Dichroizm kołowyDichroizm kołowy

Zjawisko dichroizmu kołowego (CD) jest rodzajem

spektroskopii absorpcyjnej pozwalającej na mierzenie

różnic w absorpcji światła lewoskrętnie i prawoskrętnie

spolaryzowanego kołowo.

PODSTAWYPODSTAWY

Jeśli wektor elektryczny oscyluje wzdłuż jednej linii, wówczas takie fale elektromagnetyczne nazywamy spolaryzowanymi liniowo.

Kiedy dwie fale spolaryzowane liniowo w dwóch

różnych płaszczyznach, skierowane w tym samym

kierunku, różnią się od siebie fazą mamy do czynienia

wówczas z polaryzacją kołową

Superpozycja dwóch fal o tych samych amplitudach, prostopadłych do siebie,

różniące się od siebie fazą (+90o, - 90o)

Kołowo spolaryzowane fale w medium absorbującym

Próka optycznie nieaktywna

Próka optycznie aktywna

Światło spolaryzowane

[] (mdeg) – obserwowana eliptyczność

[OR]

Kołowo spolaryzowane fale w medium absorbującym o właściwościach optycznych

Cetonia aurata Światło lewoskrętnie spolaryzowane

Chiloloba acuta

Świetlikowate, robaczki świętojańskie (Lampyridae)

Całkowite wewnętrzne odbicie

Światło lewoskrętnie spolaryzowanle

Światło prawoskrętnie spolaryzowanle

Światło niespolaryzowanle

Dla roztworu o A = 1 A = 10-4 – 10-6

ABSORBCJA ŚWIATŁAABSORBCJA ŚWIATŁA

10][][

cl

[] (deg*cm2*decimol-1) – eliptyczność molowa

l (cm) – długość ścieżki optycznej

c (mol/dm3) – stężenie substancji

[] (mdeg) – eliptyczność

ELIPTYCZNOŚĆ MOLOWAELIPTYCZNOŚĆ MOLOWA

ŚREDNIA ELIPTYCZNOŚĆ MOLOWA NA ŚREDNIA ELIPTYCZNOŚĆ MOLOWA NA RESZTĘ AMINOKWASOWĄRESZTĘ AMINOKWASOWĄ

n – ilość aminokwasów w białku

Przejścia w obrębie grup amidowych:n* (~220nm)o* (~200nm)

Elektryczny dipolowy moment przejścia amidowego n* (n*) (~220nm)

Elektryczny dipolowy moment przejścia amidowego o* ( o*) (~200nm)

Typowe widma struktur 2-rzędowych białek

Poli -Lys in 25oC:pH 10.8 () pH 11.1 (after 15min in 52oC) () pH 7.0 (r)

Widma Absorpcyjne oraz Widma Absorpcyjne oraz

CD zredukowanego i CD zredukowanego i

utlenionego cytochromu cutlenionego cytochromu c11

Dehydrogenaza aldehydu 3-fosfoglicerynianiowegow 0.1M NaF pH 7.0

Sybtylizyna w 0.1M NaF pH 7.0

.... - dopasowane składowe oraz

N-DCX C-DCXN-DCX C-DCX

Model of doublecortin tandem

Structure of the N-terminal domain of doublecortin

N-term

C-term

(nm)

(d

eg

cm

2

dmol

-1) x

106

-2.5

-2

-1.5

-1

-0.5

0

0.5

195 205 215 225 235 245 255

TandemN-termC-term

Circular dichroism spectra of isolated domains and DCX-tandem of doublecortin

Measurements were performed in 50 mM phosphate, 300mM NaCl, pH 7.0, protein concentration: 50M

TandemN-DCXC-DCX

-80

30

-50

0

200 260220 240

CD

Wavelength[nm]

Widmo CD N-DCX of doublecortin

95oC21oC

0.1<Kden<10

100 N 0

0 D 100

Tden (Tm) temperature

denaturant ½ [denaturant]

Zależność stopnia sfałdowania białka od temperatury

60 80

-30

-25

-20

-15

-30

-25

-20

-15

60 80

-0.5

-0.25

0

0.25

0.5

-0.5

-0.25

0

0.25

0.5

Krzywa denaturacyjna N-DCX (25mM bufor fosforanowy, pH 6.0, Hden = 83.9 kcal/mol, Tden = 74.57 oC.

