Sindrome de la mortalidadtemprana EMS

Enfermedad de la necrosis aguda delhepatopancreas AHPND

Xenia Caraballo Ortiz, M.Sc.Investigadora programa Salud Animal

CENIACUAxcaraballo@ceniacua.org

QUE ES??• Enfermedad bacteriana que ataca el sistemadigestivo del camarón, causando mortalidades quepueden llegar al100% en los estanques afectados.

• Nueva Pandemia.

• Pérdidas aproximadas de 1 Billón de dólares poraño= 6 billones

Effects on Business:obvious that farms are lost

Whole farming areas of Guongdong, China lost To Aphns (EMS)

2008

Thai Shrimp Production

0

100,000

200,000

300,000

400,000

500,000

600,000

700,000

1985 1987 1989 1991 1993 1995 1997 1999 2001 2003 2005 2007 2009 2011 2013

And then I learned:Still much to learn about sustainability

2014

McIntosh R. Panama 2015

GOAL 2013

PRODUCCION DE CAMARON EN LATINOAMERICA 2008-2015

Paises afectadospor EMS• China (2009)• Vietnam(2010)• Malasia (2011)• Tailandia (2012)• Mexico (2013)• India• FilipinasLista de alerta• Indonesia• Singapur• Mianmar• Brunei• Cambodia• Latinoamerica

2013

Fuente: Lightner 2013

2015

Sonora Mediados de Mayo 2013

Nayarit April 2013

Sinaloa Principios de mayo 2013

QUE LA CAUSA?INICIOS 2012

• Infección per os con tejidos congelados =NO EMS

• Inyección intramuscular = NO EMS• Toxicidad con alimentos = NO EMS• Toxicidad con crusticidas = NO EMS• Infección por agua o sedimentos = NO EMS• Búsqueda de algas tóxicas = No diferencias

con estanques normales

JULIO 2012 - VIETNAM• SPFs alimentados con tejidos NO

CONGELADOS de animales infectados• Cohabitación de SPFs de P vannamei con Pmonodon con síntomas de EMS

Sout

hCh

ina

2010

:10-

361B

/2; P

. van

nam

ei#

25,1

0x26

Results+of+Exp#1+

36+

0+

2+

4+

6+

8+

10+

12+

14+

16+

Day+0+ Day+1+ Day+2+ Day+3+ Day+4+

Numberofsurvivingshrimp

Day post challenge

Control+Immersion+1+Immersion+II+Immersion+III+

Postulados de Koch

Lightner et al., 2013

Lightner 2013

Nunan et al 2014

• Solamente bacteriasdel estómago deanimales sintomáticosproducían enfermedaden animales sanos.

• Cual bacteria ?Vibrio parahaemolyticusNo cualquier Vibrio.Productor de toxinas

Han et al 2015. Photorhabdus insect related (Pir)toxin-like genes in a plasmid of Vparahaemolyticus, the causative agent of acutehepatopancreatic necrosis disease (AHPND) ofshrimp. Dis Aquat Organ. 113(1):33-40.

Sirikharin, R. et al. 2015. Characterization andPCR detection of binary, Pir-like toxins from Vibrioparahaemolyticus isolates that cause acutehepatopancreatic necrosis disease (AHPND) inshrimp. www. PlOSONE.org.

TOXINAS EN PLASMIDOS

Vparahamolyticus

PlásmidosGenes

deToxinas

EMS

Plásmido molecula pequeña de ADN, localizada en una célulay separada del AND cromosomal. Replicación independiente

Transferencia horizonal de genes

Bacteria -------------------Bacteria

Proteina similar a toxinabacteriana que afecta insectos:

Centrifugadoy filtrado

Juve

nile+ P

enae

us+va

nnam

ei++fr

om+V

ietna

m.+++

Left+

with

+EMS

\+righ

t+app

ears+

norm

al.+

Se inyecto elsobrenadante

EMS +++Se han identificado 4 plásmidos enVP causante de AHPND (Gomez Gil2014)

134 Vibrio spp.

117 Vibrio parahaemolyticus.

16 Vibrio parahaemolyticuscausantes de AHPND/EMS.AP1, AP2; AP3, etc

Modificado de Huan et al 2014

No todos los vibrios son iguales

CUALES SON LOS SINTOMAS ?

