Drielly Cristina Braite

Gabriella Borba

Lívia B. Eslabão

Luiza P. Rodrigues

Tatiane Casarin

Ferramentas mais rápidas e mais sensíveis, de base

molecular, são de grande valor.

A extração e a purificação de ácidos nucléicos são

pontos fundamentais no diagnóstico baseado em

técnicas moleculares.

Amplificação in vitro de uma seqüência específica

de DNA.

Variação do PCR onde a reação de

amplificação é iniciada a temperaturas

elevadas

A atividade da Taq DNA polimerase é inibida

durante a preparação da reação evitando a

amplificação de produtos inespecíficos,

melhorando o rendimento da reação.

Baixa Especificidade(mispriming)

Mix de reação completo (20 a 25 oC)

Transferir para termociclador

Ciclos

Produto amplificado

Mix de reação completo (20 a 25 oC)

Transferir para termociclador (desnaturação 100 oCe manter a 80 oC)

Adicionar Taq polimerase

Produto amplificado

Trabalho intensivo;

Manual: Maior risco de contaminação.

Enzima atua em Temperatura IDEAL

Permite a inibição da atividade da

polimerase durante a preparação da reação –

AmpliTaqGold.

Aumenta: Especificidade, Sensibilidade e

Rentabilidade do produto.

Medicina Forense – Determinação da CAUSA

da morte.

Gentilmente vortex e centrifugar brevemente

todas as soluções após o descongelamento.

Coloque em tubo de PCR :

10X TrueStart Hot Start Taq buffer - 5 μl

dNTP Mix, 2 mM de cada - 5 microlitro

25 mM MgCl2 - 1,2 μl

Encaminhar primer - 0,1-1 mM

Reverse primer - 0,1-1 mM

TrueStart Hot Start Taq DNA polimerase - 0,25-2 u

Água, livre de nuclease – completar volume

O volume total - 50 μl

Gentilmente vórtice das amostras e girar para

recolher gotas.

Condições térmicas e tempo recomendado para cada

etapa da reação:

Etapa Temperatura, °C Tempo, min Número de Ciclos

Desnaturação inicial / Ativação Enzimática 95

1-2 1

Desnaturação 95 0,5-1

Recozimento TM-5 0,5-1 30

Extensão 72 1 min / kb

Final de Extensão 72 5-15 1

AmpliTaq Gold

enzima recombinante

forma inativada –

ativação 10 min 94oC

Platinum Taq Polymerase

ligação com inibidor

termolábil contendo

anticorpo monoclonal

Anticorpo Invitrogen™ Platinum™ Taq

Polipeptídio Eppendorf HotMaster™ Taq

Modificação Química

Roche FastStart TaqABgene ABgene THERMO-START ® DNA polimeraseStratagene SureStart ™ TaqSABiosciences ReactionReady™ HotStart "Sweet" PCR master mix

A reação de PCR é ativada quando a temperatura

atinge 94ºC;

Especificidade uma vez em que a Taq DNA

Polimerase é ativada quando atinge

temperatura IDEAL

Barreira física Cera - atua como cápsula;

Ligante Inibição Taq DNA Polimerase por

Anticorpo e Oligonucleotídeos;

Manual Enzima é excluída da mistura e

adicionada em Tº Ideal (RISCO: Contaminação

cruzada).

Modificação química da Polimerase (Ex.

TrueHotStart).

HOT START PCR

Aumenta a Especificidade

Comparação da PCR com a especificidade TrueStart Hot Sart Taq DNA polimerase

comercial ou outros sistemas de PCR Hot Start em um alvo complexo.

Um fragmento de DNA de 2kb do gene da beta-globina humana foi ampliado de acordo

com as recomendações do fabricante.

M – CONTROLE (Plus 100 pb DNA Ladder Gene Ruler)

02/01 – True Start Hot Start: Taq DNA polimerase (modificação química por um

ligante);

04/03 – Vendedor A: Taq DNA polimerase (modificação química);

06/05 – Vendedor B: Taq DNA polimerase (dependentes de inibidores de temperatura);

08/07 – Vendedor C: Taq DNA polimerase (baseado em anticorpos);

10/09 – Ferramentas: Taq DNA polimerase (não arranque a quente).

