Biotechnologia – termin wprowadzony pod koniec lat 50-tych XX wieku, oznacza konstruowanie nowych szczepów drobnoustrojów i linii komórkowych organizmów wyższych o niespotykanych dotąd walorach technologicznych. Biotechnologia znana dziś ze względu na osiągnięcia biologii molekularnej oraz inżynierii genetycznej towarzyszyła człowiekowi od zarania dziejów( procesy mikrobiologicznej fermentacji)Biotransformacja – proces w wyniku którego dochodzi do modyfikacji grup funkcyjnych związków organicznych przez żywe komórki lub izolowanie z nich enzymy.Organizmy transgeniczne – organizmy poddane transformacji tzn. posiadające zmodyfikowany genom. Powstały z takiej komórki, która włączyła do swego genomu fragment DNA skonstruowany za pomocą inżynierii genetycznej. Fragment ten może zawierać dowolna informację i może zostać włączony w prawie każdym miejscu genomu. Okresy w biotechnologii: - okres przedpasteurowski( od zarania ludzkości do poł XIXw) – era spontanicznych procesów fermentacyjnych w celu pozyskania ważnych procesów spożywczych: chleba, wina, piwa itd.- okres przejściowy( II poł XIXw oraz pierwsze 40- lecie XXw) – tworzenie podstaw biotechnologii wielkoprzemysłowej, zapoczątkowanej przez L. Pasteura- era mikrobiologii z wykorzystaniem aseptycznych kultur drobnoustrojów. Opracowanie technologii produkcji kw mlekowego, cytrynowego, acetonu, butanolu oraz kultur drożdży- era nowoczesnej biotechnologii – datowana do końca II wojny św tj od opracowania przemysłowej produkcji penicyliny w warunkach aseptycznych w bioreaktorach: * podokres 1 ( do roku 1970) – opracowano nowe technologie m in biosyntezy antybiotyków, aminokwasów, enzymów, oraz po raz pierwszy zastosowano biokatalizatory immobilizowane * podokres 2( od roku 1970 do dzisiaj) – praktyczne wykorzystanie genetyki i biologii molekularnej w biotechnologii. Narodziła się koncepcja manipulacji genami poza komórką. Opracowano szereg nowych biotechnologii m in produkcję insuliny, hormonów wzrostu itd. Zastosowanie współczesnej biotechnologii:

Produkcja żywności: - tradycyjne procesy fermentacyjne( produkcja pieczywa, produktów mlecznych), - nowe technologie mikrobiologii( witaminy, aminokwasy), - zastosowanie enzymów do wyrobów mleczarskich( kefiry, jogurty), - utrwalenie żywności( antyutleniacze)Rolnictwo: - produkcja pasz( preparaty białkowe, witaminowe, kiszonki roślinne),- kultury komórkowe i tkankowe in vitro, - ochrona roślin( bioinsektycydy, antybiotyki), - lecznictwo zwierząt( szczepionki)Ochrona środow: - oczyszczanie ścieków, filtry biologiczne, czynne osady Co to są i na czym polegają biotransformacje roślin ?Reakcje biotransformacji w różnych kulturach zawiesinowych. Zastosowanie: - do produkcji metabolitów wtórnych, - do biotransformacji egzogennych prekursorów w bardzo wartościowe, bądź pożądane produkty.Typy reakcji biotransformacji: - utlenianie, redukcja, - hydroliza, - rozszczepienie wiązania C-C, - kondensacja, - izomeryzacja Substraty: naturalne prekursory, - związki syntetyczne( ksenobiotyki), zw obce roślinieMateriał stosowany: - izolowane enzymy, - zawiesiny komórkowe, agregaty komórek, - immobilizowane( unieruchamiane) enzymy i komórki Lokalizacja procesu biotransf: - wytrząsanie kolby, - bioreaktory Dane ilościowe: - na swiecie jest ok. 137 gat roślin leczniczych i aromatycznych wykorzystywanych do produkcji matabolitów wtórnych lub do biotransformacji prekursorów, - w Polsce tylko ok. 40 gat roślin ( zostało przebadanych) Korzyści biotransf: - wysoka wydajność( często bliska 100%), - duża czystość produktu reakcji, - wysoka specyficzność reakcji, - możliwość zajścia reakcji w miejscach mało reaktywnych, - otrzymanie dużej ilości produktów występujących w małych ilościach w roślinie, - otrzymanie produktów o zwiększonej aktywności fermakologicznej lub zmniejszonej toksycznościBiotransf z użyciem kultur zawiesinowych – jest to najprostszy model doświadczalny, nie ma dodatkowego etapu wiązania komórek z nośnikiem, komórki nie ulegają zmianom fizjologicznym

Czynniki regulujące reakcje biotransf: - rodzaj kultury( zawiesina, kultury organów np. korzeni), - stadium rozwojowe kultury i jej warunki, a zwłaszcza nadtlenianie, skład pożywki i jej pH, - struktura chemiczna substratu, jego stężenie, właściwości Przykłady leków roślinnych:OPIUM – otrzymany z gat maku pochodzącego z Azji Mniejszej, legendy o opium spisano już egipskimi hieroglifami, Homer w Odysei wspomina o leku który „uśmierza i żółć i gładzi pamięć wszelkiego zła”, opium zawdzięcza właściwości jednemu z 15 skł czynnych odkrytych w niedojrzałych makówkach tj: „ morfinie”, w II poł XIXw udało się zmodyfikować chemicznie morfinę otrzymując silniejszą w uśmierzaniu bólu- heroinę.KOKAINA – pochodzi z liści kokainowego krzewu zwanego krasnodrzewem, liscie zawieraja 14 innych skł, wszystkie służą do produkcji leków znieczulających i innych syntetyków, liście kokainowe słyną jako środek stymulujący do nadludzkiej pracy dla andyjskich robotników i tragarzy, żuty z dodatkiem limy lub popiołu roślinnego powoduje uwalnianie się aktywnych substancji stymulujących układ nerwowy i prace mięśni, nie powoduje u Indian żujących liście uzależnienia jak w postaci czystej.MARIHUANA – zwana haszyszem, otrzymywana z konopi indyjskich( haszysz – żywica z żeńskich kwiatów konopi)CHININA – pochodzi z kory wiecznie zielonego drzewa chinowca, rosnącego na stokach Andów w Ameryce Płd., najlepszy środek na malarie na którą zapada co roku 100 mln ludzi, konkwistadorzy i jezuici przywieźli go z Europy w XVIIw, długo odrzucany i wyśmiewany, pod k XIX w o korze chinowca stało się głośno, wycięto prawie całą populacje tych drzew, roślinę uratował brytyjski kolekcjoner nasion który przesłał partie nasion do Europy, zakupił je rząd Holandii, obecnie produkuje się syntetyczna chininę – chociaż pewne szczepy zarodzce malarii stają się odporne na syntetyki w przeciwieństwie do naturalnego specyfikuASPIRYNA – pierwotnie otrzymywana z wierzby białej oraz z byliny wiązówki błotnej, już 2000 lat temu Dioskorides w swym dziele pisał o przeznaczeniu wierzby w leczeniu podagry, reumatyzmu, bólu zęba, głowy, w XIX w zidentyfikował czynny skł – kw salicylowy, a potem zmodyfikował do kw acetylosalicylowego, lista zastosowań jest niesłychanie długa i co roku dochodzą nowe

