Próba wyjaśnienia przyczyny niepowodzeń w ustaleniu

swoistości autoprzeciwciał przeciwjądrowychw surowicach ANA-dodatnich w oparciu

o analizę poszczególnych swoistości przeciwciałowych obecnych w KKI.

Jakub Ząbek, Agnieszka Palacz, Iwona Horbacz, Joanna PykaZakład Mikrobiologii i Serologii Instytutu Reumatologii

Warszawa

Autoprzeciwciała występujące w układowych chorobach tkanki łącznej

AUTOPRZECIWCIAŁA:

• Czynniki reumatoidalne• Przeciwciała skierowane przeciwko antygenom jądrowym

(ANA) i antygenom związanym strukturalnie lub funkcjonalnie z nimi

• Przeciwciała przeciwko fosfolipidom• Przeciwciała przeciwko składnikom tkanki łącznej i innych

tkanek gospodarza oraz białkom cytoszkieletu• Przeciwciała przeciwko antygenom bakterii, wirusów oraz

pasożytów

Oznaczenie obecności oraz mian i/lub poziomów wyżej opisanych autoprzeciwciał przeciwko

antygenom komórkowym wykonuje się zasadniczo z czterech następujących powodów:

• obecność autoprzeciwciał może być patognomoniczna dla danej choroby,

• miano niektórych autoprzeciwciał odzwierciedla aktywność procesu chorobowego,

• obecność danego autoprzeciwciała koreluje z określonymi objawami klinicznymi,

• autoprzeciwciała są inhibitorami enzymów istotnych dla funkcjonowania komórki.

Częstość występowania oraz swoistość wybranych autoprzeciwciał “markerowych”

w układowych chorobach tkanki łącznej*

wysoka60%anty-NuHi

niska20%anty-SSB /La/

niska30%anty-SSA /Ro/

niska30%anty-U1 RNP

niska70%anty-histonowe

>95%3%anty-PCNA

>95%10%anty-rybosomalne białko P

>95%15%anty-Sm

>90%70%anty-dsDNA

niska95%dodatnie ANASLE

Swoistość /dla danego schorzenia/

Częstość występowania /w danym schorzeniuAutoprzeciwciałoJednostka chorobowa

niska40%anty-U1 RNP

wysoka25%anty-Jo-I

umiarkowana20%dodatnia cytoplazma

niska40%dodatnie ANAZespół nakładania zapalenia wielo-/skórno-mięśniowego

>85%15%anty-jąderkowe

>90%15%anty-Scl-70

>90%40%anty-centromerowe

niska90%dodatnie ANASkleroderma

wysoka60%anty-α-Fodryna

niska70%IgM RF

umiarkowana70%IgA RF

umiarkowana70%anty-SSB /La/

umiarkowana80%anty-SSA /Ro/

niska80%dodatnie ANAZespół Sjögrena

>95%>90%anty-U1 RNP

niska>95%dodatnie ANAMCTD

umiarkowana80%MPO-ANCA

umiarkowana80%anty-histonowe

niska>90%dodatnie ANAToczeń polekowy

wysoka~ 30%anty-CCP

umiarkowana15%GS-ANA

umiarkowana15 – 30%IgM RF

umiarkowana60%anty-histonowe

umiarkowana70%dodatnie ANAMIZS

niska40%anty-histonowe

umiarkowana50%GS-ANA

wysoka40-60%anty-CCP

umiarkowana70%IgA RF

niska75%IgM RF

niska50%dodatnie ANARzs

umiarkowana100%anty-kardiolipinoweZespół antyfosfolipidowy

*Dane pochodzą z opracowania Statens Seruminstitut /Kopenhaga, Dania/ zalecanego przez European Consensus Finding Study i mogą nieznacznie różnić się od danych w tekście /pochodzących z konkretnych cytowanych prac/

Przeciwciała wykrywane w układowych chorobach tkanki łącznej

! Metody immunofluorescencyjne

Metody immunoprecypitacyjne

Odczyny immunoaglutynacyjne

● Metody immunoenzymatyczne

● Metody nefelometryczne

Przyczyny niepowodzeń

1. Typ testu (czułość testu)2. Skład antygenowy testu3. Antygeny rekombinantowe4. Natura antygenu /podfrakcje/5. Wieloswoistość surowic6. Normy7. Kompleksy immunologiczne

– – – – – – – – – – – – – – – – –8. Wiek pacjenta

Porównanie częstości identyfikacji określonej swoistości ANA w grupie 76 surowic uzyskanych od pacjentów

z układowymi chorobami tkanki łącznej

0

20

40

60

80

100

Czę

sto

ść

/%/ i

de

nty

fik

ac

ji s

wo

isto

śc

i

1/80ANA (-)

1/80ANA (+)

1/160ANA (+)

1/320 i >ANA (+)

Kaskadowa metoda oznaczania swoistości przeciwciał ANA

Kompleksemia występująca w surowicach pacjentów z układowymi chorobami tkanki łącznej jest zwykle skojarzona z fazami zaostrzenia procesu podstawowego, jak ma miejsce w TRU, gdzie towarzyszy hipokomplementemii, podwyższeniu wskaźników ostrej fazy i wskaźników aktywności choroby oraz zmianom poziomów i awidności autoprzeciwciał.

Mało uwagi poświęca się temu, że procesowi zaostrzenia choroby zwykle towarzyszyć mogą dwa zjawiska, pierwsze to wyrzut z zajętych narządów/tkanek do krążenia autoantygenów, drugie to związanie autoprzeciwciał krążących w KKI.

Pierwszy fenomen jest niedocenianym na ogół wskaźnikiem aktywnego procesu destrukcji narządów/tkanek, a drugi prowadzi do neutralizacji krążących autoprzeciwciał i obniżenia ich mian w surowicach.

