Streszczenie rozprawy doktorskiej pt. �Konstrukcja grafu wproblemie asemblacji caªego genomu z wykorzystaniem procesorów

kart gra�cznych�

mgr in». Michaª Kierzynka

Promotor: prof. zw. dr hab. in». Jacek Bªa»ewicz

Promotor pomocniczy: dr in». Paweª Wojciechowski

1 Wst¦p

Bioinformatyka i asemblacja genomu

Podstawowym no±nikiem informacji genetycznej materii o»ywionej jest kwas dezoksyrybonukleinowy

(DNA). Fakt ten zostaª odkryty w roku 1953 przez Jamesa Watsona i Francisa Cricka bazuj¡cych na

badaniach Rosalind Franklin, Raymonda Goslinga oraz Maurice'a Wilkinsa. To wydarzenie zainicjowa-

ªo gwaªtowny rozwój biologii molekularnej � gaª¦zi nauki analizuj¡cej sposób dziaªania organizmów na

poziomie kodowania informacji genetycznych. Jednym z projektów, który miaª bardzo istotny wpªyw

na wiedz¦ w tej dziedzinie byª tzw. Human Genom Project. Rozpocz¦ty w roku 1990 i trwaj¡cy 13

lat miaª na celu dogª¦bne poznanie ludzkiego genomu. Jedn¡ z motywacji projektu byªa nadzieja na

wynalezienie nowych leków, które maiªy przeciwdziaªa¢ chorobom uwa»anym dotychczas za nieuleczal-

ne. Efektem projektu byªo poznanie sekwencji ponad 3 miliardów par zasad koduj¡cych 20-25 tysi¦cy

genów. Przetwarzanie takich zbiorów danych byªo mo»liwe dzi¦ki post¦powi technicznemu, który za-

zwyczaj towarzyszy tak du»ym projektom. Ogromne zbiory danych b¦d¡ce rezultatem biomedycznych

eksperymentów nie mogªyby by¢ przetworzone gdyby nie wydajne algorytmy i metody obliczeniowe.

Na tym gruncie powstaªa nowa dyscyplina nauki zwana biologi¡ obliczeniow¡ lub te» bioinformatyk¡.

Zªo»ono±¢ procesów w organizmach »ywych oraz wspomniana du»a ilo±¢ danych do przetworzenia s¡

gªównymi powodami rosn¡cej liczby metod informatycznych, które staªy si¦ nieodª¡czn¡ cz¦±ci¡ biologii

molekularnej.

Mimo post¦pu jaki dokonaª si¦ w tej dziedzinie na przestrzeni kilkudziesi¦ciu ostatnich lat, do dzi±

nie opracowano uniwersalnej metody na odczytywanie genomu organizmów. Problem le»y nie tylko

w cz¦±ci biochemicznej eksperymentu (odczytywaniu pojedynczych nukleotydów, czyli sekwencjono-

waniu) ale równie» w skªadaniu odczytanych fragmentów genomu w caªo±¢, a zatem w opracowaniu

dobrego algorytmu rozwi¡zuj¡cego problem asemblacji. Algorytmy do asemblacji DNA s¡ niezb¦dne,

poniewa» istniej¡ce technologie pozwalaj¡ odczytywa¢ jedynie bardzo krótkie odcinki materiaªu ge-

netycznego, które nast¦pnie trzeba zªo»y¢ w caªo±¢. Warto zauwa»y¢, »e problem asemblacji de novo

(czyli bez wcze±niejszej znajomo±ci genomu) nale»y do klasy problemów silnie NP-trudnych i przy pew-

nych ograniczeniach mo»na sprowadzi¢ go do problemu poszukiwania najkrótszego wspólnego zªo»enia

(ang. Shortest Superstring Problem). Jednak»e ze wzgl¦du na specy�k¦ odczytów pochodz¡cych z se-

kwenatorów, cz¦sto nie ma mo»liwo±ci stworzenia pojedynczej sekwencji konsensusowej, a rezultatem

dziaªania algorytmów jest wówczas zbiór sekwencji (kontigów) ª¡cznie pokrywaj¡cych jak najwi¦ksz¡

cz¦±¢ poszukiwanego genomu.

Najcz¦±ciej stosowanym podej±ciem do rozwi¡zania problemu asemblacji typu de novo s¡ rozwi¡-

zania oparte na grafach. W du»ej mierze, to wªa±nie od jako±ci stworzonego grafu zale»¡ dalsze wyniki,

czyli dªugo±¢ jak i jako±¢ otrzymanych kontigów. Pomimo, i» w ostatnich latach pojawiªo si¦ wiele

algorytmów do asemblacji DNA typu de novo, ka»dy z nich ma pewne wady czy ograniczenia. Niektóre

z nich nie radz¡ sobie z du»ymi zbiorami danych, inne produkuj¡ relatywnie krótkie kontigi lub ich

wyniki s¡ kiepskiej jako±ci � sekwencje nie zawsze s¡ zªo»one poprawnie. Jako±¢ rozwi¡za« jest niestety

nierzadko po±wi¦cana kosztem szybko±ci dziaªania algorytmu. Z drugiej strony obserwowany wzrost

mocy obliczeniowej, ilo±ci pami¦ci operacyjnej oraz pojawiaj¡ce si¦ nowe architektury obliczeniowe

umo»liwiaj¡ stosowanie coraz bardziej zaawansowanych równolegªych algorytmów asemblacji pozwa-

laj¡cych cz¦±ciowo wyeliminowa¢ wspomniany kompromis pomi¦dzy jako±ci¡ rozwi¡zania a czasem

trwania oblicze«.