Temperature (oC)

CD

RTGGdmHClm

RTGGdmHClmGdmHClbaGdmHClba

F Hden

Hden

uunn

0

0

2

2

][exp

][exp][][

an+bn[GdmHCl] - intensywność fluorescencji stanu natywnegoau+bu[GdmHCl] - intensywność fluorescencji stanu zdenaturowanegom - zależność Gden od [GdmHCl]Gden - zmiana swobodnej entalpii denaturacji

Analiza krzywej denaturacyjnej

Measurement was performed in 25mM phosphate pH 7.3, 0.7M GdmHCl, heating rate = 0.25 oC/min, protein conc.= 80 g/ml. The transition was monitored by the increase of fluorescence at 353nm on excitation at 280nm

604020

1

0.8

0.6

0.4

0.2

0

Frac

tion

unfo

lded

Temperature (oC)

Tm = 40.5 oC, HvH = 68.9 kcal/mol

Denaturacja termiczna FGF

Denaturacja chemiczna FGF

21.510.50

1

0.8

0.6

0.4

0.2

0

Frac

tion

unfo

lded

GdmHCl (M)

G = 5.53 kcal/molGdm½ = 1.13 Mm = 4.8 kcal/mol M

Measurements were performed in 25mM phosphate pH 7.3, protein concentration = 25 g/ml. The transitions were monitored by the increase of fluorescence at 353nm on excitation at 280nm

Thermal unfolding transition of N-DCX and DCX-tandem of doublecortin

Measurements were performed in 25mM phosphate, 300mM NaCl, pH 7.0, heating rate = 1oC/min, protein conc.= 20 g/ml. Transitions were monitored by the changes of the CD signal at 220nm.

Tden (oC)

Hden (kcal/mol)

N-DCX 70.6 84.6 Tandem 64.9 41.3

10080604020

1.2

1

0.8

0.6

0.4

0.2

0

Temperature [oC]

Frac

tion

unfo

lded

pH8.07.05.95.04.03.02.0

pH titration of N-DCX of doublecortin

pH titration of N-DCX of doublecortin

PDB: 1axm

Asn 18 Lys 112 Lys 113 Asn 114 Lys 118 Arg 119 Arg 122 Gln 127 Lys 128

FGF-1 - Heparynafibroblast growth factor

Circular dichroism spectra of the wild-type of FGF-1 (○), V109I (■), H102Y (▲), L44F (Δ),F108Y (□) and H21Y (●) mutants.

Widma CD mutantów FGF-1

Normalized thermal denaturation curves of the wild-type (○), V109I (■), H102Y (▲), L44F (Δ), F108Y (□), H21Y (●) mutants monitored by changes of fluorescence (a) or ellipticity (b).

Denaturacja termiczna wariantów FGF-1

a b

Parametry denaturacji chemicznej mutantów FGF-1 w obecności heparyny

Mutant Tm H Tm H (oC) (kcal/mol) (oC) (kcal/mol)

WT 40.1 63.0 54.8 68.9V109I 39.9 69.3 54.1 71.9F108Y 40.7 66.2 54.6 74.3H102Y 42.2 78.5 54.9 83.4H21Y 42.8 67.3 56.6 83.3L44F 43.1 72.5 54.6 87.4

80604020

1

0.8

0.6

0.4

0.2

0

Temperature [oC]

Frac

tion

unfo

lded

Thermal induced unfolding were performed in 25mM phosphate, 1.5M Urea, pH 7.3, scan rate 0.25 oC/min. 10x molar excess of heparin were used.The transitions were monitored by the residual ellipticity at 227 nm

Struktura trzeciorzędowa białek