________________________________________________________________________

__

www.memslab.pl

1

ZASTOSOWANIE MIKROSYSTEMÓW W MEDYCYNIE

LABORATORIUM

Ćwiczenie nr 5

INSTRUMENT LAB-ON-A-CHIP DO ELEKTROFORETYCZNEJ

ANALIZY MATERIAŁU GENETYCZNEGO

Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z podstawami elektroforetycznej analizy materiału

genetycznego w laboratoriach chipowych (lab-chipach) oraz budową i właściwościami

instrumentu lab-on-a-chip do tej metody. W ramach ćwiczenia zostaną wyznaczone

współczynniki migracji elektroforetycznej µ próbek (barwników fluorescencyjnych)

z uwzględnieniem różnych parametrów procesu elektroforezy.

Wprowadzenie

Elektroforeza jest jedną najważniejszych metod analityczno-preparatywnych, znajdującą

szerokie zastosowanie m.in. w chemii, biologii molekularnej, diagnostyce medycznej.

W szczególności, elektroforeza jest podstawowym narzędziem w badaniach genetycznych,

takich jak: analizy kryminalistyczne, testy ojcostwa, genetyczny „odcisk palca”, wykrywanie

mutacji genowych, badanie lekooporności.

Elektroforeza jest techniką elektroseparacyjną, umożliwia rozdzielenie i/lub wydzielenie

składników mieszaniny w polu elektrycznym. Podstawą tej metody jest rozdzielenie cząstek

(jonów, związków) ze względu na różną ich ruchliwość w kolumnie separacyjnej, wypełnionej

ciekłym elektrolitem (buforem), w wyniku oddziaływania pola elektrycznego (Rys. 1).

Kierunek i szybkość migracji rozdzielanych cząstek zależy m.in. od ich ładunku elektrycznego,

masy cząsteczkowej, kształtu, wymiaru. Wpływ na jakość rozdziału mają nastawy parametrów

procesu, takie jak: natężenie pola elektrycznego, temperatura kolumny, rodzaj wypełnienia.

Rys. 1. Mechanizm elektroforetycznego rozdzielenia cząstek w kolumnie separacyjnej

Prędkość migracji elektroforetycznej cząstek v w kolumnie (kanale separacyjnym lab-chipa)

zależy od natężenia pola elektrycznego E oraz od współczynnika migracji µ, który

charakteryzuje zdolność przemieszczania się cząstek. Innym sposobem wyznaczenia tej

wielkości jest pomiar czasu migracji tm dla efektywnej drogi migracji Leff, która odpowiada

odległości od punktu wstrzyknięcia próbki do punktu jej wykrycia przez detektor:

(1)

________________________________________________________________________

__

www.memslab.pl

2

Natężenie pola elektrycznego E odpowiada napięciu elektrycznemu U przyłożonemu do

końców kanału separacyjnego, podzielonemu przez całkowitą długość tego kanału L:

(2)

Kluczowym parametrem w analizie elektroforetycznej jest współczynnik migracji µ, który

jest często wyznaczany eksperymentalnie na podstawie równania (1). Wartość współczynnika

może być porównana z bazą danych próbek, co pozwala na identyfikację składników próbki.

W analizie materiału genetycznego wykorzystuje się zależność współczynnika migracji od

długości fragmentu DNA, tzn. im fragment jest dłuższy, tym większe opory napotyka podczas

migracji. W rezultacie, fragmenty materiału genetycznego ulegają rozdzieleniu i są

wykrywane przez detektor jako osobne frakcje (prążki, piki).

Detekcja fluorymetryczna

W instrumentach lab-on-a-chip najczęściej stosuje się metody detekcji optycznej, z których

największą czułością charakteryzuje się metoda fluorymetryczna ze wzbudzeniem

fluorescencji światłem laserowym (LIF). W tej metodzie składniki próbki są oznakowane

barwnikami fluorescencyjnymi (fluoroforami). Barwniki te w wyniku wzbudzenia światłem

o długości fali λab emitują światło o długości fali λem, przy czym zwykle λab < λem.