Cel i zakres pracy

Niniejsza rozprawa jest odpowiedzi¡ na opisany powy»ej problem. Jej gªównym celem jest zapropo-

nowanie wysoce efektywnej, równolegªej metody konstrukcji wysokiej jako±ci grafów naªo»e« DNA,

które mog¡ by¢ nast¦pnie stosowane w procesie asemblacji de novo caªego genomu. Ponadto, w celu

oceny skuteczno±ci algorytmu, powinien on zosta¢ równie» zaimplementowany oraz przetestowany na

ró»norodnych zbiorach danych.

Zde�niowane zadanie mo»na podzieli¢ na szereg mniejszych problemów, spo±ród których najwa»-

niejsze to:

1. opracowanie oraz implementacja szybkiej metody dopasowywania sekwencji biologicznych na

procesorach kart gra�cznych (GPU),

2. zrównoleglenie zaproponowanej metody na wiele GPU,

3. opracowanie i implementacja nowego algorytmu heurystycznego opartego na k-merach sªu»¡cego

do efektywnej preselekcji podobnych do siebie sekwencji biologicznych,

4. opracowanie i implementacja metod podnosz¡cych jako±¢ tworzonego grafu naªo»e« DNA, w tym

metod uwzgl¦dniaj¡cych tzw. odczyty sparowane,

5. przygotowanie oraz przeprowadzenie obszernych testów na ró»norodnych zbiorach danych wery-

�kuj¡cych jako±¢ tworzonego grafu.

2 Problem asemblacji DNA

Asemblacj¦ DNA typu de novo mo»na okre±li¢ jako prób¦ rekonstrukcji pewnej nieznanej sekwencji

genomu na podstawie krótkich fragmentów DNA zwanych odczytami. W procesie asemblacji cz¦sto

zdarza si¦, »e wyspecjalizowane algorytmy nie s¡ w stanie odtworzy¢ caªej sekwencji genomu, lecz je-

dynie jego fragmenty, zwane kontigami. Warto zauwa»y¢, »e w przypadku sekwenatorów nowej generacji

nie wiadomo, który odczyt pochodzi z której nici podwójnej helisy DNA. W zwi¡zku z tym, dla ka»de-

go odczytu rozwa»a si¦ zazwyczaj równie» jego wersj¦ odwrotnie komplementarn¡. Jak wspomniano,

przy pewnych ograniczeniach problem asemblacji DNA typu de novo mo»e by¢ sformuªowany jako pro-

blem najkrótszego wspólnego zªo»enia (ang. Shortest Superstring Problem, SSP) [GMA80]. Niemniej

jednak, takie sformuªowanie nie odzwierciedla rzeczywistej zªo»ono±ci problemu asemblacji DNA, w

którym odczyty mog¡ zawiera¢ bª¦dy, genom pokryty jest odczytami nierównomiernie, a w±ród danych

wej±ciowych mo»na znale¹¢ krótkie fragmenty pochodz¡ce z innych organizmów. Co wi¦cej rzeczywiste

genomy zawieraj¡ wiele powtarzaj¡cych si¦ odcinków, których odr¦bno±¢ nie mo»e by¢ zignorowana,

jak w przypadku SSP, ze wzgl¦du na ich znaczenie biologiczne. Dalsza cz¦±¢ rozdziaªu przedstawia

pokrótce podej±cia stosowane w celu rozwi¡zania opisywanego problemu.

Grafy naªo»e« DNA

Graf naªo»e« DNA mo»e by¢ traktowany jako zmody�kowana wersja grafu Lysova [LFK+88]. Tak jak

w przypadku oryginalnego modelu, ka»dy odczyt reprezentowany jest jako wierzchoªek, a nakªadaj¡ce

si¦ odczyty poª¡czone s¡ ªukiem. To, które odczyty traktowane s¡ jako nachodz¡ce na siebie zale»y od

konkretnej implementacji, jednak»e warto wspomnie¢, »e nie musz¡ one pasowa¢ do siebie w sposób

idealny. W zwi¡zku z tym, z ka»dym ªukiem powi¡zana jest zazwyczaj waga stanowi¡ca o jako±ci

danego naªo»enia. Wag¡ mo»e by¢ na przykªad numeryczny wynik semi-globalnego dopasowania dwóch

sekwencji b¡d¹ dªugo±¢ naªo»enia. Przykªadowy graf naªo»e« DNA przedstawiono na Rysunku 1.

