Biaka w diagnostyce laboratoryjnej

Biaka w diagnostyce laboratoryjnejStelmach JustynaGr. A2III OAMRola biaek osocza:Kontrola dystrybucji pynw przestrzeni pozakomrkowej Funkcje transportowe Regulatory enzymw Biaka odpornociowe Cinienie onkotyczneFunkcja odywcza

Kontrola dystrybucji pynw przestrzeni pozakomrkowej gwnym biakiem speniajcym te funkcje jest albumina.Funkcje transportowe niespecyficzny ukad o duej pojemnoci transportujcy hormony,witaminy, wap, magnez, metale ladowe, bilirubin, kwasy tuszczowe, lipidy i leki (albumina); specyficzny transport i regulacja metabolizmu rnych zwizkw (transferyna-Fe, transkobalamina-witamina B12, tyreoglobulina-tyroksyna i trjjodotyronina, haptoglobina-Hb).Regulatory enzymw inhibitory proteaz (1-antytrypsyna, 2-makroglobulina); biaka ukadu krzepnicia; ceruloplazmina katalizuje utlenienie Fe+2 do Fe+3.Biaka odpornociowe immunoglobuliny (odporno swoista); ukad dopeniacza (odporno nieswoista).

2ProteinogramAlbuminy 60-70%Alfa-1 globuliny 2-4%Alfa-2 globuliny 4-7%Beta globuliny 8-13%Gamma globuliny 9-22%

Cakowite stenie biaka w osoczu 60-80 g/lWydalane z moczem= 20-80mg/dob

Za krytyczne uznaje si poziomy biaka cakowitego poniej 45g/l i albuminy poniej 20g/l.

Przy takich steniach cinienie onkotyczne jest bardzo niskie, dochodzi do ucieczki wody poza naczynia, powstawania obrzkw i przesikw do jam ciaa.

Biaka specyficzne:Albuminy- cinienie onkotyczne (80%)Alfa1-antytrypsyna-inhibitor proteazBeta2-mikroglubulina- podjednostka ukadu HLACeruloplazmina- biako wice mied i enzymBiako C-reaktywne (CRP)- wskanik stanu zapalnegoTransferyna- biako transportujce elazoFerrytyna- biako transportujce elazo w tkankachHaptoglobina- biako wice hemoglobinSHBG-Glubulina wica hormony pciowe- wie testosteronTBG-Globulina wica hormony tarczycyTranskobalamina- wie wit.B12

Paraproteinyimmunoglobuliny produkowane przez pojedynczy klon komrek linii limfocytw B (np. plazmocyty)zazwyczaj wystpuje w obrbie globulin gammaparaproteiny pojawiaj si najczciej w przebiegu szpiczaka mnogiego, plazmocytom i choroby Waldemstroma (makroglobulinemia-IgM)elektroforeza biaek osocza jest podstawowym badaniem wykrywajcym paraproteiny ale mocz powinien by take badanyw przebiegu szpiczaka wydzielane s tylko immunoglobuliny zbudowane z acuchw lekkich, ktre s wykrywane w 75% przypadkw w moczu jako biako Bence-Jonesa

Synteza i degradacja biaek osocza:Dwie due pule biaek:albumina-czynnikiem regulujcym jej syntez w wtrobie jest cinienie onkotyczne dziaajce poprzez onkoreceptory oyska naczyniowegoimmunoglobuliny-syntetyzowane w limfocytach w wyniku ich aktywacji przez rne antygeny.Degradacja ATP-niezalena w lizosomach (biaka nieuszkodzone, dugo yjce).Degradacja ATP-zalena w cytosolu (biaka nieprawidowe, krtko yjce).Okres ptrwania biaek (czas wymagany do zmniejszenia stenia biaka do 50% wartoci pocztkowej): czynnik VIII krzepnicia: kilka godzinalbumina: czternacie dniimmunoglobuliny: dwadziecia cztery dni Biaka osocza nie gromadz si w wtrobie, prawie caa pula biaek znajduje si w przestrzeni midzykomrkowej, tylko 40% jest w naczyniach, pozostae 60% w przestrzeni pozanaczyniowej.Prawidowy poziom biaka cakowitego zaley od rwnowagi miedzy syntez a degradacj dwch, gwnych frakcji biakowych: albuminy i immunoglobulin.Wikszo biaek jest katabolizowana w wtrobie lub komrkach rdbonka naczy.Hipoproteinemia:Obnienie poziomu biaek w wyniku: a) zwikszonej utraty biaek b) zahamowania ich syntezy w wtrobie c) rozcieczenia przez nadmiar lub zmiany dystrybucji wody pozakomrkowej. Niedobory immunoglobulinZmiany objtoci przestrzeni pozakomrkowej: przewodnienia spadek cinienia krwistany zapalne

