Autoreferat Wojciech... · 2019. 9. 10. · Załącznik #2 Wojciech Mieczysław Pokrzywa 4...

AutoreferatzwiązanyzubieganiemsięostopieńdoktorahabilitowanegodrWojciechMieczysławPokrzywa

Komórkowesystemykontrolijakościbiałekwrozwojuistarzeniusię.

Warszawa,25.04.2019

Załącznik#2WojciechMieczysławPokrzywa

2

Autoreferat


3

Autoreferat1.Imionainazwisko ....................................................................................................... 4

2.Posiadanedyplomy,stopnienaukowe–zpodaniemnazw,miejscairokuichuzyskaniaoraztytułurozprawydoktorskiej ................................................................. 4

3.Informacjeodotychczasowymzatrudnieniuwjednostkachnaukowych ................. 4

4.Wskazanieosiągnięciawynikającegozart.16ust.2ustawyz14marca2003r.ostopniachnaukowychitytulenaukowymorazostopniachitytulewzakresiesztuki(Dz.U.65,poz.595zezm.) ............................................................................................. 4

4.1Tytułosiągnięcianaukowego ............................................................................... 4

4.2Publikacjewchodzącewskładosiągnięcianaukowego ...................................... 4

4.3Omówienieosiągnięcianaukowego–celówszczególnychiosiągniętychwyników ...................................................................................................................... 5

Podsumowanie .......................................................................................................... 35

5.Omówieniepozostałychosiągnięćnaukowo–badawczych .................................... 38

5.1Udziałwprojektachnaukowych/grantynaukowe .......................................... 38

5.2Wkładwnaukępodoktoracie ............................................................................ 39

6.Bibliografia ................................................................................................................ 42


4

Autoreferat1. Imiona i nazwisko

Wojciech Mieczysław Pokrzywa

2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe – z podaniem nazw, miejsca i roku ich uzyskania oraz tytułu rozprawy doktorskiej

2009 - Doktor inżynierii biologicznej i nauk agronomicznych. Katolicki Uniwersytet w Louvain, Louvain-la-Neuve, Belgia. Jednostka Biochemii i Fizjologii, Instytut Nauk o Życiu. Tytuł pracy ‘Study of the sorting properties of S. cerevisiae Sna3p and Sna4p’

2006 - Dyplom DEA - Diplôme d'études approfondies DEA (Degree of Profound Studies) w inżynierii biologicznej i naukach agronomicznych. Katolicki Uniwersytet w Louvain, Louvain-la-Neuve, Belgia. Jednostka Biochemii i Fizjologii (FYMO), Instytut Nauk o Życiu.

2004 – Magister, specjalizacja mikrobiologia. Uniwersytet Wrocławski, Wydział Nauk Przyrodniczych, w Instytucie Genetyki i Mikrobiologii.

3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych

Od 08/2017 - kierownik Laboratorium Metabolizmu Białek w Rozwoju i Starzeniu, Międzynarodowy Instytut Biologii Molekularnej i Komórkowej w Warszawie.

08/2009 - 07/2017 - podoktorski staż naukowy w Laboratorium profesora Thorstena Hoppe, CECAD - Cluster of Excellence for Aging Research, Instytut Genetyki, Uniwersytet Koloński, Niemcy.

10/2004 - 09/2008 - studia doktoranckie w Laboratorium profesora Pierra Morsomma, Katolicki Uniwersytet w Louvain, Louvain-la-Neuve, Belgia. Jednostka Biochemii i Fizjologii, Instytut Nauk o Życiu (stypendium Belgijskiego Narodowego Funduszu Badań Naukowych FNRS/FRIA).

4. Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. 65, poz. 595 ze zm.)

4.1 Tytuł osiągnięcia naukowego

Komórkowe systemy kontroli jakości białek w rozwoju i starzeniu się.

4.2PublikacjewchodzącewskładosiągnięcianaukowegoPublikacja 1 * pierwszy współautor Gazda L, Pokrzywa W*, Hellerschmied D, Loewe T, Forné I, Mueller-Planitz F, Hoppe T, Clausen T. (2013). The myosin chaperone UNC-45 is organized in tandem modules to support myofilaments formation in C. elegans. Cell, 1: 183-195. (IF2013 = 33.116, punkty MNiSW2017 = 50, cytowane 38 razy)


5

AutoreferatMój udział polegał na konceptualizacji hipotezy, planowaniu eksperymentów i protokołów. Wykonałem wszystkie eksperymenty in vivo zaprezentowane w publikacji. Wyniki przedstawiono na Rycinie 3, 6 i S6. Zinterpretowałem dane, współuczestniczyłem w pisaniu manuskryptu (tekst główny i sekcja materiały i metody) oraz przygotowałem panele do Rycin 3B-D, 6B-H i S6A-D. Swój udział w w/w publikacji oceniam na 40%. Publikacja 2 Bonizec M, Hérissant L, Pokrzywa W, Geng F, Wenzel S, Howard G.C, Rodriguez P, Krause S, Tansey W.P, Hoppe T, Dargemont C. (2014). The ubiquitin-selective chaperone Cdc48/p97 associates with Ubx3 to modulate monoubiquitylation of histone H2B. Nucleic Acids Research, 42: 10975-10986. (IF2014 = 9.112, punkty MNiSW2017 = 40, cytowane 7 razy) Mój udział polegał na przeprowadzeniu eksperymentów w ludzkich komórkach mięśniowych. Wyniki przedstawiono na Rycinie 5. Zinterpretowałem dane, współuczestniczyłem w pisaniu manuskryptu (sekcja materiały i metody) oraz przygotowałem panele do Ryciny 5. Swój udział w w/w publikacji oceniam na 20%. Publikacja 3 Segref A, Kevei E, Pokrzywa W, Mansfeld J, Schmeisser K, Livnat-Levanon N, Ensenauer R, Glickman M.H, Ristow M, Hoppe T. (2014). Pathogenesis of human mitochondrial diseases is modulated by reduced activity of the ubiquitin/proteasome-system. Cell Metabolism, 4: 642-652. (IF2014 = 17.565, punkty MNiSW2017 = 50, cytowane 49 razy) Mój udział polegał na planowaniu eksperymentów i ustanawianiu protokołów. Wykonałem testy stabilności/degradacji reporterów systemu ubikwityny/proteasom w liniach komórkowych MelJuSo. Wyniki przedstawiono na Rycinie 6. Zinterpretowałem dane, współuczestniczyłem w pisaniu manuskryptu (sekcja materiałów i metod) oraz przygotowałem panele do Ryciny 6A-D. Swój udział w w/w publikacji oceniam na 20%. Publikacja 4 Ackermann L, Schell M, Pokrzywa W, Gartner A, Schumacher B, Hoppe T. (2016). E4 ubiquitin ligase specific degradation hubs coordinate DNA double strand break repair and apoptosis. Nature Structural & Molecular Biology, 23: 995-1002. (IF2016 = 12.595, punkty MNiSW2017