Podgrafy grafu de Bruijna

Drugim rodzajem modelu grafowego, obecnie cz¦sto spotykanego w literaturze, jest model oparty na

grafach de Bruijna. Koncepcja tego rodzaju grafu jest zbli»ona do reprezentacji przedstawionej przez

Pevznera [Pev89]. W celu opisania tego podej±cia musimy zde�niowa¢ poj¦cie k-meru, który mo»e by¢

rozumiany jako ci¡g k kolejnych znaków. W wi¦kszo±ci zastosowa« jest on jednak u»ywany do opisu

jednakowej dªugo±ci (k) podci¡gów pewnej sekwencji. W modelu o którym mowa, zbiór wierzchoªków

skªada si¦ ze wszystkich k-merów jakie mo»na wydoby¢ z wej±ciowych odczytów, wliczaj¡c odczyty

odwrotnie komplementarne. Skierowana kraw¦d¹ ª¡czy wierzchoªki i oraz j, je±li su�ks o dªugo±ci k−1

k-meru i jest identyczny z pre�ksem dªugo±ci k − 1 k-meru j. Warto podkre±li¢, »e tak zde�niowany

graf stanowi indukowany podgraf grafu de Bruijna, poniewa» nie zawiera w sobie wszystkich mo»liwych

permutacji nukleotydów o dªugo±ci k, lecz jedynie te które wyst¦puj¡ w wej±ciowym zbiorze danych,

por. [dB46]. Przykªadowy graf tego rodzaju zobrazowany jest na Rysunku 2.

Rysunek 1: Przykªadowy graf naªo»e« DNA dla pi¦ciu sekwencji. Ka»dy ªuk oznaczony jest par¡ wag:

numerycznym wynikiem semi-globalnego dopasowania dwóch sekwencji oraz liczb¡ pocz¡tkowych nie-

dopasowanych nukleotydów. Podkre±lone warto±ci wskazuj¡ na wyst¡pienie niedopasowania na nakªa-

daj¡cej si¦ cz¦±ci sekwencji. Dla przejrzysto±ci sekwencje odwrotnie komplementarne s¡ pomini¦te.

Podsumowanie

W wyniku dyskusji przeprowadzonej w pracy wida¢ jednoznacznie, »e reprezentacja odczytów pocho-

dz¡cych z do±wiadczenia biochemicznego odgrywa istotn¡ rol¦ w procesie asemblacji DNA. Czytel-

nikowi zostaªy przedstawione dwa modele grafowe, które s¡ aktualnie rozpatrywane w tej dziedzinie.

W szczególno±ci graf naªo»e« DNA zostaª wybrany jako model posiadaj¡cy lepsze perspektywy. Po

analizie literatury stwierdzono jednak, »e wszystkie metody konstrukcji grafu naªo»e« DNA posiadaj¡

pewne wady. Stanowi to zatem bardzo dobr¡ motywacj¦ niniejszej pracy, która skupia si¦ na nowym

algorytmie budowy grafu naªo»e« DNA.

3 Dopasowywanie sekwencji na GPU

Oprogramowanie, które jest obecnie wykorzystywane do asemblacji de novo mo»e by¢, jak opisano w

poprzednim rozdziale, podzielone na to bazuj¡ce na grafach de Bruijna i takie, które wykorzystuje

tzw. strategi¦ overlap-layout-consensus, czyli bazuj¡ce na grafach naªo»e«. Chocia» ta pierwsza me-

toda jest obecnie bardziej popularna, gªównie ze wzgl¦du na jej szybko±¢ i zdolno±¢ do efektywnego

przetwarzania du»ych zbiorów danych, druga metoda jest nadal w punkcie zainteresowania wielu grup

naukowych. Czynnikiem ograniczaj¡cym jej stosowalno±¢ jest przede wszystkim czas potrzebny na

konstrukcj¦ grafu naªo»e«, szczególnie w kontek±cie nieustannie wzrastaj¡cej liczby odczytów z poje-

dynczego eksperymentu. Dlatego te» jest bardzo wa»ne, aby zidenty�kowa¢ te fragmenty algorytmu,

Rysunek 2: Przykªadowa sekwencja i jej reprezentacja bazuj¡ca na idei grafu de Bruijna (dla k = 4).

Podkre±lona cz¦±¢ sekwencji stanowi region powtarzaj¡cy si¦, który jest przyczyna cyklu w gra�e.

które potencjalnie mogªyby by¢ przyspieszone. Podstawowym etapem metod opartych na grafach na-

ªo»e« DNA jest, jak sama nazwa wskazuje, obliczanie tzw. naªo»e«, czyli przesuni¦cia mi¦dzy danymi

parami odczytów i odpowiadaj¡cych im warto±ci dopasowania. Najdokªadniejsze wyniki mo»na uzy-

ska¢ tutaj korzystaj¡c z dokªadnej metody dopasowywania sekwencji, któr¡ jest semi-globalna wersja

algorytmu Needlemana-Wunscha [NW70]. Du»¡ dokªadno±¢ osi¡ga si¦ tu jednak kosztem du»ej zªo»o-

no±ci obliczeniowej. Dlatego krok ten jest cz¦sto zast¦powany przez szybsze aczkolwiek mniej dokªadne

heurystyki, por. [BBF+09].

To wªa±nie rosn¡ca liczba sekwencji w biologicznych bazach danych byªa gªównym powodem, dla

którego wielu naukowców i praktyków poszukiwaªo wydajnego oprogramowania do masywnie równole-

gªego porównywania sekwencji. St¡d te» popularne staªo si¦ wykorzystanie w tym celu ukªadów kart gra-

�cznych (ang. graphics processing units, GPUs) [MV08, LR09, LMS09, LMS10, BFK+11, FKBW12].