Przyczyny:Zespoy utraty biaka: nerkowe (kbkowe zapalenie nerek, cukrzyca, tocze rumieniowaty trzewny, zakrzepica y nerkowych) jelitowo/odkowe (stany zapalne, nowotwory zoliwe, zwenie, uchyki, choroba popromienna, niewydolno krenia, zapalenie krezki) skrne (rozlege oparzenia, dermatozy) wysiki (obrzki, zapalenia puc, wodobrzusze) krwotokistany cikie (urazy, nowotwory, sepsa)Zahamowanie syntezy biaek w wtrobie:uszkodzenie miszu wtroby (toksyczne, marsko, zanik miszu, pierwotny lub wtrny nowotwr)zaburzenia wchaniania (zespoy poresekcyjne, biegunki bakteryjne, zakaenia, mukowiscydoza)niedobory biaka w diecie (niedoywienie)

Ocena niedoborw biaek osoczaNiskie poziomy biaka cakowitego i albuminy mog poza leczeniem ich przyczyny, wymaga uzupeniania ich niedoboru, a szczeglnie gdy s poniej poziomw krytycznych.Podczas uzupeniania niedoborw naley uwzgldni rwnie wielko dobow ujemnego bilansu biakowego. Skuteczno tego typu leczenia naley monitorowa przez oznaczanie poziomu biaka cakowitego i albuminy.

HiperproteinemiePrawdziwa hiperproteinemia jest spowodowana znacznym wzrostem produkcji jednej lub wielu klas immunoglobulin.Zwikszeniu stenia immunoglobulin czsto towarzyszy obnienie poziomu albuminy.Stenie biaka cakowitego moe by w granicach normy lub obnione, nawet przy znacznej hipergammaglobulinemii (w pnych stadiach marskoci wtroby, w rozwoju zespou nerczycowego w przebiegu chorb kolagenowych).Przyczyny hiperproteinemiiHipergammaglobulinemie:monoklonalne (szpiczak mnogi, makroglobulinemia Waldenstrma, choroba cikich acuchw) poliklonalne (przewleke stany zapalne, choroby autoimmunologiczne)przewleke choroby wtroby (marsko, wirusowe zapalenia, sarkoidoza) odwodnienia Dysproteinemia to nie prawidowe proporcje biaka we krwi, przy prawidowym poziomie biaka cakowitegoSzybko opadania krwinek czerwonych (Odczyn Biernackiego,OB).Test oceny zaburze proporcji midzy steniami poszczeglnych biaek osocza i waciwoci erytrocytw.

W prbie krwi pobranej z antykoagulantem (cytrynian sodu) krwinki czerwone opadaj w wyniku wikszego ciaru waciwego (1.095g/l) ni osocze (1.027g/l).

Szybko OB. Jest wypadkow skadu osocza oraz waciwoci erytrocytw. Zwikszenie stenia fibrynogenu, biaek frakcji globulinowych alfa i beta (biaka ostrej fazy), oraz spadek poziomu albuminy powoduj wzrost OB.

Maa ilo erytrocytw w niedokrwistociach jest przyczyn ich szybszego opadania.