= 45, cytowane 7 razy) Mój udział polegał na planowaniu eksperymentów i ustanawianiu protokołów. Wykonałem eksperymenty związane z ubikwitylacją in vitro. Wyniki przedstawiono na Rycinie 1. Zinterpretowałem dane, współuczestniczyłem w pisaniu manuskryptu (sekcja materiałów i metod) oraz przygotowałem panel dla Ryciny 1E. Swój udział w w/w publikacji oceniam na 20%.


6

AutoreferatPublikacja 5 * pierwszy współautor Riga T, Pokrzywa W*, Kevei E, Akyuz M, Balaji V, Adrian S, Hoehfeld J, Hoppe T. (2017). The ubiquitin ligase CHIP integrates proteostasis and aging by regulation of insulin receptor turnover. Cell, 169: 470-482. (IF2017 = 31.398, punkty MNiSW2017 = 50, cytowane 28 razy)

Mój udział polegał na konceptualizacji hipotezy, planowaniu eksperymentów i ustanawianiu protokołów. Przeprowadziłem eksperymenty interakcji i ubikwitylacji in vitro oraz większość eksperymentów in vivo. Wyniki przedstawiono na Rycinie 1, S1, S2, 3, S3, 5 i Rycinie S5. Zinterpretowałem dane, współuczestniczyłem w pisaniu manuskryptu (główny tekst oraz sekcja materiałów i metod) oraz przygotowałem panele do Rycin 1C, S1A i B, S2A i B, 3A, B, D, F, G i H, Ryciny S3B-E, 5E-I oraz Ryciny S5F i G. Przygotowałem również Rycinę 7 i streszczenie graficzne przedstawiające model zidentyfikowanego mechanizmu. Swój udział w w/w publikacji oceniam na 40%.

Publikacja 6 (publikacja z afiliacją mojego laboratorium) Koyuncu S, Saez I, Lee HJ, Gutierrez-Garcia R, Pokrzywa W, Fatima A, Hoppe T, Vilchez D. (2018). The ubiquitin ligase UBR5 suppresses proteostasis collapse in pluripotent stem cells from Huntington's disease patients. Nature Communications, 9:2886. (IF2018 = 12.353, punkty MNiSW2017 = 45, cytowane 3 razy) Mój udział polegał na planowaniu eksperymentów i protokołów. Brałem udział w eksperymentach dotyczących ubikwitylacji HTT. Wyniki przedstawiono na Rycinie 10E. Zinterpretowałem dane, współuczestniczyłem w pisaniu manuskryptu (sekcja materiały i metody) oraz udzieliłem krytycznych porad dla innych eksperymentów. Swój udział w w/w publikacji oceniam na 15%. Publikacja przeglądowa 1 (publikacja z afiliacją mojego laboratorium) * pierwszy współautor Kevei É, Pokrzywa W*, Hoppe T. (2017). Repair or destruction-an intimate liaison between ubiquitin ligases and molecular chaperones in proteostasis. FEBS Letters, 591: 2616-2635. (IF2017 = 2.999, punkty MNiSW2017 = 30, cytowane 5 razy) Mój udział polegał na zaprojektowanie i napisaniu manuskryptu, przygotowanie Rycin 1 i 2. Swój udział w w/w publikacji oceniam na 45%. Publikacja przeglądowa 2 (publikacja z afiliacją mojego laboratorium) * pierwszy współautor Balaji V, Pokrzywa W*, Hoppe T. (2018). Ubiquitylation pathways in insulin signaling and organismal homeostasis. BioEssays, 40: e1700223. (IF2015 = 4.419, punkty MNiSW2017=40, cytowane 2 razy)


