1

dr Tomasz Lipiński WROCŁAWSKIE CENTRUM BADAŃ EIT+

DEFINICJE, WPROWADZENIE DO BADANIA TOKSYCZNOŚCI NANOMATERIAŁÓW

– METODY IN VITRO, IN VIVO, INTERPRETACJA WYNIKÓW, WADY I ZALETY STOSOWANYCH METOD

WROCŁAWSKIE CENTRUM BADAŃ EIT+

2

Nanomateriały – substancje, materiały pochodzenia naturalnego bądź wytworzone przez człowieka, których co najmniej 1 rozmiar zawiera się w przedziale od 1 do 100 nm.

ISO (International Organization for Standardization): "Material with any external dimension in the nanoscale or having internal structure in the nanoscale.„ Nanoscale: "Size range from approximately 1 nm to 100 nm„ European Commission: "A natural, incidental or manufactured material containing particles, in an unbound state or as an aggregate or as an agglomerate and for 50% or more of the particles in the number size distribution, one or more external dimensions is in the size range 1 nm – 100 nm. In specific cases and where warranted by concerns for the environment, health, safety or competitiveness the number size distribution threshold of 50% may be replaced by a threshold between 1% to 50%."

Definicje

3

10-1 10 102 103 104 105 106 107 108 1

. molekuła wody

glukoza przeciwciało wirus bakteria komórka kropka

piłka tenisowa

nanometry

4

Jak definiujemy toksyczność ?

Toksyczność - to właściwość związków chemicznych (nanomateriałów) polegająca na powodowaniu zaburzeń funkcjonowania komórek, tkanek, które w efekcie mogą prowadzić do trwałego uszkodzenia lub śmierci organizmu Genotoksyczność – przypadek szczególny; negatywny wpływ może być zaobserwowany czasem dopiero w kolejnym pokoleniu

Toksyczność pierwiastków, związków chemicznych nieorganicznych i organicznych- dobrze ustalone procedury, znane mechanizmy działania, Nanomateriały – nowe mechanizmy działania, duża zależność właściwości biologicznych i chemicznych od parametrów fizycznych (kształt, rozmiar ładunek powierzchniowy)

5

Toksykologia- nauka interdyscyplinarna

Dziedzina badań z obszaru biologii, chemii i medycyny podejmująca zagadnienia związane z niepożądanymi/ niekorzystnymi skutkami oddziaływania substancji na organizmy żywe, ale też badania zajmujące sposobami detekcji, zapobiegania i leczenia skutków zatruć u ludzi. Specjalizacje:

Toksykologia kliniczna Toksykologia chemiczna Toksykologia kryminalistyczna Toksykologia środowiskowa (toksykologia środowiska wodnego, ekotoksykologia) Nanotoksykologia – nowy obszar, „in statu nascendi’

6

Podział ze względu na poziom strukturalny Oddziaływanie na poziomie molekularnym (białka, kwasy nukleinowe) Oddziaływanie na organelle komórkowe Toksyczność komórkowa Toksyczność względem tkanek i narządów Toksyczność na poziomie całych organizmów - jednokomórkowce (bakterie grzyby, pierwotniaki) - organizmy wielokomórkowe (robaki, owady, bezkręgowce i kręgowce) Ze względu na model badawczy In vitro In vivo

Nanotoksykologia-obszary badawcze

7

Właściwości nanomateriałów- więcej niż prosta suma?

Substancje makro - dobrze zbadane i zdefiniowane - aktywność biologiczna zależna głównie od

właściwości chemicznych, dość dobrze przewidywalna

Substancje nanocząsteczkowe - znacznie rozwinięta powierzchnia - zwiększona reaktywność chemiczna - większa mobilność - nowe właściwości fizyczne np. optyczne Nieprzewidywalne efekty toksyczne !