Niestety prawie wszystkie z wy»ej wymienionych narz¦dzi zostaªy zaprojektowane tak, aby uzyskiwa¢

dobr¡ wydajno±¢ jedynie przy skanowaniu bazy danych, tzn. gdy pojedyncza sekwencja porównywana

jest do wszystkich pozostaªych. Pozostaªe metody zostaªy zoptymalizowane dla scenariusza, w którym

ka»da sekwencja jest porównywana ze wszystkimi pozostaªymi. Oznacza to, »e w obu przypadkach

wydajno±¢ wspomnianych metod dramatycznie spadªaby, gdyby zastosowa¢ je w procesie asemblacji

de novo, gdzie jedynie wybrane pary sekwencji s¡ ze sob¡ porównywane.

Dlatego te» powstaªa potrzeba aby opracowa¢ narz¦dzie adresuj¡ce powy»ej przedstawiony pro-

blem, narz¦dzie, które przetwarza dane pochodz¡ce z sekwencjonowania nowej generacji tak wydaj-

nie, jak to mo»liwe. W ramach niniejszej pracy zaprojektowano i zaimplementowano bibliotek¦ G-

DNA [FKB+13], która speªnia wy»ej przedstawione wymagania. Jest to pierwsze wysoce równolegªe

rozwi¡zanie, zoptymalizowane pod k¡tem przetwarzania odczytów nukleotydowych (DNA/RNA) z no-

woczesnych sekwenatorów jak np. Roche/454, Illumina/Solexa i AB/Solid. Rozwi¡zanie wykorzystuje

algorytm Needlemana-Wunscha, oparty na dynamicznym programowaniu, do obliczania zarówno jako-

±ci jak i stopnia naªo»enia poszczególnych sekwencji. Omawiana biblioteka zostaªa zaimplementowana

na GPU oraz zoptymalizowana pod k¡tem architektury Fermi. Wyniki pokazuj¡, »e oprogramowanie

osi¡ga wydajno±¢ do 89 GCUPS na pojedynczej karcie gra�cznej i w rezultacie jest to najszybsze

oprogramowanie tego typu na ±wiecie, patrz Rysunek 3. Ponadto skaluje si¦ ono dobrze na systemach

wyposa»onych w wiele kart gra�cznych. Detale implementacyjne opisywanej metody zostaªy szczegó-

ªowo opisane w pracy doktorskiej.

0

50

100

150

200

SOLiD Illumina 454 454 Titanium *

GC

UP

S

63

112

82

160

83

165

89

177 1xGPU 2xGPU

Rysunek 3: Wydajno±¢ implementacji algorytmu G-DNA (w GCUPS) dla zbiorów danych pochodz¡-

cych z sekwenatorów ró»nego typu. ∗ odnosi si¦ do zbioru danych z dªugimi sekwencjami.

4 Algorytm konstrukcji grafów naªo»e« DNA

Gªównym wkªadem rozprawy doktorskiej w nauk¦ jest zaproponowana metoda konstrukcji grafu na-

ªo»e« DNA, której gªówna idea jest opisana pokrótce poni»ej. Algorytm w du»ej cz¦±ci opiera si¦ na

k -merowej analizie sekwencji biologicznych. Dla ka»dej sekwencji algorytm oblicza tzw. peªn¡ oraz

cz¦±ciow¡ charakterystyk¦ k -merow¡. Charakterystyki takie tworzone s¡ poprzez ekstrakcj¦ z danej

sekwencji wszystkich mo»liwych k-merów o zadanej dªugo±ci, które nast¦pnie sortowane s¡ malej¡co

ze wzgl¦du na liczb¦ wyst¡pie« danego k-meru. Takie posortowanie sprawia, i» najbardziej charak-

terystyczne k-mery dla ka»dej z sekwencji znajduj¡ si¦ na pocz¡tku jej charakterystyki k-merowej.

Przykªad ilustruj¡cy powy»sze zagadnienie przedstawiony jest na Rysunku 4. W przypadku charakte-

rystyk cz¦±ciowych k-mery ekstrahowane s¡ jedynie z wybranej cz¦±ci sekwencji.

W dalszej kolejno±ci charakterystyki u»ywane s¡ do sortowania sekwencji (odczytów z sekwena-

tora). Sekwencje sortowane s¡ dwukrotnie: zgodnie z peªnymi oraz cz¦±ciowymi charakterystykami

k-merowymi. To drugie sortowanie ma szczególne znaczenie gdy sekwencje nakªadaj¡ si¦ jedynie w

niewielkim stopniu, np. na 50% dªugo±ci sekwencji (Rysunek 5). W ka»dym z przypadków sortowane

przebiega w taki sposób aby zmaksymalizowa¢ prawdopodobie«stwo wyst¦powania podobnych do sie-

bie sekwencji w bliskim s¡siedztwie, w obr¦bie którego poszczególne pary sekwencji tworz¡ tzw. pary

Rysunek 4: Peªna charakterystyka k-merowa pojedynczej sekwencji. Dla ustalonej warto±ci k ekstrahuje

si¦ wszystkie mo»liwe k-mery, które sa nast¦pnie sortowane wzgl¦dem cz¦sto±ci ich wyst¦powania.

obiecuj¡ce (Rysunek 6). Nast¦pnie ich wzajemne podobie«stwa, a mówi¡c precyzyjniej wªa±ciwo±ci

nakªadania si¦, s¡ wery�kowane przez dokªadny algorytm Needlemana-Wunscha dopasowania parami

(por. Rozdziaª 3). Pary sekwencji, które pomy±lnie przejd¡ proces wery�kacji ª¡czone s¡ w gra�e ªukiem

skierowanym. Zaproponowany algorytm ma zªo»ono±¢ O(n · log2n + n), gdzie n to liczba sekwencji w

danej instancji problemu.