7

AutoreferatMój udział polegał na zaprojektowanie i napisaniu manuskryptu. Swój udział w w/w publikacji oceniam na 45%. 4.3 Omówienie osiągnięcia naukowego – celów szczególnych i osiągniętych wyników Wstęp Proteostaza W żywym organizmie integralność sieci białek komórkowych jest stale zagrożona. Podwyższona temperatura, wytwarzanie reaktywnych form tlenu lub akumulacja wadliwych białek prowadzą do stresu cieplnego, oksydacyjnego i proteotoksycznego, który przesuwa równowagę konformacyjną białek w kierunku częściowo rozwiniętych i źle sfałdowanych stanów podatnych na agregację (Balchin et al., 2016; Buchberger et al., 2010; Dahl et al., 2015; Richter et al., 2010; Sala et al., 2017). Agregacja białek może zakłócać podstawowe procesy komórkowe powodujące ciężką patologię, w tym neurodegenerację i demencję (Choe et al., 2016; Douglas and Dillin, 2010; Woerner et al., 2016). Aby chronić proteom przed stresującymi warunkami, komórka wykorzystuje mechanizm, który rozpoznaje częściowo rozwinięte i źle sfałdowane białka i promuje ponowne fałdowanie lub, w przypadku uszkodzenia końcowego, ich degradację (Balchin et al., 2016; Buchberger et al., 2010; Popovic et al., 2014; Sala et al., 2017). Kluczowymi graczami w ochronie białek przed stresem są białka opiekuńcze (chaperony) i ich regulatorowe ko-chaperony. Wyczuwają rozwinięcie białka na podstawie ekspozycji jego powierzchni hydrofobowych, które normalnie są schowane w natywnej strukturze (Hartl et al., 2011; Mayer and Bukau, 2005). Wiązanie białek opiekuńczych zapobiega agregacji i kieruje uszkodzone białka na określone ścieżki fałdowania lub degradacji (Behl, 2016; Buchberger et al., 2010; Hartl et al., 2011; Kettern et al., 2010). W degradacji białek pośredniczy system ubikwityna-proteasom (UPS) i selektywna autofagia (Ciechanover, 2005; Khaminets et al., 2016; Popovic et al., 2014; Rubinsztein et al., 2012; Xie and Klionsky, 2007). System ubikwityny/proteasom Selektywna degradacja niepożądanych, nieprawidłowo sfałdowanych lub aggregatów białkowych ma kluczowe znaczenie dla zachowania funkcjonalności komórki. Podstawowym modułem proteolitycznym mechanizmów utrzymujących homeostazę białkowa (proteostazę) w jest system UPS (Morimoto, 2008). Proteasom 26S jest wielokatalitycznym kompleksem proteazy składającym się z części regulatorowej 19S (RP) przenoszącej substraty do proteolitycznej części rdzenia (CP) 20S, gdzie ulegają rozkładowi na krótkie peptydy (Finley, 2009). Niechciane białka są kierowane do UPS przez kowalencyjne przyłączenie ubikwityny (Ub) do wewnętrznych


8

Autoreferatreszt lizyny poprzez wspólne działanie enzymów aktywujących ubikwitynę E1, enzymów koniugujących ubikwitynę E2 i ligaz ubikwitynowych E3 (Kerscher et al., 2006a; Komander and Rape, 2012; Kuhlbrodt et al., 2005). Zazwyczaj przyłączenie łańcucha ubikwityny (poliubikwitylacja) jest wystarczające do ukierunkowania białek substratowych na obrót proteasomalny (Komander and Rape, 2012). Ubiquitylacja jest procesem dynamicznym i odwracalnym, ponieważ enzymy deubikwitylujące (DUB) modulują rozmiar i topologię łańcuchów polubikwityny, a tym samym wpływają na los sprzężonego substratu. DUB, które wiążą się z proteasomem usuwają proteolityczne sygnały Ub (Lee et al., 2010) lub edytują topologię łańcuchów ubikwityny, aby wygenerować wydajniejsze sygnały degradacji (Kim et al., 2009; Kuhlbrodt et al., 2011). Ponadto, DUB katalizują przetwarzanie nieaktywnych prekursorów ubikwityny i ich recykling (Amerik et al., 1997; Sowa et al., 2009). Pomimo dużej liczby strukturalnie niespokrewnionych substratów, koniugacja ubikwityny jest niezwykle specyficzna. Ligazy ubikwityny (E3) stanowią największą grupę enzymów w szlaku UPS, co jest zasadniczo związane z ich kluczową rolą w wyborze substratów. Szczegółowa analiza kilku klas ligaz E3 doprowadziła do identyfikacji specyficznych substratów i szlaków molekularnych, które regulują (Kerscher et al., 2006a; Kuhlbrodt et al., 2005). Co ciekawe, zidentyfikowano podgrupę wyspecjalizowanych ligaz E3 kontrolujących jakość białek komórkowych (QC), które współpracują z różnymi chaperonami w celu rozpoznania, ubikwitylowania a tym samym degradacji szczególnie uszkodzonych białek (Ryc. 1).

Rycina 1. Ilustracyjna reprezentacja subkomórkowej lokalizacji różnych ligaz ubikwityny QC. Enzymy E3 QC działające w szlakach kontroli jakości (np. CHIP, Doa10, HUWE1, Listerin, Rsp5 i San1) i powiązane chaperony (w kolorze zielonym i szarym) są szeroko rozpowszechnione w większości przedziałów subkomórkowych, w tym w jądrze, cytoplazmie czy błonie plazmatycznej (Kevei et al., 2017)


