PRZEDMOWAPodrcznik Chemia medyczna przeznaczony jest przede wszystkim dla studentw Akademii Medycznych, jako pomoc dydaktyczna podczas realizacji programu nauczania z chemii na I roku studiw i stanowi teoretyczne uzupenienie do wicze zawartych w Praktikum z chemii medycznej. W podrczniku przedstawiono wybrane wiadomoci z chemii oglnej, analitycznej, instrumentalnej oraz organicznej. Pocztkowe rozdziay w zwizy i nowy sposb przypominaj studentom wybrane wiadomoci z programu dydaktycznego szkoy redniej, ktre s niezbdne podczas realizacji nauczania chemii na I roku medycyny. Materia ten dotyczy wiza chemicznych, roztworw wodnych wraz ze sposobami wyraania ich ste, reakcji w roztworach wodnych oraz waciwoci roztworw buforowych. Cz z tych wiadomoci przedstawiono w formie zada z rozwizaniami, ktre stanowi wzorcowe przykady pozwalajce na ostateczne opanowanie podstawowych oblicze chemicznych. W tym te celu zamieszczono na kocu podrcznika szczegowy ukad okresowy i zestaw tabel z wybranymi parametrami fizykochemicznymi (rozdzia 22). Przedstawione w podrczniku informacje, dotyczce zagadnie rwnowagi wodno-elektrolitowej, skadnikw bionieorganicznych oraz rwnowagi kwasowo-zasadowej pynw ustrojowych niezbdne s do poznania i zrozumienia chemicznych podstaw mechanizmw homeostazy w roztworach wodnych ustroju. Wiadomoci te stanowi dla studenta medycyny podstawowy zakres nowej wiedzy chemicznej, ktr bdzie dalej pogbia podczas studiw. Dalsz cz stanowi chemia organiczna. Oglne podstawy z tego zakresu studenci zdobyli w szkole redniej i sprawdzili sw wiedz podczas egzaminw wstpnych na studia medyczne. Na tej podstawie zakadam, e studenci I roku medycyny maj wiadomoci z chemii organicznej programu dydaktycznego szkoy redniej, ktre s niezbdne do dalszej realizacji nauczania chemii na studiach. W celu przypomnienia wiadomoci, na kocu podrcznika zestawiono w tabelach najwaniejsze grupy funkcyjne (rozdzia 22). Podstawowym zakresem nowej wiedzy chemicznej dla medyka, ktr bdzie dalej zgbia podczas studiw jest przede wszystkim chemia organiczna realizowana na przykadach zwizkw wystpujcych w modelowym organizmie ywym, jakim jest czowiek. Podczas mojej wieloletniej pracy dydaktycznej w lskiej Akademii Medycznej mogam obserwowa kopoty studentw z przyswojeniem nieatwych zagadnie przewidzianych programem nauczania chemii, dotyczcych struktury, wa7

ciwoci i funkcji podstawowych zwizkw organicznych obecnych w organizmie ywym. Sdz, e mogo to wynika zarwno z niedostatecznego przygotowania przez szko redni w tym zakresie, jak i koniecznoci szukania wymaganej wiedzy w kilku rnych podrcznikach chemii organicznej i biochemii. Dlatego zagadnieniom tym powiciam niemal dwie trzecie podrcznika, sdzc, e uatwi studentom medycyny pokonanie trudnoci zwizanych ze zdobywaniem wiedzy chemicznej na modelu organizmu ywego. Kolejne rozdziay obejmuj wiadomoci powicone scharakteryzowaniu struktury, waciwoci i funkcji biologicznej wglowodanw, lipidw z pochodnymi i ikozanoidami, oraz dotyczce aminokwasw, peptydw, polipeptydw wraz z biakami i modyfikacjami aminokwasw w biakach. Dalej omwiono porfiryny i ich pochodne, a nastpnie zasady azotowe, nukleotydy i kwasy nukleinowe wraz z przykadowymi czynnikami modyfikujcymi DNA. W przystpny sposb starano si przedstawi chemiczne modyfikacje, jakim mog ulega acuchy boczne aminokwasw w biakach oraz mechanizm dziaania czynnikw zmieniajcych struktur kwasw nukleinowych. Zawarta w podrczniku wiedza o strukturze makroczsteczek, zalenoci funkcji moleku od jej struktury, o wzajemnych oddziaywaniach midzy czsteczkami i in. jest niezbdna dla dalszego zrozumienia i poznania m.in. struktury bon komrkowych, mechanizmw przemian w biochemii, podstawowych zasad fizjologii, farmakologii, pozwala wyjani chemiczny charakter mechanizmu przekazywania sygnaw midzy komrkami, podstaw rnic w okresie ptrwania glikoprotein w kreniu. Ponadto sdz, e student z pomoc tego podrcznika atwiej moe zrozumie m.in. nieenzymatyczn glikacj, czyli modyfikacj wystpujc np. w cukrzycy i odrni j od posttranslacyjnego procesu enzymatycznego, odpowiedzialnego za glikozylacj biaek. Osoby zainteresowane i dociekliwe, ktre pragn poszerzy wiadomoci odsyam do zacytowanej, atwo dostpnej literatury rdowej i uzupeniajcej (rozdzia 23). Podrcznik Chemia medyczna, cho zosta napisany dla studentw medycyny, moe by take przydatny dla studentw stomatologii, fizjoterapii, farmacji, analityki medycznej, weterynarii i innych kierunkw przyrodniczych. Sdz, e ksika ta moe zarazem stanowi pomoc dydaktyczn dla nauczycieli szk rednich, prowadzcych zajcia fakultatywne o profilu biologiczno-chemicznym, przygotowujcych uczniw do olimpiad z chemii lub biologii i wszystkich innych zainteresowanych wiedz o strukturze i waciwociach bioczsteczek, speniajcych wane funkcje biologiczne tylko w okrelonych warunkach rodowiska, ywego organizmu. Podrcznik Chemii medycznej jest pierwszym wydaniem na polskim rynku wydawniczym, dlatego bd szczeglnie wdziczna Czytelnikom za wszelkie rzeczowe uwagi, ktre postaram si uwzgldni w nastpnym wydaniu. Katowice, 30. 11. 2001 r.8

Iwona ak

1.

ATOMY, CZSTECZKI, WIZANIA CHEMICZNEIwona ak

STRUKTURA ATOMOWA I WIZANIA CHEMICZNEAtomy skadaj si z dodatnio naadowanego jdra atomowego oraz z otaczajcych go ujemnie naadowanych elektronw. Praktycznie caa masa atomu skupia si w jdrze, zawierajcym elektrycznie obojtne neutrony i dodatnio naadowane protony. Elektrony o niewielkiej masie kr w odlegoci okoo 10-10 m, czyli 100 pikometrw (pm) lub 1 angstrema od jdra atomowego. Liczb protonw obecnych w jdrze atomowym okrela liczba atomowa, ktra ma t sam warto dla wszystkich atomw tego samego pierwiastka, np. 1 dla H; 6 dla C, 7 dla N, 8 dla O, 11 dla Na. Sum protonw i neutronw okrela liczba masowa. Atomy danego pierwiastka mog mie rne liczby masowe, w zalenoci od zawartoci neutronw w jdrze. Masa atomowa pierwiastka to warto rednia liczb masowych wielu atomw pierwiastka. Fakt, e masa atomowa stanowi warto redni, wyjania, dlaczego zazwyczaj nie jest liczb cakowit. Wedug teorii Schrdingera, ruch elektronu wok jdra mona opisa matematycznie jako rwnanie falowe, ktrego rozwizanie, oznaczone greck liter psi , nosi nazw funkcji falowej lub orbitalu. Orbital jako funkcja falowa opisuje obszar wok jdra atomu, w ktrym istnieje najwiksze prawdopodobiestwo znalezienia elektronu, maksymalnie dwch. Istniej 4 rne orbitale atomowe (oznaczone jako s, p, d, f) o rnych ksztatach, mianowicie o kulistym orbitale s, hantli wszystkie trzy orbitale p, licia koniczyny cztery orbitale d, pity orbital d ma ksztat obwarzanka. Orbital s ma charakter bezkierunkowy, natomiast pozostae maj kierunkowy rozkad adunku. Orbitale znajduj si w poszczeglnych powokach elektronowych. Pojemno powoki najbliszej jdra, czyli pierwszej, ograniczona jest do 2 elektronw, drugiej do 8, trzeciej do 18, czwartej do 32 elektronw. Powoka, im dalej ley od jdra, tym jej elektrony maj wiksz energi.

9

Na pierwszej powoce elektronowej znajduj si maksymalnie dwa elektrony o najniszej energii, ktre zajmuj pojedynczy orbital 1s. Bogatsze, z punktu widzenia energetycznego, dwa elektrony nale do powoki elektronowej drugiej i zajmuj wikszy orbital 2s. Sze pozostaych elektronw tej powoki wykazuje jeszcze wiksz energi, znajduj si one na trzech orbitalach 2p. Orbitale te maj jednakow wzgldem siebie energi, ale s odmiennie zorientowane w przestrzeni, praktycznie kady z nich jest prostopady do dwch pozostaych. Wysze energetycznie elektrony (maksymalnie 18) powoki trzeciej umiejscowione s na jednym orbitalu 3s, trzech orbitalach 3p i piciu orbitalach d. Konfiguracj elektronow stanu podstawowego atomu, czyli ukad o najniszej energii, przedstawia si poprzez opis orbitali zajtych przez elektrony, kierujc si nastpujcymi zasadami: orbital mog zajmowa maksymalnie dwa elektrony, ktre zgodnie z zakazem Pauliego, musz mie przeciwny spin; dwie odmienne orientacje spinu okrela si strzakami, jako (w gr) i (w d); w pierwszej kolejnoci wypeniane s orbitale o niszej energii,wg zapisu:

1s2s2p3s3p4s3d4p5s4d5p6s4f5d6p; dostpne nie zapenione orbitale o jednakowej energii, np. orbitale p, zajmowane s kolejno przez pojedyncze elektrony ze spinami skierowanymi w t sam stron, a wszystkie zostan zajte (regua Hunda); przykadowy opis konfiguracji elektronowej w stanie podstawowym i w stanie wzbudzonym atomw ilustruje tabela 1. Liczba pojedynczo obsadzonych orbitali ma odzwierciedla liczb wiza kowalencyjnych, jakie moe utworzy atom. Analizujc pierwiastki nalece do kolejnych grup ukadu okresowego, atwo zauway, e w stanie podstawowym atomu liczba niesparowanych elektronw walencyjnych berylowcw, borowcw i wglowcw nie zawsze jest zgodna z ich wartociowoci. Koncepcja stanw wzbudzonych atomw pozwala wyjani t pozorn niezgodno zmian konfiguracji elektronowej. W atomie w stanie wzbudzonym (na skutek zblienia si atomu zdolnego do utworzenia wizania chemicznego) pojawiaj si dodatkowe niesparowane elektrony walencyjne, w wyniku przejcia z zapenionego niszego podpoziomu na wolny podpoziom wyszy. Istnienie atomu w stanie wzbudzonym jest ograniczone tylko do atomw zwizanych w czsteczce, wolne atomy w stanie wzbudzonym nie istniej. Stan wzbudzenia zmienia konfiguracj elektronw walencyjnych w atomach berylu, boru i wgla (tab. 1), sprawiajc, e liczba niesparowanych elektronw odzwierciedla wartociowoci tych pierwiastkw w zwizkach chemicznych.

10

Tabela 1. Konfiguracje elektronowe atomw w stanie podstawowym oraz w stanie wzbudzonym Konfiguracja elektronowa przykadowych atomw Pierwiastek Liczba atomowa Konfiguracja w stanie podstawowym wzbudzonym

Wodr

1

1s 2p 2s 1s 2p 2s 1s 2p 2s 1s 2p 2s 1s 2p 2s 1s 3s 2p 2s 1s

bez zmiany

Beryl

4

Bor

5

Wgiel

6

bez zmiany

Azot

7

bez zmiany

Tlen

8

bez zmiany

Sd

11

Atomy, ktre posiadaj jeden, dwa lub trzy elektony walencyjne mog tworzy odpowiadajc im liczb wiza kowalencyjnych, natomiast atomy z czterema lub wicej elektronami na powoce walencyjnej mog tworzy tyle wiza, ile potrzebuj elektronw do zapenienia orbitali s i p swych powok walencyjnych dla utworzenia oktetu. Przykadowo, beryl tworzy dwa wizania, bor trzy, wgiel czte11

