KALIBRACJA METOD

ANALITYCZNYCH

Agata Dziwińska3 rok OAM

Ujednolicenie sposobu działania, narzędzi pomiarowych oraz jednostek miar, aby niezależnie od miejsca i czasu pomiar dawał taki sam wynik w granicach wyznaczonych niepewności pomiarów.

Metrologia chemiczna - cel

Zbiór operacji ustalających w danych warunkach relację między sygnałem analitycznym instrumentu a stężeniem lub ilością (masą) substancji oznaczanej w celu wyznaczenia stężenia lub zawartości tej substancji w analizowanej próbce

Kalibracja metody analitycznej

Ogół czynności służących wzorcowaniu przyrządu pomiarowego.

Kalibracja

Numeryczne wyrażenie kalibracjiy = F(x) Odwrotna postać funkcji kalibracyjnej. Wprost

wykorzystywana do obliczenia stężenia analitu.

x - stężenie lub ilość analitu

y – poziom sygnału mierzonego

Funkcja pomiarowa -kalibracyjna

Funkcja analityczna

Roztwór wzorcowy lub materiał referencyjny traktowany jest jako próbka i poddany kompletnemu procesowi analitycznemu. Monitorujemy odpowiedź przyrządu lub systemu pomiarowego.

Do sporządzenia krzywej kalibracyjnej stosujemy wiarygodne materiały odniesienia

Kalibracja przyrządu jest czynnością wstępnej walidacji.

Kalibracja w praktyce

Rodzaj przyrządu pomiarowego

Liczba próbek – czas analizy

Wymagana dokładność oraz niepewność wyniku pomiaru

Skład matrycy próbki

Możliwość zmiany składu próbki

Możliwości przygotowania próbek wzorcowych w szerokim zakresie stężeń analitu

Na sposób kalibracji wpływa:

Kalibracja zewnętrzna, wielopunktowa Wpływ matrycy na wynik pomiaru

Pomiary serii (3-10) roztworów standardowych podobnych do przewidywanych próbek analitycznych o wzrastających stężeniach

3-krotny pomiar dla każdego roztworu, uśrednienie wartości po odrzuceniu błędów grubych

Metoda krzywej kalibracyjnej

Dane kalibracyjne - zestaw par liczb

xi - stężenie roztworu wzorcowego yi – uśredniona wartość sygnału

Wykreślenie funkcji natężenia sygnału od stężenia wzorca w układzie współrzędnych

Dopasowanie danych kalibracyjnych do liniowej funkcji kalibracyjnej metodą najmniejszych kwadratów - regresji liniowej (suma kwadratów odległości w kierunku osi y wszystkich punktów od prostej ma najmniejszą wartość)

Miara odchylenia:

Y = ac + bY - wielkość mierzonac – stężenia analitua – wsp. proporcjonalności - nachylenie krzywej wzorcowej, określa czułość metodyb - wartość stała wyznaczona dla ślepej próby

Kalibracja zewnętrzna Wpływ matrycy na wynik pomiaru

W przypadku nieliniowej zależności sygnału od stężenia

2 roztwory wzorcowe o stężeniach zbliżonych do badanego – jeden o stężeniu mniejszym, drugi o stężeniu większym.

Metoda roztworów ograniczających

Kalibracja wewnętrzna Zminimalizowany wpływ składu matrycy

W oznaczeniach ilościowych dla wielu próbek różniących się składem matrycy (matryca złożona lub nieznana)

Warunki konieczne◦ rejestrowany sygnał wprost proporcjonalny do stężenia

◦zerowy sygnał próby

Metoda dodatku wzorca

Szybki sposób – zalecany gdy pomiar niestabilny

Pomiar kolejno dla roztworu próbki o nieznanym stężeniu, a następnie po każdym dodatku znanej, zaniedbywalnie małej objętości roztworu wzorcowego analitu