Rozdzielone frakcje, migrując kolejno przez obszar detekcji w końcowej części kanału

separacyjnego są oświetlane światłem lasera (λab) i emitują błyski światła fluorescencji

wzbudzonej (λem). Błyski te są rejestrowane przez detektor (kamerę CCD), a sygnał jest

przetwarzany do postaci charakterystyki czasowej (elektroferogramu).

Elektroferogramy

Elektroferogram jest zapisem czasowym sygnału detektora, umożliwiającym analizę

ilościową i jakościową próbki. Do najważniejszych parametrów elektroferogramu zaliczamy

czas migracji tM i wysokość H (Rys. 2).

Rys. 2. Elektroferogram dla pomiarów czasu migracji

________________________________________________________________________

__

www.memslab.pl

3

Czas migracji liczony jest od momentu wstrzyknięcia próbki do kanału (dozowanie) do

momentu wykrycia frakcji przez detektor, co odpowiada 90% wartości maksymalnej sygnału

przed pojawieniem się piku lub plateau.

Stanowisko pomiarowe

W ćwiczeniu studenci zapoznają się z instrumentem lab-on-a-chip do elektroforetycznej

analizy materiału genetycznego, opracowanym w Zakładzie Mikroinżynierii i Fotowoltaiki

WEMiF PWr. Instrument ten był wykorzystywany do analizy jedno- i dwuniciowych

fragmentów materiału genetycznego. W ramach ćwiczenia wykorzystywane będą barwniki

fluorescencyjne, migrujące podobnie jak fragmenty DNA, o określonej długości.

Najważniejsze elementy stanowiska pomiarowego to: chip do elektroforezy, stacja dokująca,

komputer z oprogramowaniem (Rys. 3).

Rys. 3. Stanowisko pomiarowe

1. Chip do elektroforezy

Chip jest szklaną strukturą o wymiarach 35 mm × 17 mm × 2 mm, zawierającą

mikroprzepływowe układy dozowania i separacji próbki (Rys. 4). Chip jest wykonany

w całości ze szkła borowo-krzemionkowego typu Pyrex®, z wykorzystaniem metod

mikroinżynierii. Układy mikrofluidyczne są wytworzone w jednym podłożu szklanym

techniką trawienia mokrego; w drugim podłożu wykonane są otwory przelotowe. Podłoża

są połączone metodą bondingu termicznego, bez użycia warstw pośrednich.

a)

b)

c)

Rys. 4. Chip do elektroforezy: a) schemat funkcjonalny, b) schemat przekroju, c) widok

________________________________________________________________________

__

www.memslab.pl

4

Chip umieszczony jest w dwuczęściowej, polimerowej obudowie, tzw. module (Rys. 5).

Górna strona modułu, wykonana z PTFE (Teflon®), zawiera zbiorniczki cieczowe na bufor

oraz okno detekcji optycznej. W bocznej części modułu znajduje się apertura, umożliwiająca

wprowadzenie wiązki światła laserowego do szklanego chipa.

a)

b)

c)

Rys. 5. Moduł chipa: a) schemat funkcjonalny, b) schemat przekroju, c) widok

Przed analizą kanały chipa oraz zbiorniczki cieczowe modułu są wypełniane ciekłym

elektrolitem (buforem). Gotowy do pracy moduł umieszczany jest w stacji dokującej, gdzie

wykonywane są dalsze etapy analizy. Po zakończeniu procesu, bufor jest usuwany, a kanały

i zbiorniczki oczyszczane za pomocą wskazanych odczynników. Po osuszeniu modułu, chip

jest „zregenerowany” i gotowy do ponownego użycia.

Stanowisko przygotowania chipa

Do przygotowania chipa do pracy oraz jego regeneracji wykorzystywane są pipety

laboratoryjne, strzykawka, jednorazowe końcówki (tipsy) oraz pompka (Rys. 6a). Pipety

umożliwiają pobranie i dozowanie precyzyjnie odmierzonej objętości cieczy. Na stanowisku

dostępne są pipety na zakres 1-10 µL (szara) oraz 10-100 µL (żółta). Pipety wyposażone są w

pokrętła nastawy dozy, spust oraz tłoczek pracujący na dwóch poziomach (Rys. 6b).

Pipety mogą być używane przez studentów dopiero po przeprowadzeniu

instruktażu przez prowadzącego. Zabrania się przekręcania nastawy dozy poza

dopuszczalny zakres pipety.