ry, azot trzy, a tlen dwa wizania kowalencyjne. Atom boru (np. w czsteczce BF3) nie moe utworzy trwaej struktury oktetu, natomiast atomy pierwiastkw, ktre dysponuj orbitalami d i inne, np. SF6, mog nie spenia reguy oktetu, poniewa na powoce walencyjnej maj wicej elektronw. Elektronami niewicymi, ktre nosz rwnie nazw wolnej pary elektronowej, s sparowane elektrony walencyjne nie zaangaowane w tworzeniu wiza kowalencyjnych. Przykadami z tabeli 1 mog by atom azotu (np. w czsteczce amoniaku), ktrego dwa elektrony walencyjne tworz woln par elektronow (2s), oraz atom tlenu (np. w czsteczce wody), ktry ma dwie pary wolnych elektronw (2s, 2p). Atomy cz si ze sob, poniewa wytworzona czsteczka jest bardziej trwaa, ma mniejsz energi ni poszczeglne, pojedyncze atomy. W stanie naturalnym niemal wszystkie pierwiastki chemiczne istniej w postaci czsteczkowej. Dotychczas nie stworzono uniwersalnej teorii wizania chemicznego, ktra tumaczyaby jednolicie ca rnorodno i zoono wszystkich struktur czsteczkowych. Opracowano wiele teorii i metod wyjaniajcych rnorodne cechy i waciwoci wizania chemicznego. Najstarsz jest elektronowa teoria wizania chemicznego, stworzona przez Lewisa na pocztku XX wieku. Powszechnie znana, poniewa jest przedmiotem nauczania chemii, zarwno na poziomie podstawowym, jak i rednim, dlatego w podrczniku chemii medycznej mona zrezygnowa ze szczegowego jej omawiania. Teoria elektronowa wizania chemicznego opiera si na konfiguracji oktetowej (czasami dubletowej) elektronw walencyjnych (charakterystycznej dla gazw szlachetnych). Wynika z obserwacji, e wiele pierwiastkw gwnych grup ukadu okresowego ma skonno do przyjmowania konfiguracji elektronowej gazu szlachetnego w zwizkach chemicznych, co powizane jest z ich waciwociami chemicznymi. Teoria ta wyjania charakter elektrostatyczny wizania jonowego, nie tumaczy jednak istoty kadego wizania atomowego. Przykadowo, nie tumaczy, dlaczego wizania kowalencyjne maj okrelone kierunki w przestrzeni. Niewtpliw jej zalet jest fakt, e na podstawie jednolitego kryterium (oktetu lub dubletu) opisaa rne typy wiza i ich liczby w zwizkach chemicznych. Podstawy nowoczesnej teorii wiza chemicznych tkwi w mechanice kwantowej (falowej), dziedzinie wiedzy odznaczajcej si wysokim stopniem abstrakcji i zoonoci opisw matematycznych. Wnikliwe jej poznanie wymagaoby osobnych studiw. Wnioski wynikajce z tej wiedzy s na og powszechnie zrozumiae. Pojcia majce korzenie w mechanice kwantowej stay si niezbdne w chemii, z niektrych korzysta si ju na podstawowym poziomie nauczania tego przedmiotu. Kwantowymi teoriami wizania chemicznego, ktre wyjaniaj zarwno charakter i energi wiza w czsteczce oraz geometri czsteczek, s teoria wi12

za walencyjnych i teoria orbitali molekularnych (czsteczkowych). W wielu punktach s podobne, lecz w rny sposb tumacz te same zjawiska. Teoria wiza walencyjnych opisuje wizanie kowalencyjne jako rezultat naoenia si na siebie dwch orbitali atomowych z niesparowanym elektronem o spinach przeciwnych, przy czym kady orbital pochodzi od innego atomu. Sparowane w ten sposb ze sob dwa elektrony w naoonych orbitalach s przycigane do jder obydwu atomw, poniewa s uwsplnione przez obydwa atomy i dziki temu atomy te s poczone. Kady z poczonych ze sob atomw zatrzymuje swoje wasne orbitale atomowe. Sia wizania atomowego zaley od stopnia naoenia si orbitali i jest tym wiksza, im bardziej orbitale zachodz na siebie. Teoria orbitali molekularnych (czsteczkowych) opisuje tworzenie wiza atomowych jako rezultat matematycznej kombinacji orbitali atomowych (funkcji falowych), prowadzcy do okrelenia energii i ksztatu orbitali czsteczkowych. Wedug tej teorii, tworzenie wizania atomowego jest skutkiem powstania orbitali molekularnych (czsteczkowych). Powstawanie orbitali molekularnych jest skutkiem kombinacji dwch lub wikszej liczby orbitali atomowych. Liczba utworzonych orbitali molekularnych jest taka sama, jak liczba orbitali atomowych, z ktrych kombinacje te powstay. Orbitale molekularne nazywane s tak, ze wzgldu na ich przynaleno do caej czsteczki, a nie do konkretnego atomu. Orbital molekularny opisuje t cz przestrzeni w czsteczce, w ktrej najprawdopodobniej znajduj si elektrony, charakteryzuje zatem czsteczk jako cao, a nie pojedynczy atom. Orbitale molekularne maj charakterystyczny ksztat, wymiar i poziom energetyczny. Orbital czsteczkowy, ktrego energia jest nisza od energii orbitali atomowych, z ktrych zosta utworzony, jest orbitalem wicym, tak jak np. w orbitalu H2, majcym ksztat jajka. Natomiast orbital molekularny, ktry ma energi wysz ni orbitale atomowe, z ktrych zosta utworzony, jest orbitalem antywicym. W orbitalu tym elektrony nie mog znale si w rodkowym obszarze midzy jdrami atomowymi, gdzie wystpuje wze funkcji falowej, dlatego nie mog przyczyni si do utworzenia wizania. Zatem nakadanie si dwch orbitali atomowych daje dwa orbitale molekularne, wicy i antywicy. Czsteczki w stanach podstawowych maj obsadzone elektronami tylko orbitale wice. Orbitale antywice s obsadzone elektronami tylko w stanach wzbudzonych czsteczek.

HybrydyzacjaHybrydyzacja orbitali jest procesem ich wymieszania i wyrwnania podczas tworzenia czsteczki, prowadzcym do wytworzenia nowych, jednakowych

13

i ukierunkowanych w przestrzeni orbitali atomowych z kombinacji orbitali s i p lub s, p i d. Orbitale zhybrydyzowane, nazywane rwnie hybrydami, s rwnocenne, lecz s inaczej ukierunkowane w przestrzeni ni orbitale atomowe. Wynika to z faktu, e dwie ptle orbitali p maj przeciwne znaki algebraiczne (+ i -), jedna z nich jest addytywna (dodaje si) z orbitalem s, natomiast druga ptla p jest substratywna (odejmuje si). W wyniku hybrydyzacji zmienia si symetria orbitali, jedno rami zwiksza si kosztem drugiego. Zmiana symetrii orbitali zhybrydyzowanych sprawia, e znacznie lepiej nakadaj si z orbitalem drugiego atomu podczas tworzenia wizania, dziki czemu hybrydy tworz silniejsze wizanie ni czyni to niezhybrydyzowane orbitale s i p. Ukierunkowanie orbitali zhybrydyzowanych w przestrzeni, warunkujce ksztat czsteczki, zaley od liczby elektronw walencyjnych oraz liczby orbitali atomowych uczestniczcych w mieszaniu i tworzeniu hybrydy.

Hybrydy spWymieszanie orbitalu s z pojedynczym dostpnym orbitalem p doprowadza do powstania dwch rwnocennych zhybrydyzowanych orbitali sp, ktre nosz nazw hybryd sp. Oba orbitale sp s liniowe, zorientowane wzgldem siebie pod ktem 180. Czsteczki, w ktrych elektrony walencyjne atomu centralnego (tab. 1, beryl i inne) s zaangaowane w wizania chemiczne i zawieraj hybrydy sp, maj budow liniow. Zgodnie z zasad maksymalnego, wzajemnego unikania si elektronw, wytworzone dwa wizania s maksymalnie oddalone od siebie i tworz kt 180. Taka liniowa budowa jest charakterystyczna dla czsteczek z atomem centralnym, nalecym do berylowcw, np. BeCl2, MgCl2, lub do pierwiastkw przejciowych, np. ZnCl2, HgCl2. Zhybrydyzowane orbitale sp wyjaniaj waciwoci i struktur wizania potrjnego, najczciej spotykanego w zwizkach wgla. Wizanie to wystpuje midzy dwoma atomami wgla w alkinach, np. w czsteczce acetylenu. W atomie wgla orbital 2s miesza si jedynie z pojedynczym orbitalem p, tworzc dwa rwnocenne zhybrydyzowane orbitale sp, a pozostae dwa orbitale p nie ulegaj hybrydyzacji. Po zblieniu si do siebie dwch atomw wgla, posiadajcych zhybrydyzowane orbitale sp nastpuje liniowe nakadanie na siebie po jednym takim orbitalu od kadego atomu, prowadzce do wytworzenia silnego wizania, ktre nazwano wizaniem sigma (), typu sp-sp. Rwnoczenie, obecne w obu atomach orbitale py bocznie nakadaj si na siebie, tworzc wizanie nazwane wizaniem pi (), typu py-py, podobnie jak to czyni orbitale pz obu atomw wgla, ktre tworz wizanie , typu pz-pz. Dlatego utworzenie wizania potrjnego wgiel-wgiel jest14

efektem uwsplnienia szeciu elektronw. Pozostae orbitale sp kadego atomu wgla tworz wizania sigma z atomem wodoru, doprowadzajc tym samym do wytworzenia czsteczki acetylenu. Dziki hybrydyzacji sp acetylen jest czsteczk liniow, z ktami midzy wizaniami rwnymi 180, dugoci wizania midzy atomami wgla rzdu 1,20 oraz mocy okoo 835 kJ/mol. Wizanie to jest najkrtsze i najsilniejsze ze wszystkich wiza wgiel-wgiel.

Hybrydy sp2Wymieszanie orbitalu s z dwoma dostpnymi orbitalami p doprowadza do powstania trzech rwnocennych zhybrydyzowanych orbitali sp2, ktre nosz nazw hybryd sp2. Trzy orbitale sp2 le w paszczynie i zorientowane s wzgldem siebie pod ktem 120. Czsteczki, w ktrych elektrony walencyjne atomu centralnego (tab. 1, bor i inne) s zaangaowane w wizania chemiczne i zawieraj hybrydy sp2, s planarne (paskie). Zgodnie z zasad maksymalnego, wzajemnego unikania si elektronw, trzy wizania utworzone z hybryd sp2, np. w trifluorku boru (BF3), tworz pask, trygonaln (trjktn) struktur o ktach midzy wizaniami 120. W czsteczce tej kady atom fluoru wie si z orbitalem sp2 boru, jednak jeden orbital p boru pozostaje nie zapeniony. Zhybrydyzowane orbitale sp2 wyjaniaj waciwoci i struktur wizania podwjnego, czsto spotykanego w zwizkach wgla. Wizanie to wystpuje midzy dwoma atomami wgla w alkenach, np. w czsteczce etylenu. W atomie wgla orbital 2s miesza si jedynie z dwoma orbitalami p, tworzc trzy rwnocenne hybrydy sp2 lece w paszczynie pod ktem 120 wzgldem siebie, a pozostay jeden orbital p, ktry nie uleg hybrydyzacji, jest prostopady do paszczyzny orbitalu sp2. Po zblieniu si do siebie dwch atomw wgla, posiadajcych zhybrydyzowane orbitale sp2, nastpuje liniowe nakadanie na siebie po jednym takim orbitalu od kadego atomu, prowadzce do wytworzenia wizania sigma (), typu sp2sp2. Rwnoczenie, obecne w obu atomach niezhybrydyzowane orbitale p bocznie nakadaj si na siebie, tworzc wizanie typu p-p. Dlatego utworzenie wizania podwjnego wgiel-wgiel jest efektem uwsplnienia czterech elektronw. Pozostae dwie hybrydy sp2 z kadego atomu wgla tworz cznie cztery wizania sigma z czterema atomami wodoru, doprowadzajc tym samym do wytworzenia czsteczki etylenu. Dziki hybrydyzacji sp2 etylen jest czsteczk planarn i trygonaln, z ktami midzy wizaniami, wynoszcymi rednio 120. Dugo wizania midzy atomami wgla wynosi 1,33 , a jego moc 611 kJ/mol. Wizanie podwjne midzy atomami wgla w etylenie jest dusze od wizania potrjnego w acetylenie.15

Hybrydy sp3Wymieszanie orbitalu s z trzema dostpnymi orbitalami p doprowadza do powstania czterech zhybrydyzowanych orbitali sp3, ktre nosz nazw hybryd sp3. Cztery rwnocenne orbitale sp3 s przestrzennie ukierunkowane ku naroom regularnego czworocianu (tetraedru) i s niesymetryczne w stosunku do jdra atomu. Hybrydy sp3 s najczciej wystpujcymi orbitalami zhybrydyzowanymi atomu wgla, ktre tworz pojedyncze wizania w alkanach, np. w metanie. Atom wgla (tab. 1) ma cztery elektrony walencyjne, po jednym na dwch rodzajach orbitali 2s i 2p, w wyniku hybrydyzacji tworzy cztery rwnocenne orbitale atomowe o geometrii tetraedrycznej. W wyniku naoenia si tych czterech orbitali sp3 z orbitalami 1s czterech atomw wodoru powstaje czsteczka metanu, w ktrej kt tetraedryczny (kt midzy wizaniami) wynosi dokadnie 109,5. Zhybrydyzowane orbitale sp3 wyjaniaj waciwoci i struktur wizania pojedynczego midzy dwoma atomami wgla, np. w czsteczce etanu, jak rwnie w wielu milionach innych zwizkw organicznych. W etanie wystpuje jedno wizanie wgiel-wgiel. Po zblieniu si do siebie dwch atomw wgla, ktre posiadaj zhybrydyzowane orbitale sp3, nastpuje liniowe nakadanie na siebie po jednym takim orbitalu od kadego atomu, z wytworzeniem wizania , typu sp3-sp3. Wizanie C-C ma dugo 1,54 i moc 376 kJ/mol. Wszystkie kty midzy wizaniami w czsteczce etanu s bliskie wartoci kta tetraedrycznego 109,5. Hybrydyzacja sp3 nie jest ograniczona do zwizkw wgla, moe dotyczy innych atomw, np. atomu azotu w czsteczce amoniaku lub atomu tlenu w wodzie. Atom azotu ma pi elektronw walencyjnych, w tym jedn woln par elektronow (tab. 1), dla osignicia oktetu elektronowego tworzy trzy wizania kowalencyjne. Atom azotu ulega hybrydyzacji z wytworzeniem czterech orbitali sp3, wrd ktrych trzy zajte s pojedynczymi elektronami, a jeden przez woln par elektronow. Liniowe naoenie trzech niezapenionych orbitali sp3 z orbitalami 1s trzech atomw wodoru doprowadza do wytworzenia czsteczki amoniaku. W czsteczce amoniaku kty midzy wizaniami H-N-H wynosz 107,3, warto ta jest bardzo bliska wartoci kta tetraedrycznego w metanie. Orbital z woln par elektronow hybrydy sp3 atomu azotu w amoniaku zajmuje tyle samo przestrzeni, ile wizanie N-H i peni istotn rol w determinowaniu wasnoci chemicznych amoniaku. Atom tlenu ma sze elektronw walencyjnych, w tym dwie wolne pary elektronowe (tab. 1), dla osignicia oktetu elektronowego tworzy dwa wizania kowalencyjne. Atom tlenu ulega hybrydyzacji z wytworzeniem czterech orbitali sp3, wrd ktrych dwa zajte s pojedynczymi elektronami, a dwa przez wolne pary elektronowe. Liniowe naoenie dwch niezapenionych orbitali sp3 z orbita16

lami 1s dwch atomw wodoru doprowadza do wytworzenia czsteczki wody. W czsteczce wody kty midzy wizaniami H-O-H wynosz 104,5, warto ta jest nieco mniejsza od wartoci kta tetraedrycznego w metanie. Zmniejszenie wartoci kta wynika przypuszczalnie z odpychajcego oddziaywania midzy dwiema wolnymi parami elektronowymi, powodujcego cignicie (kompresj) kta midzy atomami tlenu i wodoru.

