Czy pokrywanie się śladów jonowych może

wytłumaczyć kwadratową zależność krzywych dawka-efekt

obserwowanych dla aberracji chromosomowych ?

125.01.2018, Warszawa Agata Kowalska

1. MOTYWACJA

2. METODYKA

3. WYNIKI EKSPERYMENTALNE3. WYNIKI EKSPERYMENTALNE

4. MODELOWANIE TEORETYCZNE

5. PODSUMOWANIE I PERSPEKTYWY

2

CEL PROWADZENIA BADAŃ RADIOBIOLOGICZNYCH

Pik Bragga

RADIOTERAPIA OCHRONA RADIOLOGICZNA

poszukiwanie tzw.

Terapia węglowa (2 pola) Terapia fotonowa (9 pól)

Jäkel et al, Med Phys 35, 2008

poszukiwanie tzw. „radiation fingerprint”

ochrona przed pierwotnym i wtórnympromieniowaniem kosmicznym

3

LET

ŚLADY JONOWE

Fazy fizyczne Rozkład elektronów – rozkład dawki Faza biologiczna –aberracje chromosomowe

Średnia strata energetyczna na jednostkę drogi [keV/μm] vs Liniowy przekaz energii (LET) [keV/μm]

- LET odnosi się do tarcz mikrobiologicznych - LET nie uwzględnia wkładu od

elektronów δ o energiach > 100 eV4

SCHEMAT ODPOWIEDZI KOMÓREK NA PROMIENIOWANIE JONIZUJĄCE

ZDROWE KOMÓRKI

USZKODZENIE DNA

NAPRAWA

Start:t≈10-5 s

FAZA BIOLOGICZNA

SUKCES !PRAWIDŁOWA NAPRAWA

BRAK ABERRACJI=

PRZEŻYCIE

PORAŻKA !ABERRACJE

APOPTOZA TRANSFORMACJANOWOTWOROWA

PRZEDWCZESNE RÓŻNICOWANIE

Ritter S., Durante M. Heavy-ion induced chromosomal aberrations: A review, Mut. Res., 701 (1) :38-46 (2010)

5

Mikroskopowy rozkład dawki a statystyczny rozkład aberracji

Rozkład Poissona:

k – liczba aberracji na komórkęλp - średnia liczba aberracji na

komórkę w populacji

Rozkład Neymana

n – liczba uderzeń w komórkęλN - średnia liczba uderzeń

w komórkęμ – średnia liczba aberracji na komórkę

na każde uderzenie

KRZYWE DAWKA-EFEKT

Local Effect Model

gęstośćaberracji

gęstośćdawki

∝

fotony ciężkiejony

RADIOTERAPIA

Ne: 50 MeV/u; LET:136 keV/µm

γ : 1.3 MeV; LET:0.2 keV/µm

NAPRAWAUSZKODZEŃ

POKRYWANIE ŚLADÓW

JONOWYCH

7

1. MOTYWACJA

2. METODYKA

3. WYNIKI EKSPERYMENTALNE3. WYNIKI EKSPERYMENTALNE

4. MODELOWANIE TEORETYCZNE

5. PODSUMOWANIE I PERSPEKTYWY

8

σ ≈ 25μm2

LIMFOCYTY KRWI OBWODOWEJ:

� Łatwo dostępna tkanka

� Mało inwazyjny sposób pobrania

� Zsynchronizowana populacja

� Wrażliwość na promieniowanie jonizujące

limfocytów zbliżona jest do wrażliwości

komórek szpiku kostnego

METODYKA

CHROMOSOMY WIDOCZNE SĄ JEDYNIE W METAFAZIE PODZIAŁU KOMÓRKOWEGO!

