KONSTRUKCJA I WŁAŚCIWOŚCI BIOCZUJNKA AMPEROMETRYCZNEGO KONSTRUKCJA I WŁAŚCIWOŚCI BIOCZUJNKA AMPEROMETRYCZNEGO Z UNIERUCHOMIONĄ OKSYDAZĄ ARYLOALKOHOLOWĄZ UNIERUCHOMIONĄ OKSYDAZĄ ARYLOALKOHOLOWĄ

Pracownia Analizy Przepływowej i ChromatografiiKierownik pracy: prof. dr Marek Trojanowicz, Opiekun: dr Ewa Poboży

Mechanizm działania bioczujnika

benzylowy

anyżowy

3,4 dimetoksybenzylowy3-hydroksy 4-metoksybenzylowy

4- hydroksy 3-metoksy cynamonowywanilinowy

Cel pracy Rodzielanie substratów AAO

H2O2

Aldehydaromatyczny

Alkohol aromatyczny (ox) Oksydaza

Aryloalkoholowa

O2

(red) Peroksydaza chrzanowa

(ox) Peroksydaza chrzanowaH2O

Os (III) e-

(red) OksydazaAryloalkoholowa

Os (II)

0 250.0 500.0 750.0 1000.0 1250.0 1500.0

-6 -0.275x10

-6 -0.225x10

-6 -0.175x10

-6 -0.125x10

-6 -0.075x10

-6 -0.025x10

t / s

I/ A

 WE: modyfikowana enzymatyczna elektroda pastowa z oksydazą alkoholi aromatycznych: CP/PVPOs/HRP/AAO; RE:Ag/AgCl; CE: Pt, Nośnik: 0,1 mol*l-1 bufor cytrynowo fosforanowy o pH 4; F= 1 ml*min-1; V= 20 μl

Optymalizacja pracy bioczujnika w układzie przepływowym

Celem pracy było skonstruowanie bioczujnika amperometrycz-

nego z unieruchominą oksydazą aryloalkoholową (AAO) do

oznaczania zawartości alkoholi aromatycznych.

Optymalizowano procedurę przygotowania elektrody oraz

parametry jej zasto-sowania w pomiarach stacjonarnych i

przepływowych. Właści-wości katalityczne oksydazy

zastosowanej w elektrodzie pastowej lącznie z peroksydazą

chrzanową (HRP) i mediatorem transpor-tu elektronów

umożliwiły oznaczenie zawartości alkoholi aromatycznych w

próbkach rzeczywistych na poziomie mikro-molowym z limitem

detekcji dla alkoholu anyżowego 5 mol/l.

Opracowany bioczujnik zastosowano również do pomiarów w

układzie analizy przepływowo-wstrzykowej (FIA) a wyniki

oznaczeń bioczujnikowych alkoholi aromatycznych w szeregu

napojów porównywano z oznaczeniami metodą HPLC.

0 250.0 500.0 750.0 1000.0 1250.0 1500.0

-7-0.200x10

-7-0.100x10

0

-70.100x10

-70.200x10

-70.300x10

-70.400x10

-70.500x10

-70.600x10

-70.700x10

t / s

i / A

Z uwagi na możliwość wystąpienia interferencji od matrycy, próbki rze-czywiste monitorowano używając 6 elektrod jednocześnie. Trzy z nich były kompletnymi bioczujnikami, tzn. zawierały AAO, HRP i PVPOs, elektroda nr.4 miała w sobie tylko HRP i PVPOs, nr. 5 tylko PVP, a nr.6 była grafitową elektrodą grafitową bez żadnych dodatków.