9

AutoreferatSieć białek opiekuńczych Wraz ze wzrostem wielkości genomu obfitość czynników chroniących proteostazę w komórkach eukariotycznych została dostosowana do rosnącej złożoności proteomu (Powers and Balch, 2013). Mechanizmy utrzymujące proteostazę muszą radzić sobie z większym obciążeniem fałdowania białek przypisanym różnym organellom subkomórkowym, bardziej złożoną organizacją metabolizmu specyficznego dla typu komórkowego i unikalnymi stresami, z jakimi borykają się wielokomórkowe, złożone organizmy. Tak więc nie jest zaskakujące, że ludzka sieć białek utrzymujących protesotazę składająca się z białek opiekuńczych, i współopiekuńczych posiada ponad 300 różnych członków (Brehme et al., 2014). Molekularne chaperony pomagają białkom substratowym w uzyskaniu i utrzymywaniu ich aktywnej konformacji. W przypadku nieodwracalnych uszkodzeń chaperony kierują źle sfałdowane białka w kierunku wyspecjalizowanych systemów proteolitycznych komórki zależnych od lizosomów i proteasomów ((Kaushik and Cuervo, 2012; Kettern et al., 2010; Park and Cuervo, 2013). Klasy białek opiekuńczych są nazywane zgodnie z ich masą cząsteczkową (Hsp100, Hsp90, Hsp70, Hsp60, Hsp40 i małe białka szoku cieplnego) (Hartl et al., 2011) i tworzą różne podgrupy w oparciu o ich funkcję. Głównymi białkami opiekuńczymi u eukariontów są Hsp90 i Hsp70. Te chaperony zależne od ATP ulegają konstytutywnej ekspresji jak i ekspresji indukowanej stresem oraz współpracują z różnymi ko-chaperonami w celu rozpoznania, wiązania i fałdowania substratu (Nillegoda et al., 2015; Nillegoda et al., 2017; Tzankov et al., 2008; Zuehlke and Johnson, 2010). Systemy opiekuńcze Hsp70 i Hsp90 odgrywają ważna rolę w różnych organellach komórki eukariotycznej i regulują szereg procesów, w tym fałdowanie polipeptydów de novo oraz ponowne fałdowanie lub degradację nieprawidłowo sfałdowanych białek. Ponadto wykazują również aktywność dezagregacyjną, ułatwiającą translokację białek przez błony i przebudowę multimerycznych kompleksów białkowych (Craig and Marszalek, 2017; Zuiderweg et al., 2017). Hsp90 bierze również udział w regulacji wiązania receptor-ligand lub montażu kompleksów białkowych i jest zaangażowany w szlaki regulacyjne, takie jak naprawa DNA lub odpowiedź immunologiczna (Schopf et al., 2017). Szersza rola tego opiekuna jest dobrze odzwierciedlona przez liczbę jego substratów, gdzie Hsp90 oddziałuje z ponad 10% wszystkich białek komórkowych (Zhao et al., 2005). Tworzenie się sarkomerów oraz miofibryli stanowi doskonały przykład wzajemnego oddziaływania pomiędzy fałdowaniem a degradacją białek (Hoppe, 2009; Kim et al., 2008). Włączenie miozyny do włókien kurczliwych mięśni wymaga precyzyjnego mechanizmu zapewnionego dzięki współpracy chaperonów Hsp70 i Hsp90 z ko-chaperonem UNC-45 (Barral et al., 2002; Gazda et al., 2013; Kim et al., 2008a; Srikakulam and Winkelmann, 2004).


10

AutoreferatFałdowanie i aktywność różnych podtypów miozyny są koordynowane i utrzymywana dzięki konserwatywnym białkom zawierającym domenę UCS (UNC-45/CRO1/She4p). Jednym z pierwszych poznanych białek UCS było białko UNC-45 obecne w nicieniu Caenorhabditis elegans. Badania nad UNC-45 wykazały jego kluczową role w organizacji włókien mięśniowych poprzecznie prążkowanych (Etard et al., 2007; Price et al., 2002; Wohlgemuth et al., 2007). Początkowo zauważono, że mutacje w UNC-45 wywołują dezorganizację miofibryli i poważne wady ruchliwości C. elegans (Barral et al., 1998b; Barral et al., 2002; Venolia and Waterston, 1990b). Również w przypadku muszki owocówki czy Danio pręgowanego UNC-45 jest niezbędny do prawidłowego rozwoju mięśni (Etard et al., 2007; Etard et al., 2008; Melkani et al., 2011; Wohlgemuth et al., 2007). Ponadto homologi UNC-45 istnieją u wyższych kręgowców, co wskazuje na ewolucyjnie zachowany wymóg specyficznych dla miozyny ko-chaperonów (Price et al., 2002). Rzeczywiście, nieprawidłowa funkcja UNC-45 jest związana z powstawaniem miopatii (Janiesch et al., 2007b).

Rycina 2. Funkcja i regulacja UNC-45. (A) UNC-45 i Hsp90 są odpowiedzialne za zwijanie globularnej domeny głowy miozyny. B) UNC-45 może promować łączenie miozyny w włókna. C) Ilość UNC-45 jest ściśle regulowana przez ubikwitylację. D) UNC-45 i Hsp90 skanują włókna miozyny, aby ponownie zawinąć domeny, które rozwinęły się podczas skurczu. E) Za niski lub za wysoki poziom białka UNC-45 w mięśniu powoduje degradację miozyny przez system UPS. Uwaga: dla uproszczenia łańcuchy lekkie miozyny zostały pominięte na tym diagramie (Kachur and Pilgrim, 2008)

Zatem, UNC-45 zapewnia specyficzność substratową dla partnerskich białek opiekuńczych podczas etapów tworzenia się sarkomerów. W związku z tym poziom białka UNC-45 musi być precyzyjnie regulowany, aby nie kolidował z postępem fałdowania miozyny. Poziomy UNC-45 są kontrolowane przez proteolizę zależną od ubikwityny, w


11

Autoreferatktórej pośrednicza ligazy ubikwityny CHIP i UFD-2 oraz segregaza ubikwityny CDC-48/p97. Ten kompleks ubikwitylacyjny moduluje poziomy UNC-45 i koordynuje fałdowanie miozyny zarówno u C. elegans, jak i w ludzkich mioblastach (Hoppe et al., 2004b; Janiesch et al., 2007b), wskazując, że sieć utrzymująca proteostazę reguluje funkcjonowanie mięśni. Patologiczną konsekwencję zwiększonego poziomów UNC-45 w tworzeniu sarkomerów podkreśla obserwacja, że ludzki UNC45b jest silnie nad ekspresjonowana w odpowiedzi na niedokrwienną niewydolności serca (Stanley et al., 2007). Jednakże mechanizm molekularny UNC-45 w promowaniu fałdowania miozyny i składania jej w włókna kurczliwe nie został w pełni zrozumiany.