Rysunek 5: Pi¦¢ przypadków w których odcinki sekwencji scharakteryzowane przez k-mery odpowiadaj¡

nakªadaj¡cym si¦ cz¦±ci¡ sekwencji. Pomimo i» taka wyidealizowana sytuacja nie zdarza si¦ cz¦sto, zbiór

cz¦±ciowych charakterystyk k-merowych policzony dla ka»dej z sekwencji znacznie zwi¦ksza szanse, »e

dwie nakªadaj¡ce si¦ sekwencje znajd¡ si¦ we wspólnym s¡siedztwie.

W dalszej kolejno±ci jako±¢ grafu jest podnoszona za pomoc¡ czterech dodatkowych procedur, które

w du»ym skrócie opisane s¡ poni»ej:

1. Metoda najmniejszego indeksu leksykogra�cznego: z ka»dej sekwencji ekstrahowane s¡ dwa lek-

sykogra�cznie najmniejsze deskryptory. Odczyty, które wspóªdziel¡ identyczne deskryptory s¡

Rysunek 6: Gªówna idea algorytmu wyboru nakªadaj¡cych si¦ par sekwencji: gdy odczyty s¡ posorto-

wane, dokªadny algorytm wery�kuje które z s¡siaduj¡cych sekwencji rzeczywi±cie si¦ nakªadaj¡.

traktowane jako pary obiecuj¡ce a ich wªa±ciwo±ci nakªadania si¦ s¡ wery�kowane przez algo-

rytm dokªadny.

2. Metoda porówna« odczytów typu paired-end : zaªó»my, »e P jest zbiorem dotychczas wyznaczo-

nych ªuków w gra�e, a i a′ s¡ odczytami typu paired-end, podobnie b i b′. Idea metody jest

nast¦puj¡ca: je±li (a, b) ∈ P oraz (a′, b′) /∈ P , wówczas (a′, b′) staje si¦ obiecuj¡ca par¡ i dokªadny

algorytm dopasowywania sekwencji wery�kuje czy (a′, b′) ∈ P .

3. Metoda porównywania bezpo±rednich nast¦pników: wery�kuje czy odczyty nakªadaj¡ce si¦ z dan¡

sekwencj¡ nakªadaj¡ si¦ równie» pomi¦dzy sob¡.

4. Metoda sprawdzania odczytów odwrotnie komplementarnych: zaªó»my, »e a′′ jest odczytem od-

wrotnie komplementarnym do odczytu a, podobnie b′′ i b. Metoda dodaje brakuj¡ce ªuki pomi¦dzy

odczytami a′′ i b′′, dla których speªniony jest warunek: (a, b) ∈ P .

W rezultacie dziaªania metody bazowej oraz czterech wy»ej opisanych procedur (Rysunek 7) do-

kªadno±¢ zaproponowanego algorytmu do tworzenia grafu naªo»e« DNA jest bardzo wysoka, co zostanie

pokazane w nast¦pnym rozdziale. Ponadto warto zwróci¢ uwag¦, »e w pracy poªo»ono du»y nacisk na

zrównoleglenie wykonywania wszystkich opisanych kroków algorytmu. W tym celu wykorzystano za-

równo równolegªo±¢ oferowan¡ przez karty gra�czne jak i przez procesory centralne.

5 Wybrane wyniki testów obliczeniowych

W celu kompleksowego zbadania wªasno±ci zaprojektowanego algorytmu testy przeprowadzono na dwo-

jakim rodzaju danych: na zbiorach syntetycznych oraz rzeczywistych, pochodz¡cych z sekwenatora

Rysunek 7: Uproszczona wersja diagramu prezentuj¡ca caªy algorytm konstrukcji grafu naªo»e« DNA.

Illumina Genome Analyzer IIx. Dzi¦ki zbiorom syntetycznym mo»liwy byª dokªadny pomiar jako±ci

konstruowanych grafów przy u»yciu macierzy pomyªek (przy czym najwa»niejszymi parametrami w

rozpatrywanym przypadku s¡ czuªo±¢ oraz precyzja). Mo»liwo±¢ taka wynika z faktu, i» dokªadna lo-

kalizacj¦ odczytów w oryginalnym genomie jest znana a zatem znany jest i fakt nakªadania si¦ b¡d¹

nie dowolnej pary odczytów (tzw. ground truth). W przypadku zbiorów danych pochodz¡cych z eks-

perymentów biochemicznych, skonstruowano prosty algorytm trawersuj¡cy graf i skªadaj¡cy kontigi,

których dªugo±¢ oraz jako±¢ byªy nast¦pnie sprawdzane za pomoc¡ mapowania do genomu referencyjne-

go. Poni»ej przedstawiono wybrane wyniki testów. Bardziej szczegóªowe wyniki wraz z dokªadniejszym

opisem i interpretacj¡ znajduj¡ si¦ w rozprawie doktorskiej.