0 250.0 500.0 750.0 1000.0 1250.0 1500.0

-8-0.800x10

-8-0.550x10

-8-0.300x10

-8-0.050x10

-80.200x10

t / s

i / A

0 250.0 500.0 750.0 1000.0 1250.0 1500.0

-5-0.150x10

-5-0.125x10

-5-0.100x10

-5-0.075x10

-5-0.050x10

-5-0.025x10

0

t / s

i / A

-1,10E-03

-1,00E-03

-9,00E-04

-8,00E-04

-7,00E-04

-6,00E-04

-5,00E-04

-4,00E-04

-3,00E-04

-2,00E-04

0 1 2 3 4

F (ml/min)

I (m

A)

10mM anisyl alcohol, n=5y = -0.0005x - 0.0001

R2 = 0.9989

-5.00E-04

-4.50E-04

-4.00E-04

-3.50E-04

-3.00E-04

-2.50E-04

-2.00E-04

-1.50E-04

-1.00E-04

-5.00E-05

0.00E+00

0.00E+00 1.00E-01 2.00E-01 3.00E-01 4.00E-01 5.00E-01 6.00E-01

C (mM)

I (m

A)

anisol; n=5

Zakres liniowej odpowiedzi bioczujnika na alkohol anyzowy

y = -4,0837x - 13,349

R2 = 0,9983

-220

-170

-120

-70

-20

0 10 20 30 40 50

c mikroM

I n

A

Czułość bioczujnika na różne substraty

Detekcja w warunkach FIA

Sześciokanałowe naczynko pomiarowe o radialnym, cienkowarstwowym przepływie, pozwala na badania powtarzalności oznaczenia (jeżeli użyjemy jednakowych elektrod ) albo na kontrolowanie wpływu matrycy (jeżeli elektrody będą się różniły składem pasty). Sześć elektrod pracujących i elektroda odniesienia znajduje się w górnej części naczynka. Wlot i 6 otworów wyloto-wych dla każdej elektrody są w dolnej części. Układ radialny elektrod, które są w jednakowej odległości od wlotu zapewnia laminarny i identyczny dla wszystkich charakter przepływu.

Celem tego etapu była identyfikacja poszczególnych alkoholi aromatycznych w napojach. Zoptymalizowano procedurę rozdzielenia mieszaniny 7 wzorców (rodzaj i skład eluentu, długość fali, przepływ). Następnie w zoptymalizowanych warunkach do układu HPLC wstrzykiwano próbki napojów i na podstawie czasów retencji identyfikowano zawarte w nich składniki.

1. Alk. 3-hydroksy 4-metoksybenzylowy (1 ppm)

2. Alk. 3,4 dimetoksybenzylowy (2 ppm)

3. Alk. Anyżowy (5 ppm)

4. Alk. 3- hydroksy 4-metoksy cynamonowy ( 1 ppm) 5. Alk.

3-metoksybenzylowy (5ppm)

6. Alk.benzylowy (10 ppm)

7. Trans, trans 2,4 heksadien 1-ol (10ppm)

StabilnośćWpływ szybkości przepływu Wpływ pH

1. AAO HRP PVP CP2. AAO HRP PVP CP3. HRP PVP CP4. PVP CP5. CP6. AAO HRP PVP CP

Zastosowana elektroda pastowa jest elektrodą dyskową o średnicy 0,85 mm. Unieruchomienie składników w paście pozwala dobierać propor-cje i skład pasty bioczujnika w dowolny sposób.

Pasta bioczujnika AAO HRP PVP CP zawiera: 50 mg grafitu, 250 µl roztworu AAO (267U/ml), 5 mg HRP (263U/mg), 5mg PVPOs oraz 20 µl oleju parafinowego.

Elektody pracujące: AAO HRP PVP CP, HRP PVP CP, PVP CP, CP ( nazwy wg kolorów)

Elektroda odsniesienia: Ag/AgCl sat; Elektroda pomocnicza: Pt E: -100mV

Prędkość przepływu 1 ml*min-1; objętość wstrzykiwanej próbki: 20 μl; stężenie wstrzykiwanej próbki 10 mmol*l-1

Eluent: 0,1 mol*l-1 bufor cytrynowo- fosforanowy o pH 4

–4,1 mA/M

Elektroda pracująca: AAO/HRP/PVPOs CP,  Potencjał: -100 mV vs Ag/AgCl, Elektrolit: 0,1M bufor cytrynowo-fosforanowy pH 4, elektroda pomocnicza:Pt, elektroda odniesieniaAg/AgCl Sygnały uzyskane dla alkoholu anyżowego