TYPY WIZA CHEMICZNYCHPodzia wiza na typy ma charakter formalny, w rzeczywistoci midzy niektrymi typami brak wyranej granicy. Podstawowymi typami wiza s: wizania jonowe (elektrowalencyjne), atomowe, atomowe spolaryzowane, koordynacyjne, wodorowe oraz wizania midzyczsteczkowe, czyli siy Van der Waalsa.

Wizanie jonoweWizanie jonowe powstaje w wyniku przycigania elektrostatycznego odmiennych adunkw. Wystpuje midzy dwoma jonami i wynika z przycigania elektrostatycznego ich przeciwnych adunkw. Na og obecne jest w solach nieorganicznych. Typowe wizanie jonowe tworzy si midzy pierwiastkiem (metalem) silnie elektrododatnim (nalecym do litowcw), ktry oddaje elektron, a pierwiastkiem (niemetalem) silnie elektroujemnym (nalecym do fluorowcw), przyjmujcym elektron. Utworzona wica para elektronowa jest niemal cakowicie przesunita do atomu bardziej elektroujemnego, dziki czemu atomy uczestniczce w tworzeniu wizania jonowego osigaj konfiguracj oktetow. Przykadowo, podczas tworzenia NaCl, atom sodu oddaje elektron, przechodzc w jon Na+, ktry osign konfiguracj neonu. Natomiast atom chloru przyjmuje elektron, przechodzc w jon Cl-, o konfiguracji argonu. Wytworzony NaCl okrela si jako jonowe ciao stae, posiadajce wizanie jonowe.

Wizanie atomoweWizanie atomowe, czyli kowalencyjne (kowalentne), powstaje w wyniku uwsplnienia (sparowania) dwch elektronw o spinie przeciwnym, po jednym od kadego atomu. Atomy nie rnice si elektroujemnoci lub rnice si minimalnie tworz wizanie atomowe, w ktrym wica para elektronw rozmieszczona jest symetrycznie midzy dwoma jdrami atomowymi, zatem przycigana jest przez oba jdra atomowe w jednakowym stopniu. Atomy uczestniczce w wizaniu osi17

gaj konfiguracj gazu szlachetnego. Przykadowo, atomy w czsteczce wodoru H2 osigaj konfiguracj helu, a w czsteczce chloru Cl2 konfiguracj argonu. Wyjtek stanowi atomy pierwiastkw metalicznych, nie wykazujce tendencji do tworzenia midzy sob wiza kowalencyjnych. Wedug teorii orbitali molekularnych, hel moe tworzy czsteczk He2, ktra jest nietrwaa, poniewa na obu orbitalach: wicym i antywicym liczba elektronw jest jednakowa. Zgodnie z teori wiza walencyjnych atom helu nie moe utworzy wizania, poniewa jego oba elektrony walencyjne s ju sparowane, dlatego czsteczka helu nie powstaje. Sparowanie dwch elektronw nie zawsze jest wystarczajce do utworzenia oktetu, dlatego atomy mog wykorzysta dwa lub trzy elektrony do uwsplnienia, tworzc wizania wielokrotne, podwjne lub potrjne, jak np. w N2. Czsteczki posiadajce czyste wizanie atomowe (H2, O2, N2, itp.) maj symetryczny rozkad adunku, dlatego s czsteczkami niepolarnymi. Wszystkie pojedyncze wizania atomowe, ktre s skierowane wzdu prostej czcej jdra dwch atomw nosz nazw wiza sigma , tworzonych przez osiowe naoenie orbitali atomowych. Istniej trzy typy wiza sigma. Wizanie sigma typu s-s powstaje w wyniku naoenia si dwch orbitali s z niesparowanym elektronem, tak jak w czsteczce H2. Wizanie sigma typu p-p powstaje w wyniku liniowego naoenia si dwch orbitali p z niesparowanym elektronem, tak jak np. w czsteczkach fluorowcw F2, Cl2. Wizanie sigma typu s-p powstaje w wyniku liniowego naoenia si orbitali s i p z niesparowanymi elektronami, tak jak w czsteczce HCl. Wizanie to jest powszechne w zwizkach wodoru z pierwiastkami 15, 16 i 17 grupy ukadu okresowego. Wizania sigma s najczstsze, ale jak ju wczeniej powiedziano s te wizania innego typu, mianowicie wizania pi (), utworzone w wyniku bocznego nakadania si dwch orbitali p lub d, ktre s skierowane prostopadle do paszczyzny wizania sigma, czyli paszczyzny czsteczki. Wystpuj one w wielu zwizkach organicznych i nieorganicznych, wrd tych ostatnich obecne s np. w N2, O2, tlenkach wgla, azotu, fosforu.

Wizanie kowalencyjne spolaryzowaneRnica elektroujemnoci midzy atomami jest zerowa w przypadku wizania atomowego, w ktrym rozmieszczenie elektronw jest symetryczne. Maksymalna rnica elektroujemnoci midzy atomami wystpuje w wizaniu jonowym. Midzy tymi skrajnymi wizaniami znajduje si przewaajca wikszo wiza chemicznych, w ktrych elektrony s przycigane przez jeden atom (bardziej elektroujemny) silniej ni przez drugi. Sprawia to, e rozdzia elektronw w wizaniu18

jest niesymetryczny, co oznacza, e chmura elektronowa jest przesunita w kierunku bardziej elektroujemnego z atomw tworzcych wizanie. Wizania z niesymetrycznym rozdziaem elektronw nazywane s wizaniami atomowymi spolaryzowanymi. Waciwoci wynikajc z niesymetrycznego rozkadu elektronw w czsteczce jest polarno. Przyjto jako regu ogln, e wizaniami atomowymi spolaryzowanymi s te, w ktrych rnica elektroujemnoci midzy atomami ma warto mniejsz ni dwie jednostki. Przy czym, im bardziej zblione s elektroujemnoci atomw biorcych udzia w wizaniu, tym wikszy jest udzia wizania atomowego. Jeli rnica elektroujemnoci jest niewielka, tak jak np. midzy atomem wodoru i atomem wgla (=0,4), to polarno wizania jest niska. Wizania pomidzy atomami, ktrych elektroujemnoci rni si o wicej ni 2 jednostki s w duym stopniu wizaniami jonowymi. Wizania midzy atomami rnicymi si elektroujemnoci ( [G] + [C], czsteczki DNA, w ktrych [A] + [T] < [G] + [C], czsteczki DNA, w ktrych [A] + [T] = [G] + [C]. Czsteczki DNA pierwszego typu s najbardziej powszechne, z reguy rnice midzy sum AT a sum GC okazuj si stosunkowo niewielkie, przedstawicielami ich mog by zarwno czsteczki DNA pochodzce z wirusw (Polyoma), bakterii (Mycoplasma), drody, muszek (Drosophila), jak i z organizmu czowieka. Przedstawicielem DNA trzeciego typu mog by czsteczki DNA wywodzce si z Echerichia coli. Rzadko wystpuj czsteczki DNA drugiego typu, obecne np. u Alcaligenes faecalis. Kwasy deoksyrybonukleinowe lub ich rejony mog wystpowa w trzech gwnych formach przestrzennych (strukturach drugorzdowych) zwanych A, B i Z. Dominujc struktur drugorzdow DNA jest forma B, bdca regularn prawoskrtn helis, zgodn z modelem Watsona i Cricka. Oba antyrwnolege acuchy B-DNA zwijaj si helikalnie wok osi helisy, do ktrej pary zasad azotowych ukadaj si prostopadle.

328

B-DNA

A-DNA

Z-DNA

Schematyczne diagramy gwnych form: A-, B-, Z-DNA. (wg [12], zmodyfikowane)

W centrum helisy DNA znajduj si zasady azotowe obu nici, ktrych paszczyzny uoone s jedna nad drug w formie charakterystycznych dwch stosw, stabilizowanych warstwowo oddziaywaniami hydrofobowymi. Na zewntrz helisy DNA umiejscowione s oba rdzenie fosfocukrowe, pomidzy ktrymi przebiegaj helikalnie dwie bruzdy (rowki): maa o szerokoci 6 i dua o szerokoci 12 .

rdze cukrowo-fosforanowy

329

Obecno bruzd sprawia, e moe mie miejsce specyficzne rozpoznawanie, oddziaywanie lub wizanie biaek regulatorowych, np. kontrolujcych ekspresj genw (poprzez ich moduy oddziaywujce bezporednio z DNA np. tzw. palce cynkowe lub typu helisa-zwrot-helisa, lub suwaka leucynowego) z okrelonymi (swoistymi) sekwencjami zasad azotowych, ukrytymi w centrum helisy, bez rozrywania dwupasmowej struktury DNA. Przez bruzdy te mog rwnie wsuwa si rne paskie aromatyczne czsteczki policykliczne, ktre wlizguj si midzy pary zasad azotowych uoone w stosy, czyli ulegaj procesowi interkalacji. Zgodnie z tym mechanizmem dziaa wiele zwizkw rakotwrczych, a take lekw przeciwnowotworowych. W formie B helisy DNA wystpuj reszty deoksyrybozy C2'-endo, wizania glikozydowe o konformacji anty, 10 par zasad azotowych przypada na kady peny skrt, ktry ma wysoko 34 , a rednica helisy wynosi 23,7 . W formie A prawoskrtnej helisy DNA wystpuj reszty deoksyrybozy C3'-endo, wizania glikozydowe o konformacji anty, 11 par zasad azotowych przypada na kady peny skrt, ktry ma wysoko 25 , rednica helisy za wynosi 25,5 . W formie A pary zasad azotowych nachylone s do osi helisy pod ktem 20, zatem nie s do niej prostopade, jak w formie B. Wystpuje praktycznie tylko jedna gboka bruzda dua. W sekwencji formy Z helisy DNA wystpuj przemiennie nukleotydy purynowe i pirymidynowe np. GC, AC. W tej formie DNA wszystkie nukleotydy purynowe maj wizania glikozydowe konformacji syn, natomiast nukleotydy pirymidynowe zawieraj wizania glikozydowe konformacji anty. Obrt tych par zasad o 180 wok wizania N-glikozydowego powoduje, e Z-DNA jest helis lewoskrtn. Sprawia to rwnie, e obwodowe rdzenie fosfocukrowe tworz wzr zygzakowaty i std wywodzi si nazwa tej formy Z-DNA. W formie Z-DNA pary zasad azotowych odchylone s od osi helisy o kt 10, zatem nie s do niej prostopade, jak w formie B. Forma Z jest najbardziej wyduona spord wszystkich trzech form DNA, na kady peny skrt przypada 12 par zasad azotowych, skok helisy wynosi 45,6 , a rednica 18,4 . Forma ta ma tylko ma gbok bruzd, ktra jest wska. Z-DNA wymaga wysokiego stenia soli lub specyficznych kationw, poliamin (spermina, spermidyna) do stabilizacji i nie tworzy struktur nukleosomowych. Wystpowanie w obrbie DNA fragmentw o zrnicowanej strukturze sprawia, e dugie acuchy polideoksyrybonukeinowe nie s sztywnymi helikalnymi zwojami cylindrycznymi, lecz tworz liczne zagicia, struktury, tzw. spinki do wosw lub superhelikalne skrty. Rnorodno strukturalna fragmentw DNA zwiksza jego zdolno do rozpoznawania i oddziaywania z innymi skadnikami komrki. Wikszo sekwencji DNA eukariotycznego stanowi kompleks nukleoproteinowy, gwnie w formie nukleosomw.

330

Rdze nukleosomu stanowi oktamer zoony z omiu histonw, mianowicie H2A, H2B, H3 i H4, z ktrych kadego jest po dwa. Oktamer owinity jest lewoskrtnie przez acuch 146 par zasad azotowych, stanowicy 1,75 skrtu helisy DNA. Poszczeglne nukleosomy poczone s fragmentem DNA, zwanym cznikiem, zawierajcym od 40 do 80 par zasad. Histon H1 znajduje si poza oktamerem, moe zewntrznie ochrania krtkie fragmenty DNA nukleosomu w miejscach, od ktrych zaczynaj si czniki. Histony neutralizuj wzajemne odpychania ujemnych adunkw obecnych na rdzeniach cukrowo-fosforanowych. Ponadto, umoliwiaj ciasne upakowywanie nici DNA do rnych form skondensowanej heterochromatyny, a do chromosomu, ktry jest maksymalnie skondensowan form DNA. Rozwinicie tych struktur ma miejsce wwczas, gdy DNA uczestniczy w replikacji lub transkrypcji. Waciwa organizacja nukleosomw i innych kompleksw biakowych z DNA wymaga dziaania rwnie biaek opiekuczych, tzw. chaperonw (fonetycznie: czaperonw).

