ΜΙΚΡΟΠΟΛΛΑΠΛΑΣΙΑΣΜΟΣ

ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ

ΠΟΛΛΑΠΛΑΣΙΑΣΜΟΣ in vitro

Ιστοκαλλιέργεια ή μικροπολλαπλασιασμός ή in vitroπολλαπλασιασμός ονομάζεται η τεχνική παραγωγής φυτικού υλικού από πολύ μικρά φυτικά τμήματα (έκφυτα, ιστούς ή κύτταρα), που προέρχονται από το μητρικό φυτό και αναπτύσσονται υπό ασηπτικές συνθήκες μέσα σε δοκιμαστικούς σωλήνες ή δοχεία. Στην ιστοκαλλιέργεια οι συνθήκες περιβάλλοντος και ανόργανης θρέψης ελέγχονται απόλυτα.

ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ Παραγωγή πολύ μεγάλου αριθμού πανομοιότυπων γενετικά φυτών.

Τα φυτά που παράγονται είναι απαλλαγμένα από ιώσεις και βακτήρια.

Δυνατότητα για διατήρηση γενετικού υλικού σε περιορισμένο χώρο.

Δυνατότητα πολλαπλασιασμού και διάσωσης απειλούμενων φυτών που επιζούν σε πολύ μικρό αριθμό.

ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ

Απαιτείται εξειδικευμένο προσωπικό.

Απαιτείται ακριβός εξοπλισμός.

Συχνές μολύνσεις εφόσον οι διαδικασίες αποστείρωσης και απολύμανσης δεν τηρούνται.

Η ιστοκαλλιέργεια περιλαμβάνει πέντε διεθνώς αναγνωρισμένα

στάδια:

Στάδιο 0: Επιλογή φυτικού υλικού (έκφυτα) και προετοιμασία εκφύτων.

Στάδιο 1: Εγκατάσταση της ασηπτικής καλλιέργειας.

Στάδιο 2: Σχηματισμός πολλαπλών βλαστών

Στάδιο 3: Ριζοβολία

Στάδιο 4: Μεταφύτευση-Σκληραγώγηση-Εγκλιματισμός

ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΜΙΚΡΟΠΟΛΛΑΠΛΑΣΙΑΣΜΟΥ

Η επιλογή των μητρικών φυτών που θα χρησιμοποιηθούν στον μικροπολλαπλασιασμό για λήψη εκφύτων έχει πρωταρχική σημασία, γιατί μόνο ένα φυτό με άριστα χαρακτηριστικά μπορεί να δώσει άριστα θυγατρικά φυτά όταν πολλαπλασιαστεί.

Γι’αυτό η επιλογή των μητρικών φυτών γίνεται σε πειραματικούς αγρούς.

Όταν είναι η κατάλληλη εποχή, τα υποψήφια φυτά εξετάζονται ως προς την κατάσταση της υγείας τους, την πιστότητα της ποικιλίας ή του υβριδίου που επιδιώκεται να αναπαραχθεί και την παραγωγικότητα.

Σε ορισμένες περιπτώσεις, εφόσον υπάρχει πρόβλημα με ασθένειες επιδιώκεται η παραγωγή υγιών θυγατρικών φυτών.

Τα φυτά που επιλέχθηκαν ως δότες υποβάλλονται σε θερμοθεραπεία πριν την λήψη των εκφύτων.

Στάδιο 0: Επιλογή φυτικού υλικού

ΘΕΡΜΟΘΕΡΑΠΕΙΑ Η έκθεση των φυτών σε υψηλές θερμοκρασίες μειώνει την συγκέντρωση των ιών ή τους

καθιστά ανενεργούς.

Συνίσταται στην έκθεση του μολυσμένου μητρικού φυτού σε περιβάλλον με θερμοκρασία 30-40ο C για χρονική περίοδο 6 έως 12 εβδομάδες, χρονικό διάστημα που εξαρτάται από το είδος του ιού.

Ο μηχανισμός εξυγίανσης έχει να κάνει με το γεγονός ότι εξαιτίας της υψηλής θερμοκρασίας καθυστερεί η διαδικασία “αναπαραγωγής” και διάδοσης των ιών στους νέους φυτικούς ιστούς.

Η απαλλαγή ολόκληρου του φυτού από τον ιό είναι αδύνατη.