Pierwszy test obrazuje czuªo±¢ (Rysunek 8) oraz precyzj¦ algorytmu konstrukcji grafu naªo»e«

DNA na danych syntetycznych. Jak ªatwo zauwa»y¢, czuªo±¢ metody wzrasta wraz ze wzrostem roz-

miaru s¡siedztwa. Jednak warto podkre±li¢, »e ulega ona nasyceniu bardzo szybko. Nawet przy bardzo

niewielkim rozmiarze s¡siedztwa wynosz¡cym 10 sekwencji, algorytm znalazª 96.66% wszystkich na-

kªadaj¡cych si¦ par sekwencji w testowanym zbiorze danych. Dla rozmiaru s¡siedztwa wynosz¡cego

1000 czuªo±¢ algorytmu wyniosªa 98.5%, ale warto zauwa»y¢, »e warto±¢ 98% zostaªa osi¡gni¦ta ju»

dla s¡siedztwa o rozmiarze 60. �wiadczy to o du»ej zbie»no±ci zaproponowanego algorytmu sortowa-

nia. Dla porównania, podano równie» wyniki czuªo±ci algorytmu dla nieposortowanych sekwencji. W

tym wypadku czuªo±¢ wzrastaªa liniowo by dla s¡siedztwa o wielko±ci 1000 sekwencji osi¡gn¡¢ zaled-

wie 1.134%. Dla testowanych danych precyzja algorytmu niezale»nie od rozmiaru s¡siedztwa wynosiªa

pomi¦dzy 95.4% a 96.2%.

Rysunek 8: Czuªo±¢ algorytmu konstrukcji grafu naªo»e« DNA dla danych syntetycznych w zale»no±ci

od rozmiaru s¡siedztwa. Wyniki przedstawione s¡ zarówno dla sekwencji posortowanych (tak jak ma

to miejsce w algorytmie) jak i nieposortowanych, które podane s¡ jako punkt odniesienia.

Kolejny test obrazuje czuªo±¢ algorytmu w zale»no±ci od minimalnej dªugo±ci naªo»enia, przy któ-

rym sekwencje uznaje si¦ za nakªadaj¡ce si¦. Na Rysunku 9 wida¢ jasno, »e czuªo±¢ algorytmu spada w

przybli»eniu liniowo (a» do 40%) gdy algorytm korzysta jedynie z peªnych charakterystyk k-merowych.

Sytuacja ulega znacznej poprawie gdy algorytm korzysta równie» z charakterystyk cz¦±ciowych. Na-

wet dla bardzo krótkich naªo»e«, rz¦du 20%, metoda byªa w stanie poprawnie wskaza¢ ponad 75%

nakªadaj¡cych si¦ par odczytów w zbiorze danych. Ponadto warto wspomnie¢, »e precyzja algorytmu

pozostawaªa w przybli»eniu na tym samym poziome niezale»nie od wersji algorytmu.

Kolejny test miaª za zadanie pokaza¢ wpªyw poziomu bª¦dów sekwencjonowania na jako±¢ wyni-

ków. W tym celu wygenerowano 51 zbiorów danych, w których odsetek bª¦dów wynosiª odpowiednio od

0� do 50�. Dodatkowo w kolejnych uruchomieniach mody�kowano liczb¦ akceptowalnych bª¦dów (w

rozumieniu SNP) w obr¦bie naªo»enia dwóch sekwencji. Czuªo±¢ algorytmu w ró»nych kon�guracjach

pokazana jest na Rysunku 10. �atwo zauwa»y¢, »e w przypadku rosn¡cej liczby bª¦dów w zbiorze da-

nych czuªo±¢ algorytmu spada w szybki sposób gdy nie toleruje on »adnych bª¦dów. Jednak»e, czuªo±¢

t¡ mo»na przywróci¢ do odpowiednio wysokiego poziomu poprzez regulacj¦ parametru odpowiada-

j¡cego za liczb¦ dopuszczanych bª¦dów. Z drugiej strony, w takim wypadku precyzja metody ulega

nieznacznemu spadkowi: dla ka»dego kolejnego bª¦du dopuszczanego przez algorytm precyzja spada o

0.4% � 0.9%. Mocn¡ stron¡ algorytmu jest jednak to, »e t¡ niewielk¡ warto±¢ cz¦sto mo»na po±wi¦ci¢

w zamian za znaczny wzrost czuªo±ci metody.

Ponadto wykonano równie» testy na dwóch mocno ró»ni¡cych si¦ zbiorach danych pochodz¡cych

z sekwencjonowania bakterii oraz nicienia. Dla zwi¦zªo±ci, przedstawione tu wyniki dotycz¡ jedynie

pierwszego testu. W celu porównania dªugo±ci oraz jako±ci skonstruowanych kontigów, asemblacj¦ prze-

Rysunek 9: Czuªo±¢ algorytmu konstrukcji grafu naªo»e« DNA dla danych syntetycznych w zale»no-

±ci od minimalnego naªo»enia wymagaj¡cego wykrycia. Cz¦±ciowe charakterystyki k-merowe znacznie

poprawiaj¡ czuªo±¢ algorytmu, w szczególno±ci dla krótkich naªo»e«.

prowadzono równie» z u»yciem najbardziej popularnych pakietów oprogramowania do asemblacji de

novo, a mianowicie: Velvet 1.2.10 [ZB08], SOAPdenovo 2.04 [LLX12], Celera Whole-Genome Shotgun

(WGS) Assembler 8.1 [MSD00], String Graph Assembler (SGA) 0.10.13 [SD12] and SR-ASM (Short