DISGENINA – odkryta w latach 40-tych XXw, substancja pochodzi z pochrzyny ?, rodzina leśnych pnączy, odkryta przez amerykańskich chemików, posłużyła do produkcji pierwszej tabletki antykoncepcyjnej, ten fakt zapoczątkował na świecie rewolucje seksualna Opłacalność biotransformacji: Kalkulacja kosztów: według szacunku przemysłowej produkcji metabolitów wtórnych na drodze kultur tkankowych jest opłacalna gdy cena kg produkcji przewyższa 1000$Przykłady biotransf:TAKSOL( cytostatyk) –diterpen, wyst w korze, igłach i korzeniach cisa. Kuracja dla jednego pacjenta wymagałaby ścięcia 3 dojrzałych okazów bardzo wolno rosnących drzew. Z tego względu syntezę taksolu prowadzi się w kulturach zawiesinowych. Planuje się izolowanie genów odpowiedzialnych za biosyntezę taksolu i przeniesienie ich do komórek szybko namnażajacych się. Kastanospermina – izolowana z Castanospermum australe, hamuje proces glikozylacji białek, płaszcza wirusów, w tym HIVDisgenina – steroid otrzymywany z Discoreadaltoidea, używany do produkcji leków , które konfigurują na liście najlepiej sprzedających się. Winblastyna i winkrystyna- używane w terapii nowotworowej.- kuracja winblastyną daje trwałe wyleczenia u ponad 80 % chorych na ziarnice złośliwą. – winkrystyna daje ustanie objawów u 90 % dzieci cierpiących na ostre białaczki limfatyczne.Rośliny zmodyfikowane genetycznieTransgen- właściwy gen, przeniesiony do transformowanej rośliny. Nie ma on w genomie rośliny swojego odpowiednika w postaci allelu, stąd roślina transgeniczna jest heterozygotą. Linia transgeniczna- samozapylone rośliny transgeniczne o nowym fenotypie dają potomstwo rozszczepiające się lub jednolite. Te ostatnie pochodzą z homozygoty i dają ustaloną linie transgeniczną. Zmienność samaklonalna- rośliny powstałe z transgenicznej komórki i mogą wykazywać różne zmienione właściwości, co nazywamy zmiennością samoklonalną- dziedziczoną trwale w kolejnych pokoleniach. Metody wprowadzania obcych genów:

-transformacja za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens, A. rhizogenes (metoda wektorowa). Przydatna dla roślin 1-liściennych. -transformacja bezpośrednia (metoda bezwektorowa)- mikrowstrzeliwanie. Przydatna dla roślin 1- i 2-liściennych. *metoda pośrednia- stosuje się komórki bakterii – E. coli i A. tumefaciens jako biologiczne „pociski” do transformacji. Przydatna dla roślin 1- i 2-liściennych *bezpośrednie transformowanie protoplastów za pomocą elektroporcji lub glikolu polietylenowego- PEG Etapy transformacji wektorowej: -kokultywacja- umieszczenie eksplantatów (fragmentów liści, korzeni, liści) w roztworze bakterii, - odpłukanie bakterii, - umieszczenie eksplantatów w pożywce z antybiotykiem w celu zabicia bakterii, - umieszczenie dalsze materiału roślinnego na pozywce – regeneracyjnej z odpowiednim czynniekiem selekcyjnym: antybiotykiem lub herbicydem, - regeneracja roslin jest możliwa najczęśćiej z pojedynczych transformowanych komórek we wczesnym etapie regeneracji. Przeprowadza się testy na aktywność genów reporterowych wprowadzonych dodatkowo do plazmoidów. Geny te są odpowiedzialne za kodowanie produktów które łatwo wykrywa się testami enzymatycznymi, histochemicznymi lub fluorymetrycznymi.Mikrowstrzeliwanie:( zasady metody) – metoda transformacji polegająca na wprowadzeniu z bardzo dużą prędkością rzędu kilkuset metrów/sekundę do komórek metali pokrytych DNA. Prędkość tę uzyskuje się w specjalnie skonstruowanych akceleratorach, czynnikiem przyśpieszającym ruch cząsteczek metala jest proch strzelniczy lub obecnie hel.Przydatność metody: rośliny 1-liścienne, nagonasienne, 2-liścienne trudne dotąd do stransformowania np. soja, fasolaObieg transf:- niedojrzałe zarodki, - kalus enbriogeniczny z zarodków, - niedojrzałe kwiatostany, - zawiesina komórekWady metody: - niska wydajność transf ( mechaniczne uszkodzenia komórek, szok akustyczny), - odrywanie się metalu od DNA, - wprowadzenie do genomu roślinnego zbyt dużo kopii genów jednocześnie Jak funkcjonują bioreakt? Zasada działania bioreakt – zagwarantowanie optimum warunków wzrostu i rozwoju komórką somatycznym w kierunku zainicjowania embriogenezy somatycznej

poprzez regulację i kontrolę wewnętrzną czynników fizyko – chemicznych.Komputerowej kontroli podlegają następujące parametry: - dozowanie świeżej pożywki, - kontrola ilości namnażanych komórek, - temp( z dokładnością do 0,1◦), - szybkość rotacji pozywki( przemiszczania się suspensji w bioreaktorze) zwykle 50 rpm, ponizej komórki sedymentuja i zamierają, pH sygnału aktywowania pompy perystaltyczne wtłaczające sterylny roztwór kwasu lub zasady, - poziom tlenu regulowany droga dodatkowego dotlenienia lub zmiany szybkości rotacji pożywki (poziom tlenu mierzy elektroda tlenowa), -potencjał redox, - stężenie CO2 Podział bioreak ze względu na system napowietrzania pożywki: - bior zaopatrzone w mieszadła magnetyczne typu rotacyjne bębny, wirujące filtry, - bior w których powietrze jest wtłaczane często pod ciśnieniem poprzez system membran umieszczonych w dolnej strefie urzadzienia, - zwykłe napowietrzanie, - dodatkowe kolumny( bąbelkowe napowietrzanie), - poprzez systemy sylikonowych lub polipropylenowych węży zaopatrzonych w liczne perforacje i mikropory, - bior z równomiernym rozprowadzeniem powietrza z góry bez mieszania zawartości pożywki, - podświetlane przewody rozprowadzające tlen Rozmnażanie wegetatywne in vitro( = rozmn klonalne, mikrorozmnażanie, masowe rozmn) Rozmnażanie wegetatywne in vitro: 1.Powstanie zarodków somatycznych kulturach tkanek i organów2.Różnicowanie pąków przybyszowych w kulturach kalusa3.Różnicow pąków przybysz. bez pośrednictwa tkanki kalusowej4. Rozwój pąków bocznych w kulturze merystemów wierzchołkowych5.Rozwój pąków bocznych w kulturze fragmentów pędów i innych organów6. Kultury primordiów pędowychRozmnażanie wege in vitro realizuje się poprzez:1.Organy przysposobione do rozmnażania wegetatywnego (skrócone pędy)-bulwy, cebule, kłącza2.Sadzonki-odciete części rośliny3.Odkłady4.Transplantacje: - szczepienie, - podkładki, - okulizacja

Dezynfekcja i traktowanie wstępne:1.przemycie eksplantantu woda bieżącą przez1-2 godz. często z dodatkiem detergentów 2.sterylizacja powierzchniowa 70%-etanol-30 sek. ; 80%-etanol-5 min.(pąki drzew)3.dezynfekcja właściwa:-podchloryn wapnia lub sodu 2-10%- 5-20 min.-HgCl2 0,2- 1,0% 3-10 min.- chloroamina 0,2- 1,0% 5-10 min.4.przemywanie 3-6- krotne sterylną wodąPożywka (Murashige i Skooga)1.nieroganiczne sole (mikro i makroskl.)2.witaminy3.organiczny N4.regulatory wzrostu5.żródło energii i węgla + wyciąg: z mleczka kokosowego, kukurydzianego, wyciąg z drożdży, bielma itd. Warunki zewnętrzne:-światło-temp.ok.25"C-źródło węgla (sacharoza)-witaminy - wielkość eksplantatuAUKSYNY:-stymulują podziały kom.w kierunku tworzenia się tkanki kalusowej-wpływają na organogenezę kalusa-stymulują powstawanie tkanki embriogennej →zarodki somatyczne-indukują merystemy korzeni przybyszowych na pędach- stymulują syntezę etylenu (efekt niepożądany) i starzenie się kulturCYTOKININY:-pobudzają podziały kom. brak cytokinin zwiększa poliploidalność jąder-wpływają na różnicowanie się ksylemu i lignifikację komórek-stymulują wyrastanie pędów bocznych-hamują indukcję, wzrost i rozwój korzeni-redukują długość pędów-opóźniają starzenie-likwidują zjawisko dominacji wierzchołkowej