Αυτό έχει ως αποτέλεσμα οι νεοσχηματιζόμενες βλαστικές κορυφές να ελευθερώνονται από την παρουσία των ιών.

Η λήψη αυτών των βλαστικών κορυφών και η καλλιέργεια τους in vitro παρέχει τη δυνατότητα δημιουργίας υγιών θυγατρικών φυτών.

Αμέσως μετά τη λήψη του, κάθε έκφυτο τοποθετείται σε ένα δοκιμαστικό σωλήνα που περιέχει το κατάλληλο υπόστρωμα ανάπτυξης.

Μετά από λίγες εβδομάδες το έκφυτο αποκτά μόνο βλαστούς.

Στο στάδιο αυτό ανάλογα µε το είδος, τα έκφυτα παραµένουν συνήθως από 4-8 εβδοµάδες.

Το χρησιμοποιούμενο σε αυτή τη φάση υπόστρωμα καλλιέργειας περιέχει κυτοκινίνες ή άλλους ειδικούς ρυθμιστές αύξησης που μπλοκάρουν την ανάπτυξη των ριζών, ώστε τα μασχαλιαία μάτια του να διεγερθούν και να σχηματίσουν επιπλέον βλαστούς (αναβλαστήματα).

Κατά μέσο όρο από κάθε βλαστό λαμβάνονται 5-20 αναβλαστήματα τα οποία, αν μεταφυτευθούν ξανά σε άλλα γυάλινα δοχεία με το ίδιο υπόστρωμα, σε διάστημα 2-4 εβδομάδων δίνουν νέους βλαστούς με τον ίδιο ρυθμό.

Θεωρητικά με τον τρόπο αυτό μπορούν να παραχθούν μέχρι και 1.000.000 νέα φυτά σε ένα χρόνο.

Η παραμονή όμως των αναβλαστημάτων μέσα στα γυάλινα δοχεία με το υπόστρωμα δεν είναι δυνατή για διάστημα μεγαλύτερο των δύο μηνών. Πέρα από αυτό το χρονικό όριο οι βλαστοί μαραίνονται και καταστρέφονται. Εκτός αυτού, οι διαδοχικοί πολλαπλασιασμοί πολλαπλασιάζουν και τον κίνδυνο εμφάνισης και αναπαραγωγής κάποιας γενετικής μεταλλαγής.

Γι΄ αυτό στην πράξη γίνονται μόνο 3-4 διαδοχικοί πολλαπλασιασμοί, οπότε από κάθε μερίστωμα (έκφυτο) λαμβάνονται 100-200 βλαστοί.

Στάδιο 2: Σχηματισμός πολλαπλών βλαστών

Όταν από ένα έκφυτο παραχθεί ο επιθυμητος αριθμός βλαστών, ακολουθεί η φάση του σχηματισμού ριζών.

Κάθε ένας από τους βλαστούς που έχουν παραχθεί στο προηγούμενο στάδιο μεταφέρεται σε νέο αποστειρωμένο δοχείο που περιέχει διαφορετικό υπόστρωμα καλλιέργειας, ειδικό για τη διέγερση του σχηματισμού ριζών.

Στα υποστρώματα αυτού του σταδίου του μικροπολλαπλασιασμού για την διέγερση του σχηματισμού ριζών χρησιμοποιούνται αυξίνες και/ή γιββερελλίνες.

Τα αναβλαστήματα χρειάζονται μερικές εβδομάδες μέχρι να ολοκληρώσουν την ριζοβολία και να μοιάζουν με κανονικά φυτά, μολονότι το μεγεθός τους παραμένει πολύ μικρό.

Στάδιο 3: Ριζοβολία

Στάδιο 4: Μεταφύτευση-Σκληραγώγηση-Εγκλιματισμός

Αφού ολοκληρωθεί η ριζοβολία, τα νέα φυτά από τα γυάλινα δοχεία μεταφέρονται σε μικρά ατομικά δοχεία ανάπτυξης γεμισμένα με εδαφικό υπόστρωμα (συνήθως χρησιμοποιείται μείγμα τύρφης με περλίτη) και στη συνέχεια ακολουθεί η μεταφορά τους στο θερμοκήπιο με στόχο να εγκλιματισθούν.