8

Schorzenia związane z ekspozycją na nanomateriały

9

In vitro - badania na liniach komórkowych

Badane parametry: - przeżywalność (MTT, MTS, XTT, WST-1, CCK-8, Resazurin assay) - integralność błon (test LDH) - morfologia (mikroskopia świetlna i elektronowa) - potencjał proliferacyjny (cystometria przepływowa, inkorporacja

znakowanej tymidyny ) - powstawanie wolnych rodników (ROS) - analiza mechanizmu śmierci komórkowej (Aneksyna V) - wydzielanie cytokin (PCR, ELISA, cytometria przepływowa) - badania genotoksyczności (test kometkowy, Amesa, MLA, MNA)

Zalety: - niski koszt - możliwość wykonania w standardowym laboratorium Wady: - trudność przełożenia wyników na wyższy poziom skomplikowania- inny model badawczy, gatunek, czy toksyczność dla człowieka 10

Test CCK-8

Problemy: Interferencja badanego materiału z zastosowanym testem; np. nanomateriały oparte na węglu Monteiro-Riviere NA, Inman AO, Zhang LW. Limitations and relative utility of screening assays to assess engineered nanoparticle toxicity in a human cell line. Toxicology and applied pharmacology 2009;234(2): 222-235.

11

Test LDH

LDH- dehydrogenaza mleczanowa - występuje we wszystkich komórkach, uwalnia się do środowiska po ich uszkodzeniu. Pomiar poziomu uwolnionego enzymu pozwala określić stopień lizy komórek.

https://www.gbiosciences.com/Bioassays/CytoScan-LDH-Cytotoxicity-Assay

12

http://www.eclinpath.com/hematology/morphologic-features/white-blood-cells/toxic-change/normal-and-toxic-change-neutrophils-2

Neutrofile zdrowe Neutrofile uszkodzone

Morfologia komórki

https://www.nanowerk.com/spotlight/spotid=1216.php

Łatwość badania, duży panel dostępnych technik mikroskopowych

Mikroskopia elektronowa Mikroskopia świetlna

13

Potencjał proliferacyjny- test EdU

EdU= (5-ethynyl-2’-deoxyuridine)

EdU Cell Proliferation Assay. Millipore Inc. cat. nr. 17-10528

Test polega na pomiarze inkorporacji analogu tymidyny do nowosyntezowanego DNA podczas podziałów komórkowych. Analog posiada grupę alkinową, do której sprzęga się barwnik fluorescencyjny metodą „ click chemistry”. Wybarwione komórki analizuje się na cytometrze przepływowym

14

Niefluorescencyjny prekursor DCFH-DA łatwo przenika przez błonę komórkową. W komórce dochodzi do jego deacetylacji przez esterazy komórkowe do prekursora , który akumuluje się w komórce, w obecności rodników tlenowych, hydroksylowych ulega utlenieniu do silnie fluorescencyjnego barwnika DCF

http://labomics.com/index.php/ros-assay-kit-for-detection-of-ros-in-live-cells.html

Analiza ROS

15

Detekcja apoptozy – test z aneksyną V

Podczas procesu apoptozy dochodzi do ekspozycji fosfatydyloseryny na zewnętrznej powierzchni błony komórkowej. Test zawiera równomolowe ilości dwóch białek fuzyjnych aneksyny V z komplementarnymi podjednostkami lucyferazy. Związanie obu form aneksyny V z błoną komórkową poprzez fosfatydyloserynę prowadzi do zbliżenia podjednostek lucyferazy i utworzenia funkcjonalnego enzymu. Fluorescencję można czytnikiem płytek. Test zawiera też barwnik tworzący kompleksy fluorescencyjne z DNA, co umożliwia jednoczesne wykrywanie nekrozy.