- "odmładzają" i zwiększają wigor eksplantantów- rejuwenalizacja drzew i krzewów, ukorzenianie pędów-niskie dawki cytokininy +auksyna stymulują rozwój tkanki embriogennej→ zarodki somatyczneGIBERELINA: (GA 3)-pobudza wydłużanie międzywęźli pędów-przyspiesza wzrost merystemów-stymuluje proliferację pędów bocznych-hamuje ukorzenianie pędów-hamuje indukcję embriogenezy somatycznej-stymuluje kiełkowanie dojrzałych zarodkówABA: (kwas abscysynowy)-inhibitor wzrostu-stymuluje tworzenie kalusa-współdziała z cytokininą i auksyną w dojrzewaniu zarodków somatycznych-inicjuje embriogenezę-pozytywnie wpływa na dojrzewanie i kiełkowanie sztucznych nasion-inicjuje rozwój minibulw-zwiększa żywotność protoplastów i ich dzielenie sięETYLEN:-hamuje podziały kom. i morfogenezę-wprowadza komórki w stan spoczynku-hamuje embriogenezę somatyczną-wywołuje objawy starzenia się eksplantantów (żółknięcie i opadanie liści), epinastię i deformację organów-wpływa na zanik wigoru-stymuluje ukorzenianie sadzonekZdolności regeneracyjne roślin:RESTYTUCJA - uzyskanie rośliny z np. .liścia innej rośliny, powstała z różnych organów rośliny matecznej TOTIPOTENCJA - powstanie rośliny z 1 komórkiPRZEBIEG MIKROROZMNAŻANIA:I FAZA:1.wybór rośliny matecznej, pobranie organu, dobór pożywki 2.stabilizacja kultury- uzyskanie zdolnego do regeneracji eksplantantu (pierwsze przyrosty tkanki kalusowej, rozwój pąków, pędów)II FAZA: szereg pasaży tkanki kalusowej, paków przybyszowych,

zarodków, wierzchołków, pędów - na świeża pożywkęIII FAZA: -ukorzenienie eksplantatów-przygotowanie do wysadzenia w pobliżu lub do gruntu -przywrócenie autotroficzności-aklimatyzacjaZ chwila wysadzenia do gruntu proces mikrorozmnażania jest zakończonyZdolności morfogenetyczne kom roslinnych:- kom. roślinne są totipotentne czyli maja zdolność do dzielenia się oraz odtwarzania poszczególnych organów i całego organizmu z pojedynczej kom. rośl.Ujawnienie pełnej totipotencji może nastąpić drogą organogenezy bezpośredniej i pośredniej*ORG.BEZPOŚREDNIA-pierwotny eksplantat -(roślina) organ- pierwotny eksplantat- zarodek somatyczny-organ (roślina) *ORG.POŚREDNIA - pierw ekspl.- kalus (zarodek, zawiązki korzenia, pędu)- organ (roślina)Najbardziej przydatne do rozwoju w kulturze in-vitro są eksplantaty zawierające kom merystemów wierzchołkowych, bocznych i interkalarnych, potem w kolejności kom.kambialne, floem, okolnica i promienie rdzeniowe.U nasiennych regeneracja następuje łatwiej u dwuliściennych niż jednoliść. a najtrudniej u nagonasiennych. U każdego gatunku można wybrać fragment rośliny dający dobre efekty. Jeśli zregenerowany organ powstał z grupy kom. niejednorodnych genetycznie to otrzymamy CHIMERĘ.Bodźcem wyzwalającym odróżnianie w kulturach in vitro jest odizolowanie kom. i tkanek od rośliny matecznej oraz wpływ regulatorów wzrostu zastosowanych w pożywce.KULTURA KALUSA Zastosowanie:-materiał wyjściowy do otrzymywania zawiesin komórkowych i protoplastów-szeroko wykorzystany do mikrorozmnażania i transformacji-do pozyskiwania na skale masową zarodków somatycznych

-do biotransformacji i pozyskiwania metabolitów wtórnych-do badań podstawowych nad morfologią i strukturą komórkiGeneza:-w tworzeniu kalusa mogą brać udział wszystkie tkanki eksplantatu-mogą tez brać udział tylko nieliczne tkanki np. kom. miękiszowe rdzenia łodygi lub kambium wiązkoweBUDOWA TKANKI KALUSOWEJ-początkowo są to niezróżnicowane kom. parenchymatyczne o różnym kształcie i wielkości-po pewnym czasie trwania kultury kalus wykazuje heterogeniczność i obok kom. parenchymatycznych powstają nieregularne formacje tk. przewodzących, centra merystematyczne-kalus może mieć strukturę luźna i łatwo się rozpadać lub bardzo zwartą-barwa może być zróżnicowana od białej, żółtej, pomara. przez różne odcienie zieleni-analizy cytologiczne kalusa wykazują na wielką różnorodność genetyczną kom.-od diploidalności do poliploidalnościKULTURA PĄKÓW PRZYBYSZOWYCH:-w różnych częściach roślin z mniej lub bardziej dojrzałych tkanek mogą powstawać wierzchołki pędów zwane przybyszowymi .Tworzą się one na różnych organach roślin (korzeniach, łodygach, liściach)W łodygach i liściach pąki przybyszowe powstają z epidermy i subepidermy. Eksplantaty korzenia wytwarzają pąki przybyszowe w korze pierwotnej, a z budowy wtórnej tworzą pąki w sąsiedztwie albo w obrębie floemu wtórnego.Kierunek organogenezy eksplantatów pierwotnych a wiec tworzenie pędów korzeni przybyszowych lub zarodków somatycznych zależy nie tylko od rodzaju wzajemnych proporcji zastosowanych auksyn i cytokinin ale również od rodzaju tkanki, gatunku rośliny i kondycji kultury.Metoda wykorzystywana do rozmnażania roślin cebulowych. Embriogeneza somatyczna – jest procesem biologicznym, podczas którego formują się zarodki z komórek wegetatywnych, wyzwolenie potencjału do tworzenia się zarodka w pojedynczej kom lub ich grupie nazywane jest indukcja embriogeniczności. Budowa zarodka somatycznego: - istnieje wiele wspólnych cech w formowaniu zarodków somatycznych i zygotycznych, a poszczególne stadia rozwoju zarodków( globularne, serca) sa podobne lub wręcz