Bez mediatora Z mediatorem

Porównanie elektrod pracujących o różnym składzie

AAO different concentration

739.1 789.1 839.1 889.1 939.1 989.1 1039.1 1089.1 1139.1

-70.056x10

-70.106x10

-70.156x10

-70.206x10

-70.256x10

-70.306x10

-70.356x10

-70.406x10

-70.456x10

t / s

i / A

Wzorzec (C= 1ppm)

Alk. 3-hydroksy 4- metoksy

cynamonowy w Martinii

Martinii+ wzorzec

Chromatogram mieszaniny wzorców alkoholi aromatycznych Kolumna: Phenomenex Luna C18; detektor UV Waters 2487; λ= 210 nm; Eluent MeOH/ H2O (75/25); F= 1 ml/min

Oznaczenia w próbkach napojów

FIA HPLC

Odpowiedź bioczujnika dla próbki Martini

3 sygnały od nieznanego alkoholu aromatycznego

Identyfikacja nieznanego alkoholu aromatycznego

w próbce Martini na podstawie chromatogramu

Przeprowadzono oznaczenia szeregu

próbek rzeczywistych napoi..

rejestracje dla kilku rodzajów Listę

Jedynym z badanych napoi, w którym

występują alkohole aromatyczne

okazało się Martini. Było to Martini

Rosso wyprodukowane przez Martini

& Rossi, numer partii 8 1499 1101 1.

 

Chromatograficznym oznaczeniom jakościowym poddane

zostały vermuty Martini Bianco, Martini Rosso, oraz

Ciociosan oraz próbka szampana.

Wyniki ( z wyjątkiem Martini) wskazują na nieoobecność

dodatków aromatyzujących w postaci alkoholi w tych

napojach. Martini zawiera alkohol 3-hydroksy 4-

metoksycynamonowy.

Rodzaj próbki Obecność alkoholi

Pacharan -

Anis -

Bacardi -

Soberano -

Martini +

Magno (whisky)

-

Lanas -

Wódka -

Wino -

WnioskiZakres liniowej odpowiedzi bioczujnika Amperogram dla alkoholu anyżowego

Oksydaza AAO katalizuje reakcje utleniania kilku alkoholi aromatycznych.

Skonstruowany bioczujnik jest najbardziej czuły na alkohol anyżowey, benzylowy i 2-

naftalenometanol

-2500

-2000

-1500

-1000

-500

0

0 1000 2000 3000 4000

C / mikroM

I / n

A

alkohol anyżowy

nadtlenek wodoru

2-naftalenometanol

aldehyd benzylowy

alkohol benzylowy

Wybór mediatora

Centrum aktywne HRP jest

głęboko ukryte pod łańcuchami

bialkowymi i transport

elektronów wymaga użycia

mediatora.

Zastosowanie kompleksu

osmowego powoduje wzrost

czułości o 3 rzędy wielkości oraz

dwukrotne skrócenie czasu

odpowiedzi.

0

20

40

60

80

100

120

2 3 4 5 6 7 8 9pH

Wzg

lędn

a w

ysok

ość

sygn

ału

(%)

-4.00E-04

-3.50E-04

-3.00E-04

-2.50E-04

-2.00E-04

-1.50E-04

-1.00E-04

-5.00E-05

0.00E+00

0 10 20 30 40 50numer wstrzyknięcia

I (m

A)

1. Unieruchomienie oksydazy aryloalkoholowej w paście grafitowej umożliwia otrzymanie stabilnego i czułego bioczujnika amperometrycznego do pomiarów stężeń alkoholi aromatycznych

2. Zastosowanie kompleksu osmu (II) jako mediatora umożliwia detekcję przy niskich potencjałach i zapewnia dobre właściwości dynamiczne elektrody

3. Opracowany bioczujnik umożliwia oznaczanie całkowitej zawartości alkoholi aromatycznychw próbkach rzeczywistych. Ich identyfikacja wymaga zastosowania metod chromatograficznych

Praca wykonana częściowo na Uniwersytetcie w Alcala(Hiszpania) w ramach stażu ERASMUS pod kierunkiem prof.dr E. DominguezAgata Granis

5 mM10 mM5 mM

10 mM

2,5 mM1 mM