Τα φυτάρια διατηρούνται για 30 - 40 ημέρες στο θερμοκήπιο προκειμένου να εξοικειωθούν στις συνθήκες του περιβάλλοντος και να αναπτυχθούν αρκετά, ώστε να είναι έτοιμα για μεταφύτευση στο φυσικό έδαφος.

Η περίοδος του εγκλιματισμού είναι πολύ κρίσιμη για τα φυτά.

Πρέπει να εγκλιματιστούν –προσαρμοστούν στα εξής:

Από τη φάση της ετεροτροφίας στη φάση της αυτοτροφίας

Επιβίωση σε συνθήκες φυσιολογικής ατμοσφαιρικής υγρασίας

Εκμάθηση του μηχανισμού ανοιγοκλεισίματος των στοματίων

ΣΥΝΘΗΚΕΣ in vitro ΕΓΚΛΙΜΑΤΙΣΜΟΣ

Ο φωτισμός, που εξασφαλίζεται κυρίως από λαμπτήρες φθορισμού, έχει πολύ μικρότερη ένταση από την ηλιακή ακτινοβολία.

Ο αερισμός των καλλιεργειών in vitro είναι εξαιρετικά περιορισμένος αφού τα φυτά αναπτύσσονται σε κλειστά δοχεία όπου η ανταλλαγή αερίων πραγματοποιείται με βραδείς ρυθμούς μέσα από την ημιπερατή μεμβράνη σφράγισης.

Η βραδεία ανταλλαγή αερίων συντελεί στον υπερκορεσμό του εσωτερικού του δοχείου καλλιέργειας με υδρατμούς με αποτέλεσμα η σχετική υγρασία να υπερβαίνει το 95%, ενώ μειώνεται και η συγκέντρωση του CO2 στο δοχείο.

Η θερμοκρασία επώασης των in vitro καλλιεργειών διατηρείται σε σταθερά επίπεδα καθ’ όλη τη διάρκεια του εικοσιτετραώρου. Αυτό έχει ιδιαίτερες συνέπειες στην προώθηση της ριζοβολίας και την ανάπτυξη σωστά διαμορφωμένου ριζικού συστήματος.

Συνθήκες σκότους στο ριζικό συστημα.

Το θρεπτικό υπόστρωμα ανάπτυξης των in vitro καλλιεργειών είναι πλούσιο σε πηγές ενέργεια και άνθρακα, όπως είναι η σακχαρόζη. Αντίθετα στη φύση τα φυτά φωτοσυνθέτοντας κατασκευάζουν τις δικές τους πηγές.

Τα στομάτια ανοίγουν όταν το φυτό έχει επάρκεια νερού και κλείνουν όταν το νερό είναι περιορισμένο.

Το υπόστρωμα της ιστοκαλλιέργειας αποτελείται από διάφορα υλικά, τα οποία περιέχουν απαραίτητα στοιχεία για την ανάπτυξη των εκφύτων. Ουσιαστικά λοιπόν το υπόστρωμα δεν είναι τίποτε άλλο παρά μια συνταγή.

Για την παρασκευή του υποστρώματος χρησιμοποιούνται διάφορες μέθοδοι.

Υπάρχει λοιπόν η δυνατότητα να:

Παρασκευαστεί το υπόστρωμα προσθέτοντας ένα ένα τα υλικά που

απαιτούνται .

Να παρασκευαστούν πυκνά διαλύματα από μίγματα διαφόρων ενώσεων και να τα αναμιγνύονται κάθε φορά με συγκεκριμένη αναλογία ώστε να επιτευχθεί το τελικό υπόστρωμα

Να χρησιμοποιηθεί έτοιμο υπόστρωμα σε σκόνη και να διαλύεται κάθε φορά σε συγκεκριμένο όγκο νερού ώστε να παρασκευάζεται το τελικό υπόστρωμα. Η συγκεκριμένη τεχνική είναι αυτή που χρησιμοποιείται ευρέως για την παρασκευή υποστρωμάτων σε εργαστήρια παραγωγής πολλαπλασιαστικού υλικού.

ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΑ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ

Το θρεπτικό μέσο μιας καλλιέργειας αποτελείται κυρίως από:

1. Ανόργανα άλατα, δηλαδή μακροστοιχεία και ιχνοστοιχεία

2. Σύνθετα οργανικά συστατικά, κυρίως βιταμίνες

3. Ρυθμιστικές ουσίες ανάπτυξης, όπως οι φυτοορμόνες

4. Πηγές άνθρακα και ενέργειας, συνήθως υδατάνθρακες

5. Στερεοποιητικό παράγοντα, όπως το άγαρ

6. Νερό

Τέλος, η οξύτητα του μέσου ρυθμίζεται σε μια ορισμένη τιμή. Για συνήθεις εφαρμογές το pH του υποστρώματος πρέπει να είναι 5,6-5,8.

Απαραίτητη η χρήση υδροχλωρικού οξέος (HCl ) για μείωση τιμών pH

και καυστικού νατρίου (NaOH) για αύξηση τιμών pH.

ΕΤΟΙΜΑ ΣΚΕΥΑΣΜΑΤΑ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΩΝ ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ

Οι περισσότεροι φυτικοί ιστοί αναπτύσσονται καλύτερα σε πλούσια θρεπτικά διαλύματα όπως είναι αυτό των Murashige και Skoog (MS).

Μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί το κλασικό, πλούσιο υπόστρωμα MS με τη συγκέντρωση των ανόργανων στοιχείων μειωμένη στο 50% (1/2 ΜS) ή στο 25% (1/4 MS).

Επίσης έχουν αναπτυχθεί θρεπτικά μέσα κατάλληλα για την ιστοκαλλιέργεια ειδικών κατηγοριών φυτών, όπως ορισμένων ξυλωδών φυτών με ευαισθησία σε κάποια συστατικά υποστρωμάτων (Υπόστρωμα Ξυλωδών Φυτών –Woody Plant Medium/WPM)

Κατηγορίες ρυθμιστών αύξησης:

Οι ρυθμιστές αύξησης διακρίνονται στους παρακάτω :

Αυξίνες (auxins)

Κυτοκινίνες (cytokinins)

Γιββερελλίνες (gibberellins)

Αναλόγως του σταδίου της ιστοκαλλιέργειας χρησιμοποιούνται και οι αντίστοιχοι ρυθμιστές αύξησης.

Σάκχαρα

Τα καλλιεργούμενα κύτταρα, τουλάχιστον στην αρχική φάση της ιστοκαλλιέργειας, δεν έχουν την ικανότητα να φωτοσυνθέτουν (είναι δηλαδή ετερότροφα).

Δεν μπορούν να αφομοιώσουν το διοξείδιο του άνθρακα και να παράγουν υδατάνθρακες τους οποίους χρησιμοποιούν ως πηγή ενέργειας και άνθρακα.

Η προσθήκη υδατανθράκων κρίνεται απαραίτητη.

Ως κύρια πηγή υδατανθράκων χρησιμοποιείται η σακχαρόζη.

Η εκλογή του κατάλληλου σακχάρου, όπως και η κατάλληλη συγκέντρωσή του στο διάλυμα εξαρτώνται από τον φυτικό ιστό που καλλιεργείται και από τον σκοπό του πειράματος.

Βιταμίνες

Οι ιστοί που καλλιεργούνται in vitro στερούνται της ικανότητας σύνθεσης βιταμινών

Η προσθήκη αυτών στο μέσο καλλιέργειας κρίνεται απαραίτητη.

θειαμίνη (βιταμίνη Β1 ή thiamine-HCl)

νικοτινικό οξύ (nicotinic acid)

πυριδοξίνη (pyridoxine-HCl ή βιταμίνη Β6).

Στερεοποιητικοί παράγοντες

Η ανάπτυξη των ιστών που καλλιεργούνται μπορεί να πραγματοποιηθεί σε υγρό υπόστρωμα ή σε στερεό υπόστρωμα.

Για την στερεοποίηση του μέσου καλλιέργειας χρησιμοποιούνται διάφορες ουσίες φυσικής ή τεχνητής προέλευσης, οι στερεοποιητές.

Κύριος στερεοποιητής, φυσικής προέλευσης είναι το άγαρ-άγαρ (agar)

Η χρήση του άγαρ προτιμάται έναντι των άλλων στερεοποιητών λόγω των πλεονεκτημάτων που παρουσιάζει.

1. Δεν αντιδρά με τα συστατικά του μέσου καλλιέργειας

2. Δεν προσβάλλεται από τα ένζυμα που εκκρίνουν τα φυτά.