identyczne, - zarodki mają wyraźne zaznaczoną biegunową strukturę typu pęd- korzeń. Efektem końcowym embriogenezy somatycznej jest kompletna roślina z wykształconym jednym liscieniem(1-liścienne) lub dwoma liścieniami( 2-liścienne), a także epikotylem i korzonkiem zarodnikowym.Zastosowanie: - metoda ta może znaleźć istotne zastosowanie w nasiennictwie i szkółkarstwie, ze względu na niezwykle wysoki współczynnik rozmnażania, - przykładowo w Cyclamen persicum do 40 tys sztuk zarodków w 1 litrze pożywki w czasie 10 tyg, - metoda znalazła zast do produkcji drzew leśnych głównie iglastych, roślin ozdobnych i warzywnych.Izolowane merystemy Alternatywne sposoby prowadzenia kultur merystemów:1. Wielokrotny podział roślin które rozwinęły się z merystemów na „ sadzonki węzłowe” – metoda przydatna w wielkotowarowym systemie uprawy roslin ozdobnych, sadowniczych oraz Asparagus officinalis i Solanum tuberosum, zapewnia ciągłą produkcję mikrosadzonek identycznych z genotypem rośliny matecznej. Szczególna odmianą tej metody jest indukowanie organów spichrzowych np. mikrobulwek lub mikrokłączy u Alstromeria, Cymbidium, Gloriosa na pędzie uzyskanym z merystemu. Pożywki nie zawierają lub zawierają śladowe ilości substancji wzrostowych co zapobiega zmienności somaklonalnej. 2. Pobudzenie pojedynczego merystemu do podziału – poliferacja tk merystematycznej w której powstają liczne pąki i pędy na drodze organogenezy bezpośredniej( bez stadium kalusa), - duże wierzchołki pędów ( merystem wierzchołkowy, zawiązki liści i powierzchniowo usytuowane paki boczne) wkłada się na pozywkę z dodatkiem cytokinin o wysokim stężeniu co powoduje rozwój tzw wieloroślinek. Ponowne pasaże wieloroślinek gwarantuje w krótkim czasie uzyskanie tysięcy roślin potomnych, - wykorzystywana do propagacji m in Dianthus, Chrysantemum, Rosa multiflora, oraz drzew Malus czy Prunus.3. W ramach tej techniki obiecująca jest metoda „ powiększania” lub „ rozszerzania” merystemów – praktykuje się wykładanie merystemów na pożywkę zawierającą retandanty( paklobutrazol, acymidol, diaminozyd, etylen lub etafon), - w efekcie merystem powiększa się 56-krotnie , po czym może być powtórnie podzielony i po kolejnych

subkulturach przeniesiony na pozywkę bez substancji wzrostowych, na którego z każdego eksplantatu rozwiną się rośliny4. poliferacja tk merystematycznej drogą regeneracji czyli organogenezy pośredniej poprzez stadium kalusa, rozwijające się pąki i pędy, - izolowane merystemy wykładane są na pozywki z dodatkiem dużych ilości auksyn przez co uzyskuje się efekt namnożenia kalusa, w tk kalusa pojawiają się centra merystematyczne z których dopiero masowo rozwijają się pęd i rośliny, - wadą jest duża tendencja do zmienności somaklonalnejKultura pędów bocznych( pachwinowych) Inicjalnymi eksplantatami w tej metodzie mikrorozmnażania mogą być: - merystemy pąków wierzchołkowych lub bocznych, - wierzchołki pedów, - pąki kwiatowe( boczne), - fragmenty pędów z węzłem, parą liści i pąków bocznych, - wierzchołki mogą być izolowane z zarodków somatycznych. Wymienione eksplantaty zawierają: merystem, 2-3 zawiązki liści, oraz kilka paczków bocznych osadzonych w „ kątach liści”, inaczej nazywana sadzonkowaniem in vitro Procedura postępowania- po wyłożeniu na pożywkę nie zawierającą substancji wzrostowych paki nie krzewią się, rozwijają się w pojedynczą roślinkę.Za pomocą tej metody rutynowo namnaża się wiele gat: Nephrolepis, Arhidiaceae, Spatiphyllum.Tempo mikrorozmnażania: 1roslina mateczna→ daje 3-krotny wzrost co 4 tyg lub 6- krotny wzrost co 6 tyg→ milion roślin potomnych rocznieKultury primordiów pędowych 1. Zakładamy je izolując z pąków wierzchołkowych merystemy z 3 zawiązkami( primordiami) liściowymi , umieszczamy je na pożywce płynnej, ważne jest: - skład pożywki(NAA•BAP), - cyrkulacja, - objętość płynu i tkanki, - temp, - intensywność naświetlenia, - częstotliwość 2. Po wstępnym okresie stabilizacji- intensywne namnażanie primordiów pedowych, które tworzą zielone eulorofilowe agregaty 3. Po wyłożeniu ich na pożywkę zestaloną z dodatkiem auksyny→ ukorzenianie→ regeneracja rośliny

Metoda znalazła zastosowanie w masowej produkcji wielu gat roślin 1 i 2 – liściennych oraz drzewiastych, ma bardzo wysoki współczynnik namnażania, porównywalny do embriogenezy somatycznej.Produkcja roślin in vitro na świecieRozmnażanie wegetatywne in vitro znalazłą zastosowanie przede wszystkim w produkcji takich roslin, które trudno się rozmnaża za pomocą tradycyjnych metod in vivo( rośliny ozdobne, drzewa leśne, odm heterozygotyczne) oraz rośliny elitarne o dużej wartości jednostkowej.Morfologia i fizjologia aklimatyzowanych roślin: 1. Kutikula pozbawiona wosku, brak ochrony przed transpiracją2. Nie funkcjonujace aparaty szparkowe( brak reakcji na ABA)3. Asymilacja CO2 bardzo niska w przybliżeniu 2,6 mg•dm-3h-

1( dorosłe rosliny ok. 10 mg CO2) Czasami bilans (-) przewaga oddychania4. Zawartość chlorofilu spada5. Często eksplantaty są nie ukorzenione, stąd dodatkowo problem indukcji rizogenezy Okres fotosyntetycznej aklimatyzacji trwa ok. 4 tyg Ukorzenianie: - stanowi 35-75% wszystkich kosztów mikrorozmnażania: * cecha gatunkowa, * dopuszczalne traktowanie regulatorami wzrostu( ex-vitro), * poza słojem np. IBA, NAA, * istotna wielkość eksplantatu, * rodzaj podłoża( mineralne) Przygotowanie do samodzielnego wzrostu -in vitro: pożywka ukorzeniająca, po właściwym ukorzenieniu uchylić zamknięte naczynia, usunąć agar,doodać fungicydy, umieścić w stałym podłożu (mineralne ,gleba) -ex vitro: ukorzenianie poza szkłem (subst. stymulujące ukorzenianie), umieścić w stałym podłożu (mineralne, gleba)CZYNNIKI KORZYSTNE -wysoka wilgotność-cieniowanie-właściwy fotoperiod-ogrzewanie podłoży ↓po rozwinięciu nowych liści-wyłączenie ogrzewania-stopniowa redukcja wilgotności

-zwiększenie natężenia światła słonecznegoPodłoże mineralne np.Vernikulit, pianka poliuretanowa, perlit, wełna mineralna, kostki torfopodobne Zalety:-sterylne, wolne od patogenów-ułatwia ukorzenianie dzięki specjalnej strukturze porowato-fibrylnej-nie zawiera subst. odżywczych tj. zanieczyszczeń organicznych-sprasowane w bryłach lub kostkach ułatwia transport roślin-gwarantuje dogodną migrację i dyfuzję gazów-zapewnia optymalną dystrybucję H2OWarunki fotoautotroficzne -wysokie nat. światła-wysokie stężenie CO2

Zalety hodowli autotroficznej1.namnażanie roślin jest 2 razy szybsze2.można zredukować lub wyeliminować subst .wzrostowe3.spada wilgotność poniżej 100% co hamuje m.in. syntezę etylenu, poprawia to wigor roślin, normalnie funkcjonują aparaty szparkowe4.przy braku cukru spada % infekcji bakteryjnej i grzybowej5.można prowadzić hodowlę w dużych pojemnikach-spadek kosztów6.łatwa aklimatyzacja roślin przy wsadzaniu do gruntuKorzyści z klonowania in vitro- mikrorozmnażanie może być kontynuowane przez cały rok-umożliwia powrót do formy juwenilnej-ułatwia prace hodowlane (pozyskanie nowych odmian, skracanie cyklu hodowlanego, namnażanie genotypów niestabilnych-chimer)-zastępuje szczepienie bądź okulizację -umożliwia przechowywanie ogromnej ilości materiału namnożeniowego na stosunkowo małej pow.-ułatwia fitosanitarne przemieszczanie się roślin między różnymi krajami-dostarcza materiał wolny od mikroorg .patogenicznych-przy doborze właściwej metody klonowania obniża koszty produkcji roślin-gwarantuje stabilność genetyczną Kultury protoplastów - stanowią unikalną populację jednokomórkowych jednostek odizolowanych od siebie.

