Enzymologia-14

Medyczne aspekty enzymologii

   1. Zastosowania diagnostyczne:      - oznaczanie aktywności enzymów jako element diagnozy      - enzymy jako bioodczynniki dla oznaczania stężenia metabolitów

  2. Choroby, których przyczyną jest deficyt enzymatyczny

  3. Enzymy jako leki       - usuwanie substancji toksycznych       - leczenie objawów chorób deficytu enzymatycznego       - terapia przeciwnowotworowa

Przykłady enzymów stosowanych w diagnostyce

Enzym Źródło (oryginalne) Stosowany do oznaczania----------------------------------------------------------------------------------------------------------------Oksydaza cholesterolowa Nocardia erythropolis Cholesterol

lub Brevibacterium spp.Kreatynaza Pseudomonas spp. kreatynaKreatyninaza j.w. kreatynina-galaktozydaza E. coli jony Na+, ELISAOksydaza glukozowa Aspergillus niger glukozaDehydrogenaza Glc-6-P Leuconostoc mesenteroides glukoza-glukozydaza S. cerevisiae aktywność -amylazyOksydaza glicerolo-3-P Aerococcus viridians triacylogliceroleHeksokinaza S. cerevisiae glukozaPeroksydaza Chrzan enzym wskaźnikowy,

testy ELISAOksydaza pirogronianowa Pediococcus spp. pirogronian,

transaminazyOksydaza kwasu moczowego Arthrobacter protopharmiae kwas moczowyUreaza Klebsiella aerogenes mocznik

Pomiary aktywności enzymów przydatne w diagnostyce klinicznej Nekroza komórek – następuje uwolnienie wszystkich enzymów

Stan zapalny – następuje zmiana przepuszczalności błony cytoplazmatycznej i uwolnienie enzymów cytoplazmy

 Warunki jakie powinien spełniać enzym przydatny dla celów diagnostyki klinicznej    - enzym powinien być obecny we krwi, moczu lub innych łatwo osiągalnych płynach ustrojowych;     - względna łatwość oznaczania;     - znaczące różnice poziomów aktywności w stanie patologicznym i normalnym;     - stabilność enzymu w płynie ustrojowym     - pożądana cecha – specyficzność tkankowa

Enzym zawarty gł. w komórkach wątroby i mięśnia sercowego. Zwiększenie jego aktywności w krwi powyżej dopuszczalnej granicy przemawia za uszkodzeniem rozlanym lub martwicą jednego z tych narządów. Ma zastosowanie w diagnostyce zapaleń wątroby oraz zawału mięśnia sercowego.

Aminotransferaza alaninowa, ALAT

Enzym zawarty gł. we włóknach mięśnia sercowego i mięśni szkieletowych, a także w komórkach wątroby i in. narządów.

Zawał serca - wypłukiwanie enzymu z rozpadających się włókien mięśnia sercowego- wzrost aktywności enzymu w surowicy krwi

Zjawisko to jest czułym wskaźnikiem martwicy mięśnia sercowego, występującej w 100% przypadków rozległego zawału, ale tylko w ciągu pierwszych kilku dni choroby (później aktywność spada do normy). W uszkodzeniach innych narządów, np. wątroby, aktywność AspAT wzrasta mniej znacznie.

Aminotransferaza asparaginianowa, AspAT

Enzym, którego aktywność we krwi wzrasta we wczesnym okresie zawału mięśnia sercowego (norma 1333-4000 nkat/l = 80-240 U/l), a także w stanach nadmiernego rozpadu krwinek czerwonych, czyli ich hemolizy.

Dehydrogenaza mleczanowa (LDH)

Kinaza fosfokreatyninowa, CPK

Enzym, którego wzrost aktywności w surowicy krwi, powyżej 50 jednostek, jest czułym wskaźnikiem martwicy zawałowej mięśnia sercowego w kilku pierwszych dniach choroby.

