Aleksandra Plotta

15 listopada 2016

Badanie genotoksyczności substancji

aktywnych testem Amesa

AGENDA

1. Substancje aktywne.

2. Genotoksyczność.

3. Testy służące do wykrywania genotoksyczności.

4. Test Amesa.

5. Wady i zalety.

htt

p:/

/od

kry

wcy.p

l/g

id,1

5139499,p

ag

e,8

,tit

le,O

rgan

izm

-w-l

iczb

ach

,ga

leri

azd

jecie

.htm

l

2. Substancje aktywne

Wytyczna ICH M7 odnośnie wykrywania i kontroli DNA-reaktywnych (mutagennych) zanieczyszczeń w środkach

farmaceutycznych w celu ograniczenia ryzyka karcenogennego.

EMA/CHMP/ICH/83812/2013

1. Substancje aktywne

Grupy substancji o wysokim potencjale TTC*

- aflatoxin-like,

- N-nitroso compounds,

- azoxy compounds

TTC – próg zagrożenia toksykologicznego

1.5 mcg/dzień/osobę = teoretyczne zagrożenie rakowe z 1 na 105 w trakcie życiowej ekspozycji

Odnosi się to do mutagennych zanieczyszczeń w farmaceutykach przeznaczonych do leczenia długoterminowego (> 10 lat).

Bazując na wytycznej ICH M7

2. Genotoksyczność

Genotoksyczność- szerokie pojęcie odnoszące się do wszelakich szkodliwychzmian w materiale genetycznym, niezależnie od mechanizmu jakim zmianajest indukowana.

GENOTOKSYCZNOŚĆ ≠ KARCENOGENNOŚĆ

htt

p:/

/ww

w.m

uta

cje

ge

nety

czn

e.p

l/

2. Genotoksyczność

3. Testy służące do wykrywania genotoksyczności

1. Test Umu (Szczep testowy TA1535/pSK1002 posiada zwielokrotniony plazmid pSK1002).

2. Klasyczny Test Amesa (metoda płytkowa).

3. Test Amesa II (metoda mikropłytkowa).

4. Test wykorzystujący szczepy bakteryjne Vibrio harvey (nadaje się do oznaczania mutagenności czwartorzedowych soli amoniowych).

Większość testów do badania genotoksyczności opiera się na podwalinach klasycznej metody Amesa ( lata 70. XX wieku ), jednak powstaje szereg udogodnień i usprawnień metody (np. wprowadzenie mikropłytki)

4. Test Amesa

4. Test Amesa

ZAŁOŻENIA TESTU

1. Test badający siłę mutagenności danej substancji.

2. Wykorzystujący auksotroficzne szczepy bakteryjne z wprowadzoną mutacją punktową w operonie danego aminokwasu.

3. Wykorzystujący szczepy z mutacją ramki odczytu bądź substytucją par zasad.

4. Wykorzystujący aktywację metaboliczną z wykorzystaniem homogenatu ssaczej wątroby, w celu sprawdzenia czy związek pod wpływem aktywacji nie przekształca się w mutagenne pochodne.

4. Test Amesa

Indicator

medium

Test sample, controls

Bacterial stock

-80ºC

Overnight

culture

Assay preparation

37ºC, 11-15 h

250 rpm

Exposure cultures

24-well plate

37ºC, 90 min, 250 rpm

(E.Coli +S9: 20 min)

Bacterial culture

-/+ S9-mix

Exposure Medium

C-

D1

D2

D3

D4

D5

D6

C+

TAxxx

384-well plates

37oC

48 h

A

B

C

D

C-

D1

D2

D3

D4

D5

D6

C+

Transfer to 24-well plate

A

B

C

D

C-

D1

D2

D3

D4

D5

D6

C+

C- C- D4D4

D1D1

D2D2

D3D3

D5D5

D6 D6

C+ C+

Transfer

4. Test Amesa

Punkty krytyczne:

1. Transport.

2. Hodowla całonocna.

3. Dodanie substancji badanej.

4. Transfer z płytki 24 - dołkowej na 384 - dołkową.

5. Stężenie 2-aminoantracenu (2 – AA) w kontroli pozytywnej.

htt

ps:/

/ww

w.b

rita

nnic

a.c

om

/scie

nce/S

alm

onella

-typhim

urium

4. Test Amesa

Dzień I- Założenie hodowli całonocnej

Warunki inkubacji:37°C, 200 rpm, 14-16 hnatlenienie

Zamrażarka -70°C

1

2

3

4

4. Test Amesa

DZIEŃ II

1. PRZYGOTOWANIE I ROZCIEŃCZENIE PODSTAWOWEGO ZWIĄZKU CHEMICZNEGO

4. Test Amesa

DZIEŃ II

2. PRZENIESIENIE ZWIĄZKU CHEMICZNEGO NA PŁYTKI DO EKSPOZYCJI

4. Test Amesa

DZIEŃ II

3. PRZYGOTOWANIE HODOWLI DO EKSPOZYCJI

INKUBACJA: 90 minut, 200 rpm,37°C

4. Test Amesa

DZIEŃ II

4. DODANIE PODŁOŻA WSKAŹNIKOWEGO

4. Test Amesa

DZIEŃ II

5. PRZENIESIENIE HODOWLI PO EKSPOZYCJI Z PŁYTKI 24-DOŁKOWEJ DO PŁYTEK 384-DOŁKOWYCH

4. Test Amesa

DZIEŃ IV Odczyt płytek testowych i statystyczna analiza danych

E. Coli S9-

E. Coli S9-

4. Test Amesa

DZIEŃ IV Odczyt płytek testowych i statystyczna analiza danych

4. Test Amesa

DZIEŃ IV Odczyt płytek testowych i statystyczna analiza danych

E. Coli S9-

5. Podsumowanie

Zalety Wady

Stosunkowo szybki czas uzyskania

wyniku

Wysoki koszt odczynników

Wysoka dokładność Pracochłonny

Łatwe opracowanie danych

statystycznie

Wymagający specjalistycznego

sprzętu