-każdy zastosowany czynnik eksperymentalny dociera do wszystkich komórek jednakowo tj. w tym samym czasie i z jednakową częstotliwością.-protoplasty są bardzo przydatne w badaniach czynników indukujących morfogenezę oraz badaniach mutacyjnychWykorzystanie protoplastów Jako system jednokom. pozbawiony ścian komórkowych i zdolny do ich odtwarzania, protoplasty stanowią doskonały model doświadczalny służący do badania szeregu procesów przebiegających na poziomie:- bosyntezy ścian komórkowych- badania właściwości plazmolemy, składu błon, ładunku receptorów błonowych, mechanizmu aktywnego, pobierania i transportu związków drobnocząsteczkowych -funkcjonowanie organelli -badanie wpływu patogenów na roślinę -źródła pozyskania mieszańców somatycznych - doskonały materiał do biotransformacji-wpływ hormonów na morfogeneze - badania czynników wpływających stymulująco bądź hamująco na podstawowe funkcje metaboliczne Pozyskiwanie protoplastów : -fragment tkanki (np. Liść), podajemy sterylizacji oraz usuwamy epidermę-skrawki umieszcza się w mieszaninie enzymów macerujących ścianę komórkową ( istotny czas inkubacji, temp, pH)-degradacja dwuetapowa: -najpierw działają enzymy peptyno- a następnie celulityczne-degradacja jednoetapowa: - stosuje się mieszaninę różnych enzymów o aktywności totalnie degradującej ściany-ważny dodatek stabilizatorów osmotycznych ( o charakterze jonowym i niejonowym)-mieszaninę filtruje się przez sita-delikatnie wiruje się -w zależności od zastosowania stabilizatora frakcję protoplastów zbiera się w osadzie lub na powierzchni płynu-przemywa kilkakrotnie roztworem stabilizatorów osmotycznych lub pożywką

- ostatecznie protoplasty poddaje się ocenie morfologicznej i jakościowejFuzja protoplastów:Zlanie protoplastów ułatwiają tzw. stymulatory które mogą być różnego pochodzenia:- natury fizycznej: wirowanie, impulsy elektryczne, elektroforeza- natury chemicznej: glikol polietylenowy, alkohol poliwinylowy, lektyny, wysokie stężenie jonów wapnia o silne alkalicznym pH

Somatyczna hybrydyzacja protoplastów polega na:Fuzja protoplastów

↓sekcja heterokariocytów

↓hodowla mieszańców (krzyż. wsteczne)

↓pełna regeneracja roślin ( nowa jakość)

Wydajność fuzji 30% Heterokariony 10-40%

Selekcja heterokariocytówDo czynników identyfikujących i selekcjonujących należą: - barwienie różnymi barwnikami „ przyżyciowymi” np: rodamina B- fluorescencyjna -okresowe stosowanie różnych inhibitorów metabolicznych -analiza izoenzymatyczna-stosowanie różnych markerów cytochemicznych i molekularnychKontrola zdrowotności kulturMetody eliminowania wirusów:-Chemioterapia- stosowanie związków, które włączają sie w metabolizm wirusa i hamują jego namnażanie ( antymetabolity) również antybiotykoterapia -Termoterapia- działanie podwyższoną temperaturą ( ok 3 tyg w temp. 35-40C ) na roślinę w celu inaktywacji wirusów-Izolowanie merystemów wierzchołkowych z roślin poddanych uprzednio termoterapiiKontrola zdrowotności namnożonego materiału.

-testowanie biologiczne-testy sereologiczne ( gotowe przeciwciało zawarte w surowicy łączy się z wirusem zawartym w ekstrakcie z rośliny)-analiza pod mikroskopem elektronowym i fluorescencyjnym-testy enzymoimmunologiczne- ELISA-metody molekularne( hybrydyzacja kwasów nukleinowych wirusa i znakowanej sondy)Jak funkcjonują bioreaktory?Zasada funkcjonowania bioreaktorów:-zagwarantowanie optimum war. wzrostu i rozwoju kom somatycznych w kierunku zainicjowania embriogenezy somatycznej poprzez regulację i kontrolę wewnętrznych czynników fizyko-chemicznych.Komputerowej kontroli podlegają następujące parametry:-dozowanie świeżej pożywki-kontrola namnażanych komórek-temp- szybkość rotacji pozywki( przemieszczanie się suspensji w bioreaktorze), zwykle 50 rpm, poniżej komórki sedymentują i zamierają -pH – sygnał uaktywnia pompy perystatycznej wtłaczającej sterylny roztwór kwasu lub zasady-poziom tlenu-potencjał redox-stężenie CO2

Zbyt gwałtowne dostarczanie O2 może spowodować lizę komórek i stres mechanicznego urazu.Ze względu na sposób napowietrzania bioreaktora dzielimy na:-bioreaktory zaopatrzone w mieszadła magnetyczne ( typu rotacyjne bębny, wirujące filtry) -bioreaktory do których powietrze jest wtłaczane często pod ciśnieniem, poprzez system membran umieszczonych w dolnej strefie urządzenia-bioreaktory z równomiernym wprowadzaniem powietrza od góry - zwykłe napowietrzanie- dodatkowe kolumny( bąbelkowe napowietrzanie) - poprzez system silikonowych lub polipropylenowych węży zaopatrzonych w liczne perforacje lub mokropory

Problemy związane z powiększaniem skali kultur - przygotowanie inokultur- metoda inkubacji, transfer do bioreaktora i odbiór namnożonego materiału - stres mechaniczny związany z mieszaniem pożywki- wprowadzenie światła do bioreaktora - problem zachowania podobieństw o charakterze fizycznym i biologicznymEmbriogeneza somatyczna w bioreaktorach. Modelowy system indukowania embriogenezy somatycznej w bioreaktorze- na przykładzie poinsecji (Gwiazda betlejemska-Euphorbia pucherina)Etapy:* Faza proembriogenna ( inicjacja embriogenezy)

-kultura wstępna- eksplantant (merystem wierzchołkowy) pobrany z rośliny rosnącej w szklarni umieszczony na pożywce zestalonej agarem indukującej kalusowanie. Po 2-3 tygodniach kalus przenosi się na pożywkę płynną o tym samym składzie i umieszcza się na wytrząsarce -pasażowanie- po kolejnych 3 tyg agregaty komórek filtruje się a większe skupiska komórek osadzone na sitach przenosi ponownie na pożywkę zestaloną agarem, celem wyprodukowania tzw „ wtórnych kalusów” mających zdolność do zarodnikowania klonalnego -pozyskiwanie inokulum wyjściowego – po 2 tyg szybko rosnącą masę poddaję się filtrowaniu na sitach i uzupełnia w 2\3 swieżą pożywką, otrzymana zawiesina stanowi suspensję wyjściową dla bioreaktora

* Kultury w bioreaktorach – pożywka płynna ( ściśle kontrolowane warunki wewnętrzne). Zarodki stopniowo osiągaja stadium globuli i dalej stadium serca. Barwa suspensji zmienia się z białawej na zielonkawo- brązową *Konwersa embrionów w rośliny -zarodki usuwa się z bioreaktorów, odsącza się na sita i umieszcza na szalkach Petriego na pożywce zestalonej pozbawionej auksyn- MS +0,05 mg BAP