Kwasy rybonukleinoweCzsteczki kwasw rybonukleinowych s znacznie mniejsze od czsteczek DNA, ich masa czsteczkowa osiga 35 000 daltonw. Wszystkie czsteczki RNA s formami jednoniciowymi, niektre mog tworzy rejony dwuniciowe, stabilizowane wizaniami wodorowymi midzy komplementarnymi zasadami azotowymi. Rejony dwuniciowe w obrbie pojedynczej nici polinukleotydowej powstaj midzy sekwencjami komplementarnymi, ktre s rozmieszczone w rnych rejonach liniowej struktury pierwszorzdowej, oddziauj ze sob parami i s stabilizowane wizaniami wodorowymi. Oddziaywania te sprawiaj, e pojawiaj si sparowane rejony dwuniciowe w obrbie pojedynczej nici polinukleotydowej. Rejony sparowane nadaj okrelon struktur przestrzenn czsteczce. RNA zamiast deoksyrybozy zawiera ryboz, a zamiast tyminy uracyl. Wyrnia si trzy gwne typy RNA, z ktrych kady spenia odmienne funkcje, s to: informacyjny RNA (mRNA), transportujcy RNA (tRNA) i rybosomalny RNA (rRNA). Wszystkie wymienione typy kwasw rybonukleinowych eukariotycznych s produktami rnorodnych modyfikacji chemicznych, ktre maj miejsce po transkrypcji i skadaj si na proces okrelany mianem dojrzewania RNA, ktremu podlega wikszo pierwotnych transkryptw (bezporednich produktw transkrypcji). Proces dojrzewania RNA obejmuje nastpujce zmiany: 1) usuwanie pewnych sekwencji nukleotydowych przez endonukleazy, rybozymy i egzonukleazy; 2) dodawanie nukleotydw do koca 5' i 3' pierwotnego transkryptu lub produktu jego rozcicia; 3) chemiczne modyfikacje (gwnie metylacje) niektrych nukleotydw w obrbie zasad azotowych lub reszt monocukrowych. Kwasy rybo-

331

nukleinowe oddziauj z biakami, tworzc kompleksy rybonukleoproteinowe (RNP).

mRNAInformacyjny RNA suy jako matryca w syntezie biaka. W komrce jest tyle specyficznych rodzajw czsteczek mRNA, ile komrka syntetyzuje rodzajw acuchw polipeptydowych. Informacyjne RNA stanowi okoo 5% wszystkich kwasw rybonukleinowych w komrce. Dojrzae czsteczki mRNA maj podobny plan budowy w komrkach eukariotycznych.czapeczka P~P-N7CH3G N6CH3A N6CH3A AAAA.....AAAAAA

sekwencja kodujca

ogon poli(A)

Schematyczny plan budowy eukariotycznego mRNA

W budowie wikszoci eukariotycznych mRNA charakterystyczne jest wystpowanie trzech staych elementw, mianowicie czapeczki (ang. cap) znajdujcej si na kocu 5', specyficznej sekwencji kodujcej i ogona poli(A), ktry wystpuje na kocu 3'. Czapeczk stanowi reszta N7-metyloguanozyny o odwrconej orientacji (w porwnaniu z typowymi wizaniami 3'5'-fosfodiestrowymi), ktra poczona jest mostkiem 5'-5'-trifosforanowym, najczciej z N6-metyloadenozyn. Ta szczeglna chemiczna modyfikacja powstaje kotranskrypcyjnie, zanim syntetyzowany RNA osignie dugo 2030 nukleotydw. Dwa pierwsze nukleotydy za czapeczk mog by metylowane, zarwno w pozycji atomu azotu zasady azotowej (zwykle jest to N6 adeniny), jak i w pozycji C2' rybozy. Funkcja czapeczki polega na ochronie pre-mRNA oraz mRNA przed dziaaniem 5'-egzonukleaz, ponadto uczestniczy w procesie dojrzewania mRNA (np. w splicingu), w transporcie mRNA z jdra do cytoplazmy i translacji. Sekwencja kodujca (czyli rejon ulegajcy translacji) jest specyficzna dla kadego rodzaju mRNA, tym samym odmienne rodzaje mRNA rni si sekwencj kodujc. Sekwencja kodujca mRNA jest komplementarna do sekwencji eksonw pojedynczej nici matrycowej DNA, przy czym U jest komplementarna do A w nici DNA. Tym samym sekwencja kodujca mRNA stanowi kopi eksonw nici kodujcej DNA, jednak w mRNA wystpuje U wszdzie tam, gdzie w kodujcej nici DNA wystpuje T.

332

HO OH C C HC H H CH O H2 N HN O5'

NH2 O P O O O P O O O P O O HC H H CH 2' 3' C C OCH 3 O P O O O HC H H CH 3' C C OH O CH 2 N N5'

N N

N

N N CH3

H2 C O

O CH2

N

O NH O

Struktura chemiczna czapeczki mRNA i przylegych nukleotydw

W procesie dojrzewania sekwencja kodujca jest skadana z eksonw premRNA, po wyciciu sekwencji interweniujcych, zwanych intronami (niekodujcych), ktre przerywaj sekwencje kodujce zwane eksonami. Proces rozcinania pre-mRNA, wycinania intronw i skadania eksonw nazywa si skadaniem mRNA (ang. splicing). Reakcje te zachodz w jdrze komrkowym i wymagaj obecnoci w intronie sekwencji na kocu 5'-GU-3', a na kocu 3' sekwencji 5'-AG-3', poprzedzonej sekwencj bogat w pochodne pirymidyny, zwan traktem polipirymidynowym, przed ktr ma znajdowa si sekwencja rozgazienia. Podczas skadania mRNA, w wyniku ataku grupy 2'-hydroksylowej z reszty nukleotydu adeninowego sekwencji rozgazienia na wizanie z udziaem G z 5' koca, powstaje charakterystyczna czsteczka o ksztacie lassa oraz wolny ekson 1. Po czym nastpuje rozcicie po reszcie G w sekwencji AG na kocu 3' intronu, w wyniku czego intron zostaje uwolniony w postaci lassa i zdegradowany, a dwie sekwencje eksonowe cz si ze sob. Podczas dojrzewania alternatywnego moe mie miejsce przeksztacanie pre-mRNA w wicej ni jeden rodzaj dojrzaego mRNA, dziki rnym sposobom skadania (tzw. alternatywne skadanie). Alternatywne skadanie mRNA wynika ze zrnicowanego uycia miejsc splicingowych 5' i 3', dziki wykorzystaniu rnych promotorw, uyciu rnych miejsc poli(A) i ostatecznie z pozostawienia jednych, a usunicia innych eksonw.333

W wyniku alternatywnego skadania z jednego pre-mRNA powstaj odmienne sekwencje kodujce w mRNA dziki rnym kombinacjom pocze eksonw. Za alternatywne skadanie mRNA odpowiedzialne s czynniki swoiste dla okrelonych typw komrek. Proces ten katalizowany jest przez kompleksy biaek z maymi jdrowymi RNA (snRNP). Niezwyk form dojrzewania mRNA jest redagowanie RNA, w wyniku ktrego ulega zmianie sekwencja pierwotnego transkryptu. Przykadowo, podczas redagowania pre-mRNA apolipoproteiny-B w komrkach jelita u czowieka nastpuje pojedyncza zmiana zasady C na U, czego konsekwencj jest powstanie kodonu stop w mRNA i skrcenie sekwencji kodujcej do 6666 nukleotydw z dugoci 14 500 nukleotydw, ktrej produktem jest apolipoproteina B48 o wielkoci 241 kDa. W komrkach wtroby pre-mRNA apolipoproteiny-B nie ulega redagowaniu, dlatego produktem sekwencji kodujcej tego mRNA jest apolipoproteina B100 o wielkoci 512 kDa. Ogon poli(A) to sekwencja 200250 nukleotydw adeninowych, znajdujca si na kocu 3' mRNA. Ogon poli(A) tworzy si posttranskrypcyjnie (w procesie dojrzewania mRNA), w wyniku cicia pre-mRNA, a nastpnie dodania acucha reszt nukleotydw adeninowych, dziki obecnoci specyficznej sekwencji w DNA (tym samym w odpowiednim transkrypcie pre-mRNA), zwanej sygnaem poliadenylacji. Niektre mRNA maj wicej ni jedno miejsce poliadenylacji, tzw. alternatywne miejsca poli(A), dziki temu rne miejsca mog by uyte w odmiennych warunkach, np. w rnych typach komrek, dajc ostatecznie rne dojrzae mRNA. Ogon poli(A) stabilizuje mRNA, umoliwia przyczenie biaek zabezpieczajcych ten kwas rybonukleinowy przed dziaaniem 3'-egzonukleaz. Ogon poli(A) moe pomaga w translacji mRNA.

tRNACzsteczki tRNA peni funkcje czsteczek adaptorowych, ktre dostarczaj aminokwasy do rybosomw, gdzie tworzone s wizania peptydowe midzy aminokwasami w kolejnoci okrelonej przez mRNA. Transportujce RNA stanowi okoo 15% wszystkich kwasw rybonukleinowych w komrce. Istnieje przynajmniej jeden tRNA dla kadego z dwudziestu aminokwasw (cznie 61 tRNA). Czsteczki tRNA s mae, jak na kwasy nukleinowe, ich liniowa sekwencja moe mie dugo od 60 do 95 nukleotydw, zazwyczaj 76. Na kocu 5' czsteczki znajduje si monofosforan, zwykle przy guanozynie, a na kocu 3' staa trjnukleotydowa sekwencja 5'-CCA-3'. W sekwencji tej do grupy -OH przy C2' lub C3' rybozy nukleotydu adeninowego przycza si aminokwas wizaniem estrowym. Sekwencja 5'-CCA-3 prokariotycznych tRNA jest zakodowana w genie, natomiast334

u eukariota dodawana jest enzymatycznie podczas posttranskrypcyjnego procesu dojrzewania pre-tRNA. W strukturze pierwszorzdowej tRNA stwierdza si wiele zmodyfikowanych nukleozydw, ktre mog stanowi nawet 20% wszystkich nukleotydw w czsteczce. Zmodyfikowanymi nukleozydami, powszechnie wystpujcymi w tRNA, s pseudorydyna, rybotymina, dihydrourydyna, inozyna, N6-izopentenyloadenozyna, 4-tiourydyna, wszystkie wprowadzane s posttranskrypcyjnie w procesie dojrzewania. W czsteczce tRNA znajduje si 15 niezmiennych nukleotydw. Struktura pierwszorzdowa tRNA zawiera liczne, liniowo oddalone sekwencje komplementarne, umoliwiajce powstawanie rejonw dwuniciowych, nadajcych okrelon struktur przestrzenn czsteczce tRNA. Struktura drugorzdowa typu licia koniczyny jest charakterystyczna dla wszystkich tRNA. W strukturze tej rejony komplementarne czsteczki oddziauj ze sob, tworzc cztery ramiona i trzy ptle. Ramiona zawieraj sparowane nukleotydy (poczone wizaniami wodorowymi w komplementarne pary), natomiast ptle tworz niesparowane i w wikszoci niezmienne nukleotydy. Koce 5' i 3' polirybonukleotydu tRNA tworz rejon (z 7 par nukleotydw) sparowany wizaniami wodorowymi, ktry nazywa si ramieniem akceptorowym aminokwasu. Nastpne, bardzo krtkie rami, ktre skada si z 3 lub 4 par kom3A C C

5p

G

PTLA DHU

G T

PTLA TC

G C

PTLA ANTYKODONOWA

335

plementarnych nukleotydw sparowanych wizaniami wodorowymi, poprzedza ptl dihydrourydylow (DHU). Jej nazwa wynika z obecnoci zmodyfikowanej zasady dihydrouracylu. Ptla ta moe skada si z 710 nukleotydw. Po przeciwnej stronie ramienia akceptorowego znajduje si rami antykodonowe, skadajce si z 5 par komplementarnych nukleotydw sparowanych wizaniami wodorowymi, zakoczone ptl antykodonow. Ptla ta zawiera 7 nukleotydw, z ktrych trzy centralne tworz antykodon, komplementarny do trjnukleotydowego kodonu okrelonego aminokwasu, znajdujcego si w sekwencji kodujcej mRNA. Obecno inozyny w antykodonie umoliwia czsteczce tRNA rozpoznawanie wicej ni jednego kodonu. Rami zmienne (dodatkowe) jest najbardziej zmiennym elementem w strukturze poszczeglnych czsteczek tRNA. Moe mie rn dugo, od bardzo sabo zaznaczonej, skadajcej si z 3 nukleotydw do dugiego ramienia utworzonego a z 21 nukleotydw. Dugie rami zmienne moe zawiera rejon sparowany, skadajcy si z 7 par nukleotydw. Rami TC, skadajce si z 5 par nukleotydw sparowanych zakoczone jest ptl TC, utworzon z 7 niesparowanych nukleotydw, wrd ktrych nie zmiennymi nukleotydami s GTC. Wikszo niezmiennych nukleotydw znajduje si w ptlach i nie ma istotnego znaczenia w tworzeniu struktury drugorzdowej, lecz bior udzia w tworzeniu trzeciorzdowych wiza wodorowych, ktre stabilizuj struktur trzeciorzdow tRNA. Tworzenie komplementarnych par midzy nukleotydami niezmiennymi ptli DHU i ptli TC umoliwia czsteczce tRNA przybranie konformacji przestrzennej (struktury III-rzdowej), przypominajcej odwrcon liter L, zawierajc na jednym kocu (duszym) antykodon, a na drugim (krtszym) miejsce akceptorowe dla aminokwasu. Wszystkie dojrzae tRNA powstaj z duszych pierwotnych transkryptw, tzw. pre-tRNA, w procesie dojrzewania. Reakcje skadajce si na proces dojrzewania tRNA u eukariota polegaj na 1) odciciu sekwencji liderowej z koca 5'; 2) odciciu dwch nukleotydw z koca 3'; 3) dodaniu do koca 3' sekwencji CCA; 4) wyciciu centralnego intronu z czsteczki pre-tRNA; 5) chemicznych modyfikacjach zasad azotowych. Procesy te katalizuj egzonukleazy i endonukleazy (RNazy D, E, F, P) oraz enzymy modyfikujce zasady. RNaza P jest endonukleaz, skadajc si z jednej czsteczki RNA i jednej biaka (jest wic RNP), za aktywno katalityczn odpowiedzialna jest czsteczka RNA (rybozym), ktra przeprowadza dojrzewanie koca 5' tRNA. Rybozymy to katalityczne czsteczki RNA, czyli biokatalizatory, zdolne do katalizowania chemicznej reakcji w nieobecnoci biaka. W przypadku RNazy P, jej skadnik biakowy przypuszczalnie pomaga katalizowa reakcj in vivo, ponie-