9

PROCEDURA PRZYGOTOWANIA MATERIAŁU BADAWCZEGO

IrradiationCell culture

(48 h; 370C; 5% CO2)

Fixation

• drop fixator

(metanol+acetic acid)

• centrifuge 1200 rpm, 10 min

• remove supernatant

ABERRACJE CHROMOSOMOWE

J.R.K. Savage J Med. Genetics 12,103-122 (1975)

• centrifuge 1000 rpm, 10 min;

• remove supernatant

• drop KCl

• keep 20 min in 370 C

• centrifuge 1000 rpm, 10 min;

• remove supernatant

• remove supernatant

• repeat this process

• drop on slides

prepared material

• stain with Giemsa

IAEA Cytogenetic dosimetry: application in preparedness for and response to radiation emergencies. IAEA, Vienna (2011)10

PhasotronJINR, Dubna

� Promieniowanie referencyjne:

Kwanty γ z rozpadu 60Co

� Dawki:

0.5 ; 0.75 ; 1.0 ; 1.5 ; 2.0 ; 3.0 Gy

PARAMETRY WIĄZEK UŻYTYCH DO NAPROMIENIOWANIA

AkceleratorITEP-TWAC Moskwa

Cyklotron MC-400JINR, Dubna Aparat radioterapeutyczny

Rokus-M, JINR, Dubna

11

150 MeV

~20 MeVNAPROMIENIANIE PROTONAMI

1.Komory jonizacyjne 2. Kolimator I 3. Filtr grzebieniowy 4. Kolimator II

5. blok z plexiglasu (o szerokości odpowiadającej 40mm wody) 6. Kolimator III

7. blok z plexiglasu (o dowolnie dobranej szerokości) 8. próbka krwi

J. Kubancak, A.G. Molokanov, Measurements of LET spectra of JINR

phasotron radiotherapy proton beam, BATH, 6,8-14, 2013

SOBP

150 MeV

12

NAPROMIENIANIE JONAMI BORU

sample container (~0.2 ml)

1.5 mm

13 mmIZOLACJA LIMFOCYTÓW

A.A. Bezbakh et al.,Upgrading the Genome Facility for Radiobiological Experiments with Heavy-Ion Beams, Physics of

Particles and Nuclei Letters, 10, 175-178, 2013

13

1. MOTYWACJA

2. METODYKA

3. WYNIKI EKSPERYMENTALNE3. WYNIKI EKSPERYMENTALNE

4. MODELOWANIE TEORETYCZNE

5. PODSUMOWANIE I PERSPEKTYWY

14

ROZKAŁADY STATAYSTYCZNE ABERRACJI CHROMOSOMOWYCHDLA WYBRANYCH DAWEK - PRZYKŁADY

150 MeV protons; Poisson fit1,0

60Co γ irradiation; Poisson fitPOISSON

n – liczba uderzeń w komórkę;

λN - średnia liczba uderzeń w komórkę;

μ – średnia liczba aberracji na komórkę

na każde uderzenie

����� = ��� ����� ��� = � ����−�!

∞

�=0∙ ��

� �−���!

∞

�=0= ! �

��! ��

−∞

�=0����

0 2 4 6 8 10 12 14 16

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0 11B ions; Neyman fit

0.2 Gy

λP=0.36; λ

Ν=0.43; µ=0.84; X2

= 0.34

0.5 Gy

λP=1.17; λ

N=1.07; µ=1.06; X2

=3.48

1.5 Gy

λP=3.4; λ

N=3.2; µ=1.05; X 2

=0.85

Fre

que

ncy

Number of total aberrations/cell

NEYMAN A

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Number of total aberrations/ cell

SOBP protons ; Poisson fit

0.5 Gy

λP=0.14 ; X

2= 0.54

3 Gy

λP=1.82 ; X

2= 1.84

5 Gy

λP=4.1 ; X

2= 1.34

150 MeV protons; Poisson fit

0.5 Gy

λP=0.09 X

2= 0.62

3 Gy

λP=1.32 X

2= 1.59

5 Gy

λP=3.6 X

2= 0.64

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,060Co γ irradiation; Poisson fit

