Drożdżowe systemy ekspresyjne

Drożdżowe systemy ekspresyjne

Dr inż. Marta Wanarska

Katedra Mikrobiologii

Wydział Chemiczny

Politechnika Gdańska

Zastosowanie drożdżowych systemów ekspresyjnych

Produkcja białek• wirusowych

• prokariotycznych

• eukariotycznych

których wytwarzanie na innej drodze jest trudne, niebezpieczne, ekonomicznie nieopłacalne

Produkcja metabolitów niebiałkowych• alkoholi• kwasów organicznych• cukrów

z wykorzystaniem substratów odpadowych (serwatka, glicerol, hydrolizaty biomasy roślinnej)


Charakterystyka drożdży jako gospodarzy ekspresyjnych dobrze scharakteryzowane łatwość przeprowadzenia manipulacji genetycznych szybki wzrost i produkcja dużej ilości biomasy wydajne systemy ekspresyjne możliwość produkcji białek wewnątrz- i zewnątrzkomórkowo trwałe rekombinanty – integracja plazmidów ekspresyjnych z genomem

gospodarza modyfikacje posttranslacyjne białek • tworzenie mostków disiarczkowych

• N- i O-glikozylacja

• przyłączanie kwasów tłuszczowych

• proteolityczne dojrzewanie białek możliwość produkcji białek fuzyjnych posiadających domeny ułatwiające

oczyszczanie i detekcję białek lub zwiększające immunogenność


Gatunki drożdży stosowane do produkcji heterologicznych białek

Saccharomyces cerevisiae Pichia pastoris Pichia methanolica Hansenula polymorpha Kluyveromyces lactis Yarrowia lipolytica Arxula adeninivorans Schizosaccharomyces pombe

Saccharomyces cerevisiae

Niski poziom produkcji i sekrecji białek

Niestabilność plazmidów rekombinantowych

Hiperglikozylacja białek Wąski zakres

metabolizowanych źródeł węgla

Pichia pastoris i Hansenula polymorpha- podstawowa charakterystyka biochemiczna

P. pastoris H. polymorpha

Źródła węgla

i energii

glukoza

glicerol

metanol

glukoza

glicerol

metanol

Źródła azotu jony amonowe jony amonowe

sole kwasu azotowego (V)

Optymalna temperatura

wzrostu

30 °C 37-43 °C

Metabolizm metanolu

1 – oksydaza alkoholowa, 2 – katalaza, 3 – syntaza dihydroksyacetonu, 4 - dehydrogenaza formaldehydowa, 5 – dehydrogenaza mrówczanowa, 6 - kinaza dihydroksyacetonu, 7- aldolaza fruktozo-1,6-bisfosforanu, 8 – fosfataza fruktozo- 1,6-bisfosforanu

Arxula adeninivorans – podstawowa charakterystyka biochemiczna

Źródła węgla i energii• szeroka gama cukrów, w tym skrobia• alkohole (z wyłączeniem metanolu) i diole• kwasy karboksylowe i dikarboksylowe• n-alkany• pierwszorzędowe alkiloaminy

Źródła azotu• jony amonowe• sole kwasu azotowego (V)• pierwszorzędowe alkiloaminy

Arxula adeninivorans – podstawowa charakterystyka biochemiczna

Termotolerancyjność zdolność do wzrostu w zakresie temperatury 30-48 °C

Temperaturozależny dimorfizm• wzrost w postaci pojedynczych pączkujących komórek w temp. do

42 °C• wzrost w postaci strzępek w temperaturze powyżej 42 °C

W postaci strzępek wykazuje wyższy poziom sekrecji białek

Różny wzór glikozylacji białek w zależności od formy morfologicznej

• N-glikozylacja w obu typach komórek• O-glikozylacja tylko w pojedynczych komórkach

Formy morfologiczne Arxula adeninivorans

A. adeninivorans LS3

hodowana w 30 °C

A. adeninivorans LS3

hodowana w 45 °C

Yarrowia lipolytica – podstawowa charakterystyka biochemiczna

Źródła węgla i energii• glukoza• glicerol• etanol• octany• n-alkany• kwasy tłuszczowe

Źródła azotu• jony amonowe

Dimorfizm zależny od warunków środowiskatworzy strzępki w obecności N-acetyloglukozaminy jako jedynego źródła węgla w pożywce