336

wa in vitro rybozym RNazy P wymaga wikszego stenia jonw Mg2+ od stenia magnezu obecnego w komrkach.

rRNARybosomalne RNA s jednoniciowymi polirybonukleotydami, wystpujcymi w komrkach jako gwne skadniki rybosomw oraz jderka. Stanowi okoo 80% komrkowego kwasu rybonukleinowego. Masa czsteczkowa wikszoci rRNA jest bardzo dua, poniewa pojedyncza czsteczka moe zawiera kilka tysicy nukleotydw, z wyjtkiem nielicznych, ktrych pojedyncza czsteczka posiada 121 lub 158 nukleotydw. Charakterystyczn modyfikacj chemiczn dla czsteczek rRNA stanowi metylacja, wykryto 24 swoiste metylacje zasad azotowych, przy czym grupa metylowa dodawana jest gwnie do piercienia adeniny. Ponadto, czsto obserwuje si metylacj prowadzc do 2'-O-metylorybozy, ktra moe zachodzi w ponad 100 miejscach czsteczki rRNA. Reakcje metylacji, zachodzce w jdrze komrkowym, przeprowadzaj niskoczsteczkowe czstki RNP, ktrych snRNA s komplementarne do rejonw rRNA, z ktrymi tworz pary, definiujc w ten sposb miejsca metylacji. Aktywnym donorem grup metylowych jest S-adenozylometionina. Struktura drugorzdowa wszystkich czsteczek rRNA wyrnia si obecnoci sparowanych rejonw dwuniciowych, tzw. ramion, poprzedzielanych rejonami niesparowanymi, jednoniciowymi, tzw. ptlami. Obecno w

5

3

PTLE RAMIONA

polirybonukleotydzie rejonw ramion i ptli sprzyja specyficznym oddziaywaniom i wizaniu biaek, tym samym tworzeniu kompleksw rybonukleoproteinowych RNP, majcych istotne znaczenie w formowaniu rybosomw.

337

W komrkach eukariotycznych wystpuj 4 rodzaje rRNA. Wielkoczsteczkowy rRNA, ktrego acuch polirybonukleinowy tworzy 4718 nukleotydw, okrela si jako 28S rRNA.[Wielko S (Swedberg) jest liczbow wartoci wspczynnika sedymentacji (s), zdefiniowanego szybkoci, z jak makroczsteczki sedymentuj (opadaj) w polu wirowania (przyspieszenia odrodkowego, tysickrotnie wikszego od pola grawitacji ziemskiej), osiganego w ultrawirwkach. Wartoci S s nieaddytywne, poniewa zale od masy i ksztatu czsteczki.]

Mniejsz czsteczk jest 18S rRNA, ktra skada si z 1874 reszt nukleotydowych. Niskoczsteczkowe rRNA s dwa, jeden z nich, mianowicie 5,8S rRNA (skadajcy si z 158 nukleotydw), wystpuje tylko u eukariota, drugi natomiast, 5S rRNA (skadajcy si z 121 nukleotydw), poza tym, e jest obecny w komrkach eukariotycznych, charakterystyczny jest rwnie dla komrek prokariotycznych. W komrkach prokariotycznych wystpuj 3 rodzaje rRNA, mianowicie: 23S rRNA, 16S rRNA i 5S rRNA. Dojrzae czsteczki rRNA powstaj z pierwotnego transkryptu pre-rRNA, pojedynczego dugiego prekursora, w wyniku serii modyfikacji i ci w tzw. zewntrznych transkrybowanych sekwencjach lub wewntrznych transkrybowanych sekwencjach rozdzielajcych, skadajcych si na proces dojrzewania. W komrkach ssakw pierwotny transkrypt o wielkoci rzdu 13 500 nukleotydw zawiera po jednej kopii 18S rRNA, 5,8S rRNA i 28S rRNA. Natomiast eukariotyczny 5S rRNA powstaje z odrbnego genu w procesie transkrypcji katalizowanej przez polimeraz RNA (III), odmienn od polimerazy RNA (I), ktra transkrybuje prerRNA dla trzech pozostaych rybosomalnych kwasw rybonukleinowych. Proces dojrzewania transkryptu 5S rRNA jest znacznie ograniczony lub te nie zachodzi wcale. Wszystkie trzy prokariotyczne rRNA transkrybowane s przez jedn polimeraz RNA III w formie pojedynczej nici pierwotnego transkryptu, na ktrej znajduj si rwnie sekwencje pre-tRNA. Proces dojrzewania pre-rRNA katalizowany jest enzymatycznie, w tym rwnie przez rybozymy. Udowodniono (przynajmniej u jednego przedstawiciela eukariota), e wystpujcy w pre-rRNA u Tetrahymena termophila intron przeprowadza autokatalityczny splicing. W ukadzie in vitro intron ten wymaga kofaktora, ktrym jest guanozyna lub jej ufosforylowane pochodne, natomiast zupenie nie potrzebuje obecnoci biaek do wycicia si z prekursora. Intron ten spenia kryteria typowego rybozymu. Rybozym ten, poza wasnoci samowycinania, posiada zdolno katalizowania ligacji uwolnionych fragmentw rRNA. Rybozymy, czyli katalityczne, krtkie czsteczki RNA, charakteryzuj si minimalnymi wymogami sekwencyjnymi, koniecznymi do ujawnienia swych wasnoci. Fakt ten sta si podstaw konstruowania syntetycznych rybozymw, ktre mog rozcina inne czsteczki RNA, w nadziei, e bdzie mona je stosowa w terapii, do inaktywacji odpowiednich mRNA, wirusw i do zabijania komrek nowotworowych.338

Dojrzewajce czsteczki rRNA zwijaj si w przestrzeni, cz si z biakami rybosomowymi, podlegajc samoorganizacji prowadzcej do wytworzenia rybosomw. Oznacza to, e informacje o strukturze rybosomw s zawarte w strukturze ich skadnikw. Rybosomy to typowe RNP, czyli kompleksy rybonukleoproteinowe o olbrzymiej masie czsteczkowej, rzdu 2,75 106 daltonw u prokariota (70 S) i rzdu 4,5 106 daltonw u eukariota (80 S). Kady rybosom skada si z dwch podjednostek, wikszej i mniejszej. Rybosomy eukariotyczne w swej duej podjednostce (o wielkoci 60S, czyli 3 106 Da) zawieraj trzy rodzaje rRNA (28S, 5,8S, 5S) i okoo 45 rnych biaek, natomiast w maej podjednostce (o wielkoci 40S, czyli 1,5 106 Da) jeden rodzaj rRNA (18S) oraz okoo 30 rnych biaek. Rybosomy prokariotyczne w swej duej podjednostce (o wielkoci 50S, czyli 1,7 106 Da) zawieraj dwa rodzaje rRNA (23S, 5S) oraz okoo 31 rnych biaek, natomiast w maej podjednostce (o wielkoci 30S, czyli 0,95 106 Da) jeden rodzaj rRNA (16S) oraz okoo 21 rnych biaek.

Wasnoci chemiczno-fizyczne kwasw nukleinowychCzsteczki DNA s bardzo dugie w porwnaniu do swej rednicy i stosunkowo sztywne, dlatego roztwory ich maj du lepko. Kwasy nukleinowe wykazuj rn wraliwo na rodowisko zasadowe i kwasowe. Czsteczki DNA s odporne na dziaanie mocnych zasad. Pozostawienie DNA w roztworze 1M NaOH przez 2040 godzin w temperaturze 37C nie dostarcza adnych produktw hydrolizy zasadowej. W tych warunkach RNA rozpada si cakowicie do mieszaniny 2- i 3- monofosfonukleozydw. Nastpuje to dziki obecnoci grupy OH przy atomie C2' rybozy, ktra w rodowisku zasadowym uczestniczy w tworzeniu nietrwaych wewntrzczsteczkowych wiza fosfodiestrowych w cyklicznych nukleozydo-2,3-fosforanach. Wizania te rozpadaj si z rwnym prawdopodobiestwem do nukleozydo-2- i nukleozydo-3-fosforanw. Brak grupy OH przy atomie C2' deoksyrybozy uniemoliwia powstanie cyklicznych fosforanw nukleozydw i jest podstaw opornoci kwasw deoksyrybonukleinowych na dziaanie zasad. Hydroliza kwasowa kwasw nukleinowych dostarcza rnych produktw zalenie od stenia stosowanych kwasw, czasu trwania hydrolizy i temperatury. Wizania glikozydowe rni si wraliwoci na dziaanie kwasw, mianowicie: w nukleotydach purynowych wizania glikozydowe s bardziej labilne ni w nukleotydach pirymidynowych.

339

Krtkotrwae ogrzewanie (w 100C), zarwno DNA, jak i RNA z kwasami (np. HCl) o niskich steniach (ok. 1M) pocztkowo dostarcza kwasw apurynowych, bdcych acuchami polinukleotydowymi, pozbawionymi zasad purynowych. W dalszym etapie tej hydrolizy kwasowej (po 1 godz.) powstaj mononukleotydy pirymidynowe, pentozy i kwas fosforowy. Pod wpywem dziaania mocnych kwasw mineralnych (np. 72% roztwr HClO4) i podwyszonej temperatury (100C przez 1 godz.) zarwno z DNA, jak i z RNA uwolnione zastaj zasady purynowe oraz pirymidynowe, pentozy, a take kwas fosforowy, tym samym ulegaj cakowitej hydrolizie. Hydroliza enzymatyczna kwasw nukleinowych polega na rozkadzie ich wiza fosfodiestrowych przez enzymy z grupy endo- lub egzo- rybonukleaz lub deoksyrybonukleaz. W zalenoci od rodzaju uczestniczcego w reakcji enzymu powstaj rne produkty, nukleozydo-5'-monofosforany lub nukleozydo-3'-monofosforany. Uwolnienie zasad azotowych z pocze glikozydowych przeprowadzaj specyficzne nukleozydazy. Szczegln grup endonukleaz stanowi enzymy restrykcyjne, zwane restryktazami. S to enzymy syntetyzowane przez rnorodne szczepy bakterii, ktrych zadaniem jest degradacja obcego (np. wirusowego) DNA w komrce bakteryjnej. Enzymy te charakteryzuj si prawie absolutn specyficznoci, rozpoznaj w nici DNA sekwencj, zazwyczaj 48 nukleotydow, w obrbie ktrej rozcinaj specyficzne wizanie fosfodiestrowe. W genomie bakteryjnym sekwencje te zwykle s metylowane na reszcie adeniny lub cytozyny, co zabezpiecza DNA gospodarza przed degradacj przez wasne enzymy restrykcyjne. Enzymy restrykcyjne rozpoznaj i rozszczepiaj sekwencje palindromowe w DNA. Sekwencja palindromowa dwuniciowego DNA to taka sekwencja nukleotydw, ktra jest identyczna, gdy odczytuje si j na obu niciach w kierunku 5'3'. Niektre restryktazy, w wyniku hydrolizy DNA, dostarczaj fragmenty zakoczone jednoniciowymi sekwencjami, zwanymi potocznie kocami kohezyjnymi. Koce kohezyjne fragmentw DNA wytworzonych skutkiem dziaania tego samego enzymu restrykcyjnego s zawsze komplementarne do siebie, niezalenie od rda pochodzenia preparatu DNA poddawanego hydrolizie. Takie produkty hydrolizy DNA mona poczy ze sob na zasadzie komplementarnoci poprzez jednoniciowe koce kohezyjne. Fakt ten sprawi, e enzymy restrykcyjne stay si wanym narzdziem w biologii molekularnej, umoliwiajcym nie tylko wycinanie, ale i czenie fragmentw DNA w rekombinowane czsteczki.

Denaturacja i renaturacja DNAProces denaturacji kwasw nukleinowych polega na zniszczeniu ich struktury II- i III-rzdowej. Czynnikami denaturujcymi DNA s: wysoka warto pH, alkohole, fenole, wysoka temperatura, ultradwiki, promieniowanie.340

Zwizkami powszechnie stosowanymi w analizie kwasw nukleinowych w celu spowodowania denaturacji kwasw nukleinowych s formamid (HCONH2) i mocznik (H2NCONH2). Zwizki te powoduj rozrywanie wiza wodorowych wikszoci czsteczek wody i wykluczaj umiejscawianie si wody pomidzy zasocjowanymi warstwowo hydrofobowymi zasadami azotowymi, doprowadzajc do denaturacji dwuniciowych struktur kwasw nukleinowych. Wpyw rodowiska zasadowego polega na zmianie tautomerycznych form zasad azotowych w kwasach nukleinowych, w kierunku form enolowych (laktymowych), poniewa czsteczka traci proton, a adunek ujemny jest stabilnie zlokalizowany na atomie tlenu. Ma to wpyw na wizania wodorowe midzy parami zasad azotowych, powodujc ich rozerwanie, tym samym zniszczenie dwuniciowej struktury DNA, czyli jego denaturacj. Pod wpywem ogrzewania struktura podwjnej helisy DNA ulega podobnemu zniszczeniu i rozpada si na pojedyncze nici. Rozpad struktury helikalnej nastpuje w okrelonej temperaturze, zwanej temperatur topnienia DNA. Temperatura topnienia (Tm) okrelonych czsteczek DNA, to taka warto, przy ktrej dochodzi do utraty poowy helikalnej struktury DNA, z towarzyszcym nagym wzrostem pochaniania wiata w ultrafiolecie (przy 260 nm). Na przed-

Zmiana absorbancji przy 260 nm

75

80

85

temp.

stawionym powyej wykresie temperatura topnienia analizowanego preparatu DNA wynosi 85C. Jej warto zaley od skadu zasad azotowych DNA, mianowicie im wysza zawarto par CG, tym wysza temperatura topnienia.

