.

Identyfikacja bakterii Legionella izolowanych z wody

W ostatnich latach szczególną uwagę zwraca się na nie-bezpieczeństwo zanieczyszczenia bakteriami z rodzaju Le-gionella w systemach dystrybucji wody. Bakterie tepowszechnie występują w wodach powierzchniowych, je-ziorach oraz łatwo wnikają do systemów dystrybucji wody.Namnażają się w komórkach pierwotniaków i stanowiąpowszechny element heterogennych biofilmów w środo-wiskach wodnych. Znajdowane są w domowych i publicz-nych instalacjach wodnych, systemach rozprowadzaniaciepłej wody do celów sanitarnych oraz wieżach chłodni-czych. Ze względu na wysokie ryzyko zakażenia bakteriamiz rodzaju Legionella zaleca się prowadzenie regularnejkontroli obiegów wody w środowisku przemysłowym,szpitalach, hotelach, szkołach i przedszkolach oraz innychsieciach wodnych dostarczających wodę użytkową. Ze-staw pożywek i testów do wykrywania i liczenia Legionella

i Legionella pneumophila w środowisku wodnym firmybioMérieux obejmuje pożywkę GVPC przeznaczoną dowykrywania i liczenia przypuszczalnych Legionella orazpożywkę BCYE z dodatkiem L-cysteiny lub bez służącejdo potwierdzania rodzaju Legionella. Uzupełnienie sys-temu stanowi Slidex Legionella Kit, szybki, lateksowy testaglutacyjny do identyfikacji wszystkich grup serologicznychbakterii Legionella pneumophila i Legionella anisa.Wśród szczepów bakterii z rodzaju Legionella znajdowa-nych w wodzie, 75% stanowi Legionella pneumophila,przy czym dominuje grupa serologiczna 1. Legionellapneumophila grupa serologiczna 1 reprezentuje od 91do 95% szczepów w próbkach klinicznych i około 30%w próbkach środowiskowych. Bakterie Legionella anisastanowią 14% szczepów wśród izolatów identyfikowa-nych jako gatunki inne niż Legionella pneumophila.

Podsumowanie

Stałe monitorowanie czystości mikrobiologicznej środo-wiska produkcji stało się nie tylko obowiązkiem producen-tów, ale również stanowi użyteczne narzędzie w procesiekontroli jakości. Wczesne wykrycie zagrożenia mikrobiolo-gicznego daje możliwość szybkiej reakcji i podjęcia natych-miastowych środków zaradczych, minimalizując lub naweteliminując straty ekonomiczne. Prawidłowa kontrola śro-dowiska produkcji wymaga jednak ciągłego poboru próbekczęsto w kilkunastu czy kilkudziesięciu punktach linii tech-nologicznej. Zastosowanie wiarygodnych i wygodnych wużyciu systemów testów mikrobiologicznych dedykowa-nych do kontroli środowiska mikrobiologicznej produkcjiznacznie usprawnia pobór próbek i skraca czas poświę-cony na wykonanie analiz. Elastyczność proponowanychprzez firmę bioMerieux systemów pozwala na zaprojekto-wanie indywidualnej dla każdego zakładu ścieżki kontrolistanu higienicznego linii technologicznej, personelu, po-wietrza i wody technologicznej.

Piśmiennictwo u Autora

18

info

rmac

je o

pro

dukc

ie

Labguard 3D to automatyczny system nowej gene-racji do monitorowania temperatury oraz innychparametrów fizycznych w laboratorium. Systemzostał zaprojektowany specjalnie z myślą o labo-ratoriach, tak aby ułatwić proces kontroli warun-ków w jakich przechowywane są odczynniki orazmateriały biologiczne. Bogata oferta sond pomia-rowych oraz elastyczność oprogramowania spra-wia, że system Labguard 3D znajduje zastosowanienie tylko w wielu gałęziach przemysłu (przemyślespożywczym, farmaceutycznym, kosmetycznym),ale również w laboratoriach klinicznych czy wetery-naryjnych. System znajduje zastosowanie wszędzietam, gdzie potrzebna jest kontrola parametrów fi-zycznych.