Yarrowia lipolytica – podstawowa charakterystyka biochemiczna

W obecności n-alkanów wydziela kwas cytrynowy i izocytrynowy

W obecności n-alkanów i przy braku tiaminy wydziela α-ketoglutaran

Produkuje zewnątrzkomórkowo znaczne ilości białek• alkaliczna proteaza• kwaśna proteaza• RNA-za• kwaśna fosfataza• lipaza• esteraza

Optymalna temperatura wzrostu 30-34 °C


Szczepy gospodarzy ekspresyjnych

Wektory ekspresyjne• bakteryjne ori replikacji• bakteryjny marker selekcyjny• sekwencja umożliwiająca

utrzymanie się wektora w komórce drożdży

• drożdżowy marker selekcyjny• drożdżowy promotor i

terminator transkrypcji

Drożdżowy wektor

ekspresyjny

PTEF1

AmpR

URA3

PHO5t

25S rDNA

ColE1 ori

Szczepy ekspresyjne Pichia pastoris

Szczep Fenotyp Uwagi

X-33, Y-11430 szczep dziki Selekcja antybiotykowa

GS115 His-, Mut+ Selekcja na podłożu bez histydyny; szybki metabolizm metanolu

KM71 His-, Muts Selekcja na podłożu bez histydyny; wolny metabolizm metanolu

SMD1168 His-, Pep4-, Mut+ Selekcja na podłożu bez histydyny; brak aktywności proteazy A; szybki

metabolizm metanolu

JC300 Ade-, Arg-, His- Selekcja na podłożu bez adeniny, argininy i histydyny

JC308 Ade-, Arg-, His-, Ura-

Selekcja na podłożu bez adeniny, uracylu, histydyny i argininy

Szczepy ekspresyjne Hansenula polymorpha


DL-1, NCYC495, CBS4732

szczep dziki Selekcja antybiotykowa

DL10 Leu-, Ura- Selekcja na podłożu bez leucyny i uracylu

uDLB11 Leu-, Ura-, Pep4- Selekcja na podłożu bez leucyny i uracylu; brak aktywności proteazy A

L1 Leu- Selekcja na podłożu bez leucyny

A11 Ade- Selekcja na podłożu bez adeniny

LR9 Ura- Selekcja na podłożu bez uracylu

Szczepy ekspresyjne Arxula adeninivorans


LS3 Szczep dziki Selekcja antybiotykowa

135 Adm- Tworzy strzępki w 30 °C; selekcja antybiotykowa

G1211 Leu- Selekcja na podłożu bez leucyny

G1212 Trp- Selekcja na podłożu bez tryptofanu

Szczepy ekspresyjne Yarrowia lipolyticaSzczep Fenotyp Uwagi

W29 Szczep dziki Selekcja antybiotykowa; selekcja na podłożu z sacharozą

Po1d Leu-, Ura-, ΔAEP, Suc+ Selekcja na podłożu bez leucyny i uracylu; brak aktywności alkalicznej proteazy, zdolność do metabolizmu

sacharozy

Po1f Leu-, Ura-, ΔAEP, ΔAXP, Suc+

Selekcja na podłożu bez leucyny i uracylu; brak aktywności alkalicznej proteazy, brak aktywności kwaśnej proteazy, zdolność do metabolizmu

sacharozy

YLP21 Ura-, ΔAEP, ΔAXP, Suc+

Selekcja na podłożu bez uracylu; brak aktywności alkalicznej

proteazy, brak aktywności kwaśnej proteazy, zdolność do metabolizmu

sacharozy

Promotory transkrypcji P. pastoris

Promotor Uwagi

AOX1 (genu oksydazy alkoholowej)

Indukowany metanolem; represja w obecności glukozy i glicerolu

FLD1 (genu dehydrogenazy formaldehydowej)

Indukowany metanolem i metyloaminą; represja w

obecności glukozy i glicerolu

PEX8 (genu kodującego białko tworzące matrix peroksysomów)

Słaba aktywność w obecności glukozy; wzrost aktywności w

obecności metanolu

GAP (genu dehydrogenazy aldehydu 3-fosfoglicerynowego)

Konstytutywny, aktywny w obecności glukozy i glicerolu

YPT1 (genu GTPazy niezbędnej w sekrecji białek)