341

Zawarto GUANINY + CYTOZYNY (%)

100

80

60

40

20

0 70 80 90 100 110

temperatura topnienia

Denaturacja jest odwracalna, po usuniciu czynnika denaturujcego, ma miejsce odtworzenie komplementarnej struktury podwjnej helisy DNA, a proces ten nazywa si renaturacj. Zdenaturowany DNA w temperaturze nieco niszej od temperatury topnienia, po powolnym schadzaniu w temperaturze pokojowej ulega prawie cakowitej renaturacji do struktury dwupasmowej. Szybko renaturacji wyraa si jako iloczyn stenia (mol/l) i czasu (s), u prokariota zazwyczaj jest odwrotnie proporcjonalna do wielkoci genomu. Jednoczenie szybko renaturacji DNA okazuje si tym wiksza, im wysza zawarto w nim powtarzajcych si sekwencji, np. mysi satelitarny DNA (10% mysiego DNA) renaturuje w cigu kilku sekund, znacznie szybciej od najmniejszych czsteczek DNA (np. faga T4, lub E.coli). Natomiast DNA zawierajcy sekwencje unikatowe, nie powtarzajce si (np. 70% mysiego DNA) renaturuje bardzo wolno. Podczas renaturacji czenie w podwjne helisy pojedynczych acuchw polinukleotydowych, pochodzcych z rnych kwasw nukleinowych (zarwno typu DNA-DNA, jak i DNA-RNA), nazywa si hybrydyzacj. Tworzenie hybryd jest moliwe midzy podobnymi (spokrewnionymi) acuchami polinukleotydowymi, ktre na dugich odcinkach czsteczki maj komplementarne sekwencje zasad azotowych. Hybrydyzacja kwasw nukleinowych wykorzystywana jest jako metoda w biologii molekularnej.

342

0

C dsDNA

0

C

0

C

ssDNA

Denaturacja i renaturacja termiczna DNA

Spektroskopowe waciwoci kwasw nukleinowychKwasy nukleinowe, podobnie jak nukleotydy, nukleozydy i zasady azotowe, selektywnie pochaniaj wiato w nadfiolecie (UV), z maksimum przypadajcym na 260 nm. Waciwo ta wynika z obecnoci w omawianych zwizkach ukadw aromatycznych: purynowego i pirymidynowego, zawierajcych sprzone wizania podwjne oraz heteroatomy.

343

Zdolno kwasw nukleinowych do absorpcji wiata wykorzystuje si do wykrywania, ilociowego oznaczania oraz okrelania stopnia czystoci preparatw kwasw nukleinowych. Absorbancja kwasw nukleinowych nie jest addytywn sum absorbancji wszystkich zasad azotowych, wchodzcych w ich skad, rzeczywista molowa absorpcja okazuje si nisza o okoo 40% od wartoci teoretycznie obliczonej na podstawie skadu. Zjawisko to nosi nazw efektu hipochromowego, ktry wynika z helikalnego uporzdkowania przestrzennego nici polinukleotydowych, opisanego struktur drugorzdow i trzeciorzdow. Widma absorpcyjne kwasw rybonukleinowych i deoksyrybonukleinowych s bardzo podobne. Absorbancja przy 260 nm jest najmniejsza dla dwuniciowego DNA (dsDNA), wiksza dla jednoniciowego DNA (ssDNA) lub RNA i najwiksza dla wolnych nukleotydw.

jednoniciowy

dwuniciowy Absorbancja

220

260

300

nm

Czsteczki jednoniciowe DNA s produktami denaturacji dwuniciowych czsteczek DNA i silniej absorbuj wiato o dugoci fali 260 nm ni czsteczki dwuniciowe DNA. Zjawisko to nosi nazw efektu hiperchromowego, ktry jest konsekwencj obnienia uporzdkowania przestrzennego nici polinukleotydowych. Wielko efektu hiperchromowego jest proporcjonalna do iloci nukleotydw znajdujcych si w obrbie helikalnych fragmentw czsteczki, ktre ulegy w tym procesie zniszczeniu. Renaturacji cakowitej DNA do struktury dwupasmowej towarzyszy efekt hipochromowy. Szybkie schodzenie zdenaturowanego preparatu DNA, raczej utrwala struktury jednoniciowe. Takie ssDNA mog splata si swymi krtkimi regionami komplementarnymi pojedynczej nici, w nieznacznym natomiast stopniu powstaj dwuniciowe struktury, stabilizowane wizaniami wodorowymi, dlatego w tych warunkach efekt hipochromowy jest raczej niewielki.

344

Denaturacji i renaturacji DNA, poza zmian absorpcji wiata w ultrafiolecie, towarzysz zmiany innych wasnoci fizycznych, jak lepko i skrcalno optyczna. Wasnoci spektroskopowe makroczsteczek pozwalaj okreli przyblion czysto preparatw kwasw nukleinowych, na podstawie wartoci stosunku absorbancji przy 260 nm i 280 nm (A260/A280). Wolny od zanieczyszcze dwuniciowy DNA ma warto wspczynnika A260/A280 rwn 1,8, czysty RNA okoo 2, czyste biaka poniej 1 (okoo 0,5). Preparat DNA, ktrego warto wspczynnika A260/A280 jest wiksza od wartoci 1.8, moe by zanieczyszczony RNA. Jeli wspczynnik A260/A280 ma warto poniej 1.8, to preparat zanieczyszczony moe by biakami.

345

20.

CZYNNIKI MODYFIKUJCE STRUKTUR DNAIwona ak, Pawe Niemiec

Czynniki chemiczne lub fizyczne o charakterze mutagennym s niejednorodn grup. Wszystkie reaguj bezporednio z DNA, wprowadzajc modyfikacje w strukturze nukleotydw, lece u podstaw zmian sekwencji zasad azotowych. Chemicznymi czynnikami modyfikujcymi struktur DNA s: kwas azotawy, hydroksylamina, zwizki alkilujce, analogi zasad azotowych, barwniki akrydynowe, policykliczne wglowodory aromatyczne oraz reaktywne formy tlenu. Charakter mutagenny wykazuj niektre leki, np.: pewne klasy cytostatykw, antybiotykw oraz lekw psychotropowych. Do fizycznych czynnikw mutagennych zalicza si promienie X, promienie , , , UV oraz hipertermi.

Chemiczne czynniki modyfikujce DNAKwas azotawy jest zwizkiem, ktry deaminuje cytozyn, adenin i guanin w DNA. Deaminacja cytozyny przeksztaca j w uracyl. Deaminacja kwasem azotawym adeniny przeksztaca j w hipoksantyn.NH2 N O N H cytozynaNH2 N N adenina N N H kwas azotawy deaminacja N N H HN

O kwas azotawy deaminacja O N H uracylO N

N

hipoksantyna

Deaminacja kwasem azotawym guaniny przeksztaca j w ksantyn.

346

O HN H2N N guanina N N H kwas azotawy deaminacja O HN

O N N N H H ksantyna

Jeli modyfikacje te zostan utrwalone podczas replikacji, wwczas w DNA ma miejsce zamiana zasad azotowych GC na AT, gdy nastpia deaminacja typu cytozynauracyl lub zamiana zasad azotowych AT na GC, gdy miaa miejsce deaminacja typu adeninahipoksantyna, lub zasad azotowych GC na AT, gdy zasza deaminacja typu guaninaksantyna w DNA. Hydroksylamina jest zwizkiem, ktry w ukadzie in vitro reaguje z cytozyn w DNA, przeksztacajc j w zwizek podobny do uracylu, w konsekwencji moe prowadzi to do tranzycji CT.N N HONH hydroksylamina OH O CH3 S O CH3 O metylosulfonian metylu O H2N C N CH2CH3 N O

etylonitrozomocznik

Do zwizkw alkilujcych nale midzy innymi sulfonian dietylowy, sulfonian etylometylowy oraz metylosulfonian metylu, etylonitrozomocznik i diepoksybutan. Obecno grup metylowych, etylowych i innych w tych zwizkach, powoduje alkilacj zasad azotowych. Najwiksz wraliwo na alkilacj w -helisie wykazuje atom azotu (N7) guaniny. W dalszej kolejnoci mog ulega alkilacji atomy azotu guaniny (N1), adeniny (N1 i N3) i cytozyny (N3). Pod wpywem tych zwizkw obserwuje si liczne tranzycje i transwersje typu: ATTA, ATGC, GCCG, GCAT, GCTA. Analogiczny mechanizm dziaania (z mechanizmem bifunkcyjnych zwizkw alkilujcych) wykazuj niektre pochodne platyny (Pt), wykorzystywane w terapii przeciwnowotworowej. Do grupy tej naley midzy innymi cis-diamino-dichloroplatyna (cDDP).H3N ClPt ClNH3 ClClPt NH3 NH3

trans -diamino-dichloroplatyna

cis -diamino-dichloroplatyna

Rezultatem budowy cDDP (centralnie pooony atom Pt z dwiema reaktywnymi grupami Cl-) jest skonno do atwej zamiany ligandw w rodowisku wodnym i do formowania kompleksw z grupami funkcyjnymi o ujemnym adunku, czyli z grupami nukleofilowymi w czsteczkach substancji biologicznie czynnych.347

Mona wyrni dwa rodzaje oddziaywa tego cytostatyku z DNA. S to monofunkcyjne oraz bifunkcyjne reakcje zwizku. Efekt monofunkcyjny dotyczy rzadkich przypadkw, kiedy jeden z atomw chloru unieczynniany jest przez np. H2O (ryc. a) lub biako niehistonowe ryc. b (okoo 0,15% wszystkich adduktw cDDPDNA).

a)

b)

c)

d)

Bifunkcyjne dziaanie cis-platyny jest znacznie czciej spotykane i silniejsze od monofunkcyjnego. Reakcja wymiany obu ligandw moe mie dwojaki charakter: jeden z nich polega na midzyniciowym wizaniu krzyowym z zasadami nalecymi do dwch rnych nici (ryc. c), stanowi mniej ni 1% cakowitej iloci adduktw cDDPDNA. Drugi, najwaniejszy pod wzgldem terapeutycznym, polega na wewntrzniciowym wizaniu krzyowym z zasadami azotowymi nalecymi do tej samej nici (ryc. d), stanowi okoo 98% wszystkich adduktw cDDPDNA. Odlego midzy dwoma labilnymi ligandami Cl- w czsteczce cDDP jest rzdu 0,33 nm, niemal taka sama, jak odlego midzy dwiema ssiadujcymi zasadami w -helisie. Std w krzyowych wizaniach wewntrzniciowych dominuj oddziaywania typu 1,2-wiza wewntrzniciowych. Oddziaywania te nie wystpuj w izomerze trans-DDP, u ktrego odlego midzy dwoma labilnymi ligandami Cl- rwna si 0,45 nm. Trans-diamino-dichloroplatyna nie wykazuje wic waciwoci genotoksycznych. Analogi zasad azotowych s strukturalnie podobne do zasad wystpujcych w czsteczce DNA, dziki temu mog by rozpoznawane i wbudowywane podczasTA CGTTG A TGCA A C

5BuTA CGBTG A TGCA A C

O Br HN O N H 5 - bromouracyl 5-bromouracyl ( 5Bu )

zmiana tautomerycznaTA CGBTG A TGCGA C

replikacjaTA CGCTG A TGCGA C

5Bu

348

replikacji przez polimeraz DNA. Powoduj one mutacje na skutek niewaciwego parowania zasad. Przykadami tych zwizkw mog by 2-aminopuryna i 5-bromouracyl. Drugi z tych zwizkw jest analogiem tyminy i normalnie ulega parowaniu z adenin. 5-bromouracyl moe ulec przesuniciu tautomerycznemu, na skutek ktrego ulega parowaniu z guanin. Po replikacji wyjciowa para TA zostaje zastpiona przez GC. Barwniki akrydynowe wnikaj (interkaluj) midzy zasady azotowe w acuchu DNA, powodujc ich rozsunicie. Do grupy tej nale midzy innymi oran akrydyny, proflawina oraz akryflawina. Deformacje matrycy DNA, spowodowane interkalacj barwnikw akrydynowych, wywouj bdy replikacji, prowadzce w rezultacie do delecji lub insercji pojedynczych par nukleotydw, a w dalszej konsekwencji do mutacji typu zmiany ramki odczytu.

H 2N

N proflawina

NH 2

H 2N

N CH 3 akryflawina

NH 2

Interkalatorem jest te bromek etydyny. Czsteczka tego zwizku zawiera cztery piercienie o rozmiarach zblionych do pary zasad puryna-pirymidyna. Mechanizm dziaania bromku etydyny jest podobny do mechanizmu dziaania barwnikw akrydynowych. Zwizek ten wykorzystuje si powszechnie jako barwnik DNA, stosowany w elektroforezie agarozowej. Pod wpywem UV zwizany z DNA bromek etydyny emituje wiato o zabarwieniu pomaraczowym.NH2

H2N

N+

CH3Br-

bromek etydyny (EtBr)

Wielopiercieniowe wglowodory aromatyczne, takie jak np. benzo[a]piren czy benzo[a]antracen tworz addukty z DNA. S to produkty reakcji przyczania (addycji) atomw lub czsteczek (w tym przypadku wielopiercieniowych wglowodorw aromatycznych) do czsteczki innego zwizku (w tym przypadku DNA).