0.5 Gy

λP=0.14; X 2

=0.48

2 Gy

λP=0.78; X 2

=1.11

3 Gy

λP=1.68; X 2

=0.90

Fre

qu

en

cy

0 2 4 6 8 10 12 14 16

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0 12C ions; Poisson fit

0.8 Gy

λP= 0.43 X 2

= 0.31

2.92 Gy

λP= 2.48 X 2

= 0.62

4.44 Gy

λP= 4.51 X 2

= 2.29

Fre

qu

en

cy

Number of total aberrations/cell

POISSON

15

ROZKŁADY STATYSTYCZNE ABERRACJI CHROMOSOMOWYCH –POISSON VS. NEYMAN A + ZALEŻNOŚĆ PARAMETRU μ OD DAWKI

0 2 4 6 8 10 12 141E-3

0,01

0,1

1

Fre

quen

cy

12C ions

3.22 Gy

Poisson fit

λP=3.4 X

2=0.24

Neyman fit

λN=30.7 µ=0.11 X

2=0.44

Number of total aberrations/cell

0 2 4 6 8 10 12 141E-3

0,01

0,1

111

B ions

1.5 Gy

Poisson fit

λP=3.39; X

2= 4.2

Neyman fit

λN=3.22; µ=1.05; X

2=0.86

Fre

quency

Number of total aberrations/cell

λN - średnia liczba uderzeń w komórkę

λp - średnia liczba aberracji na komórkę

μ – średnia liczba aberracji na komórkę na każde uderzenie

0 1 2 3 4 5 6

1E-3

0,01

0,1

1 µ 150 MeV p( linear fit )

µ SOBP p ( linear fit )

µ 12C ions ( linear fit )

µ 11

B ions ( linear fit)

Mean n

um

ber

of aberr

ations

in

duced b

y s

ingle

hit −

µ

Dose (Gy)

Zależność parametru μ od dawki:

na każde uderzenie

� największy wzrost dla protonów (SOBP i150 MeV)

� dla 11B parametr μ nie zależy od dawki

POKRYWANIE SIĘ ŚLADÓW JONOWYCH ?

16submitted to Rad. Env. Biophys.

0 1 2 3 4 5 6

0

1

2

3

4

5 60

Co γ rays

high energy protons

SOBP protons

12

C ions

11

B ions

exchange type a

berr

ations/c

ell

Dose (Gy)

KRZYWE DAWKA-EFEKT

ZŁAMANIAWYMIANA ELEMENTÓW CHROMATYD

0 1 2 3 4 5 6

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5 60

Co γ rays

high energy protons

SOBP protons

12C ions

11B ions

chro

mosom

e a

nd

chro

matid b

rea

ks/c

ell

Dose (Gy)0 1 2 3 4 5

0

1

2

3

4

5

SOBP protons

60

Co γ rays

high energy protons

11

B ions

12

C ions

Yexchanges/Y

non-e

xcha

nge a

berr

ation types

Dose (Gy)

17EPJ D (2015)

1

2

3

4

5

6

7 60

Co γ rays

high energy protons

SOBP protons

12

C ions

11

B ions

ab

err

atio

n n

um

be

r/ce

ll

KRZYWE DAWKA-EFEKT

LET α

0 1 2 3 4 5 6

0

1ab

err

atio

n n

um

be

r/ce

ll

Dose (Gy)

LET α

β=const

fit

parameters

60Co γ

rays

high energy

protons

SOBP

protons 12

C ions 11

B ions

Total

aberration

yield

α 0.10±0.05 0.07±0.03 0.18±0.04 0.46±0.06 2.2±0.1

β 0.15±0.02 0.13±0.01 0.13±0.01 0.12±0.01 -

Int. 0.02±0.01 0.02±0.01 0.02±0.01 0.01±0.01 0.006±0.009

LET

(keV/μm) - 0.2 0.57 1.31 16 76

18

WZGLĘDNA SKUTECZNOŚĆ BIOLOGICZNA – (RELATIVE BIOLOGICAL EFFECTIVENESS – RBE)

10 SOBP protons

150 MeV protons

199 MeV/n C ions

22 MeV/n B ions

RB

Ee

ff

10 SOBP protons

150 MeV protons

199 MeV/n C ions

22 MeV/n B ions

RB

Ed

1 2 3 4 5 6

1

aberration number per cell

1 2 3 4 5 6

1

RB

EDose (Gy)