Przed skorzystaniem z pipety, należy wybrać dedykowane do niej tipsy.

a)

b)

Rys. 6. Stanowisko do przygotowania chipa: a) widok stanowiska, b) pipety laboratoryjne

________________________________________________________________________

__

www.memslab.pl

5

Procedura pobierania cieczy pipetą:

1. sprawdzić czy wymagana objętość dozy jest dobrze ustawiona, jeśli nie to ustawić ją

pokrętłem (nie przekraczać skrajnych wartości!),

2. założyć na pipetę odpowiednią końcówkę (tipsa),

3. wcisnąć tłoczek do pierwszego poziomu, aby wypuścić powietrze,

4. trzymając pipetę w pionie zanurzyć tipsa w cieczy i stopniowo zwolnić tłoczek,

5. poczekać, aż poziom cieczy w tipsie przestanie podnosić się; wyjąć tipsa z cieczy.

Procedura dozowania cieczy pipetą:

1. ustawić pipetę pionowo nad obszarem dozowania i wcisnąć tłoczek do drugiego poziomu,

2. po opróżnieniu tipsa, odsunąć końcówkę pipety od miejsca dozowania i zwolnić tłoczek.

3. wyrzucić tipsa do pojemnika na odpady (użyć odpowiedniego spustu na pipecie).

Pipety nie wolno obracać do góry nogami lub kłaść poziomo - pracujemy z pipetą

ustawioną pionowo lub, jeśli musimy zwolnić rękę, zawieszamy ją na stojaku.

Przygotowanie chipa do analizy

Przed rozpoczęciem pracy upewnić się czy kanały i zbiorniczki modułu są opróżnione.

1. Czyszczenie mikrokanałów chipa

Pobrać bufor z pojemnika C (4 x 50 µL, żółta pipeta) i wypełnić nim kolejno 4 puste

zbiorniczki, następnie oczyścić mikrokanały używając pompki (opis poniżej). Upewnić

się, że kanały i zbiorniczki są puste (odwrócić chipa).

2. Wypełnienie buforem

Pobrać 0,25 mL buforu z pojemnika B do strzykawki medycznej. Delikatnie wprowadzić

końcówkę strzykawki do zbiorniczka 1 (Rys. 7a) i wpasować, aby połączenie było

szczelne. Powoli naciskając tłok strzykawki wypełnić buforem mikrokanały i zbiorniczki

2-4. Zakończyć proces, gdy zbiorniczek 2 będzie wypełniony buforem. Ostrożnie usunąć

strzykawkę, aby nie wytworzyć bąbli powietrza w zbiorniczku 1. Uzupełnić poziom

buforu we wszystkich zbiorniczkach korzystając z żółtej pipety, przy czym

w zbiorniczkach 1 i 2 powinien być menisk wypukły. Sprawdzić, czy w zbiorniczkach

1 i 2 nie ma bąbli powietrza i czy widoczny jest otwór wlotowy oraz fragment kanału

separacyjnego. Jeśli wytworzył się bąbel powietrza, należy zaciągnąć go z dna

zbiorniczka za pomocą pipety, a następnie uzupełnić poziom buforu w zbiorniczku. Bufor

pozostały w strzykawce lub pipecie można zlać do pojemnika B. Na koniec należy

sprawdzić, czy bufor nie rozlał się na obudowie chipie lub czy nie przedostał się przez

uszczelkę (chip należy obejrzeć z obu stron).

3. Umieszczenie chipa w platformie pomiarowej stacji dokującej.

Otworzyć pokrywę, podnieść uchwyty elektrod (Rys. 8 i 9a), położyć chipa zgodnie ze

schematem w aplikacji pomiarowej (Rys. 9b). Opuścić elektrody i sprawdzić czy są one

zanurzone w buforze w zbiorniczkach 1 i 2 (Rys.9c).

Ustawić parametry stacji dokującej (napięcie, temperaturę, opis poniżej, Rys. 10).