Sintomatología piscinas

• Nado errático• Animales muertos en las orillas y en el fondo• Presencia de aves• Bajo crecimiento• La mortalidad generalmente aparece en las

primeras dos semanas y puede llegar a 100%en el primer mes

• La mortalidad puede repetir a los 60 días.

Signos clínicos

• Disminución del tamañodel hepatopáncreas(Atrofia)

• Cambio en laconsistencia delHepatopáncreas(cauchosa – dura)

• Tracto digestivo vacío Microcolony of bacteria growingon epicuticle of gastric wall

Lumen of Stomach

EMSCOLONIZESTHE STOMACH AND PRODUCESATOXIN THAT DAMAGESTHE HEPATOPANCREAS

35

Juvenile+Penaeus+vannamei++from+Vietnam.+++Left+with+EMS\+right+appears+normal.+

10+

Juvenile+Penaeus+vannamei+Left+with+normal+HP\+right+with+EMS/AHPND+

Juvenile+Penaeus+vannamei++from+Vietnam.+++Both+with+atrophied+HPs+indicative+of+EMS.+

Diagnóstico

Síndrome de Mortalidad Temprana (EMS)

Última actualización: Agosto de 2013 © 2013 Página 4 de 7

Diagnóstico confirmatorioDebido a lo reciente de las investigaciones y

descubrimientos sobre esta enfermedad emergente encamarones penaeidos, la única herramienta de diagnósticoque se tiene hasta el momento es la histología (inclusión enparafina y tinción con Hematoxilina y Eosina) para elreconocimiento de las lesiones producidas por las toxinasdel agente etiológico, en las células y túbulos delhepatopáncreas. Sin embargo, investigadores de laUniversidad de Arizona en los Estados Unidos bajo ladirección del Dr. Donald V. Lightner, están desarrollandouna prueba basada en PCR, para la detección molecular dela cepa de V. parahaemolyticus causante de la AHPND.Esta ya ha sido evaluada con camarones enfermos de Asia yde México y ha mostrado reacciones positivas en amboscasos; aún se encuentra en fase de evaluación y se esperaque esté disponible en el mercado a finales de 2013 oprincipios de 2014.

Las siguientes son los principales hallazgoshistopatológicos de importancia diagnóstica en camaronescon AHPND:

a. Coloración Degeneración progresiva y aguda delHP con disfunción de las células R, B, F y E,notándose en las E una disminución marcada en susactividad mitótica

b. Daño de los túbulos del HP que avanza de la zonaproximal hacia la distal

c. Cariomegalia (aumento del tamaño de los núcleos)en las células E del HP

d. Descamación de las células tubulares del HPquedando con forma esférica

e. Infección secundaria severa en el HPprincipalmente con especies de Vibrio

f. Destrucción masiva y completa del HP en la parteterminal de la enfermedad

g. Agregación hemocítica en el HP, encapsulandozonas con células muertas

h. Melanización de las áreas más afectadas en la faseavanzada de la enfermedad, principalmente en lasporciones proximales de los túbulos de algunoscamarones

Fotos cortesía del Dr. D.V. Lightner y del Dr. C. Pantoja(The University of Arizona, USA).