System Labguard 3D pomaga spełniać wszelkie wyma-gania zawarte w normach: ISO 17025 – Wymaganiadotyczące laboratoriów badawczych i wzorcujących,ISO 15189 Laboratoria medyczne, Szczególne wymaga-nia dotyczące jakości i kompetencji czy PN-EN ISO 7218Mikrobiologia żywności i pasz – Wymagania ogólne i za-sady badań mikrobiologicznych a także wymagania FDA21 CFR część 11. Posiadanie automatycznego systemudo monitorowania ułatwia procesy związane z akredytacjąoraz audytami i kontrolami zewnętrznymi. Cztery podstawowe funkcje systemu Labguard 3D tomierzenie parametrów fizycznych ich monitorowanie, za-pisywanie oraz alarmowanie w trybie rzeczywistym. Funk-cja alarmowania gwarantuje otrzymanie informacji w

momencie kiedy doszło do awarii monitorowanego urzą-dzenia. Dzięki temu użytkownik może wprowadzić dzia-łania naprawcze i zapobiec stracie odczynników czymateriałów biologicznych przechowywanych w monito-rowanym urządzeniu. Działanie systemu Labguard 3D opiera się na bezprzewo-dowej technologii radiowej przekazywania sygnału z na-dajnika do odbiornika. Do nadajnika podłączone są sondypomiarowe, które umieszczone są w komorze monitoro-wanego urządzenia. Odbiornik, który podłączony jest bez-pośrednio do sieci internetowej przekazuje dane dokomputera. Nowoczesne nadajniki oferowane w systemie Labguard3D posiadają wbudowane cyfrowy wyświetlacz. Dziękiczterem rodzajom nadajników: jedno-, dwu-, trzy- i cztero-kanałowym możliwe jest podłączenie od jednej do czterechróżnych sond pomiarowych. Uniwersalność nadajnikówto istotna zaleta systemu. Dzięki niej możliwe jest podłą-czenie do jednego nadajnika sond różnego rodzaju np.do pomiaru temperatury, wilgotności względnej oraz stę-żenia CO2. Wyświetlacz cyfrowy nadajnika prezentuje sze-reg istotnych dla użytkownika informacji. Poza nazwąmonitorowanego urządzenia, aktualną wartością danegoparametru fizycznego wyświetlane są również informacjeo stopniu zużycia baterii oraz jakości łączności radiowej.Nadajniki wyposażone są w kolorowe diody alarmowez projekcją 360o. Do każdego rodzaju alarmu (przekro-czenie wymaganej wartości parametru fizycznego, pro-blem z łącznością, problem z zasilaniem) przypisany jestodpowiedni kolor. Poza alarmami, które wyświetlane sąna obudowie nadajnika jest też alarm w postaci czerwonejdiody z projekcją pionową, który umożliwia obserwowaniesygnału świetlnego na suficie. Zasilanie nadajników możeodbywać się na trzy sposoby: klasyczny zasilacz elek-tryczny, kabel USB oraz baterie litowe.Spośród bogatej oferty sond pomiarowych najbardziej po-pularne są sondy do pomiaru temperatury. Z systememLabguard 3D możliwe jest jej monitorowanie w zakresieod -196oC do ponad 1000oC. Dwie najczęściej instalowanesondy to: sonda pracująca w zakresie -30oC do + 80oCoraz sonda PT100 pracująca w zakresie -90oC do + 130oC.Umożliwiają one monitorowanie temperatury w praktycz-nie wszystkich urządzeniach laboratoryjnych: niskotempe-raturowych zamrażarkach, zamrażarkach klasycznych,

Monitorowanie temperatury i innych parametrów fizycznych w laboratoriumMgr Marta Warowny-Krawczykowska