-po 3 tyg. normalnie rozwijające się zarodki izolowane są od form dewiacyjnych i kalusujących-prawidłowo rozwijające się zarodki ponownie się umieszcza na pożywce o tym samym składzie i po 1-2 tyg zarodki kiełkują wytwarzając długi hypokotyl charakterystyczny dla poinsecji -po osiągnięciu 20 -25 mm eksplantaty przenosi sie do szklarni ( przeżywalność ok 90 %)Efektywność stymulowania embriogenezy somatycznej w bioreaktorach dla poinsecji.Wydajność- teoretycznie można otrzymać 100 tyś. zarodków z 1 litra suspensji -czas ok 3 miesiąceztuczne nasiona:-pozbawione otoczki zarodki somatyczne poddane procedurze wysuszenia-otoczkowanie zarodków poddane desykacji-uwodnienie zarodki ( merystemy wierzchołkowe) otoczone kapsułą z żelu- uwodnione zarodki zanurzone w płynnym żeluOtoczkowanie nasion:-unieruchomienie fragmentu tkanki-zminimalizowanie funkcji życiowych-ochrona przed niekorzystnymi czynnikami środowiska-ochrona przed utlenieniem i desykacja (odwodnienie)-ochrona przed uszkodzeniem mechanicznym podczas siewu i transportu-wprowadzenie regulatorów, mikroflory, pestycydów- możliwość wprowadzenia do otoczek hydrofilnych dodatkowych otoczek hydrofobowych Etapy wytwarzania sztucznych nasion:-roślina macierzysta-eksplantat-indukcja i proliferacja kalusa embriogennego-namnożenie komórek w zawiesinie embriogennej.-synchronizacja stadiów embiogenezy i hartowanie zarodków.-filtrowanie-suszenie-otoczkowanie-wysiew nasion in-vivo lub in-vitro

Rodzaje hydrożeli:-otoczki polisocharydowe-najważniejsze ze wszystkich-organiczne żele (poliakryloamidowe)-żele białkowe (żelatyna, polimer glutaraldehydowy lub formaldehydowy)Pochodzenie chemiczne wiązań żelifikujących !!!!!-żele powstają poprzez krzyżowe wiązanie jonowe odpowiednio naładowanych polimerów np. Alginian, chitozan, karaginian-żele powstałe zimnej lub gorącej polimeryzacji (agar, agaroza, karaginian).-żele powstałe drogą chemicznej reakcji (poliakrylamian, formaldehyd).Otoczki agarowe Agar- polisacharyd ekstrahowany z różnych gatunków czerwonych wodorostów Procedura pozyskiwania:- 2-4% agar rozpuszcza się w soli fiajologicznej w temp. 100C, a następnie schładza do 50C - dodaje się materiał roślinny (zarodki lub merystemy) zawieszone w soli fizjologicznej - po zestaleniu tnie się żel lub otacza fazą hydrofobową np. olejem - można ciepły agar wraz z komórkami wkraplać do oleju silikonowego lub sojowego, umieścić na mieszadle magnetycznym i po stężeniu oddziela się kuleczki (zawierające materiał roślinny) droga wirowania Otoczki agarozoweAgaroza- naturalny czynnik żelifikujący otrzymany z agaru pozbawionego grup estrowo-siarczanowychProcedura pozyskiwania: -agaroza 2-4% w temp. 35*C dobrze się rozpuszcza a jednocześnie żelifikuje-przygotowany już roztwór wraz z komórkami dodajemy wkraplając do oleju roślinnego umieszczonego na mieszadle, całość oziębiamy i wirujemyOtoczki alginianowe* Alginiany otrzymywane są z olbrzymich brązowych alg morskich Macrocystis i Laminaria drogą ekstrachowania zasadą sodową.

Otrzymywany kwas alginianowy składa się z jednostki M ( kwas manuroniowy ) oraz jednostki G ( kwas gulurioniowy )* Kiedy jony Na+ zastąpimy jonami dwuwartościowymi np. Ca2+

,Ba2+ , Si2+, Zn2+ lub Al3+ tworzy się sieć polimerowa pomiędzy jonami. Powstają wiązania krzyżowe pomiędzy grupami karboksylowymi, a molekułami polisacharodowymi. Proces jest termo niezależny i bardzo dobrze w strukturę żelu dopasowuje się wapń. Procedura pozyskania -suspensje komórek miesza się w temp. pokojowej ze sterylnym roztworem alginianu sodu 2-3% -następnie mieszaninę tę wkrapla się do roztworu chlorku wapnia (50-300 mM CaCl2) -perełki o określonej średnicy (0,5-5 mm) utwardzają się przez kilkanaście minut do kilku godzin- powleka się je dodatkową warstwą hydrofobową - na etapie kiełkowania zarodków, otoczki rozpuszcza się w EDTA lub buforze cytrynianowym ( fosforanowym ) Kiełkowanie i konwersjaKiełkowanie- zdolność do formowania korzonka zarodkowego Konwersja- równoczesny rozwój korzonka zarodkowego i merystemu pędu, z wytworzeniem rośliny o fenotypie właściwym dla danego gatunku Otoczki karaginianoweOtrzymywane z komórek czerwonych wodorostów typu Chondrus, Euchemia, Gigartina...Procedura pozyskiwania- 2-5% roztwór karaginianu ogrzewa się do temp. 45°C, a po schłodzeniu miesza się w/w roztwór z suspensją komórek - następnie wkrapla się zawiesinę w karaginianie komórki do roztworu KCl (kąpiel utwardzająca)perełki (2-4 mm) otrzymuje się w KCl przez 1-5 godz. - najczęściej stosowane Inne -celuloza i jej pochodne-chitozan-żelifikujące gumy

-pektyny-podwójne otoczkowanie np. alginiany/ pektyniany , karaginian/ chitozan lub -algininian/ chitozan-najnowsze otoczki hydrofobowe-Tulanox, Elwox-Bio- kapsuły! (osłonki zaindukowane wokół zarodka somatycznego imitujące okrywę nasienną z kutikuląEfektywność maszyny do otoczkowania-500000 sztucznych nasion o średnicy 80 ul dzienniemaszyna otoczkuje zarodki somatyczne: pomidorów, bawełny, petunii, ogórka, sałaty, papryki, tytoniu, melona, zbóż.-Stopień konwersji 8-90% i zależy od gatunku rośliny i warunków kiełkowania. W warunkach polowych dla sztucznych nasion M. media (lucerna) A. gravedens (seler) czy D. carota (marchew) wynosi 50-80%Embriogeneza somatyczna, sztuczna nasion dla drzew i krzewów

Formy drzewiasteForma dojrzała --x→ forma juwenilna(młodociana)

Zdrewniała → zielnarejuwenalizacja

→”odmłodzenie”

stymulacja wigoru

Uratowano wiele roślin reliktowych, np. tysiącletnie cyprysyRodzaje nasion:-Ortodoks- genotypy, które można poddawać wysuszeniu-Rekakacitrant ?- genotypy bardzo wrażliwe na wysuszenia (nie tolerują) Etapy wytwarzania sztucznych nasion-Uzyskanie i namnażanie materiału wyjściowego -Dojrzewanie i hartowanie (przygotowanie materiału do suszenia i otoczkowania) GA3 , ABA zapewniają prawidłowy rozwój zarodka, odporność na dehydratację oraz zapobiegają przedwczesnemu kiełkowaniu. hartowanie polega na osuszeniu i lekkim schłodzeniu -Odwodnienie- eksykator lub glikol polietylenowy-Otoczkowanie- otoczka pełni rolę „sztucznego bielma„ a dodatkowo osłonka hydrofobowa „okrywę nasienna”

-Wysiew- w zależności od typu sztucznych nasion, przenosi się je do warunków in vitro w celu dalszego przechowywania lub wysiewu do gruntu in vivoProblemy technologii sztucznych nasion-indukcja zarodków somatycznych (dodatek różnych substancji m. in. Aminokwasów) -faza dojrzewania zarodków i konwersji → podstawa ABA-problem O2

-wysychanie otoczek-stopniowe uwodnienie nasion!-koszty produkcjipróby tworzenia Bio- kapsuł