Chaperon UNC-45 jest zorganizowany w moduły tandemowe wspierające formowanie myofilamentów (Publikacja 1) Podczas gdy rola Hsp90 w fałdowaniu miozyny jest dobrze opisana w różnych organizmach (Du et al., 2008; Hawkins et al., 2008; Srikakulam et al., 2008), mechanizm działania UNC-45 jest mniej jasny. Aby wyjaśnić, w jaki sposób UNC-45 koordynuje zarówno składanie miozyny, jak i montaż włókien kurczliwych, nawiązaliśmy współpracę z laboratorium prof. Tima Clausena (IMP, Wiedeń) i połączyliśmy analizy biochemiczne i strukturalne z badaniami fizjologicznymi w C. elegans. Aby uzyskać wgląd w mechanistyczną rolę UNC-45, wykrystalizowaliśmy białko pełnej długości z C. elegans i określiliśmy jego strukturę krystaliczną w rozdzielczości 2.9 Å. Oprócz znanej N-końcowej domeny TPR, regionu centralnego i domeny C-końcowej UCS, struktura krystaliczna pełnej długości białka UNC-45 wykazała dodatkową domenę, którą nazwaliśmy „szyja”. Region szyi łączy domeny TPR i centralną z domeną UCS, które razem tworzą strukturę podobną do jamy ustnej (Ryc. 1). Co ciekawe, dodatkowe badania ko-krystalizacji wykazały, że Hsp70 i Hsp90 oddziałują z N-końcową domeną TPR, wskazując, że rzeczywiście oba białka opiekuńcze wspierają UNC-45 w fałdowaniu i składaniu miozyny (Ryc. 1).


12

Autoreferat

Rycina 1. Struktura monomeru i polimeru UNC-45. (A) Prezentacja protomeru UNC-45 pokazującego architekturę domen. Krystalizowany peptyd Hsp90 jest pokazany w trybie liliowym. Linie przerywane przedstawiają elastyczne pętle zawierające reszty 508–524 i 608–617. (B) Opiekun miozyny UNC-45 jest zorganizowany w moduły tandemowe. Widok zbliżenia interfejsu oligomeru UNC-45 przedstawiający złożony pakiet czterech helis i pozycji kluczowych w formowanie się oligomerów UNC-45.

Jednakże obserwacja, że UNC-45 może tworzyć łańcuchy różnej długości było najbardziej intrygującym odkryciem. UNC-45 tworzy liniowy łańcuch białkowy poprzez interakcję między regionem szyi i domeną TPR. Domena UCS nie bierze udziału w tworzeniu polimeru UNC-45 i wystaje ze szkieletu UNC-45, zapewniając okresową sekwencję miejsc wiązania miozyny. Multimeryczna organizacja strukturalna domen TPR i UCS zapewnia zatem funkcjonalną niezależność w wiążących współpracujących białek opiekuńczych i substratów dla UNC-45. Wiązanie Hsp70/90 z domeną TPR UNC-45 ułatwi skoordynowane zwijanie cząsteczek miozyny z określoną okresowością. Co ciekawe, odległość strukturalna między modułami tandemowymiUNC-45 pozwoliłaby im działać na dimeryczne głowy miozyny, w zwiniętych filamentach grubych mięśni (Ryc. 4B). Przewidywanie strukturalne, że multimeryczne łańcuchy UNC-45 pomagają w montażu i rozwoju sarkomerów mięśniowych, potwierdziliśmy używając organizm modelowy C. elegans. W tym celu skorzystaliśmy z wrażliwych na temperaturę mutacji (ts) unc-45 (allel m94), które indukują paraliż mięśniowy w robakach rosnących w temperaturze 25°C, spowodowany zaburzeniami w syntezie filamentów grubych miozyny oraz ogólną dezorganizację sarkomerów (Ao and Pilgrim, 2000; Barral et al., 1998a; Barral et al., 2002; Epstein and Thomson, 1974; Hoppe et al., 2004a; Kachur and Pilgrim, 2008; Venolia and

A

B


13

AutoreferatWaterston, 1990a). Używając robaki unc-45(m94) przeanalizowaliśmy, w jakim stopniu transgeniczna ekspresja różnych wariantów UNC-45 przywróciła (bądź nie) funkcjonalność mięśniową robaków unc-45(m94). Aby zbadać znaczenie multimeru UNC-45 dla integralności sarkomerów, w robakach unc-45(m94) ekspresjonowaliśmy mutanty UNC-45 L121W, V480R/V484R i DTPR (Ryc. 2A), które powinny być nie zdolne do formowania liniowych łańcuchów UNC-45. Ponieważ mutacje L121W i V480R/V484R nie wpływały na ogólną strukturę protomeru UNC-45 i jego oddziaływanie z Hsp90, wynikowy fenotyp powinien w szczególności odzwierciedlać konsekwencje z powodu zaburzonego tworzenia łańcucha UNC-45. Co ciekawe, mutant L121W i V480R/V484R, w przeciwieństwie do kontroli, nie był w stanie odwrócić defekt ruchowy mutanta unc-45 ts, o czym świadczy niska ruchliwość tych robaków (liczba zgięć ciała) w odpowiedzi na temperaturę 25°C (Ryc. 2B) oraz wadliwa organizacja sarkomerów mięśniowych wykazanych poprzez niską ilość filamentów grubych (Ryc. 2C). Podsumowując, analizy in vivo mutantów specyficznie blokujących oligomeryzację UNC-45 wyraźnie pokazały, że multimeryczne łańcuchy UNC-45 są krytyczne dla prawidłowej syntezyfilamentów miozyny w mięśniach C. elegans.