Konstytutywny, aktywny w obecności glukozy i metanolu

Promotory transkrypcji H. polymorpha

Promotor Uwagi

MOX (genu oksydazy metanolowej)

Indukowany metanolem; represja w obecności glukozy; aktywny w obecności

glicerolu

DHAS (genu syntazy dihydroksyacetonu)


glicerolu

FMD (genu dehydrogenazy mrówczanowej)


glicerolu

AMO (genu oksydazy aminowej) Indukowany metylo- i etyloaminą; represja w obecności jonów amonowych

YNT1, YNI1, YNR1 (genów kodujących białka niezbędne w

metabolizmie azotanów)

Indukowane solami kwasu azotowego (V), represja w obecności jonów amonowych

GAP (genu dehydrogenazy aldehydu 3-fosfoglicerynowego)

Konstytutywny

PMA1 (genu ATPazy błony cytoplazmatycznej)

Konstytutywny

Promotory transkrypcji A. adeninivorans

Promotor UwagiTEF1 (genu kodującego czynnik

elongacji translacji EF-1α)Konstytutywny

Promotory transkrypcji Y. lipolytica

Promotor UwagiXPR2 (genu alkalicznej proteazy) Aktywny w pH >6 i w obecności

dużej ilości peptonu

hp4d (promotor hybrydowy – 4 UAS promotora XPR2 i TATA box

promotora LEU2)

Aktywny w fazie stacjonarnej hodowli

ICL1 (genu liazy izocytrynianowej) Indukowany n-alkanami, kwasami tłuszczowymi, etanolem i octanem

sodu; represja w obecności glukozy i glicerolu

POX2 (genu oksydazy acylo-CoA) Indukowany n-alkanami i kwasami tłuszczowymi; represja w


POT1 (genu tiolazy 3-oksoacylo-CoA)

Indukowany n-alkanami i kwasami tłuszczowymi; represja w


Drożdżowe markery selekcyjne

P. pastoris geny oporności na antybiotyki • gen oporności na zeocynę

markery auksotroficzne• gen HIS4 P. pastoris lub S. cerevisiae• gen ARG4 S. cerevisiae• gen URA3 P. pastoris• gen ADE1 P. pastoris


H. polymorpha geny oporności na antybiotyki • gen oporności na zeocynę• gen oporności na pleomycynę

markery auksotroficzne• gen LEU 1.1 H. polymorpha• gen URA3 H. polymorpha• gen ADE11 H. polymorpha• gen LEU2 S. cerevisiae• gen URA3 S. cerevisiae• gen LEU2 C. albicans


A. adeninivorans geny oporności na antybiotyki • gen oporności na higromycynę B

markery auksotroficzne• gen LEU2 A. adeninivorans• gen TRP1 A. adeninivorans• gen TRP1 A. adeninivorans pod kontrolą krótkiego fragmentu

promotora LEU2 A. adeninivorans


Y. lipolytica geny oporności na antybiotyki • gen oporności na pleomycynę

gen SUC2 S. cerevisiae

markery auksotroficzne• gen LEU2 Y. lipolytica• gen URA3 Y. lipolytica• gen ADE1 Y. lipolytica

Sekwencje umożliwiające utrzymanie się wektora ekspresyjnego w komórce drożdży

P. pastoris Sekwencje umożliwiające rekombinację

homologiczną z genomem drożdży• 5’ fragment promotora AOX1• 5’ fragment promotora GAP• gen HIS4 P. pastoris

A. adeninivorans Sekwencje umożliwiające rekombinację

homologiczną wektora z genomem drożdży• sekwencja kodująca 25S rRNA A. adeninivorans


H. polymorpha Sekwencje umożliwiające rekombinację

homologiczną wektora z genomem drożdży• gen MOX H. polymorpha• gen AMO H. polymorpha • gen LEU2 S. cerevisiae• gen URA3 S. cerevisiae

Sekwencje umożliwiające autonomiczną replikację wektora w komórkach drożdży

• sekwencje ARS H. polymorpha


Y. lipolytica Sekwencje umożliwiające rekombinację homologiczną wektora

z genomem drożdży• terminator transkrypcji LEU2

• terminator transkrypcji URA3

• terminator transkrypcji XPR2

• sekwencje kodujące rRNA

• sekwencje „zeta” (sekwencje LTR retrotranspozonu Ylt1) w szczepach niosących retrotranspozon Ylt1