Ze względu na fazę wdrożeniową na dzień dzisiejszy namnaża się przez sztuczne nasiona: hybrydy ryżu, geranium, europejskie odm. ogórka , gerberę, kawę, lucerne.Potencjalne korzyści-szybkie namnażanie pożądanej linii-gwarancja genetycznej jednorodności roślin-bezpośrednie transplantowanie tkanki do gleby-dostarczanie i namnażanie zmiennych (niestałych) genotypów, takich jak rośliny transgeniczne o wysokiej niestabilności genetycznej-dostarczenie sterylnych linii-redukcja kosztów związanych z wegetatywnym namnażaniem linii elitarnych-możliwość masowej produkcji tkanki embriogennej z komórek poddanych inżynierii genetycznejBanki genówPrzechowywanie materiału roślinnegoKrótkoterminowe przechowywanie materiału roślinnego w stosunkowo niskiej temp. Ok. 4°C, przy niskim natężeniu światła i na ubogich pożywkach. Długoterminowo-- w temp. 70°C (zamrażanie przemian metabolicznych, chociaż istnieje niebezpieczeństwo powolnego utleniania tłuszczów oraz wzrost ilości mikrokryształów lodu w komórkach- w temp. -196°C (temp. Ciekłego azotu) komórki przez wiele lat nie tracą żywotności

Przechowywanie komórek in vitro w bankach genów (zamrażanie) Proces wieloetapowy, który obejmuje etapy:1.wzrost wstępny

kultury prowadzi się w pożywkach o obniżonym potencjale chemiczny, wody (sacharoza, mannitol, glukoza) oraz przy niskiej zawartości azotu (komórki są małe i słabo zwakuolizowane)

2.krioprotekcja (krioprezerwacja)przed zamrożeniem usuwa się nadmiar wody z komórek i przestrzeni międzykomórkowych. Uzyskuje się ten efekt nasączając tkanki roztworem gliceryny, sacharozy, dwufenylosulfanianem DMSO, aminokwasem proliną lub glikolem plietylenowym. Możliwe jest łączenie kriopretaktantów w formie 2 lub 3 składników.

3.zamrażaniea) zamrażanie metodą konwencjonalną -zamrażanie wstępne (0-40°C) optymalne tempo schładzania 0,5-2 C/min. (zależy od stopnia odwodnienia struktury i krystalizacji, wody w krioprotektancie) -zamrażanie trwałe w cikłym azocieb) metoda odwodnienia -struktury roślinneulegają odwodnieniu (dehydratacji) w temp. pokojowej-zamrażanie w ciekłym azociec) metoda witryfikacji-umieszczenie tkanki w silnie stężonym roztworze krioprotektantów (odciąganie wody do przestrzeni międzykomórkowych i do roztworu)-zamrażanie w ciekłym azocie4.przechowywanie właściwe (-196°C)5.odmrażanie6.przywrócenie właściwego tempa wzrostu komórekKrioprezerwacja zapewnia zachowanie stabilności genetycznej materiału na bardzo długi okres czasu stad z powodzeniem stosowana jest do przechowywania tkanek roślinnych, sztucznych nasion. Schemat zamrażania komórek w ciekłym azocie

Komórki roślinne↓

Pożywka adaptacyjna

↓Mieszanina kriochronna

↓Zamrażanie

Wieloetapowe Jednoetapowe

Przechowywanie↓

Rozmrażanie

Przeżywalność zakonserwowanego materiału zależy od:-tolerancji na dehydratację i działanie skoncentrowanych roztworów odwadniających -odporność na zamrażanie protoplastu (cecha uwarunkowana genetycznie)-stopnia uwodnienia i wielkości zamrożonej strukturyBanki genów

Holandia, Francja, Anglia, BelgiaPolska- Leśny Bank Genów w Kostrzycy od 1995 r.Ex- situ (poza naturalnym środowiskiem) →banki genówIn- situ (poza naturalnym ekosystemem)In vitro (w szkle)Zachowanie zasobów genowych in vitro

-techniki kultur in vitro umożliwiają mikrorozmnażanie i średnio- lub długoterminowe przechowywanie materiału roślinnego w bankach genów roślinnych-izolowanie komórki, tkanki zmodyfikowane genetycznie, haploidy, rośliny użytkowe, rzadkie lub ginące gatunki, kolekcje ogrodów botanicznych lub arboretów, roślin transgenicznych przechowywane są w:

*warunkach powolnego wzrostu*warunkach kriogenicznych*w postaci sztucznych nasion

prof. Broda

Biotechnologia-tworzenie określonych produktów przez wykorzystanie procesów

biologicznychHodowla roślin Biotechnologia

współczesna w hodowli roślin Biotechnologia - techniki kultur in vitroklasyczna - genetyka molekularna,(hodowla roślin istnieje już od tysięcy lat) inżynieria genetyczna

Hodowla roślin. W cyklu hodowlanym wprowadza się nowe oraz doskonali już istniejące cechy użytkowe tworząc odmiany w gatunkach roślin uprawnych. Rośliny nabierają nowych właściwości przez trwałą zmianę składu genetycznego.Genetyka- nauka o dziedziczności i zmienności organizmów żywych Badanie fenotypu → genomu (genotypu) (genetyka molekularna, inżyniria genetyczna)Genomika- nauka o molekularnych badaniach genetycznychBadanie genomu (zbiór informacji genetycznej) → fenotypuRośliny transgeneniczne- rzepak, kukurydza, soja, bawełnaNaukowe podstawy hodowli roślin1800 r. – prace T. A. Knighta, krzyżowanie roslin groch I pszenicy1840 r. – Louis de Vilma wprowadza nową metodę selekcji indywidualnej, stosowaną do dnia dzisiejszego 1866 r. – Grzegorz Mendel badania nad dziedziczeniem cech grochu, praca pt. „Versuche uber Pflanzen- hybriden”

- Prawa Mendla- ponowne ich odkrycie w 1900- Tschemark, de vries, Correns

1900 r. – De Vries- mutacje USA- kolekcjonowanie genotypów roślin uprawnych1910 r. – pierwsze prace nad heterozją kukurydzy

- prawo Hardy-ego- Weineberga- prawo czystości Johanensena

1920 r. – Muller i Stader- indukcja mutacji promieniami X- chromosomowa teoria dziedziczenia Morgana

- zmiana ploidalności za pomocą kolchicyny 1950 r. – wykorzystanie zjawiska heterozji i powszechna uprawa1960 r. – odkrycie mechanizmu regulacji działania genów ( Jackob i Monod)

- kultury in vitro- kultury protoplastów- uwodnienie totipotencji pojedynczej komórki roślinnej- wyhodowanie półkarłowych pszenic

1970 r. – kultury pylników- uzyskanie haploidów- embriogeneza somatyczna z protoplastów- pierwsze doświadczenie z selekcjonowaniem DNA

1980 r. – zastosowanie metod biotechnologii- udowodnienie, że przeniesione pozageneratywnie geny u roślin

ulegają dziedziczeniu zgodnie z prawami Mendla1990 r. – transforowanie roślinKultury in vitroTo hodowla komórek i tkanek roślinnych na sztucznych pżywkach w warunkach sterylnych.Regeneracja roślin na drodze organogenezy lub embriogenezy somatycznej1.Mikrowstrzeliwanie- rozmnażanie klonalne 2.kultury zarodków3.kultury roślin haploidalnychHaploid- roślina zawierająca w swoich komórkach somatycznych gametyczną liczbe chromosomów Sposoby uzyskiwania roślin haploidalnych-eliminacja chromosomów w zarodkach powstających w wyniku krzyżowań między gatunkami i między rodzajami -androgeneza – sporoficzny rozwój gametofitu męskiego

*kultury pylnikowe *kultury izolowanch mikrospor

-gynogeneza- sporoficzny rozwój z haploidalnych komórek woreczka zalążkowego

*kultury niezapłodnionych zalążkó i zalążni*kultury zapłodnionych zalążków i zalążni