Rycina 2. Analiza funkcjonalna mutantów oligomeryzacji UNC-45. (A) Zbliżony widok interfejsu oligomeru z zaznaczonymi resztami, ważnymi dla oligomeryzacji UNC-45, takimi jak Val480, Val484 i Leu121 przedstawionymi jako pomarańczowe kule i ΔTPR otoczone ramką. (B i C) W celu oszacowania ratowania nieskoordynowanego fenotypu unc-45(m94), robaki unc-45(m94) ekspresjonujące różne warianty UNC-45 hodowano w temperaturze 25°C. Przedstawiono odpowiednio liczbę zgięć ciała i kwantyfikację ilości włókien miozynowych w sarkomerach. Struktura UNC-45 pozwoliła nam również na wizualizację potencjalnego miejsca wiązania miozyny, które jest długim kanionem obejmującym całą domenę UCS w sposób podobny do śruby (Ryc. 3A). W związku z tym domena UCS UNC-45 powinna preferować wiązanie w znacznym stopniu niesfałdowanych części miozyny, jak już sugerowano wcześniej (Srikakulam et al., 2008). W celu potwierdzenia obserwacji strukturalnych przeprowadziliśmy ponownie analizę in vivo mutantów UNC-45, które zniekształcają w różnym stopniu proponowany kanion wiążący miozynę w domenie UCS. Wprowadziliśmy

A B C


14

Autoreferatmutację N758Y, aby zablokować centralne przejście kanionu (najbardziej konserwatywny odcinek domeny UCS), mutację Y750W, aby zmodyfikować zewnętrzną krawędź kanału oraz delecję Δ602-630, aby zamknąć N- część końcowa kanału UCS poprzez usunięcie przedłużonej pętli obejmującej centralny kanion (Ryc. 3A). Jak uprzednio, mutanty N758Y, Y750W i Δ602-630 zostały ekspresjonowane w robakach unc-45(m94) i testowane pod kątem ich zdolności do ratowania zależnego od temperatury defektu ruchowego i ich możliwości interakcji z ciężkim łańcuchem miozyny (UNC-54). W przeciwieństwie do mutanta Y750W, który wciąż jest zdolny do wiązania miozyny i przywracania funkcji mięśniowej, mutanty N758Y i A602-630 nie ratują defektu w organizacji sarkomerów ani nie wiążą się z UNC-54 (Ryc. 3B-D). Ponieważ mutacje te nie wpłynęły na integralność strukturalną UNC-45, jak i zdolności do interakcji z Hsp90 (Ryc. 3D), wyniki te wyraźnie wskazują, że kanion UCS jest niezbędny do interakcji z wydłużonym segmentem peptydowym substratu miozyny in vivo.

Rycina 3. Interakcja UNC-45 z miozyną. (A) Model ukazujący domenę UCS używaną do wiązania miozyny przez UNC-45. Aby zilustrować położenie substratu, ligand peptydowy (zielony) nałożonej cząsteczki β-kateniny został przeniesiony na strukturę UNC-45. Okna powiększania zapewniają szczegółowy widok na mutacje Y750W i N758Y, funkcjonalnie powiązane reszty w β-kateninie i delecję Δ602-630. (B) W celu oszacowania poziomu odwrócenia paraliżu robaków unc-45(m94), robaki unc-45(m94) produkujące wskazane warianty UNC-45 hodowano w temperaturze 25°C i liczono zgięcia ciała. (C) Immunobarwienie robaków unc-45(m94)


15

Autoreferathodowanych w 25°C ekspresjonujących UNC-45 Y750W, N758Y lub D602–630. (D) Interakcja wariantów UNC-45 z chaperonem Hsp90 i miozyną UNC-54. Miozyna UNC-54 i Hsp90 były koimmunoprecypitowane wraz z UNC-45 z lizatów komórkowych wskazanych robaków. Oddziaływania białek oceniano za pomocą analizy Western blot przy użyciu przeciwciał specyficznych dla UNC-54, Hsp90 i UNC-45. Nasze dane sugerują, że multimer UNC-45 tworzy wielostanowiskową platformę dokującą chaperony Hsp70 i Hsp90 do działania w regularnych pozycjach na niesfałdowanej miozynie. System UNC-45 idealnie nadaje się do montażu regularnych filamentów grubych w sarkomerach, umożliwiając białku z pojedynczą domeną TPR na jednoczesne rekrutowanie opiekunów Hsp70 i Hsp90 w celu przeprowadzenia etapów fałdowania substratów (Ryc. 4A). Ponadto oferuje on właściwy odstęp około 170 Å w celu pracy z sąsiednimi cząsteczkami miozyny, których dimeryzowane domeny głowy są rozmieszczone z przybliżoną okresowością 145 Å w dojrzałych miofibrylach (Craig and Woodhead, 2006) (Ryc. 4B). Łańcuchy UNC-45 tworzą elastyczne linie montażowe, które powinny być zdolne do rozmieszczania domen motorycznych miozyny w układzie śrubowym wzdłuż grubej osi włókna, co jest warunkiem prawidłowego montażu grubych włókien i sarkomerów. Ta wcześniej nieopisana funkcja wzorcowania molekularnego powinna głównie zależeć od właściwości tworzących łańcuch jednostek UNC-45, a zatem leży u podstaw jego autonomicznej roli w organizacji sarkomerów. Rycina 4. Model fałdowania i inkorporowania miozyny w filamenty grube promowany przez tandemy UNC-45. (A) (Góra) UNC-45 (wskazane różne domeny), jego oligomery, Hsp70 (niebieski) i Hsp90 (fioletowy) stanowią podstawowe elementy składowe kompleksu składania miozyny. (Dół) Łańcuchy UNC-45 tworzą rusztowanie molekularne, które pozwala na jednoczesne wiązanie Hsp70, Hsp90 i miozyny, pośrednicząc w ten sposób w interakcjach między niesfałdowaną miozyną i jej białkami opiekuńczymi. (B) UNC-45 wymusza zwijanie miozyny w regularnych odstępach. W stanie rozluźnienia mięśni, dimeryczne głowy miozyny wystają z okresowością 145 Å z filamnetu grubego. Obserwowana okresowość między modułami tandemowymi UNC-45 (170 Å) dobrze pasuje do odstępu między protomerami sąsiednich par miozyny (110 do 220 Å), jak pokazano schematycznie w powiększonym oknie (miozyna w kolorze zielonym, pomarańczowe kółka symbolizują równe odstępy). Dzięki tej funkcji UNC-45 może bezpośrednio łączyć fałdowanie miozyny z jej inkorporacją w filamenty grube.