Aplicações PCR Hot Start

Hot start Especificidade

Sensibilidade

Rentabilidade do Produto

Utilização de barreira física – cera – na Taq DNA Polimerase

Utilização de Inibidores - Oligonucleótídeos

Utilização de RT-HOT START PCR

Transcrição reversa HOT START PCR

Associa hibridização In Situ e PCR

Além dos primers específicos para a

sequência de DNA e dos reagentes próprios

para PCR, um dos nucleotídeos adicionados é

marcado com biotina para a detecção do

local onde haverá fragmentos de DNA, se

houver amplificação.

Permite a localização de sequências de

células específicas dentro de populações de

células, como tecidos e amostras de sangue.

Detectar DNA viral, proviral, rearranjos do

DNA e translocações.

Pode detectar quantidades pequenas de DNA.

Tempo de alongamento do DNA é maior,

devido à dificuldade da barreira física de

uma célula fixada.

PCR In Situ – incorporação direta do nucleotídeo

repórter no produto da PCR, durante a síntese.

RT In Situ PCR – incorporação direta do nucleotídeo

repórter no cDNA amplificado.

PCR Hibridização In Situ – o produto da PCR é

marcado com uma sonda, depois da síntese,

utilizando um passo de hibridização.

Protocolo - In Situ PCR

Amostras de tecido

Formalina tamponada e

parafina

Cultura de células

PBS e formalina

tamponada

Lâminas devem ser

revestidas com

silano.

Elas são colocadas

em xileno fresco

para a remoção da

parafina.

Pepsina, tripsina ou proteinase K.

Funções:

Permitir a entrada da sonda / primer / Taq polimerase;

Exposição do DNA.

Para cada lâmina, preparar 25l de solução:

2.5 l de PCR buffer

4.5 l de MgCl2 (25 mM solução estoque)

4.0 l de solução dNTP (200 M concentração final de cada nucleotídeo)

1.0 l de albumina de soro bovino 2% (BSA)

0.4 l de solução dUTP digoxigenina (1 mM soluçãoestoque)

1 l de cada um dos primers: primer 1 and primer 2 (20 M)

11 l de água

0.5 l de Taq polimerase

RT In Situ PCR

É a combinação entre a PCR In Situ e a

transcrição reversa.

Ela difere da PCR In Situ normal em dois

passos:

na digestão com DNase e na etapa de

transcrição reversa.

PREPARAÇÃO DA AMOSTRA, FIXAÇÃO, INCORPORAÇÃO DA PARAFINA, PREPARAÇÃO DO CORTE, REMOÇÃO DA

PARAFINA E DESIDRATAÇÃO

DIGESTÃO PROTEOLÍTICA

IN SITU RT IN SITU

DIGESTÃO COM DNase

RT

PCR

Detecções de viroses que possuem o genoma

composto por RNA, por exemplo, hepatite C;

Detecção de mRNAs humanos.

PCR Hibridização In Situ

PCR In Situ – 15 ciclos a 94ºC em 1 min.

PCR Hibridização In Situ – 35 ciclos a 94ºC em

1 min.

São moléculas de DNA de fita simples, de

pequeno tamanho, que estão marcadas com

uma substância radioativa ou com uma

substância qualquer que permitam suas

visualizações no final da hibridização.

Radioativos – nucleotídeos contendo radioisótopos

(32P,33P,35S ou3H);

Não radioativos – fluoróforo, enzima, molécula

repórter (biotina, digoxigenina).

Aplicações PCR In Situ

PCR in situ e hibridização

7 pacientes soropositivos e 8 soronegativos

Células do sangue fixadas com acetona

Padrão de positividade em 6 soropositivos e em

todos os soronegativos

PCR in situ consegue distinguir qual o tipo e quantas

células hospedam o vírus

10 amostras de tecidos pulmonar, sendo que 3 não apresentavam pneumonia

Embebidos em parafina

Primers para Streptococcus pneumoniae, Staphylococcusaureus e Streptococcus equisimilis

Em 7 casos foram encontrados uma das 3 bactérias

Genoma bacteriano encontrado no citoplasma de leucócitos

PCR in situ identificou bactérias em tecidos

Importante para a criação de animais de produção

Detecção da co-infecção pelo Coronavírus grupo 3 e

Astrovírus

Primers da região do vírus IBV, semelhante ao genoma

do Coronavírus

Lâminas com porções de intestino, íleo, bursa, timo,

baço, ceco para técnica de RT PCRT in situ

Associa análises morfológicas e moleculares