Zakład Biofizyki, IFD UW1

Czynniki inicjujące translację – determinanty oporności roślin na wirusy z rodziny Potyviridae

Anna Kropiwnicka

dr Joanna Żuberek

Zakład Biofizyki, IFD UW2

Inicjacja translacji u Eukaryota

Robaglia et al. (2006) Trends Plant Sci. 11, 40

Zakład Biofizyki, IFD UW3

Roślinny kompleks inicjujący translację

eIF4E i eIF(iso)4E~50% podobieństwa w sekwencji aa~24 kDa

eIF4G - 180 kDa eIF(iso)4G - 86 kDa eIF4F i eIF(iso)4F

Podobna aktywność przeprowadzania translacji in-vitroeIF(iso)4F preferuje hipermetylowane kapy i mRNA mniej ustrukturyzowaneeIF4F bardziej wydajny w prowadzeniu translacji niezależnej od kapu (RNA ustrukturyzowane i z wewnętrznymi miejscami inicjacji)

oraz w warunkach inhibicji translacji zależnej od kapu

Arabidopsis thaliana:

Robaglia et al. (2006) Trends Plant Sci. 11, 40

Zakład Biofizyki, IFD UW4

Potywirusy – postrach roślin

Rodzaj Potyvirus jest największy wśród wirusów roślinnych

To ok. 30% wszystkich znanych wirusów roślinnych

Najbardziej powszechne i niszczycielskie

Duże straty w rolnictwie – atakują wiele ważnych roślin uprawnych

Nawet 50% straty w zimowej produkcji jęczmienia w Europie i Wschodniej Azji z powodu: Barley yellow mosaic virus Barley mild mosaic virus

Zakład Biofizyki, IFD UW5

Wirusy z rodziny Potyviridae

Genom - jednoniciowe RNA o dodatniej polarności (ok. 10 kb)

Należą trzy rodzaje:Potyvirus i Rymovirus - jeden segment RNABymovirus - genom podzielony na dwa segmenty

VPg (viral genome-linked protein) kowalencyjnie związane z 5`-końcem RNA

Każdy segment koduje jedną poliproteinęWycinanie z poliproteiny przynajmniej 8 dojrzałych białek przez wirusowe proteazy

Robaglia et al. (2006) Trends Plant Sci. 11, 40

Zakład Biofizyki, IFD UW6

~25 kDa Prekursor NIa:

N – VPg wewnętrzne miejsce cięcia proteaza C

VPg wiąże się kowalencyjnie (przez Tyr) do nowo syntetyzowanego RNA

Rola w cyklu życiowym potywirusa:

Oddziaływanie z wirusową polimerazą RNA -> replikacja

Akumulacja w jądrze -> replikacja?

Oddziaływanie z eIF4E lub eIF(iso)4E warunkuje zajście

infekcji wirusowej

Potywirusowe VPg

Zakład Biofizyki, IFD UW7

Postulowane funkcje izoform eIF4E podczas infekcji

Oddziaływanie VPg-eIF4E ułatwia translację niezależną od kapu Utworzenie ciasnej pętli

Inhibicja eIF4E-zależnej translacji w komórce -> uwolnienie rybosomów

Ruch z komórki do komórki

Replikacja genomu

Stabilność wirusowego RNA

Utworzenie ciasnej pętli podczas inicjacji replikacji Urydylowane VPg primerem

Lellis et al. (2002) Current Biol. 12, 1046

Dreher et al. (2006) Virology 344, 185

Zakład Biofizyki, IFD UW8

Oporność roślin

Zaburzone oddziaływanie VPg-izoforma eIF4E uniemożliwia rozwój infekcji potywirusowej -> roślina uzyskuje oporność

Oporność recesywna – nieadekwatność lub brak czynnika wymaganego w cyklu życiowym wirusa

Geny oporności o charakterze dominującym - odpowiedź nadwrażliwości na infekcję (gen-za-gen)