16

AutoreferatCdc48/p97 to chaperon selektywny wobec ubikwityny koordynujący rearanżację chromatyny z transkrypcją genów (Publikacja 2) Cdc48 i jego ssaczy homolog p97 to AAA-ATPaza i chaperon cytozolowy, który rozpoznaje i usuwa ubikwitylowane białka z kompleksów białkowych lub błon. Jedna z funkcji Cdc48/p97dotyczy regulacji ilość białka UNC-45 poprzez stymulacje jego degradacji (Janiesch et al., 2007a; Piccirillo and Goldberg, 2012). Konsekwentnie, mutacje w p97 są bezpośrednio związane z miopatią z ciałami inkluzyjnym (miopatia ciał inkluzyjnych związana z chorobą Pageta kości i otępieniem czołowo-skroniowym, zwana IBMPFD) powodująca zanik mięśni i formowanie się agregatów białkowych w mięśniu szkieletowym i mięśniu sercowym (Watts et al., 2004). Co więcej, zaburzona degradacja UNC-45 przez mutanty p97 związane z IBMPFD, prowadzi do dezorganizacji miofibryli w mięśniach chorujących jednostek (Janiesch et al., 2007a). W związku z tym wydaje się, że p97 reguluje poziomy UNC-45 podczas procesu różnicowania i ochrony filamentów grubych miozyny. Bezpośrednie wiązanie między p97 a ligazami ubikwityny UFD2 i CHIP (homologi robaczych UFD-2 i CHN-1) wskazuje na regulację składania miozyny przez ewolucyjnie zachowany kompleks p97/UFD2/CHIP (Kim et al., 2008b). Rzeczywiście, UFD2 i CHIP są również zaangażowane w tworzenie się mięśni serca i szkieletu (Mammen et al., 2011; Willis et al., 2008). Jednakże Cdc48/p97 jest ewolucyjnie zachowanym białkiem zależnym od ubikwityny zaangażowanym w szeroką gamę funkcji komórkowych, ze względu na jego zdolność do asocjacji z wieloma kofaktorami. Na przykład, polimerazy RNA II jest ubikwitylowana, gdy zatrzymuje się w miejscach uszkodzeń DNA indukowanych ultrafioletem i ekstrahowana z chromatyny przez segregację zależną od Cdc48 (Verma et al., 2011). Oprócz roli w usuwaniu polimerazy II RNA z chromatyny po uszkodzeniu DNA, niewiele wiadomo o tym, jak ta AAA-ATPaza jest zaangażowana w proces transkrypcji. Nasze wyniki wskazują na wieloaspektową rolę Cdc48/p97 w kontrolowaniu procesów transkrypcyjnych. Cdc48 oddziałuje przede wszystkim z ubikwitylowanymi białkami i działa jako selektywna segregaza ubikwityny w środowisku chromatyny jądrowej zarówno w komórkach drożdży, jak i wyższych komórek eukariotycznych (Dantuma and Hoppe, 2012). Drożdżowy histon H2B reprezentuje jeden z najliczniejszych celów ubiwkitylacji związanych z chromatyną (Sun and Allis, 2002). Co ciekawe, ubikwitylowany H2B (Ub-H2B) jest głównie związany z transkrybowanymi regionami genów, które charakteryzuje również obecność Cdc48. Zaobserwowaliśmy, że kompleksy Cdc48 są krytyczne dla utrzymania prawidłowych poziomów ubikwitylowanego H2B. Łącząc mutacje Cdc48 z delecją specyficznych dla H2B enzymów deubikwitylujących, Ubp8 i Ubp10, odkryliśmy, że Cdc48 stymuluje rekrutację lub aktywność maszyn ubikwitylacyjnych dla histonu H2B. W tej nowo opisanej funkcji Cdc48 pośredniczy specyficzny kofaktor z rodziny UBX, Ubx3.