Uzyskujemy różnice stężeń, a nie bezwzględną wartość stężenia

Stężenie próbki:

y = bx+a

a, b - współczynniki funkcji kalibracyjnej

Kalibracja zewnętrzna, jednopunktowa Wpływ matrycy na wynik pomiaru

Warunki konieczne◦ założenie, że wyraz wolny liniowej funkcji

analitycznej nie różni się istotnie od zera◦ stężenie analitu w próbce oraz stężenie

roztworu wzorcowego w przybliżeniu równe◦ identyczne matryce analitu i wzorca

Metoda porównania ze wzorcem

Poszukiwane stężenie analitu xm dające sygnał ym obliczane na podstawie sygnału ys dla roztworu standardowego o stężeniu xs mierzonego w tych samych warunkach

Typy krzywych kalibracyjnych

Krzywe nieprostoliniowe

(Wielopunktowe)◦ Powtarzalne◦ Niepowtarzalne

Krzywe prostoliniowe (Jednopunktowe)

◦ Powtarzalne◦ Niepowtarzalne

Typy krzywych kalibracyjnych

Krzywa powtarzalnaKolejne kalibracje wykonywane jak najrzadziej, w przypadku awarii metody.

O ile analiza złych wyników w materiałach kontrolnych nie wykaże błędu kalibracji!

Krzywa niepowtarzalna

Kalibracja konieczna w każdym postępowaniu analitycznych (w każdej serii pomiarowej)

Przedział zawartości analitu, dla którego sygnał urządzenia pomiarowego jest proporcjonalny do tej zawartości.

Zakres pomiarowy - przedział między najwyższym i najniższym stężeniem, jakie mogą zostać oznaczone daną metodą z założoną precyzją, dokładnością i liniowością.

Przy niskich stężeniach - ograniczony dolną granicą oznaczalności.

Zakrzywienie - wynik szumów aparaturowych i efektu matrycowego.

Koniec zakresu - punkt, w którym odchylenie od prostoliniowości ≤3%.

Liniowość

Yteor – sygnał dla roztworu o

najwyższym stężeniu, wyznaczony

metodą najmniejszych kwadratów

Yrzecz – sygnał rzeczywisty dla

roztworu o najwyższym stężeniu,

wyznaczony eksperymentalnie

Korelacja - miara powiązania między dwiema lub większą liczbą zmiennych.

Współczynnik korelacji liniowej Pearsona - najważniejszy mierniki siły związku prostoliniowego między dwiema cechami mierzalnymi – kryterium liniowości!

Analiza regresji i korelacji

Kowariancja

Odchylenia

standardowe

Określa stopień "proporcjonalnych" powiązań wartości dwóch zmiennych – moduł wartości mówi o sile związku.

r ∈ [-1;1]

Im bliżej 0 związek słabszy

Im bliżej 1 (-1) związek silniejszy

Znak współczynnika korelacji mówi o kierunku związku:

+ kierunek dodatni, związek wprost proporcjonalny

- kierunek ujemny, związek odwrotnie proporcjonalny

Wartość korelacji nie zależy od jednostek miary, w jakich wyrażamy badane zmienne.

Ocena siły związku:

Współczynnik korelacji

Siła związku korelacyjnego

0.0 - 0.2 Brak

0.2 - 0.4 Słaba

0.4 - 0.7 Średnia

0.7 - 0.9 Silna

0.9 - 1.0 Bardzo silna

Współczynnik determinacji – r² - Wskazuje jaka część zmienności cechy Y może być opisana za pomocą zmienności cechy X.

Jest to opisowa miara dopasowania modelu regresji do danych – miara siły związku liniowego między danymi.

Wykres rozrzutu (diagram korelacyjny) – graficzne przedstawienie związku korelacyjnego. Umożliwia przybliżone oszacowanie kierunku i siły związku.