Sekwencje umożliwiające rekombinację niehomologiczną wektora z genomem drożdży

• sekwencje „zeta” w szczepach nie niosących retrotranspozonu Ylt1

Sekwencje umożliwiające autonomiczną replikację wektora w komórkach drożdży

• sekwencje ARS Y. lipolytica

Zewnątrzkomórkowa produkcja białek

Zewnątrzkomórkowa produkcja białek Sekwencja sygnalna

Pichia pastoris

Hansenula polymorpha

Arxula adeninivorans

Yarrowia lipolytica

obcego białka + + + +

α-faktora

S. cerevisiae

+ + +

Kwaśnej fosfatazy P. pastoris

+

Kwaśnej fosfatazy H. polymorpha

+

Glukoamylazy

S. ocidentalis

+

Alkalicznej proteazy

Y. lipolytica

+

Lipazy Y. lipolytica +

Zwiększenie poziomu sekrecji białek przez komórki drożdży

Wprowadzenie do komórek drożdży dodatkowych genów kodujących białka opiekuńcze obecne w

retikulum endoplazmatycznym

Foldazy • izomerazy disulfidowe

Białka opiekuńcze• kalneksyna• kalretikulina

Kierowanie białek do peroksysomów

Peroksysomy Zdolne do akumulacji dużej

ilości białek Nie zawierają enzymów

modyfikujących białka• fosfokinaz• glikozylaz• proteaz

Umożliwiają produkcję niezmodyfikowanych białek

Sekwencja kierująca do peroksysomów

-Ser-Lys-Leu-COOH

peroksysomy

H. polymorpha rosnąca w pożywce z metanolem

Produkcja białek w drożdżowych systemach ekspresji

Produkcja termostabilnej β-D-galaktozydazy Pyrococcus woesei

w systemie ekspresji Pichia pastoris

Przemysłowe zastosowanie β-D-galaktozydazy

Produkcja mleka o obniżonej zawartości laktozy

Produkcja dietetycznych przetworów mlecznych

Produkcja syropu glukozowo-galaktozowego

Produkcja bezlaktozowej serwatki

Synteza galaktooligosacharydów

Pyrococcus woeseiizolowany z morskiej solfatary (Porto di Levante, wyspa Volcano,

Włochy)

Domena: ArchaeaGrupa: EuryarchaeotaKlasa: Thermococci Rząd: ThermococcalesRodzina: ThermococcaceaeRodzaj: PyrococcusGatunek: Pyrococcus woesei

Beztlenowiec Optimum temperatury - 97 - 100°C Optimum pH - 6,0 Optimum NaCl - 30% Produkty metabolizmu - H2, H2S (w obecności S0)

Ziarniak 0,8 - 2,0 μm Urzęsienie lofotrichalne

Konstrukcja systemu ekspresyjnego Pichia pastoris

pre-pro sekwencja α-faktora S. cerevisiae

Lys-Arg

Kex2

β-D-galaktozydaza P. woesei

Produkcja β-D-galaktozydazy P. woesei w systemie ekspresji P. pastoris (AOX1)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 24 48 72 96 120 144

czas [h]

bio

mas

a [g

/l]

Indukcja ekspresji genu

Krzywa wzrostu P. pastoris GS115 + pPICZαβ-gal

24 – 47 h – 25% (m/v) glicerol + 5*10-4% biotyna + 0,05% histydyna (0,24 ml/min)

48 – 72 h – 25% (v/v) MeOH + 5*10-4% biotyna + 0,05% histydyna (0,24 ml/min)

72 – 144 h – 30% (v/v) MeOH + 5*10-4% biotyna + 0,05% histydyna (0,24 ml/min)

Pożywka BMGY (2% pepton K, 1% ekstrakt drożdżowy, 0,1 M K2HPO4/KH2PO4 pH 6,0, 1,34% YNB, 4*10-5% biotyna, 2% glicerol), 30 °C, napowietrzanie 3,0 vvm, mieszanie 1200 obr./min,

Biostat R, 5l (B. Braun Biotech International, Niemcy), 2,5 l objętości roboczej

Produkcja β-D-galaktozydazy P. woesei w systemie ekspresji P. pastoris (AOX1)