Wiele naturalnych genów oporności na potywirusy

Ponad połowa ma charakter recesywny i stanowi ok. 40% wszystkich znanych recesywnych genów oporności

Znaczna część to zmutowane czynniki inicjujące translację, szczególnie izoformy eIF4E

Zakład Biofizyki, IFD UW9

Recesywne geny oporności na wirusy PotyviridaeRodzaj Wirus Roślina Gen / *Mutant eIF

Potyvirus PVY Pieprz pvr1, pvr21-pvr29 4E

TEV pvr1, pvr22 4E

PVMV pvr22 + pvr6 4E+(iso)4E

PVY, TEV Pomidor pot-1 4E

PSbMV Groch sbm1, sbm4 4E

LMV Sałata mo11, mo12 4E

CIYVV A.thaliana *eIF4E1

TuMV, LMV, TEV, PPV

lsp1, *eIF(iso)4E

CIYVV *eIF4G

LMV, PPV *eIF(iso)4G1

TuMV, PPV *eIF(iso)4G1 + *eIF(iso)4G2

Bymovirus BaYMV, BaMMV

Jęczmień rym4-rym6, eif4e1 4E

Robaglia et al. (2006) Trends Plant Sci. 11, 40

Zakład Biofizyki, IFD UW10

eIF4E pszenicy

Mutacje związane z opornością:PieprzPomidorGroch SałataJęczmieńWspólne

Domena wiążąca eIF4G

Monzingo et al. (2007) Plant Physiol. 143, 1504

Zakład Biofizyki, IFD UW11

Interakcja VPg-eIF4E

Dwa miejsca oddziaływania VPg z eIF4E Region wokół kieszeni wiążącej kap Region obrócony o 90º względem domeny wiążącej kap

Częściowe pokrycie się strefy interakcji eIF4E-kap z rejonem oddziaływania eIF4E-VPg

Precyzyjne kontakty optymalizowane dla danej pary VPg/eIF4E

Zdolność wirusów do przełamywania oporności Koewolucja między gospodarzem pragnącym uniemożliwić

wiązanie eIF4E-VPg a potywirusem usiłującym ten kontakt odzyskać

Zakład Biofizyki, IFD UW12

Pieprz (Capsicum spp.)Rodzaj Wirus Roślina Gen / *Mutant eIF

Potyvirus PVY Pieprz pvr1, pvr21-pvr29 4E

TEV pvr1, pvr22 4E

PVMV pvr22 + pvr6 4E+(iso)4E

PVY, TEV Pomidor pot-1 4E

PSbMV Groch sbm1, sbm4 4E

LMV Sałata mo11, mo12 4E

CIYVV A.thaliana *eIF4E1

TuMV, LMV, TEV, PPV

lsp1, *eIF(iso)4E

CIYVV *eIF4G

LMV, PPV *eIF(iso)4G1

TuMV, PPV *eIF(iso)4G1 + *eIF(iso)4G2

Bymovirus BaYMV, BaMMV

Jęczmień rym4-rym6, eif4e1 4E

Robaglia et al. (2006) Trends Plant Sci. 11, 40

Zakład Biofizyki, IFD UW13

pvr1, pvr21, pvr22

Allele tego samego genu kodującego eIF4E

pvr1 – C. chinese pvr2 – C. annuum

Przemianowanie pvr21 na pvr11 itd. Oporność na Potato virus Y (PVY) i Tobacco etch virus (TEV)