Reads ASseMbly) [BBF+09]. Wyniki porównania przedstawiono w Tabeli 1. Jak ªatwo zauwa»y¢ naj-

dªu»sze kontigi uzyskano metod¡ SR-ASM. Równie» ten algorytm uzyskaª najwy»sz¡ warto±¢ N50 oraz

najwi¦ksz¡ sumaryczn¡ dªugo±¢ wszystkich kontigów (obie warto±ci byªy liczone jedynie dla poprawnie

zmapowanych kontigów). Z drugiej strony, kontigi te miaªy najni»sz¡ jako±¢: 4% z nich nie zmapowaªa

si¦ w ogóle a jako±¢ pozostaªych spadaªa nawet do 80.52% identyczno±ci z genomem referencyjnym.

Pozostaªe algorytmy generowaªy kontigi o zazwyczaj bardzo dobrej jako±ci, w granicach 99% identycz-

no±ci. Warto podkre±li¢, »e jedynym asemblerem, którego wszystkie kontigi zmapowaªy si¦ do genomu

referencyjnego, byª asembler bazuj¡cy na gra�e skonstruowanym przez metod¦ zaproponowan¡ z ni-

niejszej pracy (tu oznaczony jako G-DNA). Jest to bardzo obiecuj¡cy wynik, który potwierdza wysok¡

jako±¢ konstruowanych grafów. Pomimo »e zarówno Velvet jak i Celera WGS miaªy wy»sz¡ warto±¢

N50, byªo to uzyskane kosztem cz¦±ci niepoprawnych kontigów. Warto jednak wspomnie¢, »e dªugo±¢

kontigów konstruowanych przez G-DNA mo»e by¢ przedmiotem dalszej optymalizacji.

Na zako«czenie warto równie» wspomnie¢, »e wi¦kszo±¢ testów zostaªa wykonana na infrastrukturze

obliczeniowej PL-Grid.

Rysunek 10: Czuªo±¢ algorytmu konstrukcji grafu naªo»e« DNA dla danych syntetycznych w zale»no±ci

od liczby bª¦dów sekwencjonowania w zbiorze danych oraz od liczby bª¦dów dopuszczanych przez

algorytm (0-12).

Tabela 1: Liczba oraz jako±¢ kontigów wyprodukowanych przez ka»dy z testowanych asemblerów dla

zbioru odczytów pochodz¡cych z bakterii Candidatus Microthrix.

6 Podsumowanie

Gªównym celem niniejszej pracy byªo zaprojektowanie i implementacja bardzo dokªadnego a zara-

zem wydajnego algorytmu budowy grafów naªo»e« DNA, które s¡ szeroko wykorzystywane w procesie

asemblacji typu de novo. Zaproponowany algorytm oparty jest na k -merowej analizie sekwencji biolo-

gicznych. Dla ka»dej sekwencji algorytm oblicza tzw. peªn¡ oraz cz¦±ciow¡ charakterystyk¦ k -merow¡,

które w dalszej kolejno±ci u»ywane s¡ do sortowania sekwencji. Nast¦pnie wzajemne podobie«stwa

sekwencji z s¡siedztwa wery�kowane s¡ przez dokªadny algorytm Needlemana-Wunscha dopasowania

parami. W dalszej kolejno±ci jako±¢ grafu jest podnoszona za pomoc¡ czterech dodatkowych procedur.

W rezultacie dokªadno±¢ zaproponowanego algorytmu jest bardzo wysoka.

Przedstawiony w pracy algorytm byª przetestowany na ró»norodnych zbiorach danych: pocz¡wszy

od wygenerowanych syntetycznie, ko«cz¡c na danych pochodz¡cych z rzeczywistych sekwenatorów.

Czuªo±¢ zaproponowanej metody wahaªa si¦ pomi¦dzy 97% a 99%, co w poª¡czeniu z wysok¡ precyzj¡

si¦gaj¡c¡ 99% daªo bardzo dobre wyniki. Pokazano równie», »e metoda bardzo dobrze radzi sobie nawet

w przypadku danych z bª¦dami sekwencjonowania. Ponadto, jako±¢ grafu zostaªa zwery�kowana nie

wprost na podstawie dwóch zbiorów danych pochodz¡cych z sekwenatora Illumina Genome Analyzer

II. W tym celu zaimplementowano prost¡ metod¦ przechodzenia grafu i konstrukcji tzw. kontigów,

czyli zrekonstruowanych fragmentów genomu. Zostaªa ona zestawiona z najlepszymi dost¦pnymi algo-

rytmami do asemblacji de novo i w wielu przypadkach jako±ci¡ generowanych rozwi¡za« przewy»szaªa

pozostaªe metody. Dowodzi to nie tylko wysokiej dokªadno±ci metody konstrukcji grafu, lecz równie»

jej mo»liwo±ci efektywnego przetwarzania du»ych zbiorów danych.