Toma de muestras para laboratorioHistopatología. Este tipo de técnica requiere que los

camarones capturados se encuentren visiblemente enfermosy con presencia de los signos clínicos mencionadosanteriormente. Los organismos para histología siempredeben estar vivos (preferiblemente moribundos). Losanimales enfermos seleccionados para esta prueba, debenser entre 5 y 10 por población (estanque o cuerpo de agua)y deben ser fijados mediante inyección con soluciónfijadora de Davidson-AFA (etanol absoluto: 33%,formaldehído: 22%, ácido acético glacial: 11.5% y agua

PCRPlásmidoAP2

PCRGen de la Toxina AAP3

PCRAP4 PCR Anidada de lasecuencia de ambastoxinas

WHY ISTHE EMSPATHOGEN DIFFERENT THANAVIRUS?

• Unlike viruses, itdoes not require ahost organism toreplicate

• Once established inthe environment. Itcolonizes quickly

• It can be displacedby a mature microbialcommunity

37

Histopatologia• Fase aguda• Perdida de funciones de las celulas R; B; F

&E• Desprendimiento de celulas epiteliales del

HP.• Las bacterias no se observan fácilmente

• Fase terminal• Destrucción del hepatopáncreas

AHPND Fase aguda

Case+11 0̂41.+Normal+hepatopancreas+(HP)+ 14+

AHPNDterminal

AP3/AP4 comparison

AP3

AP4

Flegel TW. International Technical Seminar/Workshop “EMS/AHPND: Government, Scientist and FarmerResponses”

• PCR:• Contig 89: Es usado por el kit comercial IQ2000• Nunan et al 2014. Plasmido

F. 5’-GTC GCT ACT GTC TAG CTG AA-3’5’-ACG GCA AGA CTT AGT GTA CC-3’Fragmento de 470 bpfor 3 min at 95°C followed by40 cycles at 95, 67 and 72°C for 20, 20 and 30 s, respectively.

• Flegel et al 2014. ToxinaVP3F:ATGAGTAACAATATAAAACATGAAACR: GTGGTAATAGATTGTACAGAAFragmento de 336 bpFor 5 min at 94°C followed by30 cycles at 94, 53 and 72°C for 30, 30 and 40 s, respectively.

Muestra para Microbiologia• Muestras

• Estomago• HP• Contenido intestinal

• Enriquecimiento preliminar en Caldo detripticasa de soya (TSA) al 1,5-2.0 % de NaClsuplemento

• Incubar durante 4 horas a 28ºC- 30ºC conagitación.

• Siembra en TCBS• Repique en TSA• Pruebas bioquimicas

DIAGNOSTICO DIFERENCIAL AHPND /EMS

SIGNOSCLINICOS

TIPO DE MORTALIDADPOSIBLESCAUSAS

HISTOLOGIADIFERENCIAL

- Letargia- Estomago

vacio- HP atrofiado- HP palido- Melanizacion

tubulos delHP

CRONICAVibriosis NO

CRONICANHP NO

AGUDA EMS/AHPNS YES

AHPND/ EMSFactores de riesgo?

A.Larva /reproductor infectadosB.Camarón reprocesado procedente de

áreas infectadasC.Corrientes marinas portando vectoresD.Alimento fresco: poliqueto, ArtemiaE.Aves migratorias:

Especiesusceptible Medio

ambientepropicio

PatógenoV parahemolyticus

Plásmido

Genes de Toxinas

P vannamei

P monodon Cual ??

Medio ambienteParámetro Propicio para EMS

Temperatura Superior a 30oC

pH >8.0

Salinidad Superior a 20 ppt

Oxígeno disuelto Inferior a 5

Materia órgánica Sedimentos en el fondo de los estanques

Agua Aguas eutroficadas

Alimento Sobrealimentación

PROBLEM FROM OVER FED/OVER BLOOM /CRASH AND LOWD.O. ;ANAEROBIC SOIL

NOVOZYMES PRESENTATION24/06/20154

Medidas generales

AlimentoAlimentoLibre de la toxina Adecuada cantidad

Medio ambienteMedio ambienteCalidad de agua y

fondos. Melaza. Agua madura Adecuada oxigenación

SemillaSemillaLarva PCR - Larva sana

LARVAS Y REPRODUCTORES SANOSTesting and quarantine• SPF• Home grown ???