Elektroforeza biaek surowicy

Elekroforeza (bibuowa, na agarozie, na octanie celulozy, w elu skrobiowym i elu poliakylamidowym)polega na wdrwce oznaczonych adunkiem elektrycznym czstek biakowych w roztworze elektrolitu podczas przepywu staego prdu elektrycznegoszybko wdrwki zaley od ruchliwoci w polu elektrycznym, a ta zaley od wielkoci czstek i wielkoci adunku powierzchniowego

Biaka, ktrych zmiana ste moe wpyn na obraz elektroforetyczny surowicy to:a) frakcja albuminowa (53-68%)b) frakcja 1-globulinowa (1-4%)c) frakcja 2- globulinowa (1-14%)d) frakcja globulinowa (8-17% razem z beta2)e) frakcja gamma-globulinowa (9-22%)Immunoelektroforeza biaek surowicy ludzkiejto poczenie rozdziau elektroforetycznego i immunoprecypitacji biaek, przy zastosowaniu specyficznych reakcji precypitacji antygen-przeciwciao, jest czsto wykorzystywana w rozpoznawaniu paraproteinemii. Identyfikacja nieprawidowych biaek po rozdziale elektroforetycznym jest moliwa, jeli zastosuje si surowice odpornociow. W wyniku reakcji antygen (antygenem jest w tym przypadku rozdzielone elektroforetycznie biako) z przeciwciaami znajdujcymi si w surowicy odpornociowej wytwarzaj si linie precypitacyjne, ktre umoliwiaj identyfikacj nieprawidowego biaka.Charakterystyczne zmiany zawartoci jednej lub kilku frakcji biakowych stwierdza si w wielu chorobach.

CHROMATOGRAFIA(bibuowa, jonowo wymienna, cienkowarstwowa) wykorzystuje rnice szybkoci wdrwki skadnikw biakowych w orodkach porowatych.Biaka pynu mzgowo-rdzeniowego: maj skad podobny do biaek osoczowychzaliczamy do nich: prealbuminy, albuminy, 1- i 2- , -, gamma- globulinystenie biaek w pynie mzgowo-rdzeniowym jest ok. 100 razy mniejsze i wynosi 0,15-0,45 g/lElektroforeza biaek PMRCechy charakterystyczne:prealbumina,biako tau (zwizane z mikrotubulami neuronw, odpowiada za ich stabilizacje oraz wizanie z neurofilamentami i organellami komrkowymi)Brak fibrynogenu.AlbuminaSyntetyzowana w wtrobie, ok.15g/dob.Czas poowicznego trwania (T1/2) 14 dni.Nieswoisty transporter bilirubiny, hormonw, witamin, wapnia, magnezu, kwasw tuszczowych, lekw oraz substancji wchonitych w jelitach i transportowanych do wtroby.Bisalbuminemia wystpowanie dwch rodzajw albumin o rnym skadzie aminokwasowym i rnej mobilnoci elektroforetycznej.

Immunoglobuliny:Immunoglobuliny (przeciwciaa) maj zdolno swoistego czenia si z antygenem i s najwaniejszymi czsteczkami ukadu odpornociowego.Syntetyzowane przez limfocyty B.Na podstawie rnic w budowie acuchw cikich (,,,,) wyrniamy odpowiednio pi klas: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM.

HipogammaglobulinemiaPierwotna uwarunkowana genetycznie raczej rzadko spotykana, moe dotyczy wszystkich lub jednej klasy Ig.

Wtrna zwizana z chorob (nowotwory, leczenie cytostatykami, usunicie ledziony). Bardzo niskie poziomy immunoglobulin zwizane s najczciej z ubytkiem limfocytw B.

HipergammaglobulinemiaHipergammaglobulinemia poliklonalna jest to prawidowa odpowied organizmu na infekcj bakteryjn lub wirusow. W pierwszym etapie infekcji nastpuje wzrost stenia IgM, po dwch tygodniach IgG oraz stopniowy zanik IgM.Podwyszony poziom IgA jest czsto zwizany z infekcjami bon luzowych (S-IgA wytwarzane miejscowo przez komrki plazmatyczne bon luzowych maj zdolno neutralizowania wirusw i wieksz efektywno aglutynacji bakterii).Hipergammaglobulinemia monoklonalna wzrost immunoglobulin produkowanych przez nadmiernie rozrastajc si lini limfocytw (grupa chorb nowotworowych limfocytw B).Przyczyny: szpiczaki, makroglobulinemia Waldenstrma, choniaki i agodne gammapatie monoklonalne.