M – Marker wielkości białek: 97, 66, 45, 30, 20,1 i 14,4 kDa

1 – pożywka hodowlana po 48 h hodowli





P. pastoris GS115 + pPICZαβ-gal

Uzyskano 300 mg białka z litra pożywki pohodowlanej

Produkcja proteinazy K Tritirachium album w systemie

ekspresji Pichia pastoris

Konstrukcja systemu ekspresyjnego Pichia pastoris

pre-pro sekwencja proteinazy K T. album

Lys-Arg

Kex2

proteinaza K T. album

Zastosowanie proteinazy K Tritirachium album

izolacja genomowego DNA z komórek bakterii, drożdży itp.

Produkcja proteinazy K T. album w systemie ekspresji P. pastoris (AOX1)

1 – Marker wielkości białek: 66, 45, 35, 25, 18,4 i 14,4 kDa

2 – pożywka hodowlana po 24 h indukcji (72 h hodowli)



P. pastoris GS115 + pPICZProtK

Uzyskano 700 mg białka

z litra pożywki pohodowlanej

Porównanie wydajności produkcji białek w różnych drożdżowych

systemach ekspresji

Produkcja interleukiny 6 (IL-6)

Szczepy gospodarzy ekspresyjnych

Arxula adeninivorans Hansenula polymorpha Saccharomyces

cerevisiae

Rekombinantowy plazmid ekspresyjny


A. adeninivorans pojedyncze komórki

A. Adeninivorans strzępki

H. polymorpha

S. cerevisiae


1. A. adeninivorans; pojedyncze komórki – IL-6 stanowi 10% wydzielanych białek

2. A. adeninivorans; strzępki – IL-6 stanowi 30% wydzielanych białek

3. H. polymorpha -IL-6 stanowi 50% wydzielanych białek

4. S. cerevisiae - IL-6 stanowi 50% wydzielanych białek


1. A. adeninivorans; pojedyncze komórki

2. A. adeninivorans; strzępki

3. H. polymorpha

4. S. cerevisiae

Konstrukcja rekombinantowego szczepu Saccharomyces cerevisiae zdolnego do produkcji etanolu z laktozy zawartej w

serwatce

Serwatkasurowiec do produkcji etanolu

Serwatka - prawie klarowna ciecz powstała po ścięciu zawartej w mleku kazeiny

laktoza 4,5 - 5,0% m/v białka 0,6 - 0,8% m/v lipidy 0,4 - 0,5% m/v sole mineralne, kwas mlekowy, kwas cytrynowy, mocznik, kwas

moczowy

Światowa produkcja serwatki – ponad 145 mln ton/rok

Zastosowanie serwatki

Zastosowanie serwatki

Przemysł spożywczy

Produkcja biogazu

Produkcja kwasów

organicznych

Produkcja SCP

Produkcja laktozy

Przemysł paszowy

Przemysł spożywczy

Przemysł farmaceutyczny

Przemysł chemiczny

50% wytwarzanej na świecie serwatki jest przetwarzane

Serwatkasurowiec do produkcji etanolu

Najwięksi światowi producenci etanolu z serwatki Anchor Ethanol Company, Nowa Zelandia (17-21 mln l/rok) Golden Cheese Company of California, USA Cerbery Ballineen Company, Irlandia

Wykorzystywane szczepy – Kluyveromyces fragilis bezpośrednia fermentacja laktozy z wytworzeniem etanolu wrażliwość na wysokie stężenie etanolu w płynie hodowlanym wrażliwość na wysokie stężenie sacharydów w płynie hodowlanym

Wydajność produkcji – 4% etanolu w płynie pohodowlanym

Etanol jako składnik biopaliw

Biopaliwo – paliwo zawierające powyżej 5% biokomponentu

bioetanolu eteru etylo-tert-butylowego

Wykorzystanie biopaliw w Polsce w 2005 r. biokomponenty – 0,48% wartości enetgetycznej paliw transportowych

Wykorzystanie biopaliw w Polsce w 2010 r. biokomponenty – 5,75% wartości energetycznej paliw transportowych