Aby obliczenia wykonywaªy si¦ w mo»liwie krótkim czasie, du»¡ uwag¦ po±wi¦cono na zrównole-

glenie metody. Najbardziej czasochªonn¡ procedur¦, czyli dokªadne dopasowywanie sekwencji, zaim-

plementowano na kartach gra�cznych. Testy przeprowadzone na szerokim spektrum realnych danych

wykazaªy bardzo wysok¡ wydajno±¢ zaproponowanej metody oraz prawie liniow¡ skalowalno±¢ przy

u»yciu wielu kart gra�cznych. W rezultacie omawiany algorytm konstrukcji grafu mo»e w rozs¡dnie

krótkim czasie zwery�kowa¢ wi¦ksz¡ liczb¦ obiecuj¡cych par sekwencji w obr¦bie s¡siedztwa, co pozy-

tywnie wpªywa na jako±¢ konstruowanego rozwi¡zania. Co wi¦cej, pozostaªe cz¦±ci algorytmu równie»

zostaªy przeanalizowane pod k¡tem zrównoleglenia, które zostaªo wykonane za pomoc¡ bardziej tra-

dycyjnych modeli wielow¡tkowo±ci na procesorach centralnych.

Podsumowuj¡c, praca przedstawia now¡, wysoce efektywn¡ oraz dokªadn¡ metod¦ konstrukcji grafu

naªo»e« DNA. Otrzymane rezultaty s¡ bardzo obiecuj¡ce, co zach¦ca do dalszych prac. Naturaln¡

kontynuacj¡ przedstawionych osi¡gni¦¢ jest stworzenie zaawansowanej metody przechodzenia grafu

oraz skªadania tzw. kontigów oraz skafoldów, czyli zrekonstruowanych fragmentów genomu. Jednak»e

jest to bardzo zªo»ony temat, który wykracza poza zakres niniejszej pracy.

Literatura

[BBF+09] J. Blazewicz, M. Bryja, M. Figlerowicz, P. Gawron, M. Kasprzak, E. Kirton, D. Platt,

J. Przybytek, Swiercz A., and Szajkowski L. Whole genome assembly from 454 sequencing

output via modi�ed DNA graph concept. Comput. Biol. Chem., 33(3):224�230, 2009.

[BFK+11] J. Blazewicz, W. Frohmberg, M. Kierzynka, E. Pesch, and P. Wojciechowski. Protein

alignment algorithms with an e�cient backtracking routine on multiple GPUs. BMC

Bioinformatics, 12:181, 2011.

[dB46] N.G. de Bruijn. A combinatorial problem. Proc. Nederl. Akad. Wetensch., 49:758�764,

1946.

[FKB+13] W. Frohmberg, M. Kierzynka, J. Blazewicz, P. Gawron, and P. Wojciechowski. G-DNA �

a highly e�cient multi-GPU/MPI tool for aligning nucleotide reads. Bull. Pol. Ac.: Tech.,

61:989�992, 2013.

[FKBW12] W. Frohmberg, M. Kierzynka, J. Blazewicz, and P. Wojciechowski. G-PAS 2.0 - an im-

proved version of protein alignment tool with an e�cient backtracking routine on multiple

GPUs. Bull. Pol. Ac.: Tech., 60:491�494, 2012.

[GMA80] J. Gallant, D. Maier, and J. Astorer. On �nding minimal length superstrings. Journal of

Computer and System Sciences, 20:50�58, 1980.

[LFK+88] I.P. Lysov, V.L. Florent'ev, A.A. Khorlin, K.R. Khrapko, and V.V. Shik. Determination of

the nucleotide sequence of DNA using hybridization with oligonucleotides. A new method.

Doklady Akademii Nauk SSSR, 303:1508�1511, 1988.

[LLX12] R. Luo, B. Liu, and Y. et al. Xie. SOAPdenovo2: an empirically improved memory-e�cient

short-read de novo assembler. Giga Science, 1:18, 2012.

[LMS09] Y. Liu, D.L. Maskell, and B. Schmidt. CUDASW++: optimizing smith-waterman sequence

database searches for CUDA-enabled graphics processing units. BMC Research Notes,

73(2), 2009.

[LMS10] Y. Liu, D.L. Maskell, and B. Schmidt. CUDASW++2.0: enhanced smith-waterman protein

database search on CUDA-enabled GPUs based on SIMT and virtualized SIMD abstrac-

tions. BMC Research Notes, 93(3), 2010.

[LR09] L. Ligowski and W. Rudnicki. An e�cient implementation of smith waterman algorithm

on GPU using CUDA, for massively parallel scanning of sequence databases. IPDPS, pages

1�8, 2009.

[MSD00] E.W. Myers, G.G. Sutton, and A.L. et al. Delcher. A Whole-Genome Assembly of Droso-

phila. Science, 287(5461):2196�2204, 2000.

[MV08] S. Manavski and G. Valle. CUDA compatible GPU cards as e�cient hardware accelerators

for Smith-Waterman sequence alignment. BMC Bioinformatics, 9 (Suppl 2)(S10), 2008.

[NW70] S.B. Needleman and C.D. Wunsch. A general method applicable to the search for simila-

rities in the amino acid sequence of two proteins. J Mol Biol, 48(3):443�453, 1970.

[Pev89] P.A. Pevzner. l-Tuple DNA sequencing: computer analysis. J. Biomol. Struct. Dyn., 7:63�

73, 1989.

[SD12] J.T. Simpson and R. Durbin. E�cient de novo assembly of large genomes using compressed

data structures. Genome Res., 22:549�556, 2012.

[ZB08] D.R. Zerbino and E. Birney. Velvet: Algorithms for de novo short read assembly using de

Bruijn graphs. Genome Res., 18:821�829, 2008.