19

1. MOTYWACJA

2. METODYKA

3. WYNIKI EKSPERYMENTALNE3. WYNIKI EKSPERYMENTALNE

4. MODELOWANIE TEORETYCZNE

5. PODSUMOWANIE I PERSPEKTYWY

20

EFEKTYWNY PROMIEŃ ŚLADU JONOWEGO

średnia odległość między uderzeniami więcej uderzeń L

gęstość prawdopodobieństwa

odległości między śladami jonowymi

średnia powierzchnia pokrywających się śladów

kwadraty

okręgi

wsp. geometryczny

F≈0.58

związek między promieniemśladu a zakrzywieniem

odpowiedzi dawka-efekt:21

EFEKTYWNY PROMIEŃ FIZYCZNY R’ WYNIKAJĄCY Z ROZKŁADU DAWKI ELEKTRONÓW WOKÓŁ ŚLADU JONOWEGO

gęstość radialna dawki (radialny profil dawki)

0,01 0,1 1 10 100

1E-7

1E-6

1E-5

1E-4

1E-3

0,01

0,1

1 d

r(r)

R’

rc rp

dawka jednego śladu jonowego:

z drugiej strony:

efektywny promień fizyczny:

r (µm)

promień rdzenia rc :

promień otoczki rp:

22

EKSPERYMENT VS. TEORIA

A. Chatterjee, H.J. Schaefer, 1976

100

101

102

103

rc

R'

R, 12

C ions

R, 150 MeV p

R, SOBP p

Radiu

s (

nm

)

rc

(nm)

rp

(µm)

R

(nm)

R’

(nm)

(β/α)exp

(Gy -1

)

60Co γ rays - - 180±45 - 1.56±0.77

150 MeV protons 5.8 93 318±69 23.02 1.86±0.81

SOBP protons 2.32 8.14 287±32 9.65 0.72±0.17

12C ions 6.56 126.9 620±81 29.86 0.26±0.04

11B ions 2.55 9.65 - 10.95 -

BIOLOGIA CZY FIZYKA?

101

102

103

Energy (MeV/nucleon)

23EPJ D (2017)

BIOLOGIA CZY FIZYKA I

BIOLOGIA FIZYKA- POCZĄTKOWE USZKODZENIA DNA

BRAK POKRYWANIA SIĘ ŚLADÓW JONOWYCH t = 0 h

Repair C

oeffic

ient

RC

RC0

Repair C

oeffic

ient

Dose (Gy)D0

Dose (Gy)

(β/α)exp

(Gy -1

)

(β/α)phys

(Gy -1

)

(β/α)biol

(Gy -1

)

150 MeV protons 1.86±0.81 0.01 1.85

SOBP protons 0.72±0.17 0.009 0.71

12C ions 0.26±0.04 0.0005 0.259

24

1,5

2,0

2,5

3,0

) exp

(β/α)exp= 0.87 LET -0.44

(β/α)exp= 1.1 LET -2

FIZYKA CZY BIOLOGIA II

PRZEWIDYWANIA MODELU POKRYWAJĄCYCH SIĘ TRAKÓW:

FIZYKA:

BIOLOGIA:

0,1 1 10 100

0,0

0,5

1,0

(β/α

)

LET (keV/µm)PUNKTY POMIAROWE NALEŻA KOLEJNO DO: kwantów gamma z rozpadu 60Co, szybkich protonów,protonów z rozszerzonego piku Bragga, jonów węgla oraz jonów boru (przy założeniu, że β=1.13±0.01

ZAKŁADAJĄC DLA D→0:

WÓWCZAS:

25

EFEKTYWNOŚĆ MECHANIZMÓW REPERACJI

∑=

−−−−

=n

i i

iii xbxbay

n 12

22

212 )(

3

1

σχ

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0

0

20

40

60

80

100

120

Co 60 gamma irradiation

aberr

ation

nu

mber/

50 c

ells

dose (Gy)

12 =χ

rozrzut punktów pomiarowychdokoła krzywej teoretycznej:

funkcja chi kwadrat

Gdy (błędy są dobrze określone) σσ = 1=χ

Y

YRFk

p

'12

2 ===χ

= 1

1≥k222

iP ki

σσ =

∑=

−−−−

=n

i i

iiiP

k

xbxbay

n 122

22

212 )(

3

1

σχ

∑=

−−−−

=n

i i

iiiP

xbxbay

nk 12

22

21

2

2 )(

3

11

σχ

Gdy (błędy są dobrze określone)