(Phytagel , Gerlite, Sea plaque, ζελατίνη)

Τα στάδια παρασκευής του 1000 ml υποστρώµατος MS

1. Προσθέτουµε 900 ml νερό σε ένα ποτήρι ζέσεως

2. Καθ’ όλη αυτή τη διάρκεια το υπόστρωµα θερµαίνεται και αναδεύεται ταυτόχρονα προς διάλυση των ενώσεων και οµογενοποίηση του διαλύματος.

3. Προσθέτουµε τις απαραίτητες ενώσεις, όπως αυτές υπαγορεύονται από το υπόστρωµά µας ή 4.400 gr MS /lt

4. Προσθέτουµε την πηγή άνθρακα (ζάχαρη) 40 gr

5. Προσθέτουμε βιταμίνη (myo inosytol) 0,1000gr

6. Προσθέτονται οι απαραίτητες φυτορυθµιστικές ουσίες (αυτό μόνον εφόσον οι φυτορυθµιστικές αυτές ουσίες μπορούν να αποστειρωθούν χωρίς να καταστραφούν, πληροφορία που τη βρίσκουμε στη βιβλιογραφία).

7. Ογκοµετρούµε το υπόστρωμα έως τα 1000ml

8. Ρυθμίζουμε το pH του υποστρώματος στην επιθυμητή τιµή 5.75

9. Χωρίζουμε το υπόστρωμα σε δύο φιάλες του 1lit (500+500)

10. Προσθέτουμε το άγαρ 3gr, (1,5 gr/φιάλη)

Ακολούθως το υπόστρωμα τοποθετείται στο αυτόκαυστο για αποστείρωση.

Αποστείρωση θρεπτικού υποστρώματος και εργαστηριακού εξοπλισμού

Η αποστείρωση του θρεπτικού υποστρώματος γίνεται συνήθως με τη συνδυασμένη εφαρμογή υψηλής θερμοκρασίας και πίεσης 121°C και 1,2-1,5 Atm.

Οι συνθήκες αυτές αναπαράγονται μέσα στο αυτόκαυστο.

Το αυτόκαυστο δεν είναι τίποτα περισσότερο από έναν κύλινδρο από ανοξείδωτο χάλυβα ο οποίος πληρούται στη βάση του με νερό.

Όταν κλειστεί ερμητικά και αναπτυχθεί στο εσωτερικό του θερμοκρασία ανώτερη των 100°C (με τη βοήθεια μιας αντίστασης), το νερό βράζει και ο παραγόμενος ατμός συμπιέζεται στον ερμητικά κλεισμένο κλίβανο μέχρις ότου επιτευχθεί η κατάλληλη πίεση.

Η αποστείρωση δεν ξεπερνά τα 20 με 30 λεπτά της ώρας (min).

Η αποστείρωση όλων των γυάλινων και μεταλλικών σκευών γίνεται στο αυτόκαυστο σε θερμοκρασία 121°C και πίεση 1,2Atm για 20 λεπτά (υγρή αποστείρωση).

Όσον αφορά τα πλαστικά τρυβλία, αυτά συνήθως είναι θερμοευαίσθητα και επομένως δεν είναι αποστειρώσιμα στο αυτόκαυστο.

ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΕΚΦΥΤΟΥ ΚΑΙ ΕΜΦΥΤΕΥΣΗ ΥΠΟ ΑΣΗΠΤΙΚΕΣ ΣΥΝΘΗΚΕΣ

Απολύμανση του φυτικού υλικού

Η δυσκολία της απολύμανσης του φυτικού υλικού οφείλεται κυρίως στην καταστροφή των ιστών του.

Περισσότερη δυσκολία παρουσιάζουν μέρη του φυτού τα οποία βρίσκονται στο έδαφος όπου οι παθογόνοι μικροοργανισμοί είναι άφθονοι (ρίζες, ριζώματα, βολβοί, κόνδυλοι, υπόγειοι βλαστοί).

Μέρη τα οποία είναι λιγότερο ευάλωτα σε μικροβιακές προσβολές, όπως τα υπέργεια μεριστώματα και οι βλαστικές κορυφές, δεν παρουσιάζουν ιδιαίτερα προβλήματα στην απολύμανσή τους.

Ο συνήθης τρόπος απολύμανσης είναι η εμβάπτιση των εκφύτων σε χαμηλής συγκέντρωσης διάλυμα υποχλωριώδους νατρίου 10-15%, για μερικά λεπτά (10 έως 20).