Uzyskiwanie zmienności genetycznej

Mutacje Rekombinacje i segregacje-kultury merystemowe - transformowanie obcego DNA-kultury kalusa -mieszańce płciowe -kultury protoplastów -mieszańce somatyczne - haploidy(-) androgeneza(-) gynogenezaUtrzymanie zmienności gamet i rozmnażania roślin-Kultura merystemów i pąków przybyszowych-Kultury kalusoweKultury komórki-Kultury protoplastówZalety wynikające ze stosowania technik kultur in vitro w pracach genetyczno- hodowlanych-Dysponowanie ogromnymi liczebnościami genotypów na bardzo małych powierzchniach-Uzyskanie efektów selekcji w krótkim czasie -Możliwości bardzo precyzyjnej kontroli czynników dotyczących działania mutagetagenami, warunków selekcji i wzrostuDiagnostyka molekularna Porównanie markerów molekularnych z markerami morfologicznymi - przy pomocy markerów molekularnych, genotypy roślin mogą być określane w całym okresie wzrostu i rozwoju rośliny, na poziomie tkankowym i komórkowym w przypadku markerów morfologicznych, genotypy określane są tylko na poziomie całych roślin i często dopiero w stanie dojrzałej rośliny.- w wielu gatunkach roślin występuje naturalna zmienność alleli w większości loci markerów molekularnych. A zatem w badaniach genetycznych można wykorzystać naturalną zmienność w istniejących populacjach bez konieczności zmienności wymaganej często dla loci morfologicznych- zmienność izoenzymów i markerów DNA wykazuje zwykle neutralność fenotypową podczas gdy markery morfologiczne

powodują zmienność fenotypowa często niepożądana w populacjach hodowlanych- allele niektórych typów loci molekularnych (np. izoenzymy, RLFP) wykazują kodominujący charakter dziedziczenia. Dominujący charakter dziedziczenia cech morfologicznych uniemożliwia rozróżnienie wszystkich genotypów- niepożądane działania epistatyczne występujące często pomiędzy loci kodującymi morfologiczne cechy mogą limitować liczbę segregującuch markerów możliwych do obserwacji w jednej segregującej populacji. Większość markerów molekularnyc pozbawiona jest tego typu oddziaływań tak więc liczba loci, jaką można obserwować w jednej populacji jest teoretycznie ograniczona. Diagnostyka oparta o markery (znaczniki, własności) -Diagnostyka oparta o markery morfologiczne (monogeniczne dziedziczenie)-Diagnostyka molekularna oparta o markery genetyczne

Wynik diagnostyczny powstaje na podstawie -Oceny polimorfizmu fragmentów restrykcyjnych (RFLP)-Określenie długości badanego fragmentu DNA-Wykrycie delecji, insercji, mutacji punktowych-Określenie sekwencji badanego fragmentu DNADiagnostyka oparta na amplifikacji DNAŁańcuchowe reakcje polimerazy PCRStadia reakcji:1.denaturacja DNA, w temp. od 95°C w wyniku której powstają jednoniciowe cząsteczki DNA2.przyłączanie starterów do jednoniciowej cząsteczki DNA w miejscach komplementarnych do homologii starterów ich długości itp.3.synteza nowych nici DNA w temp. od 72°C Rodzaje markerów molekularnych-izoenzymy (polimorfizm białek, kodominowanie)

markery DNA (polimorfizm DNA) RFLP,MAAP, AFLP, STMS, SCAR (STS)

- RFLP badanie polimorfizmuDiagnostyka oparta na hybrydyzacji z sondami molekularnymi-hybrydyzacja punktowa DNA lub RNA, unieruchomienie w temp. 80°C lub promieniowanie UV, inkubacja z sondami

-metoda Sontherna hybrydyzacja DNA-DNA-metoda Northen hybrydyzacja RNA-DNA-hybrydyzacja in situ.PTL- loci cech ilościowychInżynieria genetycznaGenetyka molekularna i technika rekombinacji DNA przyczyniły się do opracowania metod pozwalających na uzyskanie nowej zmienności droga transformacji Transformacja genetyczna – jest to proces przenoszenia obcych fragmentów DNA (genów) do genomu biorcy i stabilna ich integracje w tym genomie (przenoszenie genów bez względu na ich oddalenie fitogenetyczne) Etapy uzyskiwania roślin transgenicznych 1.wyizolowanie i sklonowanie genu przeznaczonego do transformacji 2.opracowanie metody wprowadzenia genu do komórek roślinnych 3.ustalenie metodyki regeneracji transformowanych komórek kompletnie wykształcone rośliny 4.określenie sposobu sprawdzenia integracji i ekspresji wprowadzonego genu 5.zbadanie stabilności transformowanego genu w następnych pokoleniach roślin i określenie sposobu dziedziczenia nabytej cechy Konstrukt stosowany w transformacji składa się z :

-gen strukturalny (cecha) -gen markerowy ( selekcyjny) np. aro A, odporność na glyfosad lub npt H, odporność na neomycyne i kanamycyne oraz reporterowy (wizualizujący) np. GUS, β glukuronidaza , -promotor i terminator, sekwencje regulacyjne ( promotor poprzedzający gen strukturalny jest odpowiedzialny za inicjację transkrypcji, a terminator za jej ukończenie)

Metody transformacji: -wektorowe , bakterie z rodzaju Rhizobium- Agrobaterium fumefaciens plazmid Ti oraz Agrobacterium rhizogenes , plazmid Ri

System Agrobacterium wykorzystuje się do roślin 2-liściennych - bezwektorowe , makroiniekcja, mikroiniekcja, elektroporacja,

mikrowstrzeliwanie- wykorzystuje się do wprowadzenia konstruktów DNA u roślin 1-liściennych

wektor binarny- układ 2 plazmidów

wektor monarny – 1 plazmid Skuteczna transformacja nie oznacza stabilnej ekspresji -problemem technologii roślin transgenicznych jest niestabilność ekspresji wprowadzonych genów -wprowadzone geny: nie ulęgają ekspresji, bardzo słaba ekspresja zanika w kolejnych pokoleniach Dlaczego tak się dzieje???„wyciszenie genów”- poznano powierzchownie -przypadkowe miejsce integracji obcych genów w transkrypcyjnie nieaktywne obszary genomu wyklucza z reguły możliwość transkrypcji (rejony chromosomów zwane heterochromatyną) -modyfikacja obcego DNA przez metylacje, której ulega cytozyna, prowadzi to do zablokowania trankrypcji -trandezaktywacja ( kosupresja) polega na wyciszaniu transkrypcji genu homologicznego za pomoca transformacjiGen męskiej sterylności- PGS Geny rybonukleaz RN-aza T1 (z Aspergillus oryzae) BARNAZA ( z Bacillus amyliquefaciens)

PROMOTOR TA- 29 gen rozkładający komórki tapetum -gen odpornosci na herbicydy Bosta – gen Bor acetylotransferazy (ze Steptomyces hygroscopicus) RESTORERY- transformanty z inhibitorem Barnazy – Bostor Wykorzystanie roślin transgenicznych w hodowli Metody transformowania roślin umożliwiają na drodze pozageneratywnej wprowadzenie następujących cech : 1.odporność na szkodniki i choroby wirusowe, bakteryjne i grzybowe 2.odporność na herbicydy 3.modyfikacje cech użytkowych roślin -ingerencja w metabolizm związany z dojrzewaniem -modyfikowanie spektrum barw kwiatów -zmiany w metabolizmie węglowodanów i tłuszczów

-rośliny transgeniczne jako bioreaktory do syntezy białek: alfa- amylazy, beta- glukozydazy, peroksydaza ligniny – białka przemysłowe oraz źródło przeciwciał i szczepionek -rośliny transgeniczne mogą służyć do biodegradacji plastiku

Obecnie wprowadzane są geny warunkujące cechy jakościowe o prostym, jedno- lub kilkugenowym sposobie dziedziczenia .