Ale , wprowadzamy iPi σσ >

czynnik Fano

iPi σσ =

26Acta Phys. Pol. A (2018)

20

40

60

80

100

Re

pair

Coe

ffic

ien

t (R

C)

WSPÓŁCZYNNIK REPERACJI I PROCENT ZRPEROWANYCH CHROMOSOMÓW

0,1 1 10 100

0

20

Re

pair

Coe

ffic

ien

t (R

C)

LET (keV/µm)�2 RF RC (%)

60Co γ rays 0.31±0.20 3.2±2.0 69±20

150 MeV protons 0.37±0.23 2.7±1.7 63±23

SOBP protons 0.67±0.40 1.5±0.9 33±40

12C ions 0.26±0.18 3.8±2.7 73±18

11B ions 0.43±0.21 2.3±1.1 57±21

27

UNIWERSALNOŚĆ METODY

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

12

C ions

60

Co γ rays

aberr

ation n

um

ber/

cell

KOMÓRKI CHO-K1(CHINESE HAMSTER OVARY CELLS)

� KRÓTKI CYKL KOMÓRKOWY 12-14 h

www.phe-culturecollections.org.uk

0 1 2 3 4 5 6 70,0

Dose (Gy)

J. Czub et al., Cell survival and chromosomal aberrations in CHO-K1 cells irradiated by carbon

ions, Applied Radiation and Isotopes, 67, 447-453, 2009

Cell

type

Radiation

species

LET

(keV/m) �2 RF RC (%)

CHOK1

60Co γ rays 0.2 0.006±0.0025 160±70 99.0±0.3

8.09 MeV 12

C 830 0.44±0.28 2.3±1.4 56±28

� ZDOLNOŚCI ADHEZYJNE

� TWORZENIE KOLONII

� 22 CHROMOSOMY

28

1. MOTYWACJA

2. METODYKA

3. WYNIKI EKSPERYMENTALNE3. WYNIKI EKSPERYMENTALNE

4. MODELOWANIE TEORETYCZNE

5. PODSUMOWANIE I PERSPEKTYWY

29

PODSUMOWANIE

� Zaobserwowano:

o Stałą wartość parametru β modelu liniowo kwadratowego

o Zależność parametru μ z rozkładu Neymana A (opisującego prawdopodobieństwo

powstania aberracji na jedno uderzenie ) od dawki

o Dużą efektywność mechanizmów reperacji i ich dominujący wpływ na zakrzywienie

odpowiedzi dawka-efekt

o RBE<1 dla szybkich protonów

o Model pokrywających się śladów nie opisuje zależności β/α od LET

� Zaproponowano statystyczną metodę oszacowania mechanizmów reperacji �

faktor Fano dla aberracji chromosomowych

30

PERSPEKTYWY –PCC (Premature Chromosome Condensation)

31

ϒ-rays:~20 chromatidbreaks/cell/Gy

Caluculin A

PLANY NA PRZYSZŁOŚĆ

Badanie oddziaływania neutronów prędkich i termicznych z limfocytami krwi obwodowej• Eksperymenty w Dubnej – reakcje D-T, neutrony reaktorowe, Cf, Pu-Be, Am-Be• Eksperymenty w Szczecinie (eLBRUS) – reakcje D-D

Wykorzystanie metody PCC • Badanie mechanizmów reperacji komórkowej w zależności od czasu po napromienianiu• Wyznaczenie czynnika Fano w zależności od czasu po napromienianiu• Badanie rozkładów statystycznych uszkodzeń po napromienianiu neutronami –

32

• Badanie rozkładów statystycznych uszkodzeń po napromienianiu neutronami –wyjaśnienie obserwowanych odchyleń od statystyki Poissona

• Badanie efektów porywania się obszarów oddziaływania pojedynczych neutronów –rozdzielenie efektów fizycznych i biologicznych

GRUPA BADAWCZA

K. Czerski A. Kowalska E. Nasonova

33

K. CzerskiW. PereiraM. KaczmarskiN. Targosz-Ślęczka

A. Kowalska E. NasonovaP. KutsaloE. Krasavin

DZIĘKUJĘ ZA UWAGĘ !DZIĘKUJĘ ZA UWAGĘ !

34