Στη συνέχεια ξεπλένονται με αποστειρωμένο νερό (τουλάχιστον 3-4 φορές) και εμφυτεύονται . Πρέπει να σημειωθεί ότι το πρωτόκολλο απολύμανσης εξειδικεύεται για κάθε περίπτωση (είδος εκφύτου, φυτικό είδος, κ.λπ.). Αυτό είναι εφικτό μόνο μετά από σχετικό πειραματισμό.

Ιδιαίτερη προσοχή πρέπει να δίνεται στην αποφυγή τοξικότητας λόγω απολύμανσης, τόσο με χρήση του κατάλληλου χρόνου επίδρασης του απολυμαντικού (ο οποίος δεν θα πρέπει να υπερβαίνει τα μέγιστα επιτρεπτά όρια) όσο και με την απομάκρυνση του απολυμαντικού διαλύματος μετά την ολοκλήρωση της διαδικασίας απολύμανσης με επαναλαμβανόμενο ξέπλυμα του εκφύτου σε αποστειρωμένο νερό (αυτόκαυστο).

Αποστείρωση χώρων εμφύτευσης

Για την εμφύτευση των ιστών χρειάζεται όσο το δυνατόν περισσότερο ασηπτικό περιβάλλον. Απαραίτητος ο θάλαμος νηματικής ροής αέρα.

Ο θάλαμος αποτελείται από συστοιχία δύο φίλτρων μέσα από τα οποία εισάγεται υπό πίεση ο αέρας του περιβάλλοντος χώρου. Λόγω της μικρής διατομής των φίλτρων και της νηματικής ροής που επιτυγχάνεται (χάρη στην οποία αποφεύγονται οι στροβιλισμοί και η ανάδευση των στρωμάτων του αέρα), η ατμόσφαιρα του θαλάμου παραμένει καθαρή από σωματίδια και μικροοργανισμούς σε ποσοστό 99,9999%.

Πριν από οποιαδήποτε εργασία, γίνεται απολύμανση του γύρω από τον θάλαμο χώρου με υποχλωριώδες ασβέστιο (χλωρίνη) και στη συνέχεια απολύμανση όλων των επιφανειών του θαλάμου, εξωτερικών και εσωτερικών με αλκοόλη 95% (ο/ο).

Στην συνέχεια, τοποθετούνται μέσα στον θάλαμο όλα τα απαραίτητα υλικά και σκεύη όπως οι λαβίδες, τα νυστέρια, ένα ποτήρι με αλκοόλη για την απολύμανση των εργαλείων κατά τη διάρκεια της εμφύτευσης, ποτήρια ζέσης με αποστειρωμένο νερό, δοχεία καλλιέργειας με το θρεπτικό υπόστρωμα αποστειρωμένο και συσκευή υψηλής θερμότητας για αποστείρωση των εργαλείων κατά τη διάρκεια της εμφύτευσης

Στη συνέχεια γίνεται αποστείρωση του θαλάμου και των σκευών και υλικών με υπεριώδη ακτινοβολία (UV light) για 30 λεπτά.

Η εργασία στον θάλαμο αρχίζει εφόσον περάσουν άλλα 30 λεπτά από τη στιγμή που θα σταματήσει η υπεριώδης ακτινοβολία. Αυτό συμβαίνει επειδή η υπεριώδης ακτινοβολία αντιδρά με το ατμοσφαιρικό οξυγόνο παράγοντας όζον, το οποίο, αν και απολύτως αναγκαίο στα ανώτερα επίπεδα της ατμόσφαιρας, είναι τοξικό όταν το αναπνεύσουμε (δρα ως ελεύθερο ριζικό).

Θεωρητικά ένα φυτικό κύτταρο πολλαπλασιαζόμενο μπορεί να δώσει ένα ολόκληρο φυτό ανεξάρτητα αν το κύτταρο αυτό έχει προέλθει από το φύλλο, τον βλαστό, τη ρίζα, τον οφθαλμό, κ.λπ.

Το φαινόμενο αυτό ονομάζεται ολοδυναμία (totipotency).