Biaka ostrej fazySynteza w wtrobie pod wpywem cytokin zapalnych w przebiegu zakae bakteryjnych, martwicy tkanek, ostrych i przewlekych stanw zapalnych, chorb zakanych, nowotworw.Cz nieswoistej odpowiedzi immunologicznej.Rola- modulowanie odczynu zapalnego i ochrona tkanek nieobjtych stanem zapalnym przed niszczcym dziaaniem proteinaz i silnych oksydantw wydzielanych przez fagocyty.

Niewielki :Choroby nowotworoweNiedoywienieCia MenstruacjaZesp metabolicznyOpsoniny, inhibitory proteinaz, chelatory metali, transportery hormonw, biaka wice hem i hemoglobin, biaka ukadu krzepnicia (fibrynogen i antyplazmina III) oraz biaka ukadu dopeniacza.

Ujemne biaka ostrej fazy:AlbuminaTransferrynaPrealbuminaDodatnie biaka ostrej fazy:fibrynogen1- antytrypsyna (AAT)ceruloplazminahaptoglobina (HP)biako C-reaktywne (CRP)surowicze amyloidowe biako A (SAA)laktoferrynabiaka ukadu dopeniacza

Biako C-reaktywneZnaczny wzrost obserwowany jest w pierwszej dobie uszkodzenia tkanek (zawa minia sercowego, biaaczek, w odrzucie przeszczepw, zakaeniach bakteryjnych).Prawidowe stenie CRP w surowicy jest mniejsze ni 5 mg/l.hsCRP - test o wysokiej czuoci: 0.2 mg/l; pozwala na zmierzenie bardzo maych wartoci CRP z du precyzj w zakresie decyzyjnym.Wyniki ostatnich bada wskazuj, e stenie CRP posiada znaczenie prognostyczne w chorobie sercowo-naczyniowej. Procesy zapalne odgrywaj bardzo wan rol w patogenezie miadycy, a stopie podwyszenia poziomu CRP, ktry jest charakterystyczny dla przewlekego stanu zapalnego, jest czynnikiem oceniajcym ryzyko wystpienia zawau minia sercowego lub udaru mzgu.Poziom CRP powyej 2.1 mg/l jest zwizany z trzykrotnym zwikszeniem ryzyka wystpienia zawau minia sercowego oraz dwukrotnym zwikszeniem ryzyka wystpienia udaru mzgu.

Metody ilociowego oznaczania biaek:Metoda LowryegoMetoda BradfordaMetoda mikrobiuretowaMetoda pomiaru absorbancji w UVMetoda z kwasem Bis-cynchoninowym (BCA)Metoda KiejdahlaMetoda biuretowaMetoda kolorymetryczna z odczynnikiem Nesslera

Metoda KiejdahlaMetoda referencyjna, oznaczanie azotu,

Zasada:Zawarto azotu w rnych biakach jest wzgldnie staa i wynosi ok. 16%.Znajc odsetek azotu w badanej prbie, mona obliczy, ile zawiera biaka.Metoda kolorymetryczna z odczynnikiemNessleratozielony roztwr jodku rtciowo-potasowego przechodzi w czerwony jodek amidooksyrtciowy. Pomiar absorbancji 490-510 nm

Zalety: dua specyficzno da wszystkich biaekWady: dua pracochonnoMetoda biuretowaZasada oznaczenia:Oznaczanie natenia barwy powstaej w wyniku utworzenia zwizkw kompleksowych biaek z jonami miedzi (II) w rodowisku zasadowym =530 nm

Zalety:Wysoka specyficzno dla wszystkich biaekWady: niska czuo (10mg/l).Materia: Surowica, mocz (w zaawansowanej nerczycy)

Metoda mikrobiuretowa:Modyfikacja metody biuretowej Mechanizm podobny, ale zastosowana dugo fali 310 nm zwiksza ok 10 x jej czuo Kad prb wykonuje si w dwch szeregach: biay (B) i niebieski (N) Szereg biay zawiera roztwr biaka + 30% NaOH, szereg niebieski roztwr biaka + CuSO4 w 30% NaOHWaciw absorbancj do oblicze otrzymuje si z rnicy N-B.Zalety: wysoka specyficzno w stosunku do wszystkich biaek.Wady: due zuycie roztworu biaka (dwa szeregi)Metoda LowryegoZasada: dwie odrbne reakcje: reakcja aminokwasw z odczynnikiem Folina reakcja biuretowa.