Klasyczna fermentacja alkoholowa

Wykorzystywane szczepy – Saccharomyces cerevisiae brak zdolności do bezpośredniej fermentacji laktozy z wytworzeniem

etanolu odporność na wysokie stężenie etanolu w płynie hodowlanym odporność na wysokie stężenie sacharydów w płynie hodowlanym

Produkcja etanolu z serwatki z wykorzystaniem szczepów S. cerevisiae

konieczność wstępnej hydrolizy laktozy

Rekombinantowy szczep S. cerevisiae zdolny do produkcji etanolu z serwatki

Charakterystyka szczepu• zawiera gen kodujący β-D-galaktozydazę K. lactis• zawiera gen kodujący permeazę laktozy K. lactis• geny pod kontrolą promotora CYC-GAL indukowanego galaktozą• zmutowany gen leu2d (marker selekcyjny) i sekwencja rDNA

umożliwiły uzyskanie stabilnych genetycznie rekombinantów

Wyniki badań• rekombinantowy szczep zdolny do utylizacji laktozy

• przesunięcie metabolizmu w kierunku tlenowej produkcji biomasy

kosztem fermentacji alkoholowej


Charakterystyka szczepu• zawiera gen kodujący β-D-galaktozydazę Aspergillus niger• gen klonowany z własną sekwencją sygnalną umożliwiającą

zewnątrzkomórkową produkcję białka• autonomiczna replikacja plazmidu ekspresyjnego

Wyniki badań• rekombinantowy szczep w niewielkim stopniu zdolny do utylizacji

laktozy (optymalne warunki działania enzymu pH = 3,5, temp. 65 °C)

• dwufazowość wzrostu

• niestabilność genetyczna


zdolność do zewnątrzkomórkowej produkcji β-D-galaktozydazy

• enzym wykazujący wysoką aktywność w warunkach prowadzenia fermentacji alkoholowej

• brak inhibicji enzymu produktami hydrolizy laktozy• brak inhibicji enzymu w obecności jonów wapnia

jednoczesna asymilacja glukozy i galaktozy stabilność genetyczna

brak elementów genetycznych pochodzenia bakteryjnego

Oczekiwane efekty wdrożenia wyników projektu do praktyki gospodarczej

tania, wydajna technologia produkcji etanolu pełniejsze wykorzystanie serwatki zmniejszenie zużycia paliw klasycznych poprzez szersze

wykorzystanie biopaliw zmniejszenie zanieczyszczenia środowiska naturalnego

Potencjalni odbiorcy wyników projektu

zakłady przemysłu gorzelniczego

zakłady przemysłu mleczarskiego

zakłady petrochemiczne

Konstrukcja rekombinantowego szczepu H. polymorpha zdolnego do wydajnej produkcji

etanolu z ksylozy

Surowiec – hydrolizat biomasy roślinnej (słoma, drewno) celuloza → glukoza hemiceluloza → głównie ksyloza lignina

ksyloza

ksyluloza

ksylulozo-5-fosforan

Cykl pentozofosforanowy

izomeraza ksylozowa

ksylulokinaza

ksyloza

ksylitol

ksyluloza

ksylulozo-5-fosforan

reduktaza ksylozowa

dehydrogenaza ksylitolu

ksylulokinaza

Bakterie Drożdże

Rekombinantowy szczep H. polymorpha zdolny do wydajnej produkcji etanolu z serwatki

Charakterystyka szczepu• zawiera mutacje w genie kodującym NAD(P)H-zależną reduktazę

ksylozową• zawiera mutacje w genach kodujących dwie NAD-zależne

dehydrogenazy ksylitolu• zawiera gen kodujący izomerazę ksylozową E. coli • zawiera dodatkowe geny kodujące ksylulokinazę H. polymorpha

Wyniki badań• czterokrotne zwiększenie wydajności produkcji etanolu z ksylozy

Podsumowanie

Drożdżowe systemy ekspresyjne to doskonałe narzędzie do produkcji heterologicznych białek

Nie ma jednego optymalnego systemu do produkcji wszystkich polipeptydów – wydajność produkcji zależy od stosowanego systemu i produkowanego białka

Możliwe jest skonstruowanie rekombinantowych szczepów drożdży zdolnych do produkcji metabolitów niebiałkowych z niekonwencjonalnych źródeł węgla

Drożdżowe systemy ekspresyjne

Documents

Transcript of Drożdżowe systemy ekspresyjne