Celem pracy była analiza KKI pod kątem

ewentualnej obecności autoprzeciwciał markerowych

trudnych diagnostycznie surowicach ANA-dodatnich,

w których klasycznymi metodami stosowanymi

w serodiagnostyce autoprzeciwciał nie udało się ustalić

swoistości przeciwciał ANA.

Materiał i metody

Badania przeprowadzono na grupie 588 surowic

skierowanych do Zakładu Mikrobiologii i Serologii IR

w celu oznaczenia miana i typu ANA oraz ustalenia

swoistości ANA. Surowice pochodziły z klinik

i Polikliniki IR.

Materiał i metody

W surowicach oznaczano następujące parametry:·miano i typ świecenia ANA metodą IIF na slajdach z utrwalonymi komórkami Hep-2 (firmy Euroimmun, Niemcy) oraz metodą „Colorzyme” (firmy Immunovision, USA),

·poziomy autoprzeciwciał (w zależności od typu świecenia ANA metodami ELISA i Western-blotting na teście ANA-ENA RecomLine firmy Biomedica-Poland Sp. z o.o.),

·poziom KKI metodą immunoenzymatyczną (C1q – CIC kit) firmy Quidel (USA),

·frakcję wzbogaconą w KKI uzyskiwano metodą wytrącania glikolem polietylowym o ciężarze cząsteczkowym 6000 (PEG-6000) wg Świerczyńskiej i wsp.

·frakcję γ z osadów PEG-6000 uzyskiwano przez wytrącanie nasyconego siarczanu amonu w pH 3,5 (stosowanym do dysocjacji KKI) wg metody własnej,

·białko we frakcji γ i osadach PEG-6000 oznaczano spektrofotometrycznie metodą wg Kalckara.

Wyniki

Odsetek surowic ANA+ / autoprzeciwiała (-)

5-15% (11,7%)

n=588

n=69

Wyniki

Odsetek surowic ANA+ / autoprzeciwiała (-), gdzie w osadach PEG znaleziono autoprzeciwciała

84%

n=69

84%

16%

Porównanie typów „świecenia” w met.IIF z surowic(1a,2a) i osadów PEG(1b,2b)

Przykłady swoistości autoprzeciwciał znalezionych w surowicach i osadach PEG metodą Western-blott

Struktura KKI

Wybrany przykład neutralizacji surowicami anty-Fc i Fab swoistości przeciwciał

występujących w osadach PEG

A B C

A - pasek inkubowany z osadem PEG-6000 B - pasek inkubowany z osadem PEG-6000 traktowanym surowicą antyF(ab2)

C - pasek inkubowany z osadem PEG-6000 traktowanym surowicą anty-Fc

Szczegółowa analiza składu KKI na podstawie neutralizacji

swoistości surowicami anty-Fc i anty-(Fab2)

Lp. pacjent

Swoistości oznaczane metodą Western blotting w wybranych surowicach oraz w osadach PEG

Surowica osady PEG-6000

ANAtypowanie swoistości

Kontrola*+sur.

antyFab*+sur.antyFc*

mianotyp

świecenia

1 KS 1/5120 plamisty anty Hp-śladantyRo+

antyHp++ antyDNA+

antyRo ślad antyHp ++

antyDNA słaby+

antyRo + antyHp++

antyDNA+

2 JZ 1/640 plamistyantyRo +/- antyHp

ślad

antyRo-60 +/- antyRo-52 +

+/- +/-

Ślad+

3 WK 1/640homogenno-

plamistyantyHp +/-

antyRo+ antyHp+ antyDNA+

ślad - -

ślad -

ślad

4 GO 1/1280 plamisty antyHp +/-antyHp+

antyDNA+/-+

-+

+/-

5 FO 1/320homogenno-

plamistyantySmB +/-

antySmB++ antySmD ślad

++ ślad

++ ślad

6 RL 1/320homogenno-

plamisty(-)

antyHp słaby + antyDNA słaby +

+ słaby+

++ +

7 PK 1/640 plamisty antyRo śladantyRo+/- antyHp+++ antyDNA+

ślad + ślad

+ ++

słaby+

Autorzy chcą także ustalić, czy pojawienie się

aktywności przeciwciałowej po precypitacji glikolem

polietylenowym o masie cząsteczkowej 6000 Daltonów jest

efektem prostego zgęszczenia frakcji KKI po wytrąceniu

glikolem czy też mamy do czynienia ze zmianą konformacji

poszczególnych białek wchodzących w skład KKI

– będzie to przedmiotem dalszych badań

w Zakładzie Mikrobiologii i Serologii.

Autorzy w przedstawionej pracy zaproponowali nowe metodyczne podejście do analizy surowic ANA-pozytywnych, w których nie udaje się standardowymi metodami ustalić swoistości autoprzeciwciał.

Zaproponowana metoda polega na analizie swoistości autoprzeciwciał nie w surowicy pełnej, ale w osadach po PEG-6000 (czy ewentualnie frakcjach γ z tego osadu), który zawiera obok innych makroglobulin surowiczych, także zgęszczoną frakcję KKI.

Stosując tę metodę udało się ustalić swoistość przeciwciał występujących w KKI w 84% surowic ANA(+), w których metodą standardową nie udaje się tego dokonać.

Autorzy mają nadzieję, że opracowane przez nich podejście, po niezbędnych dla celów rutynowej diagnostyki przeciwciał uproszczeniach, znajdzie zastosowanie w serodiagnostyce autoprzeciwciał markerowych, i to nie tylko w układowych chorobach tkanki łącznej.

DziękujęDziękuję za uwagę za uwagę