349

O cytochrom P 450 aktywacja metaboliczna HO OH benzo[a]piren7, 8 -diol - 9, 10 - tlenek

Wielopiercieniowe wglowodory aromatyczne zaliczane s do promutagenw, czyli zwizkw, ktre staj si waciwymi mutagenami dopiero po metabolicznym przeksztaceniu w organizmie. W aktywacji metabolicznej czsto uczestniczy kompleks cytochromu P450. Podobne zwizki wystpuj w dymie papierosowym, kawie, herbacie oraz przede wszystkim w pokarmach pochodzenia zwierzcego. Najwicej znajduje si ich w tzw. czerwonym misie. Addukty z DNA tworz take niektre heterocykliczne aminy aromatyczne, powstajce rwnie podczas obrbki termicznej biakowych produktw ywnociowych, szczeglnie podczas dugotrwaego smaenia misa w temperaturze powyej 150C, skutkiem pirolizy aminokwasw (glicyna, kwas glutaminowy, tryptofan, fenyloalanina). Dziki czeniu si z kreatynin i cukrem tworz mutagenne heterocykliczne aminy aromatyczne, np:. 3-amino-1-metylo-5H-pirydo [4,3-b]indol (Trp-P-2), 2-amino-6-metylodipirydo [1,2-a:3,2-d]indol (Glu-P-1), 2-amino-5-fenylopirydyna.CH3 N N H ( Trp - P -2) NH2

N N N CH3 (Glu - P -1) ( Glu-P-1)

NH2

N2 - amino- 5 - fenylopirydyna

NH2

Wolne rodniki reagujce z DNA to rodnik hydroksylowy (OH), jon wodorkowy (H) oraz anion ponadtlenkowy (O2-). Gwn, aktywn form tlenu, odpowiedzialn za powstanie wikszoci oksydacyjnych uszkodze czsteczki DNA, jest rodnik hydroksylowy. Wynika to z jego silnie elektrofilowego charakteru, ktry warunkuje dwa podstawowe typy przemian skadowych czsteczki DNA:350

reakcj addycji z wizaniami zasad azotowych oraz dehydratacj czsteczek deoksyrybozy. W przypadku zasad pirymidynowych w przewaajcej wikszoci reakcje te maj charakter addycji z atomami wgla, poczonymi wizaniem podwjnym C5 = C6 w piercieniu, lub oderwania atomu wodoru od grupy metylowej przy atomie wgla C5. Natomiast w wypadku zasad purynowych reakcja ta dotyczy wizania przy atomie wgla C4 lub C8. Poza tym, generowanie w bezporednim ssiedztwie chromatyny wysoce reaktywnych rodnikw tlenowych doprowadzi moe do powstania wiza poprzecznych midzy DNA a biakami, znajdujcymi si w jego otoczeniu.O CH3 HN O N H tyminaO HN H2N N guanina N OH N H H2N HN N NH2

O OH O HN N H glikol tyminyO N H CHO

CH3 OH OH

Fapy-guanina

Rodniki hydroksylowe, poza oddziaywaniem z zasadami azotowymi i biakami, mog rwnie reagowa z piercieniami deoksyrybozy. Rodnik hydroksylowy moe indukowa oderwanie kadego atomu wodoru zwizanego z czsteczk cukru. Nie wszystkie uszkodzenia piercienia cukrowego s wynikiem bezporedniej reakcji rodnika hydroksylowego z czsteczk cukru. Dua ich cz moe powstawa take na skutek oderwania atomu wodoru od czsteczki cukru przez powstay rodnik zasady azotowej.

Fizyczne czynniki modyfikujce DNAUszkodzenia DNA wywoane promieniowaniem jonizujcym, czyli promieniowaniem o duej energii, powoduj pkanie czsteczki DNA, niszczenie cukrw oraz zasad. Promienie jonizujce, przechodzc przez komrki, wybijaj elektrony z atomw i czsteczek, powodujc ich jonizacj. Powstae jony mog inicjowa rozmaite reakcje wolnorodnikowe (gwnie z udziaem omawianego wczeniej rodnika hydroksylowego), uszkadzajce DNA. Najgroniejsze dla ycia351

komrki uszkodzenia stanowi przerwy dwuniciowe w DNA, poniewa mog by zwizane s z utrat fragmentu informacji genetycznej. Uszkodzenia te powstaj pierwotnie, tj. w momencie, gdy pknicia pojedynczych nici zlokalizowane s naprzeciwko siebie w niewielkiej odlegoci, lub wtrnie, do czego dochodzi w trakcie naprawy uszkodzonej zasady, znajdujcej si naprzeciw jednoniciowego pknicia DNA. Przyjmuje si, e po zadziaaniu na komrk promieniowaniem w wysokoci 1Gy (1Gy to jednostka dawki zaabsorbowanej, odpowiadajca energii 1 dula, przyjtej przez 1kg masy ciaa) dochodzi do powstania 6001000 pkni jednoniciowych DNA, 2640 przerw dwuniciowych acucha DNA i 250 uszkodze tyminy. Promieniowanie ultrafioletowe, ze wzgldu na ma energi i znaczn dugo fali, ma mniejsz zdolno przenikania przez tkanki ni promieniowanie jonizujce, jednak promienie UV s intensywnie pochaniane przez DNA. Gwnym efektem dziaania promieni UV na DNA jest tworzenie dimerw pirymidynowych C-C, C-T a zwaszcza dimerw T-T pomidzy atomami C5 i C6 jednej reszty pirymidyny, a tymi samymi atomami wgla drugiej pirymidyny.O O CH3 promieniowanie UV N H tymina O HN N H N H CH3 O CH3 NH O

2O

HN

dimer tymidynowy

Wynikiem tej reakcji jest powstanie piercienia cyklobutanowego, ktry powoduje zblienie ssiadujcych pirymidyn, odksztacenia w szkielecie cukrowofosforanowym DNA, prowadzce w rezultacie do delecji takiego dimeru.

352

21.

ANALIZA INSTRUMENTALNA

Instrumentalna analiza chemiczna powstaa dziki konstruowaniu precyzyjnych aparatw pomiarowych, ktre pozwalaj wykorzysta wasnoci fizykochemiczne zwizkw do ich analizy jakociowo-ilociowej. Spord rnych technik analizy instrumentalnej omwiono tylko niektre, podstawowe z zakresu technik optycznych, elektrycznych i chromatograficznych.

ABSORPCJOMETRIAIwona ak, Beata SareckaAbsorpcjometria jest analityczn technik optyczn, wykorzystujc zdolno substancji chemicznych bdcych w roztworze do pochaniania wiata ca sw objtoci oraz pomiar natenia wizki wiata. Czsteczki zwizkw zdolnych do absorpcji promieniowania wietlnego s ukadami rezonansowymi, zdolnymi do drga z czstotliwoci zgodn z czstotliwoci drga fal elektromagnetycznych o okrelonej dugoci fali. Rne substancje pochaniaj promieniowanie zwykle o odmiennej dugoci fali, jeli jednak pochaniaj fale tej samej dugoci, to z rn intensywnoci. Substancje mog pochania promieniowanie elektromagnetyczne w zakresie wiata widzialnego (VIS od ang. visible), tzn. o dugoci od 400 do 750 nm (zakres kolorymetrii), lub nadfioletu (UV od ang. ultra violet), tzn. o dugoci od 200 do 400 nm, czy te podczerwieni (IR od ang. infra red), obejmujcej obszar powyej 750 nm: podczerwie bliska zakres dugoci fal 7502500 nm; podczerwie 2,525 m.; podczerwie daleka powyej 25 m do uamkw milimetra. Promieniowanie o dugoci fal 0,4200 nm to daleki nadfiolet, ktry charakteryzuje si tym, e jest pochaniany przez atomy tlenu, dlatego analizy w spektrofotometrze z tym zakresem wykonuje si po usuniciu z niego powietrza, czyli w prni. rdem promieniowania mog by lampy spektralne (np. deuterowe, wodorowe, rtciowe, sodowe), lasery lub lampy arowe. Lampy spektralne i lasery daj353

widmo liniowe, natomiast lampy arowe widmo cige. W celu otrzymania okrelonej dugoci fali uywa si odpowiednich monochromatorw. W monochromatorze znajduje si ukad (pryzmat, siatka dyfrakcyjna lub filtry), ktry przez odpowiednie ustawienie na szczelin wyjciow pozwala skierowa wizk promieniowania o danej dugoci fali. Ze szczeliny wyjciowej wizka monochromatyczna wpada do pomieszczenia pomiarowego, w ktrym przechodzi przez odpowiednie naczynie (kuwet) z roztworem zawierajcym analizowany zwizek. Kuwety powinny by wykonane z materiau przezroczystego dla okrelonych dugoci fal. Najpowszechniejszym materiaem przezroczystym jest kwarc, stosowany dla fal o dugoci: 200400 nm, 400750 nm oraz 7502500 nm. Poza tym, dla fal o dugoci 400750 nm stosuje si rwnie wysokojakociowe szko, a dla duszych fal podczerwieni krysztay: NaCl (w zakresie 2,515 m), KBr (do 25 m), CsBr (w zakresie 2540 m) i specjalne gatunki polietylenu przezroczystego dla fal o dugoci w granicach 15300 m. Podstaw kolorymetrycznego oznaczania stenia substancji w roztworze stanowi zaleno midzy intensywnoci zabarwienia roztworu, a steniem zawartej w nim substancji. Metoda ta suy do oznaczania stenia substancji majcych wasn barw. Barwa substancji zaley od selektywnej absorpcji okrelonej dugoci wiata widzialnego i jest barw dopeniajc do pochonitej. Na zabarwienie roztworu skadaj si fale elektromagnetyczne nie zaabsorbowane przez analizowan substancj, czyli promieniowanie przepuszczone. Przykadowo, czerwona barwa roztworu substancji moe by wynikiem pochaniania zieleni, ktra jest barw dopeniajc do czerwieni lub zdolnoci analizowanej substancji do przepuszczania wycznie promieniowania czerwonego. Podobnie ta barwa roztworu substancji moe by wynikiem pochaniania fal niebieskich, ktre s barw dopeniajc do tej lub zdolnoci analizowanej substancji do przepuszczania wycznie promieniowania tego. Roztwory substancji bezbarwnych to takie, w ktrych aden z rodzajw promieni widzialnych nie ulega pochoniciu. Substancje bezbarwne mona oznacza ilociowo metod kolorymetyczn, lecz po przeprowadzeniu ich w barwne pochodne na drodze stechiometrycznych reakcji chemicznych, ktre powinny przebiega szybko i do koca, powinny by powtarzalne i specyficzne oraz atwe do przeprowadzenia. Specyficzno reakcji zwykle okrela uyty odczynnik barwicy, ktry powinien reagowa tylko z badan substancj i nie powinien wchodzi w reakcj z adn inn substancj obecn w roztworze. Powstaa barwa powinna by: trwaa, niewraliwa na wiato, niepodatna na zmiany pH, niezalena od zmian temperatury i nadmiaru odczynnika barwicego. Efekty absorpcji w zakresie wiata widzialnego i ultrafioletu obserwuje si w widmach zwizkw zawierajcych grupy chromoforowe oraz ugrupowania354

atomw z wielokrotnymi sprzonymi wizaniami nienasyconymi. Niektre z nich przykadowo przedstawiono poniej.

\ C / \ C /

O

\ C / C

/ C \ C \ C / S N O N N

N

Na intensywno barwy zwizku wpywaj rwnie podstawniki, zwane grupami auksochromowymi, ktre przykadowo przedstawiono poniej. Maj one zdolno przesuwania maksimum absorpcji w kierunku fal duszych, zjawisko to zwane jest efektem batochromowym. CH3, NH2, OH, OCH3, SH, Cl, Br

Absorpcj promieniowania przez roztwory opisuje prawo Beera. Natenie (Io) wizki promieniowania, ktr przepuci si przez warstw roztworu substancji pochaniajcej wiato, spada do wartoci (I), gdy przejdzie przez roztwr. Stosunek I do Io nazywa si transmitancj (T) lub przepuszczalnoci, wyraan zwykle w procentach promieniowania przechodzcego przez analizowany roztwr:T= I I0 T% = I 100 I0

Transmitancja moe przyjmowa wartoci od 0 do 100. Warto T bdzie najwiksza (100% przepuszczalnoci wiata), gdy nie bdzie absorpcji wiata przez roztwr, najmniejsza warto T (0% przepuszczalnoci wiata) oznacza cakowit absorpcj promieniowania. Transmitancja nie jest prostoliniow funkcj stenia substancji pochaniajcej wiato w przeciwiestwie do absorbancji (A), innej wielkoci pozwalajcej oceni spadek natenia wizki wiata po przejciu przez warstw roztworu substancji pochaniajcej wiato. Absorbancja to logarytm odwrotnoci transmitancji:A = loggdzie: wspczynnik absorpcji; c stenie roztworu; l grubo warstwy roztworu absorbujcego w cm.