Live feed !!!!• Testing• Treating• Cleaning• Formulated feed ?

Washing egg/naupliiTreatment ?

In maturation and spawning phase ; mainfocus

International Technical Seminar/Workshop “EMS/AHPND: Government, Scientist and Farmer Responses”22-24 June 2015, Tryp Hotel, Panama City

DESINFECCION DE HUEVOS Y NAUPLIOS

PUTTING IT ALL TOGETHER

• Diagnostics– Improved PCR tests

• Breeding– Genetic resistance to EMS

• Hatchery– Avoid infected foods– Improve sanitation

• Farm– Manage microbial

community• Feed

– Additives to improve EMSresistanceHOW IS IT TRANSMITTED?

• Vertically– Can be carried in

broodstock and larvae– Live feeds for shrimp

reproduction, esp.polychaete worms are amajor concern

• Horizontally– Cannibalism,

consumption of carriers,fecal/oral, and water.

36 Cannibalism

Bacterial plaque on eggPLACA BACTERIANA EN HUEVO Chamberlain G. GAA meeting 2014

Testing and quarantine• SPF

• Home grown ???

Live feed !!!!• Testing

• Treating• Cleaning• Formulated feed ?

Washing egg/naupliiTreatment ?

In maturation and spawning phase ; mainfocus

International Technical Seminar/Workshop “EMS/AHPND: Government, Scientist and Farmer Responses”22-24 June 2015, Tryp Hotel, Panama City

ALIMENTO VIVO LIBRE

Medidas generales

Monitoreo y seguimientoMonitoreo y seguimiento•Toma de muestras en casos

sospechosos

NotificaciónNotificación•Aplicar planes de contingencia

Medidas de Bioseguridad

1. LARVA SANA• No importar larvas (Ideal)• originaria de países libres de

enfermedades exoticas• originaria de países que no

presenten mortalidadesinusuales

• Certificados sanitarios: PCRNegativo para AHPND/EMS,WSSV ..

Medidas de Bioseguridad

2. Camarón reprocesado• Plantas de reproceso deben tener

un tratamiento de aguas dedescarga

• originario de países libres de EMS,WSSV etc

• originario de países que nopresenten mortalidades inusuales

• PCR Negativo para AHPND/EMS,WSSV

Medidas de Bioseguridad

3. Alimento fresco• Poliqueto• Artemia• Calamar• Que provengan de zonas libres de

EMS, WSSV, etc

Medidas de Bioseguridad

• Evitar el estrés ambiental• Mantener la salubridad del entorno de

los estanques• Secar las piscinas entre ciclos puede

interrumpir ciclo de vida del patogeno

4 Pandemias en 23 añosPatógeno (año) Impacto

IHHNV (1990) MínimoTSV (1995) ImportanteWSSV (1992) MayorEMS 2011 CatástroficoOtras EHP ? CMNV ?

6/24/2015 International Technical Seminar/Workshop “EMS/AHPND:Government, Scientist and Farmer Responses” 6

“Man seems to insist on ignoring the lessons available from history.” – Norman Borlaug

5 PANDEMICS IN 23 YEARS

Minor Diseases

MicrosporidiansGregarinasStreptococcusVibriosisRickettsia

1990 – IHHNV : Impact, Minimum1995 – TSV : Impact, Important1997 – NHP : Impact, Important2001 – WSSV : Impact, Major2013 – AHPNS : Impact, Catastrophic

20?? - Enterocytozoon hepatopenae (EHP)Covert Mortality Noda Virus (CMNV)Something New

Patógeno (año) ImpactoIHHNV (1990) MínimoTSV (1993) ImportanteWSSV (1999) MayorEMS (2013) ???Otras

EHP = Enterozytozon hepatopenae

CMNV = Covert Mortality Noda virus

COMENTARIOSMUCHASGRACIAS