Modelowanie współzależności dwóch cech realizowane przez obliczenie równania regresji i przedziału ufności

◦Regresja liniowa – równanie liniowe◦Regresja krzywoliniowa

Równanie wymodelowane, aby było najlepiej dopasowane do danych empirycznych. Współczynniki a i b zwykle szacowane metodą najmniejszych kwadratów

Równania prostych regresji

Dla populacji próby

Y = aX + b

Dla populacji generalnej

Y = αX + β

Współczynniki kierunkowe

prostych

a α

Współczynniki przesunięcia

prostych

b β

a>0 jeśli "x" wzrośnie o 1 jednostkę, to "y" wzrośnie o "a" jednostek.a<0 jeśli "x" wzrośnie o 1 jednostkę, to "y" spadnie o "a" jednostek.

Krzywa kalibracji ma określony zakres prostoliniowości w którym uzyskujemy wyniki przydatne do interpretacji ilościowej;

Niekorzystne użycie większej liczby punktów kalibracji niż konieczne bo zwiększa ryzyko błędnych odczytów.

Liczba punktów kalibracji

1 punkt - stężenie analitu wszystkich próbek w zakresie liniowym.

2 punkty - stężenie próbki poza zakresem liniowy, mniejsze niż jego3-krotność.

3 punkty– stężenie próbki poza zakresem liniowym. Trzeci punkt odpowiada 6-ciokrotnie większemu stężeniu niż pierwszy

Metoda stałego odcinka czasu

Pomiary Kinetyczny

Metoda punktu końcowego

TYPY POMIARU

Metoda stałego odcinka czasu (fixed time)

Oparta na różnicy wartości pomiarów w dwóch chwilach czasu. Zaletą jest, że przy obliczaniu z różnicy „bias” jest odejmowany.

Pomiar kinetyczny Ciągły w czasie

Tryby pomiaru

Metoda punktu końcowego (end-point)Pomiar sygnału w określonym czasie (punkcie) przyrównywany do krzywej odniesienia.

Procedura pozwala określić stężenie z pomiaru absorbancji. Absorbancja mnożona przez faktor zaprogramowany w aparacie, lub obliczony w trakcie kalibracji standardami

Tryby pomiaru

C próbki = A próbki * F C standard

Stabilność kalibracji wewnątrz

laboratorium

Jednolitość kalibracji między

laboratoriami

WZORCE

Pojedynczy związek chemiczny lub pierwiastek

◦ znany skład (podany w ateście)◦ wysoka czystość ◦ wysoka trwałość

Służy jako materiał odniesienia oraz pozwala sprawdzić wyniki pracy laboratorium.

Wzorzec chemiczny

Jednorodna substancja o składzie ściśle określonym, ustalonym na podstawie wielokrotnych analiz, wykonanych określonymi metodami w różnych laboratoriach

Stosowany powszechnie w analizach porównawczych

Wzorzec analityczny – substancja odniesienia

Materiały odniesienia; referencyjne - RM

Materiały lub substancje, których jedna lub więcej własności jest wystarczająco dobrze ustalona i jednorodna, aby można je było wykorzystać do:

◦ kalibracji przyrządu pomiarowego◦ oceny metody analitycznej ◦ przypisania wartości właściwościom innych

materiałów

Materiały odniesienia posiadające odpowiedni certyfikat – atest.

Jedna lub więcej własności ustalona zgodnie z procedurą, zapewniającą spójność pomiarową z jednostką podstawową, w której ta własność jest wyrażona.

Każdej wartości certyfikowanej przypisana niepewność pomiarowa

Certyfikowane materiały odniesienia - CRM

Materiały odniesienia

Pierwszorzędowe, pierwotneO najwyższej wartości metrologicznej. Ich wartość jest ogólnie uznawana bez konieczności odniesienia do innych wzorców, ustalona przy pomocy metody bezwzględnej.

Drugorzędowe, wtórneO wartościach utworzonych przez porównanie z wzorcami pierwszorzędowymi.

Uznany umową międzynarodową za podstawę do przypisywania wartości innym wzorcom jednostki miary danej wielkości

Uznany urzędowo w danym kraju za podstawę do przypisywania wartości innym wzorcom jednostki miary danej wielkości

Wzorzec międzynarodowy

Wzorzec państwowy

Dziękuję za cierpliwość!