RealTime-Glo™ Annexin V Apoptosis and Necrosis Assay. Promega Corporation 16

Wydzielanie cytokin

• Dostępnych jest wiele metod, najważniejsze to PCR, ELISA

Wydzielanie cytokin niekoniecznie świadczy bezpośrednio o toksyczności, lecz raczej o potencjalnej toksyczności , wynikającej z zaburzenia funkcjonowania na poziomie całego organizmu przez nadmierne wydzielanie cytokin .

https://www.biolegend.com/legendplex

17

Badanie genotoksyczności

Test kometowy: Test został opracowany przez Ӧstlinga i Johansona w 1984 roku. Komórki są unieruchamiane w agarozie i nanoszone na szkiełka mikroskopowe. Po lizie komórek preparat jest poddawany elektroforezie i wybarwianiu bromkiem etydyny (barwnik wiążący DNA). Metoda pozwala na wykrycie uszkodzeń DNA oraz na badanie kinetyki naprawy DNA na poziomie pojedynczej komórki.

https://www.bioalternatives.com/en/catalog/nhdf-dna-damage-comet-assay-h2o2-stimulation/ 18

Badanie genotoksyczności

Test AMESA: Metoda opracowana przez Brucea Amesa w latach 70 –tych XX w. W teście wykorzystuje się aukstroficzne szczepy bakterii Salmonella typhimurium posiadających mutację w operonie histydyny. Czynniki mutagenne powodują tzw. mutacje powrotne dzięki którym bakterie mogą rosnąć na niesuplementowanej pożywce (podłoże minimalne). Liczba kolonii rosnących na pożywce minimalnej w odniesieniu do próbki nie poddanej działaniu mutagenu świadczy o sile mutagennej czynnika.

19

Test mutacji HGPRT i kinazy tymidynowej Fosforybozylotransferaza hipoksantynowo-guaninowa (HGPRT) jest ważnym enzymem uczestniczącym w biosyntezie DNA. Katalizuje konwersję hipoksantyny do monofosforanu inozyny i guaniny do mononfosforanu guaniny. Dodanie do hodowli prekursora toksycznego analogu powoduje obumarcie komórek, u których nie doszło do mutacji. W komórkach ze zmutownym genem nie dochodzi do powstania i wbudowania toksycznego analogu dzięki czemu komórki przeżywają. Podobny schemat wykorzystuje test mysiego szpiczaka (MLA) w którym badana jest mutacja w obrębie genu kinazy tymidynowej Istotną zaletą jest możliwość wykorzystania linii komórek ludzkich Tą techniką wykazano np., że nanocząstki TiO2 , nano- silica , nanocząstki srebra mają duży potencjał mutagenny.

20

Test mikrojądrowy (MNA) Test pozwala ocenić wpływ czynników genotoksycznych poprzez obserwację tzw. mikrojąder – struktur powstających w jądrach dzielących się komórek w przypadku pojawienia się uszkodzeń chromosomów. Często wykorzystywana linia to kmórki CHO-K1 (ang. Chinese Hamster Ovary Cell Line). Można badać praktycznie każdego rodzaju komórki.

http://www.ichtj.waw.pl/POIG/cerad/index.php?var=biological-dosimetry

http://www.kul.pl/test-mikroj-drowy-mn-widoczna-fragmentacja-j-dra-erytrocyty-karpia-cyprinus-carpio-barwione-oran-em-akrydyny,gal_12042.html 21

Badanie proteomiczne i metabolomiczne

Wang, Y., Li, C., and Chen, C. (2016) Methods and Techniques in Molecular Toxicology of Nanomaterials. Toxicology of Nanomaterials 231–256.

W badaniach proteomicznych bada się całość syntezowanych przez komórkę białek. Poprzez porównanie proteomu komórek traktowanych i nietraktowanych badanym czynnikiem można określić jego wpływ na syntezę białek. Konieczne są wysokoprzepustowe techniki analityczne: Spektrometria mass Elektroforeza 2D mikromatryce

22

Podobnie w badaniach metabolomicznych wykonuje się profile metaboliczne głównie technikami spektrometrii mass np. LC-MS, GC-MS

Przykładowy schemat analizy proteomiczno- metabolomicznej oddziaływania złota koloidalnego na komórki ludzkiego raka jelita grubego.

Gioria, S., Vicente, J. L., Barboro, P., Spina, R. L., Tomasi, G., Urbán, P., Kinsner-Ovaskainen, A., François, R., and Chassaigne, H. (2016) A combined proteomics and metabolomics approach to assess the effects of gold nanoparticlesin vitro. Nanotoxicology 10, 736–748.