Substytucje w allelach

PVY-0 PVY-0,1 TEV

pvr1 R nd R

pvr21 R S S

pvr22 R R R

Yeam et al. (2007) Plant Cell 19, 2913

Zakład Biofizyki, IFD UW14

Mutanty z pojedynczymi substytucjami Zbadanie oddziaływania in-vitro z VPg różnych szczepów TEV i

wiązania kapu

Brak oddziaływania pojedynczego mutanta G107R z VPg potwierdzony in-vivo

Substytucja G107R odpowiedzialna za oporność na TEVT51A i P66T negatywnie wpływają na efekt uzyskany przez G107R

pvr1 + pvr22 – oporność na wszystkie cztery szczepy TEV

HAT NW N Mex21 kap

pvr1 R R R S –

pvr21 S S S S + / –

pvr22 R R S R + / –

T51A + + + + +

P66T + + + + +

G107R – – – – –

V67E + – + + +

L79R + + – – + / –

D109N + + + + +

Yeam et al. (2007) Plant Cell 19, 2913

Zakład Biofizyki, IFD UW15

pvr1, pvr21 – pvr29

Identyfikacja dodatkowych alleli pvr2

Koewolucja między szczepami TEV i PVY a Capsicum spp.Znacznie więcej miejsc polimorficznych w sekwencjach kodujących niż w intronach

Przełamywanie oporności poprzez odzyskanie kontaktu ze zmutowanymi eIF4E, a nie z innymi izoformami

51 66 67 68 73 74 79 107 109 205 PVY-0 PVY-O,1,2 TEV-HAT TEV-CAA10

pvr2+ T P V A A A L G D D S S S S

pvr21 E R R S S S

pvr22 E R/L N R S R S

pvr23 E G R S S S

pvr24 E R S S S

pvr25 T E D R R S S

pvr26 E D D G R R S S

pvr27 E R G R R S S

pvr28 E R R R S S

pvr29 E D G R R S S

pvr1 A T R R nd R nd

Zakład Biofizyki, IFD UW16

pvr22 + pvr6 C. annuum

pvr22 koduje funkcjonalne eIF4E(V67E, L79R i D109N)

pvr6 koduje niefunkcjonalne eIF(iso)4E

Delecja w I egzonie (89-107)bp -> kodon stop po 51 aa Dodatkowo substytucje G268A, C483A i C537T 29 aa z zachowywanych aa na N-końcu

(Białko niezmutowane - 202 aa)

Brak residuów kluczowych dla wiązania kapu (m.in. ośmiu Trp)

Oporność na Pepper veinal mottle virus (PVMV):

pvr2 – wrażliwy pvr6 – wrażliwy

pvr22 + pvr6 – oporny PVMV może zamiennie wykorzystywać eIF4E i eIF(iso)4E Fenotyp roślin normalny -> Izoforma kodowana przez pvr6+