I 1 = log 0 = c 1 T I

355

Absorbancja (A), zwana te ekstynkcj (E) lub gstoci optyczn (D), rwna si logarytmowi stosunku natenia promieniowania padajcego (Io) do natenia promieniowania przepuszczonego (I). Prawo Bouguera-Lamberta-Beera stanowi podstawowe prawo absorpcjometrii, zgodnie z ktrym absorbancja substancji pochaniajcej wiato jest wprost proporcjonalna do stenia i gruboci warstwy roztworu, ktrego matematyczny zapis to: A = cl. Jeli stenie roztworu (mol/l) i grubo jego warstwy (w cm) s rwne jednoci, to wwczas wspczynnik absorpcji () rwna si wartoci mierzonej absorbancji, A = , dlatego nazywa si molowym wspczynnikiem absorpcji. Dla bardzo wielu substancji bezporedni pomiar A przy steniu 1 mol/l jest niemoliwy, dlatego warto molowego wspczynnika absorpcji oblicza si z pomiaru absorbancji przy steniu znacznie niszym, korzystajc z zalenoci:= A l / mol cm cl to c= A l/ mol cm

Jeeli stenie substancji pochaniajcej promieniowanie jest wyraone w gramach na litr, wwczas wspczynnik nosi nazw waciwego wspczynnika absorpcji (). Molowy wspczynnik absorpcji zaley od dugoci fali, temperatury i uytego rozpuszczalnika. Im wiksz warto ma molowy wspczynnik absorpcji danej substancji, tym mniejsz ilo tej substancji mona oznaczy kolorymetrycznie. Znajc warto molowego wspczynnika absorpcji analizowanej substancji i absorbancj roztworu o nieznanym steniu tej substancji mona obliczy jej stenie (wyraone w mol/l) na podstawie matematycznego zapisu prawa Bouguera-Lamberta-Beera, jednak obliczenia takie stosuje si rzadko, zwykle odczytuje si je ze sporzdzonego wykresu kalibracyjnego. W celu stwierdzenia, czy dana substancja pochania promieniowanie w danym zakresie dugoci fal, naley dokona pomiarw absorbancji dla kadej dugoci fali z tego zakresu. Z otrzymanych pomiarw sporzdza si wykres zalenoci absorbancji od dugoci fali, ktry jest charakterystycznym dla danej substancji widmem absorpcyjnym, w danym zakresie dugoci fal. Na widmie znajduje si maksymalna warto absorbancji dla okrelonej dugoci fali, przy ktrej nastpnie dokonuje si pomiarw absorbancji roztworw wzorcowych i badanych danej substancji. Jeeli substancja nie pochania wiata w danym zakresie dugoci fal, wartoci absorbancji s rwne lub bliskie zeru. Najwiksz zalet absorbancji jest jej wprost proporcjonalna zaleno od stenia. Wykres tej zalenoci w dostatecznie szerokim zakresie ma ksztat krzywej logarytmicznej. W pocztkowym odcinku kadej pojedynczej wartoci absorbancji mona przyporzdkowa tylko jedn warto stenia. W miar, jak wykres356

staje si asymptot krzywej, niemoliwe okazuje si przyporzdkowanie pojedynczej wartoci absorbancji tylko jednego stenia, bo w miar postpu krzywej, jednej wartoci absorbancji mona przyporzdkowa nieskoczenie wiele ste.

3 1 ABSORBANCJA STENIEPrawo Bouguera-Lamberta-Beera stosuje si tylko do pocztkowego odcinka wykresu zalenoci absorbancji do stenia. Jest on prostoliniowy i nazywa si wykresem kalibracyjnym (1), z ktrego mona odczyta szukane stenie roztworu po zmierzeniu wartoci jego absorbancji. W wykresie kalibracyjnym mog zdarza si odchylenia od prostoliniowej zalenoci, mianowicie: ujemne (2) gdy absorbancja zwiksza si wolniej wraz ze zwikszaniem stenia, ni wynikaoby to z proporcjonalnej zalenoci, lub dodatnie (3) gdy absorbancja zwiksza si znaczniej wraz ze zwikszaniem stenia, ni wynikaoby to z proporcjonalnej zalenoci. Przyczynami odchyle od prawa Lamberta-Beera mog by takie zjawiska, jak: dimeryzacja, dysocjacja lub asocjacja, ktre mog wpywa na wasnoci optyczne substancji oraz zale od stenia. Wykres kalibracyjny wykorzystuje si w zakresie prostoliniowej zalenoci. Ponadto, stenie substancji, speniajcej prawo Bouguera-Lamberta-Beera w zakresie ste, dla ktrych zaleno absorbancji od stenia jest prostoliniowa, mona oznaczy bez sporzdzania wykresu kalibracyjnego. W tym celu mierzy si warto absorbancji roztworu analizowanej substancji o znanym steniu (wzorzec) oraz roztworu analizowanego o nieznanym steniu. Stenie oznaczane oblicza si po przeksztaceniu nastpujcej proporcji: Aw : Ax = cw : cxgdzie: Aw absorbancja roztworu o znanym steniu (wzorca); Ax absorbancja roztworu analizowanego o nieznanym steniu; cw stenie znane, wzorca; cx stenie oznaczane 357

2

cx = cw Ax / Aw

Aparaty suce do pomiaru absorbancji to absorpcjometry. Stenie zwizkw barwnych oceniano pierwotnie przez intensywno zabarwienia, czyli koloru, std wywodzi si wci uywana nazwa kolorymetria, odnoszca si do absorpcjometrii w wietle widzialnym. Przyrzdem sucym do tego typu pomiarw jest kolorymetr, ktry mona traktowa jako uproszczony spektrofotometr. Przyrzdy stosowane do pomiaru absorpcji promieniowania mona najoglniej podzieli na: 1) fotokolorymetry w ktrych wiato monochromatyczne uzyskuje si przez specjalne filtry wietlne; 2) spektrofotometry zawierajce pryzmaty lub siatki dyfrakcyjne do uzyskiwania monochromatyzacji wiata. Na oglny schemat budowy tych aparatw skada si: a) rdo wiata, b) regulator natenia wizki promieniowania, c) monochromatory, d) pojemnik na roztwr badany, e) detektor, f) wskanik pomiaru. Przy pomiarze absorbancji pierwsz czynnoci, jak naley wykona jest nastawienie aparatu na wymagan dugo fali. Nastpnie trzeba przepuci wizk wiata monochromatycznego (przy ustawieniu wskanika cyfrowego na 100% przepuszczalnoci) przez kuwet zawierajc roztwr porwnawczy (np. woda lub uywany rozpuszczalnik) bd tzw. prb lep (jest to roztwr o takim samym skadzie i pH, jak roztwr badany, nie zawierajcy jednak oznaczanego skadnika). Jest to podstawowa zasada oznacze absorpcjometrycznych, pozwalajca na wyeliminowanie wpywu odczynnikw i zawartych w nich zanieczyszcze na ostateczny wynik pomiaru. Kolejny etap to przeczenie wskanika cyfrowego na absorbancj, ktra powinna wynosi 0,00. Dopiero po wyzerowaniu aparatu na prbie lepej mona odczyta absorbancj roztworu badanego, umieszczonego w identycznej kuwecie. Metody kolorytmetryczne nale do najatwiejszych i najszybszych metod analitycznych, s uniwersalne, dokadne i czue.

POLARYMETRIAIwona ak, Izabela Szotysek-BodysPolarymetria to technika analityczna, ktra wykorzystuje zjawisko skrcania paszczyzny wiata spolaryzowanego do wykrywania lub oznaczania stenia substancji optycznie czynnej, m.in. w analizie rodkw leczniczych. Przyrzdem sucym do oznaczania kta skrcenia paszczyzny wiata spolaryzowanego jest polarymetr. Wizk wiata liniowo spolaryzowanego otrzymuje si po przepusz-

358

czeniu wizki wiata monochromatycznego (lampy sodowej) przez pryzmat Nicola (nikol). Pryzmat Nicola to dwuomny kryszta szpatu islandzkiego (krystaliczny CaCO3), ktry szlifuje si pod ktem 68, przecina wzdu przektnej, po czym obie powki skleja balsamem kanadyjskim o wspczynniku zaamania rwnym 1,54; gwny przekrj jest paszczyzn polaryzacji pryzmatu.balsam kanadyjski 90 68

promie nadzwyczajny

promie zwyczajny

Schemat dziaania pryzmatu Nicola Wchodzcy do pryzmatu Nicola promie wiata rozszczepia si na dwa promienie: zwyczajny i nadzwyczajny. Promie zwyczajny pada na warstw balsamu kanadyjskiego pod ktem wikszym od granicznego, dlatego ulega odbiciu i wygaszeniu, promie nadzwyczajny za pod ktem mniejszym od granicznego, dlatego przechodzi bez zmian. Spolaryzowane promienie nadzwyczajne po opuszczeniu pryzmatu Nicola biegn dalej w tym samym kierunku, co promienie padajce na ten pryzmat. Zatem pryzmat Nicola przepuszcza drgania fali elektromagnetycznej tylko w jednej paszczynie, natomiast wygasza drgania w innych paszczyznach. Po przepuszczeniu wiata monochromatycznego przez dwa pryzmaty Nicola, ustawione jeden za drugim, natenie wiata spolaryzowanego zaley od ustawienia drugiego.

wiato spolaryzowane wykazuje maksymalne natenie, gdy paszczyzny polaryzacji obu pryzmatw Nicola s do siebie ustawione rwnolegle. W przypadku, gdy jeden zostanie obrcony wok swej osi mona obserwowa coraz wiksze zaciemnienie w polu widzenia, tj. wygaszanie wiata wychodzcego z polarymetru.Maksymalne zaciemnienie, czyli wygaszenie wiata ma miejsce, gdy kt obrotu pryzmatu Nicola osignie 90, wwczas paszczyzny polaryzacji (gwne przekroje) obu pryzmatw s do siebie prostopade (skrzyowane). W takim uoe359

niu drugi pryzmat Nicola nie przepuszcza wizki wiata spolaryzowanego wychodzcego z pierwszego. Wizka odbija si od warstwy balsamu w drugim pryzmacie i dalej biegnie jako wizka promieni zwyczajnych.Schemat budowy polarymetru

1 gdzie:

2

3

4

5

6

7

8

1 rdo wiata; 2 filtr ty dajcy wiato monochromatyczne; 3 soczewka dajca wizk promieni rwnolegych; 4 polaryzator; 5 pytka kwarcowa; 6 rurka polarymetru; 7 analizator; 8 okular

W polarymetrach pierwszy pryzmat Nicola jest nieruchomy i nosi nazw polaryzatora, poniewa suy do wytwarzania wizki wiata spolaryzowanego. Drugi to analizator, ktry jest ruchomy wok osi optycznej i sprzony ze skal ktow, suc do odczytu wielkoci kta skrcenia. Zasada dziaania polarymetru opiera si na tym, e jeli midzy pryzmatami Nicola (skrzyowane) umieci si substancj optycznie czynn, ktra skrca paszczyzn wiata spolaryzowanego o kt , to pole widzenia w okularze rozjani si proporcjonalnie do stenia tego zwizku. W celu osignicia pierwotnego zaciemnienia naley obrci analizator dokadnie o kt . W przypadku jednych zwizkw optycznie czynnych, analizator naley obrci w prawo (substancje prawoskrtne), w przypadku drugich w lewo (substancje lewoskrtne). Kt skrcenia odczytuje si na skali ktowej z dokadnoci do 0,05 za pomoc noniusza. Najczciej uywane s polarymetry pcieniowe: dwucieniowe (dwupolowe) lub trjcieniowe (trjpolowe), ktre umoliwiaj porwnanie natenia wiata opuszczajcego polaryzator z nateniem wiata przechodzcego przez analizator. W polarymetrach tych cz wizki wiata przepuszcza si przez dodatkowy pryzmat lub pytk kwarcow, ktre rozdzielaj pole widzenia w okularze. Dziki temu w okularze moe ukaza si jednoczenie pole maksymalnie jasne obok pola ciemniejszego. Polarymetr jest tak uregulowany, e jeli w rurce polarymetru nie ma substancji optycznie czynnej i zerowa kreska podziaki ktowej pokrywa si z zerow kresk podziaki noniusza, wtedy wszystkie czci pola widzenia w okularze s jednolicie szaro owietlone (wygaszone), tak jak w pozycji b na rysunku, przedstawiajcym rodzaje pl widzenia w polarymetrze.

360

Jeli w rurce polarymetrycznej umieci si substancj optycznie czynn lewoskrtn, wwczas pojawi si pasek jasny w rodkowej czci pola widzenia, ktremu towarzysz po bokach pola ciemne, tak jak w pozycji a na rysunku.Rodzaje pl widzenia w polarymetrze

alewoskrtna substancja

bwygaszenie cakowite

cprawoskrtna substancja

Jeeli w rurce polarymetrycznej umieci si substancj prawoskrtn, wwczas pojawia si pasek ciemny w rodkowej czci pola widzenia, ktremu towarzysz po bokach pola jasne, tak jak w pozycji c na rysunku. Podstaw polarymetrii jest zaleno wyraona wzorem: = []D c lgdzie: zmierzony kt skrcenia paszczyzny wiata spolaryzowanego; []D skrcalno waciwa; c stenie zwizku optycznie czynnego, w g/ml roztworu; l grubo warstwy roztworu, przez ktr przechodzi wizka wiata spolaryzowanego, w dm

Warto mierzonego kta skrcenia paszczyzny wiata spolaryzowanego przez zwizek optycznie czynny zaley od stenia substancji, od gruboci warstwy roztworu tej substancji, przez ktr przechodzi wiato spolaryzowane oraz od rodzaju substancji, jej budowy, iloci i rozmieszczenia jej centrw chiralnoci. Dan substancj optycznie czynn charakteryzuje warto skrcalnoci waciwej.

Skrcalno waciwa danej substancji to kt, o jaki skrcaaby paszczyzn wiata spolaryzowanego jednodecymetrowa warstwa roztworu danej substancji o steniu 1g/ml. Jej warto zaley od dugoci fali promieni spolaryzowanych, temperatury i rodzaju rozpuszczalnika, dlatego przy zapisie wartoci skrcalnoci waciwej podaje si te parametry:

361

gdzie:

20 D

=

c(g / ml) l(dm)

[]D20 skrcalno waciwa rozpuszczonej substancji wyraona w stopniach; indeks grny 20 oznacza temperatur pomiaru; indeks dolny D wiato monochromatyczne, czyli linia D lampy sodowej (589,3 nm); zmierzony kt skrcenia paszczyzny wiata spolaryzowanego wyraony w stopniach; c stenie roztworu wyraone w g/ml; l grubo warstwy roztworu, wyraona w dm, przez ktr przechodzi wiato spolaryzowane.

Po dokonaniu pomiaru kta skrcenia paszczyzny wiata spolaryzowanego przez substancj o znanej wartoci skrcalnoci waciwej mona okreli jej stenie, wyraone w g/ml, na podstawie matematycznej zalenoci:c= 20 D

l (dm)

W technice polarymetrii stenie wyznacza si z pomiaru kta skrcenia na podstawie prostej matematycznej zalenoci, ktrej warunki stosowania mona atwo zapewni. Zwizek midzy steniem a odpowiadajcym mu ktem skrcenia wyznacza warto skrcalnoci waciwej, ktr odczyta mona z odpowiednich zest