23

Mapa ukazująca deregulację białek w wydzielonych grupach, odpowiedzialnych za różne obszary funkcjonalne komórki.

24

Badania in-vivo

Zalety: - Wyniki są bardziej miarodajne, uwzględniają większą ilość czynników i kompleksowość układu. - Możliwość analizy wpływu środowiskowego, wydłużonego w czasie, oddziaływania międzypokoleniowego - Informacje na temat sposobu wnikania, dystrybucji, akumulacji, wydzielania, metabolizmu - Możliwość zbadania wpływu na płodność

Wady: - Względy etyczne - Wysokie koszty

25

Drosophila mealnogaster (muszka owocowa) Caenorhabditis elegans (nicień glebowy) Danio pręgowany Mysz Szczur Chomik Świnka morska Króliki Psy Koty świnie

Zwierzęta doświadczalne

26

W badaniach in-vivo określa się inne aspekty toksyczności, niemożliwe do zbadania w modelach in-vitro, takie jak: Toksyczność ostra (LD50) Toksyczność przewlekła Toksyczność podprzewlekła Działanie alergiczne Działanie rakotwórcze (ściśle związane z działaniem

mutagennym), teratogenne i embriotoksyczne Wpływ na płodność i rozrodczość Działanie drażniące na oczy i skórę Sposoby detoksykacji i leczenia

27

Badane parametry: Badania ogólne przyżyciowe wygląd, zachowanie, aktywność, pobieranie pokarmu, temperatura ciała, waga przed i po eksperymencie, śmiertelność w grupie Badania hematologiczne ( parametry krwi takie jak hematokryt, hemoglobina, obraz krwinek, czas krzepnięcia itd.) Badania biochemiczne – poziom w surowicy: białka, glukozy , mocznika, cholesterolu elektrolitów, aktywność enzymów wątrobowych , badanie moczu i kału, badania oczu

Po eutanazji: Analiza wagi i wyglądu narządów Analiza histopatologiczna Badanie dystrybucji materiału

28

Nowe koncepcje: Badania genomiczne Ivask, A., Elbadawy, A., Kaweeteerawat, C., Boren, D., Fischer, H., Ji, Z., Godwin, H. A. (2014). Toxicity Mechanisms in Escherichia coli Vary for Silver Nanoparticles and Differ from Ionic Silver. ACS Nano, 8(1), 374-386. doi:10.1021/nn4044047

Metody in silico quantitative structure-activity relationships (QSARs) Kuz׳min, V. E.; Puzyn, T.; Cronin, M. T. Development of computational models for the prediction of the toxicity of nanomaterials. Perspectives in Science 2015, 3 (1-4), 27–29.

Komórki pluripotentne Handral, H. K., Tong, H. J., Islam, I., Sriram, G., Rosa, V., & Cao, T. (2016). Pluripotent stem cells: An in vitro model for nanotoxicity assessments. Journal of Applied Toxicology, 36(10), 1250-1258. doi:10.1002/jat.3347

Zebra fish (Danio pręgowany) Chakraborty, C., Sharma, A. R., Sharma, G., & Lee, S. (2016). Zebrafish: A complete animal model to enumerate the nanoparticle toxicity. Journal of Nanobiotechnology, 14(1). doi:10.1186/s12951-016-0217-6

29

Wnioski

30

Nanomateriały ze względu na zależność właściwości od wielu parametrów wymagają indywidualnego podejścia

Nanotoksykologia nie opracowała jeszcze standardów badań wpływu nanomateriałów na organizmy żywe

Toksykologia środowiskowa- szczególnie istotna ze względu na trwałość nanomateriałów i zdolność do akumulacji

Konieczność odpowiedzi na szereg pytań np. jak określić definicję dawki?

Potrzeba opracowania nowych modeli badawczych

Dziękuję za uwagę!

31

10-1 10 102 103 104 105 106 107 108 1

. molekuła wody

glukoza przeciwciało wirus bakteria komórka kropka

piłka tenisowa

nanometry

32