4. Wprowadzenie próbki

________________________________________________________________________

__

www.memslab.pl

6

Pobrać z probówki 1 µL granatowego barwnika za pomocą szarej pipety. Barwnik jest

silnie brudzący, więc probówkę należy otwierać i zamykać ostrożnie, uważając by nie

rozchlapać cieczy. Próbówkę zamknąć natychmiast po pobraniu. Próbkę wprowadzić do

zbiorniczka nr 2 (Rys. 7b).

5. Rozpoczęcie analizy

Zamknąć pokrywę i nacisnąć kontrolkę START w panelu oprogramowania sterującego

(Rys. 11). Czas pomiędzy wprowadzeniem próbki a uruchomieniem elektroforezy

powinien być jak najkrótszy i najlepiej jednakowy, np. 30 sekund.

a)

b)

Rys. 7. Przygotowanie chipa: a) wprowadzenie buforu, b) wprowadzenie próbki

Regeneracja chipa

Po zakończeniu każdej analizy, należy oczyścić zbiorniczki i kanały chipa za pomocą

pompki. Na końcówkę rurki należy założyć tips 10 µL i uruchomić pompkę. Wsunąć tips do

kolejnych zbiorniczków, zaczynając od zbiorniczka 2, i wyciągnąć próbkę oraz bufor.

W zbiorniczkach 1 i 2 wycelować końcem tipsa w otwór wlotowy tak, aby wyciągnąć próbkę

i bufor także z kanału mikrofluidycznego (należy delikatnie poruszać tipsem i przytrzymać go

chwilę w otworze mikrokanału). Przed kolejnym krokiem upewnić się, że kanały chipa są

opróżnione.

Na koniec wyczyścić chipa buforem C, jak opisano wcześniej w punkcie 1.

2. Stacja dokująca

Stacja dokująca jest mechatronicznym urządzeniem umożliwiającym przeprowadzenie

elektroforezy w lab-chipach (Rys. 8). Kluczowymi podzespołami stacji są: układ generacji

wysokiego napięcia (HV), układ regulacji temperatury oraz układ detekcji fluorymetrycznej

ze wzbudzeniem laserowym.

Rys. 8. Stacja dokująca instrumentu do elektroforetycznej analizy lab-on-a-chip

________________________________________________________________________

__

www.memslab.pl

7

a)

b)

c)

Rys. 9. Umieszczanie modułu chipa w stacji dokującej

Przed rozpoczęciem analizy należy włączyć zasilanie układów stacji dokującej: włącznik

główny z prawej strony urządzenia oraz włączniki HV, lasera i regulacji temperatury na

panelu frontowym (Rys 10a).

Wartość napięcia elektrycznego HV doprowadzanego do chipa jest ustawiana prawym

potencjometrem na panelu frontowym stacji dokującej i mierzona za pomocą zewnętrznego

woltomierza (Rys. 10b).

a)

b)

Rys. 10. Panel frontowy stacji dokującej (a), woltomierz (b)

Stacja dokująca wytwarza potencjalnie niebezpieczne napięcie w zakresie

100–1000 VDC. Przed rozpoczęciem pracy, należy sprawdzić czy multimetr jest

ustawiony na pomiar napięcia DC w zakresie do 1000 V. Wysokie napięcie jest

podawane na elektrody przez uruchomienie oprogramowania sterującego

(zapala się wtedy czerwona dioda na panelu frontowym stacji dokującej).

W razie wątpliwości prosić o pomoc prowadzącego.

3. Oprogramowanie sterujące

Pracą stacji zarządza komputer z oprogramowaniem sterującym. Oprogramowanie

wykorzystuje graficzny interfejs użytkownika (LabVIEW) i umożliwia nastawę parametrów

analizy (m.in. wartości temperatury), przetwarzanie sygnałów oraz prezentację i zapis

wyników elektroforezy.

Panel kontrolny zawiera podgląd z kamery CCD obszaru detekcji lab-chipa w czasie

elektroforezy (okno detekcji), wykresy czasowe sygnału fluorescencji i temperatury oraz

przycisk START (Rys 11). Wbudowany algorytm przetwarzania sygnałów pozwala na

________________________________________________________________________

__

www.memslab.pl

8

jednoczesną obserwację obrazu kamery i przetwarzanie sygnału detektora podczas procesu.

Po wybraniu wartości napięcia i umieszczeniu lab-chipa w stacji dokującej, należy wybrać

nastawę temperatury (25 °C) i wcisnąć START.