nie jest niezbędna do prawidłowego rozwoju

Zakład Biofizyki, IFD UW17

Pomidor (Lycopersicon spp.)Rodzaj Wirus Roślina Gen / *Mutant eIF

Potyvirus PVY Pieprz pvr1, pvr21-pvr29 4E

TEV pvr1, pvr22 4E

PVMV pvr22 + pvr6 4E+(iso)4E

PVY, TEV Pomidor pot-1 4E

PSbMV Groch sbm1, sbm4 4E

LMV Sałata mo11, mo12 4E

CIYVV A.thaliana *eIF4E1

TuMV, LMV, TEV, PPV

lsp1, *eIF(iso)4E

CIYVV *eIF4G

LMV, PPV *eIF(iso)4G1

TuMV, PPV *eIF(iso)4G1 + *eIF(iso)4G2

Bymovirus BaYMV, BaMMV

Jęczmień rym4-rym6, eif4e1 4E

Robaglia et al. (2006) Trends Plant Sci. 11, 40

Zakład Biofizyki, IFD UW18

pot-1 pot-1 ortologiem pvr2

Ta sama lokalizacja genomowa86,6% identyczność sekwencji aaOporność na PVY i TEV

Koduje eIF4E Substytucje: L48F, N68K, A77D i M109I

Położenia mutacji powiązanych z opornością:pvr2, mo1, sbm1

Ruffel et al. (2005) Mol Gen Genomics 274, 346

Zakład Biofizyki, IFD UW19

Groch (Pisum sativum)Rodzaj Wirus Roślina Gen / *Mutant eIF

Potyvirus PVY Pieprz pvr1, pvr21-pvr29 4E

TEV pvr1, pvr22 4E

PVMV pvr22 + pvr6 4E+(iso)4E

PVY, TEV Pomidor pot-1 4E

PSbMV Groch sbm1, sbm4 4E

LMV Sałata mo11, mo12 4E

CIYVV A.thaliana *eIF4E1

TuMV, LMV, TEV, PPV

lsp1, *eIF(iso)4E

CIYVV *eIF4G

LMV, PPV *eIF(iso)4G1

TuMV, PPV *eIF(iso)4G1 + *eIF(iso)4G2

Bymovirus BaYMV, BaMMV

Jęczmień rym4-rym6, eif4e1 4E

Robaglia et al. (2006) Trends Plant Sci. 11, 40

Zakład Biofizyki, IFD UW20

sbm1 i sbm4 Allele tego samego genu kodującego eIF4E

Przemianowanie sbm4 na sbm11 Oporność na Pea seed-borne mosaic virus (PSbMV):

sbm1 – oporny na PSbMV-P1, sbm4 – oporny na PSbMV-P4 Mutacje w allelach:

sbm1 W6L A73D A74D – G107R N169Ksbm11 – A73P A74D S77Δ – –

Położenia mutacji powiązanych z opornością:pvr2 – kółka, mo1 – trójkąty

PSbMV wykorzystuje produkt sbm1+ przy multiplikacji i przemieszczaniu z komórki do komórkisbm1 – zapewne zablokowana replikacja, ale ruch z komórki do komórki obecny

sbm11 – zapewne zablokowana multiplikacja, nie wiadomo czy jest przemieszczanie

sbm1sbm11

sbm1+

sbm1sbm11

sbm1+

Gao et al. (2004) Plant J 40, 376

Zakład Biofizyki, IFD UW21

Jęczmień (Hordeum vulgare)Rodzaj Wirus Roślina Gen / *Mutant eIF

Potyvirus PVY Pieprz pvr1, pvr21-pvr29 4E

TEV pvr1, pvr22 4E

PVMV pvr22 + pvr6 4E+(iso)4E

PVY, TEV Pomidor pot-1 4E

PSbMV Groch sbm1, sbm4 4E

LMV Sałata mo11, mo12 4E

CIYVV A.thaliana *eIF4E1

TuMV, LMV, TEV, PPV

lsp1, *eIF(iso)4E

CIYVV *eIF4G

LMV, PPV *eIF(iso)4G1

TuMV, PPV *eIF(iso)4G1 + *eIF(iso)4G2

Bymovirus BaYMV, BaMMV

Jęczmień rym4-rym6, eif4e1 4E

Robaglia et al. (2006) Trends Plant Sci. 11, 40

Zakład Biofizyki, IFD UW22

rym4, rym5, rym6, eif4e1

Allele tego samego genu kodującego eIF4E Oporność na Barley yellow mosaic virus (BaYMV) i Barley

mild mosaic virus (BaMMV)

Podobne strategie przeciwko Potyviridae u jednoliściennych i u dwuliściennych

Mutacje eIF4E jako stare ewolucyjnie geny oporności na wirusy

52 53 57 109 118 120 160 161 205 206

wt N P S E K T N Q S D

rym4 F T / I / F G

rym5 S D K

rym6 S S G H F G

eif4e1 S H

Monzingo et al. (2007) Plant Physiol. 143, 1504

Mutacje związane z opornością:

Pieprz Pomidor Groch Sałata Jęczmień

Wspólne

Zakład Biofizyki, IFD UW23

Rzodkiewnik (Arabidopsis thaliana)Rodzaj Wirus Roślina Gen / *Mutant eIF

Potyvirus PVY Pieprz pvr1, pvr21-pvr29 4E

TEV pvr1, pvr22 4E

PVMV pvr22 + pvr6 4E+(iso)4E

PVY, TEV Pomidor pot-1 4E

PSbMV Groch sbm1, sbm4 4E

LMV Sałata mo11, mo12 4E

CIYVV A.thaliana *eIF4E1

TuMV, LMV, TEV, PPV

lsp1, *eIF(iso)4E

CIYVV *eIF4G

LMV, PPV *eIF(iso)4G1

TuMV, PPV *eIF(iso)4G1 + *eIF(iso)4G2

Bymovirus BaYMV, BaMMV

Jęczmień rym4-rym6, eif4e1 4E

Robaglia et al. (2006) Trends Plant Sci. 11, 40

Zakład Biofizyki, IFD UW24

Mutanty A. thaliana

Null allele eIF4E1 -cum1-1 – EMS-zaindukowany stop kodon w I egzonie

-T-DNA insercja w I intronie

Null allele eIF(iso)4E-AteIF(iso)4E-1 – insercja tranpozonu Spm w II egzon

-lsp1-1 – EMS-zaindukowany stop kodon w I egzonie (kodon 63)

-lsp1-2 – EMS-zaindukowany stop kodon w II egzonie (kodon 120)

-lsp1-3 – EMS-zaindukowany stop kodon w II egzonie (kodon 120)

i punktowa mutacja w I intronie

Null allele izoform eIF4GPojedyncze T-DNA insercje w geny:

AteIF4G, AteIF(iso)4G1 i AteIF(iso)4G2

Sato et al. (2005) FEBS Letters 579, 1167

Lellis et al. (2002) Current Biol 12, 1046

Zakład Biofizyki, IFD UW25

Mutanty A. thaliana

Wrażliwość na potywirusyTEV-Tobacco etch virus

PPV-Plum pox virus

LMV-Lettuce mosaic virus

CIYVV-Clover yellow vein virus

TuMV-Turnip mosaic virus

Potywirusy preferują kompleksy eIF4E-eIF4G, które naturalnie tworzą eIF4F w komórce

TuMV VPg może wymiennie oddziaływać z obiema izoformami eIF(iso)4G

TEV PPV LMV CIYVV TuMV

wt S S S S S

eIF4E1 nd S S R S

eIF(iso)4E R R R S R

eIF4G nd S S R S

eIF(iso)4G1 nd R R S S

eIF(iso)4G2 nd S S S S

eIF4G + eIF(iso)4G1 nd nd nd nd S

eIF4G + eIF(iso)4G2 Brak – mutacja letalna?

eIF(iso)4G1 + eIF(iso)4G2 nd R nd nd R

Zakład Biofizyki, IFD UW26

Nie tylko rośliny... Calicivirus

Ludzki wirus Norwalk (NV) i wirus Lorsdale, koci Feline calicivirus (FCV), mysi Murine norovirus (MNV) i inneGłówna przyczyna pozabakteryjnych epidemicznych zapaleń żołądka i jelit na świecie (~85%)Zwierzęta – zaburzenia oddechowe, krwotoki, „koci katar”

Genom – RNA o dodatniej polarności, 7-8 kbPoliadenylowane i kowalencyjnie związane z VPg (12-13 kDa)Brak kapu i brak IRES

Dotychczas zauważono, że: VPg oddziałuje z eIF4E, interakcja niewrażliwa na analogi kapu Inhibicja kap-zależnej i IRES-zależnej translacji w RRL Translacja wirusowego RNA zależy od jego kowalencyjnego

powiązania z dojrzałym VPg, niewrażliwa na analogi kapu, wymaga eIF4A oraz:

FCV – hamowana przez 4E-BP, wymaga eIF4E i eIF4G zdolnego do wiązania eIF4E

MNV – niewrażliwa na 4E-BP, nie potrzebuje oddziaływania z eIF4E, ani interakcji eIF4E-eIF4G

Zakład Biofizyki, IFD UW27

Dziękuję za uwagę!