Zalety:bardzo wysoka czuo reakcji (1mg/l)Wady: maa specyficzno.

Materia : Mocz, PMR.Metoda BradfordaW metodzie wykorzystuje si zdolno wizania barwnika bkitu brylantowego - Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBB G250) z grupami aminowymi biaek.=595 nm

Zalety: prostota i szybko oznaczenia dua czuo (0,5mg/l)oznaczenia mona wykonywa w obecnoci powszechnie stosowanych buforw, EDTA, zwizkw tiolowych, sacharozy, gliceroluMetoda pomiaru absorbancji w UVWarto wsp. absorpcji zaley od % zawartoci aminokwasw aromatycznych i dla biaek osocza o steniu 1 mg/ml wynosi od 0,8 do 1,6Obecno kwasw nukleinowych w badanym materiale przeszkadza w oznaczeniu (max absorbcji 260 nm)

Wady: Maa specyficznoMetoda nadaje si do oznaczania stenia oczyszczonego biaka (na podstawie znanego wsp. absorpcji)Metoda z kwasem bis-cynchoninowym (BCA)W alkalicznym rodowisku niektre skadniki biaek (tyrozyna, tryptofan, cysteina, cystyna) redukuj jony Cu2+ do Cu1+ Cu1+ tworz barwny kompleksowy zwizek z kwasem biscynchoninowym(BCA)

=540 580 nmBiaka markeryMarkery zawau minia secowegoMarkery prognostyczne: Hs-CRP- high sensitive-C-Reactive Protein (wysoko czue biako C-reaktywne) MPO- mieloperoksydaza CD-40Markery destabilizacji blaszki miadycowej PAPP-A- Pregnancy-Associated Protein-A (ciowe biako osoczowe A)Markery niedokrwienia IMA (ACB)- Ischemia Modifed Albumin (Albumin Cobalt Binding) Albumina modyfikowana niedokrwieniem (wizanie kobaltu przez albumin)

Markery martwicy komrkowej Mioglobina (niespecyficzny) H-FABP- Hart-Fatty Acid Binding Protein (sercowe biako wice kwasy tuszczowe) CK-MB Troponiny sercowe (cardiac)- cTnT, cTnIMarker niewydolnoci serca Peptydy natriuretyczne (Natriuretic peptides)- ANP-przedsionkowy (atrial) (typ A); BNP- mzgowy (brain) (typ B); NT-proBNP

Markery filtracji kbkowej (nerkowej):Beta-2 mikroglobulina- jest niskoczsteczkowym biakiem (11.8kDa) obecnym na bonie komrkowej prawie wszystkich komrek jdrzastych (take limfocytw). Beta-2-M jest ma podjednostk antygenu zgodnoci tkankowej (HLA). Nerka jest gwnym miejscem eliminacji beta-2-M gdzie jest filtrowana w kbuszkach i w 99.9% reabsorbowana w kanalikach proksymalnych.cystatyna C- jest kationowym polipeptydem o masie czsteczkowej 13kDa. Poniewa podlega staej i rwnomiernej produkcji i ulega cakowitej filtracji w kbuszkach nerkowych, cystatna-C jest endogennym markerem filtracji (GFR) lepszym ni beta-2-M i kreatynina.

SHBGSteroi Hormons Binding Globulin (globulina wica hormony sterydowe)- oznaczenie SHBG jest polecane w przypadku koniecznoci wyjanienia niskiego lub wysokiego stenia testosteronu, gdy wolny (biologicznie aktywny) testosteron jest w normie