W czasie analizy należy obserwować okno detekcji (zaznaczyć je w miejscu mikrokanałów)

i zmiany sygnału fluorescencji na elektroferogramie. Pojawienie się próbki widoczne jest jako

rozbłysk w oknie detekcji i dynamiczny wzrost sygnału detektora. Analiza zakończy się

automatycznie (po 5 minutach). Jeśli wzrost sygnału fluorescencji pojawi się wcześniej

można skrócić proces analizy.

Rys. 11. Panel kontrolny oprogramowania sterującego

Sygnał detektora zostanie zapisany w tekstowym pliku wynikowym, w katalogu na pulpicie.

Nazwa pliku wynikowego pojawi się po zakończeniu analizy. Plik zawiera dwie kolumny

danych: pierwsza – czas procesu liczony w milisekundach, druga – wartość sygnału detektora.

Po zakończeniu ćwiczenia studenci kopiują pliki wynikowe, przetwarzają dane w dowolnym

arkuszu kalkulacyjnym (np. Excel, Calc, Origin) i wyznaczają parametry: H, tM, a następie

wyznaczają prędkość migracji i współczynnik migracji. Obliczone parametry przedstawiają

w sprawozdaniu w tabeli zbiorczej, z uwzględnieniem nastaw procesu analizy.

Przebieg ćwiczenia

Przed przystąpieniem do ćwiczenia:

zapoznaj się z instrukcją,

zapoznaj się z obsługą pipet laboratoryjnych,

pracę z odczynnikami wykonuj w rękawiczkach ochronnych,

pliki wynikowe, potrzebne do przygotowania sprawozdania, będzie można wysłać na

adres e-mail po zakończeniu ćwiczenia; zaleca się jednak przyniesienie na zajęcia

pamięci USB i skopiowanie plików wynikowych.

Ćwiczenie: W ramach ćwiczenia studenci mierzą czas migracji tM próbki dla nastaw napięcia w zakresie

200-800 V dla temperatury 25°C. Analizę należy rozpocząć od najwyższej wartości napięcia

________________________________________________________________________

__

www.memslab.pl

9

(800 V). Po wykonaniu serii dla wszystkich napięć, można zmienić wartość temperatury

i wykonać serię pomiarów dla temperatury chipa równej15°C lub 35°C.

Procedura analizy:

1. Przygotować chip (bufor, próbka),

2. Ustawić wartość napięcia (800 V; 600 V; 400 V; 200 V),

3. Wybrać nastawę temperatury (25°C, 15°C; 35°C),

4. Wcisnąć START, obserwować wykres fluorescencji i zanotować tM,

5. Po zakończeniu każdej analizy zregenerować chipa (przepłukać koniecznie buforem C).

Sprawozdanie:

Przetworzyć pliki wynikowe w arkuszu kalkulacyjnym (np. Excel, Calc, Origin)

Przedstawić aproksymowane wykresy v = f (E) dla temperatury jako parametru.

Wyznaczyć parametry: tM, H, 90% H, v, µ i przedstawić w tabeli podając odpowiednie

jednostki:

Nr procesu Napięcie Temperatura tM H 0,9 H v µ

1 800 V 25°C … … … … …

2 … … … … … … …

W obliczeniach przyjąć: L = 30 mm, Leff = 27 mm.

Opisać wpływ parametrów elektroforezy na wartość v i µ.

Opisać powtarzalność wykonywanych operacji przygotowania i regeneracji chipa. Czy

mogły mieć one wpływ na wyniki? Jeśli tak, to które wartości wyników to obrazują?

Zagadnienia do przygotowania:

1. Podstawy elektroforezy lab-on-a-chip: schemat, opis i zasada pracy chipa oraz wzory.

2. Konstrukcja modułu oraz szklanego chipa do elektroforezy.

3. Co to jest elektroforeza i gdzie znajduje zastosowanie?

Literatura

1. W. Kubicki, R. Walczak, J. Dziuban, Injection, separation and fluorimetric detection of DNA in glass lab-on-a-chip for capillary electrophoresis, Optica Applicata (2011) 41:409-416

2. Publikacje na temat elektroforetycznej analizy lab-on-a-chip