Ο μικροπολλαπλασιασμός αποτελεί τη σπουδαιότερη εφαρμογή της ολοδυναμίας στη γεωπονική πράξη, καθώς επιτρέπει την αναπαραγωγή ενός ολόκληρου φυτού από δυνητικά κάθε κύτταρο κάθε φυτικού τμήματος, όσο μικρό και αν είναι αυτό.

Η επιφάνεια αυτή είναι ένας ιστός, δηλαδή μια ομάδα κυττάρων με εξειδικευμένη λειτουργία, όπως φύλλο, ρίζα κ.λπ. Όταν εισάγεται στην ιστοκαλλιέργεια, ο ιστός αυτός ονομάζεται έκφυτο .

ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗ ΚΥΤΑΡΩΝ

Όταν ενεργοποιηθούν πολλά γονίδια μέσα στο ίδιο φυτικό κύτταρο, αυτό εισέρχεται σε φάση αποδιαφοροποίησης δηλαδή χάνει τον εξειδικευμένο χαρακτήρα του και μετατρέπεται σε ένα κύτταρο χωρίς συγκεκριμένη λειτουργία. Στους ζωικούς οργανισμούς η αντίστοιχη διαδικασία οδηγεί συνήθως στη μετατροπή ενός φυσιολογικού κυττάρου σε καρκινικό.

Το σύνολο των φυτικών κυττάρων τα οποία έχουν αποδιαφοροποιηθεί σχηματίζουν μια μορφολογικά διακριτή μάζα, η οποία είναι γνωστή με το όνομα κάλος .

Ο κάλος σχηματίζεται πάντα πάνω σε στερεό υπόστρωμα καλλιέργειας, δηλαδή ένα θρεπτικό μέσο το οποίο έχει στερεοποιηθεί με τη βοήθεια ενός πηκτικού παράγοντα (σαν ένα ζελέ-άγαρ).

Κάτω από την επίδραση συγκεκριμένων ερεθισμάτων, όπως για παράδειγμα την προσθήκη χημικών ουσιών, τα κύτταρα που καλλιεργούνται in vitro μπορούν να αποκτήσουν μια συγκεκριμένη δομή και λειτουργία η οποία μπορεί να διαφέρει εντελώς από την αρχική τους δομή.

Η διαδικασία αυτή ονομάζεται γενικά διαφοροποίηση in vitro.

Άρα τα αποδιαφοροποιημένα κύτταρα αρχίσουν να διαφοροποιούνται ξανά σε καταβολές που επιθυμούνται κατά περίπτωση.

Η διαφοροποίηση in vitro μπορεί να ακολουθήσει δύο διακριτά μορφολογικά μονοπάτια, της οργανογένεσης ή της σωματικής εμβρυογένεσης.

Όπως φαίνεται και στο παρακάτω σχήμα κάθε μια από τις διαδικασίες αυτές μπορεί να συμβεί άμεσα δηλαδή πάνω στα καλλιεργούμενα έκφυτα ή έμμεσα αφού δηλαδή προηγηθεί η αποδιαφοροποίηση και ο σχηματισμός κάλου.

ΟΛΟΔΥΝΑΜΙΑ ΚΥΤΤΑΡΟΥ

ΕΚΦΥΤΟ (ομάδα κυττάρων που εισάγονται για ιστοκαλλιέργεια)

ΑΠΟΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗ (χάνουν τα κύτταρα τον εξειδικευμένο χαρακτήρα τους και

μετατρέπονται σε κύτταρα χωρίς συγκεκριμένη λειτουργία)

ΚΑΛΛΟΣ

ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗ ΣΕ ΚΑΤΑΒΟΛΕΣ ΠΟΥ ΕΠΙΘΥΜΟΥΝΤΑΙ

ΟΡΓΑΝΟΓΕΝΕΣΗ

(βλαστοί, φύλλα, οφθαλμοί κλπ.)

ΣΩΜΑΤΙΚΗ

ΕΜΒΡΥΟΓΕΝΕΣΗ (εμβρυακές δομές χωρίς να έχει

προηγηθεί γονιμοποίηση)

ΕΜΜΕΣΑ(προηγείται η

δημιουργία κάλλου)

ΑΜΕΣΑ(κατευθείαν πάνω

στα καλλιεργούμενα

έκφυτα)

ΕΜΜΕΣΑ (προηγείται η

δημιουργία κάλλου)

ΑΜΕΣΑ (κατευθείαν πάνω στα

καλλιεργούμενα

έκφυτα)