19

lodówkach, chłodniach, cieplarkach. W ofercie systemuLabguard 3D są także sondy: monitorujące jednocześnietemperaturę i wilgotność względną oraz sondy mierzącestężenie CO2, ciśnienie oraz przetworniki umożliwiającepodłączenie praktycznie dowolnej sondy analogowej (prze-tworniki analogowo-cyfrowe 0-20mA i 0-10V). W ofercie systemu Labguard 3D dostępne są także nie-zależne rejestratory danych, przeznaczone do monitoro-wania warunków transportu. Zapewniają kontrolę nadwłaściwymi warunkami przewożonych materiałów biolo-gicznych, a raport z informacjami o warunkach transportumoże być przekazywany automatycznie do systemu w mo-mencie, w którym nadajnik będzie w zasięgu odbiornika.Raport taki jest idealnym dokumentem do przedstawieniaw razie kontroli z zewnątrz. Kolejną zaletą a systemu Labguard 3D jest fakt, że opro-gramowanie instalowane jest na serwerze lub serwerzewirtualnym. Dzięki temu wszelkie aktualizacje wykony-wane są w jednym miejscu, a dostęp do oprogramowaniamożliwy jest przez przeglądarkę internetową. W zależnościod potrzeb dostępne są trzy wersje oprogramowania,które można rozbudowywać stopniowo uruchamiając po-szczególne jego funkcje. Dostęp do oprogramowaniamają tyko użytkownicy którzy posiadają indywidualny logini hasło. Dodatkowo możliwe jest przypisanie użytkowni-kom wybranych poziomów dostępów m.in. użytkownika,który może analizować informacje o alarmach i odbieraćalerty oraz administratora, który zarządza kontami innychużytkowników, może wprowadzać zamiany do konfiguracjioprogramowania, tak aby dopasować system do lokal-nych potrzeb. Oprogramowanie systemu Labguard 3Dumożliwia analizę graficzną oraz tabelaryczną gromadzo-nych danych. Możliwy jest także export danych do pro-gramu Microsoft Excel lub do formatu PDF. Dane możnaanalizować retrospektywnie. W dowolnym momenciemożna wygenerować raport za wybrany okres z przeszło-ści dla konkretnego wybranego urządzenia lub grupy urzą-

dzeń. Dzięki temu ogranicza się do minimum drukowaniezbędnych dokumentów oraz ich magazynowanie. Po-nadto zainstalowanie automatycznego systemu do moni-torowania środowiska w znacznym stopniu odciążapracowników laboratorium. Obowiązek systematycznegospisywania temperatur z urządzeń laboratoryjnych możezostać wyeliminowany, a dzięki temu zyskają Państwoczas, który będzie można wykorzystać na inne zadaniai obowiązki. Kolejna zaleta systemu Labguard 3D to zapewnienie bez-pieczeństwa dla przechowywanych odczynników i mate-riałów 24h na dobę, czyli także w nocy oraz w weekendyi dni wolne od pracy, kiedy nie ma personelu w laborato-rium. Komunikowanie alarmów możliwe jest na wielesposobów: mogą to być maile wysyłane na wybrane ad-resy, widget – „wyskakujące” kolorowe okienko na pulpi-cie komputera czy możliwość otrzymywania wiadomościSMS, faxu oraz wiadomości głosowych. Dzięki temu mogąPaństwo „zapomnieć” o manualnej kontroli parametrówfizycznych. Pomiary oraz ich kontrola odbywają się w spo-sób automatyczny, a Państwo są informowani wyłączniew przypadku zaistniałej awarii. Dodatkowo odpowiednie moduły oprogramowania umoż-liwiają wykonanie samodzielnie kalibracji i mapowania. Nażyczenie klienta z sondami dostarczamy świadectwa ka-libracji producenta lub certyfikaty wzorcowania wydaneprzez laboratoria wzorcujące posiadające akredytację Pol-skiego Centrum Akredytacji (PCA). Możliwy jest takżezakup urządzeń do przeprowadzania kalibracji na miejscuw Państwa laboratorium.Warto zaznaczyć fakt, że Labguard 3D jest systemem mo-dułowym. Oznacza to, że zakupioną dziś wersję systemumożna rozbudować o kolejne sondy, nadajniki, odbiorniki.Możliwy jest również upgrade oprogramowania do wy-ższej wersji, uruchomienie dodatkowych jego funkcji, takaby dopasować system Labguard 3D do zmieniającychsię potrzeb użytkownika.

lat

10 LAT RAZEM