Diagnostyka chorób wątroby      

aminotransferaza asparaginianowa      aminotransferaza alaninowa     fosfataza alkaliczna     -glutamylotranspeptydaza      S-transferaza glutationowa

Znaczenie diagnostyczne: wirusowe zapalenie wątroby, marskość wątroby, żółtaczka mechaniczna

Oznaczanie aminotransferaz: reakcje sprzężone z reakcjami katalizowanymi przez dehydrogenazy NADH-zależne. Pomiar absorpcji przy 340 nm

 

Oznaczanie fosfatazy: sztuczny substrat – p-nitrofenylofosforan. Hydroliza uwalnia p-nitrofenol, który w środowisku alkalicznym absorbuje przy 410 nm

kwas asparaginowy + 2-ketoglutaran szczawiooctan + kwas glutaminowy

szczawioctan + NADH + L-jablczan + H+ NAD

+

Oznaczanie -glutamylotranspeptydazy

HOOC CH

NH2

CH2 CH2 CO

NH NO2 + Gly

-Glu-Gly-Gly + NH2 NO2

Gly

Inne tkanki: mięsień sercowykinaza kreatynowa, aminotransferaza asparaginianowa, dehydrogenaza mleczanowa (zawał mięśnia sercowego) trzustka-amylaza (ostre zapalenie trzustki) prostatafosfataza kwaśna (rak prostaty).

Rozróżnienie fosfatazy pochodzącej z prostaty od enzymu z innych tkanek: winian jest inhibitorem enzymu z prostaty, a formaldehyd enzymu z erytrocytów

 

D-glukoza + NAD+ D-glukono- lakton + NADH + H+dehydrogenaza glukozowa

D-glukoza + ATPheksokinaza

D-glukozo-6-P + ADP

D-glukozo-6-P + NADP+ D-glukono- lakton-6-P + NADPH + H+

dehydrogenaza Glc-6-P

+ utleniony barwnikH2Operoksydaza

H2O2 + zredukowany barwnik

oksydazaglukozowa

D-glukoza + H2O + O2 kwas D-glukonowy + H2O2

Oznaczanie metabolitów

Glukoza

1. Reakcja sprzężona

2. Reakcja barwna

3. Reakcja wykorzystująca dehydrogenazę glukozową z B. cereus

Kwas moczowy

kwas moczowy + 2 H2O + O2 alantoina + CO2 + H2O2

oksydaza moczanowa

Pomiar:1. Bezpośrednio, spektrofotometrycznie – 293 nm (UV)2. Sprzężenie z reakcją katalizowaną przez peroksydazę

(reakcja barwna)

Mocznik

(NH2)2CO (NH4)2CO3H2O+ 2ureaza

Pomiar:1. Sprzężenie z reakcją katalizowaną przez dehydrogenazę

kwasu glutaminowego, w której substratem jest jon amonowy.oznaczenie tworzącego się NAD+ przy 340 nm (UV)

2. Immobilizowana ureaza. Tworzący się amoniak dyfunduje przezpółprzepuszczalna błonę, gdzie reaguje z barwnikiem indykatorowym

Cholesterol

estry cholesterolu + H2O cholesterol + RCOO-

esteraza cholesterolowa

cholesterol + O2 4-cholesten-3-on + H2O2

oksydaza cholesterolowa

2 H2O2 + 4-aminofenazyna chinonoimina + 4 H2Operoksydaza

Typowe zmiany aktywności we krwi enzymów uwolnionych w wyniku zawału mięśnia sercowego

ELISA – wersja kompetytywna

ELISA – wersja „sandwich”

DEFEKTY GENETYCZNE OBJAWIAJĄCE SIĘ BRAKIEM ENZYMÓW

Metabolizm aminokwasów Choroba Częst. wyst.

(na 100 000) Enzym (szlak) Symptomy

Albinizm Alkaptonuria Choroba syropu klonowego Fenuloketonuria

3

0.4

0.4

8

Tyrozynaza (biosynteza melaniny) Dioksygenaza kwasu homogentyzynowego (degradacja Phe) Dehydrogenaza -ketokwasów o rozgałęzionym łańcuchu (degradacja Ile, Val, Leu) Hydroksylaza Phe (degradacja Phe)

Brak pigmentacji, białe włosy, różowa skóra Ciemny barwnik w moczu; reumatyzm w późnym wieku) Wymioty, konwulsje, opóźnienie umysłowe, przedwczesna śmierć Wymioty, opóźnienie umysłowe

Albinizm

DEFEKTY GENETYCZNE OBJAWIAJĄCE SIĘ BRAKIEM ENZYMÓWMetabolizm węglowodanów i lipidów

Choroba Tay-Sachsa Galaktozemia Choroba von Gierkego Choroba McArdle’a Choroba Andersena Choroba Gauchera

0.3 (u Żydów aszkenazyjskich

1 na 3600)

3

1

0.1

0.2

0.3

Heksozaminidaza A (metabolizm gangliozydów) urydylotransferaza Gal-1-P (metabolizm laktozy) fosfataza Glc-6-P w wątrobie fosforylaza glikogenowa enzym rozgałęziający glikogen glukocerebrozydaza dehydrogenaza Glc-6-P

Opóźnienie umysłowe, paraliż, ślepota, śmierć w 3 roku życia Brak tolerancji mleka, opóźnienie umysłowe, zaćma w oku Powiększona wątroba, niedorozwój, hipoglikemia Niezdolność do dużego wysiłku Marskość wątroby, śmierć w wieku 2 lat Akumulacja glukocerebrozydów w makrofagach Anemia hemolityczna

Zwłóknienie torbielowate (cystic fibrosis) – brak białka transbłonowego regulującego przepływ anionów. Efekt – gromadzenie się śluzu w płucach, blokada kanałów trzustkowych

Enzymy jako leki

1. Usuwanie tkanki nekrotycznej z wykorzystaniem enzymów proteolitycznych

2. Usuwanie skrzepów w naczyniach krwionośnych (streptokinaza, urokinaza)

3. Stany niewydolności trzustki – podawanie kapsułkowanych enzymów trawiennych

Pepsyna rozkłada białka do polipeptydów. Stosowana jest w leczeniu niedokwaśności soku żołądkowego, najczęściej razem z kwasem solnym.

Streptokinaza, fibrynolizyna, proteina wytwarzana przez paciorkowce, enzym aktywujący plazminogen, który w stanie czynnym rozpuszcza skrzepy włóknika, a także inne proteiny.

Streptokinaza wyosobniona w czynnej postaci stanowi lek stosowany w celu przyspieszenia wchłaniania krwiaków.

Enzymy w terapii przeciwnowotworowej

1. Zastosowanie asparaginazy w leczeniu ostrej białaczki limfoblastycznej i ostrej białaczki granulocytarnej

Działanie asparaginazy bazuje na fakcie, że zmutowane komórki białaczkowe nie są zdolne do syntezy Asn, podczas gdy zdrowe komórki wytwarzają własną asparaginę.

Tak więc zmutowane komórki zależą od wolnej asparaginy cyrkulującej w organizmie. Asparaginaza katalizuje rozkład L-asparaginy do kwasu asparaginowego i amoniaku, co likwiduje wolną asparaginę w organizmie.

2. Aktywacja pro-leków

Przykłady proleków i aktywujących enzymów

Fosforan etopozydu fosfataza alkaliczna

5-fluorocytozyna deaminaza cytozynowa

2-(L--aminoacylo)metotreksat aminopeptydaza

Przykładami wykorzystania proleków w terapii jest:

• prontosil, króry przekształcany jest w organizmie w aktywny związek przeciwbakteryjny sulfanilamid. • enalapryl podawany jako prolek, a właściwe działanie biologiczne wykazuje enalaprylat (powstały w wyniku działania esteraz) • lewodopa, która zostaje poddana dekarboksylacji w organizmie do dopaminy. • heroina, która zostaje deacetylowana do morfiny