17

AutoreferatCdc48 wraz z kofaktorem Ubx3 kontroluje ubikwitylację histonu H2B tym samym wpływając na dynamikę nukleosomów i organizację chromatyny. Ponadto, Cdc48 jest wymagane do ko-transkrypcyjnej rekrutacji kofaktora Lge1 do chromatyny. W odpowiedzi, Lge1 stymuluje ligazę ubikwityny Bre1 odpowiedzialną za ubikiwtylację H2B. Identyfikacja Cdc48 jako regulatora ubikwitylacji H2B w drożdżach skłoniła nas do przeanalizowania, czy funkcja ta jest zachowana w ewolucji. W celu ustalenia, czy p97 może wpływać na ubikwitylację H2B, komórki mysich mioblastów C2C12 potraktowaliśmy wzrastającymi dawkami N2, N4-dibenzylochinazolino-2,4-diaminy (DBeQ), selektywnego i odwracalnego, konkurencyjnego wobec ATP inhibitora p97 (Chou et al., 2011). Analiza densytometryczna wykazała, że stosunek Ub-H2B/H2B znacznie wzrósł po traktowaniu odpowiednio 5 i 10 µM DBeQ (Ryc. 1A). Aby potwierdzić, że hamowanie aktywności ATPazy p97 prowadziło do zwiększonego stosunku Ub-H2B/H2B, ubikwitylację H2B analizowano przy użyciu komórek U2OS eskpresjonujących indukowany tetracykliną dziki p97 lub nieaktywny mutant p97 E578Q (Ju et al., 2008). Podczas gdy ekspresja indukowanego tetracykliną p97 nie zmieniła ekspresji Ub-H2B, indukcja mutanta p97 E578Q doprowadziła do 4-krotnego wzrostu stosunku Ub-H2B/H2B (Ryc. 1B). Te eksperymenty pokazują, że aktywność ATPazy p97 jest kluczowa dla regulacji ubikwitylacji H2B. Biorąc pod uwagę, że ubikwitylacja H2B ma wpływ na różnicowanie się ludzkich mioblastów w miotubule, intrygującym faktem jest, iż mutacje p97 są związane z dominującą dziedziczną miopatią (IBMPFD) (Vethantham et al., 2012). W związku z tym przeanalizowaliśmy ubikwitylację H2B wraz z różnicowaniem pierwotnych mioblastów od pacjentów cierpiących na miopatię IBMPFD w porównaniu z mioblastami od osób zdrowych. Komórki pacjenta z miopatią zawierały mutację wysoce konserwatywnej pozycji R155H, która nie wpływa na aktywność ATPazową p97 (Hubbers et al., 2007; Weihl et al., 2009). Jak pokazano na Rycinie 1C, mutacja p97 R155H nie zmieniła znacząco różnicowania w miotubiny, na co wskazuje ekspresja markera MyoD. Jednak ubikwitylacja H2B zmalała we wczesnym różnicowaniu (48 h po indukcji różnicowania), a redukcja ubiwkitylacji H2B była znacznie opóźniona w komórkach pacjenta IBMPFD. Razem dane te pokazują, że p97 jest wymagana do kontrolowania odpowiedniego stosunku Ub-H2B/H2B w ludzkich komórkach mięśniowych.


18

Autoreferat

Rycina 1. p97 jest wymagany do prawidłowego poziomu ubikwitylacji H2B. (A) Hamowanie funkcji p97 przez traktowanie DBeQ wpływa na ubikwitylację histonu H2B. Mioblasty C2C12 traktowano wskazanym stężeniem DBeQ (5 i 10 µM) przez 2 godziny. Następnie całkowite lizaty komórkowe rozdzielono metodą SDS-PAGE i poddano analizie Western blot z przeciwciałami anty-p97, anty-H2B i anty-H2B-Ub. α-tubulinę zastosowano jako kontrolę ładowania. Analizę densytometryczną przeprowadzono za pomocą oprogramowania Image J, wyniki znormalizowano do warunków kontrolnych i wyrażono jako stosunek Ub-H2B/H2B. (B) Nadekspresja nieaktywnej formy p97 zwiększa poziom ubikwitylacji histonu H2B. Nadekspresję znakowanego myc::p97 lub nieaktywnego mutanta p97-E578Q w komórkach U2OS indukowano przez inkubację z tetracykliną (1 μg/ml) przez 16 godzin. Następnie, całkowite lizaty z niezindukowanych (-) i indukowanych tetracykliną (+) komórek rozdzielono przez SDS-PAGE i poddano analizie Western blot z przeciwciałami anty-Myc, anty-H2B-Ub i anty-H2B. α-tubulinę zastosowano jako kontrolę ładowania. Analizę densytometryczną przeprowadzono za pomocą oprogramowania Image J, wyniki znormalizowano do warunków kontrolnych i wyrażono jako stosunek Ub-H2B/H2B. (C) Spowolnione usuniecie Ub-H2 w czasie różnicowania pierwotnych ludzkich mioblastów IBMPFD. Lizaty kontrolnych i pierwotnych ludzkich mioblastów IBMPFD (MB) i odpowiadające wskazanej liczbie godzin po indukcji ich różnicowania (48 i 72 h) analizowano metodą Western blot przy użyciu przeciwciał, które rozpoznają wskazane białka. α-tubulinę zastosowano jako kontrolę ładowania. MT, zróżnicowane miotuby. Podsumowując, odkryliśmy, że udział Cdc48/p97 w ubikwitylacji H2B jest ewolucyjnie zachowanym zjawiskiem, które definiuje rearanżacje chromatyny modulującą globalnie transkrypcję, co jest istotne dla procesów rozwojowych, w tym różnicowania się mięśni. Podwyższony poziomu reaktywnych form tlenu spowodowany niewydolnością mitochondrialną zaburza degradację białek za pośrednictwem systemu ubikwityna/proteasom (Publikacja 3) UPS ma kluczowe znaczenie dla eliminacji uszkodzonych białek i utrzymania proteostazy komórkowej. W celu identyfikacji nowych czynników regulujących degradacje białek przez system UPS w organizmach wielokomórkowych, zastosowaliśmy sprawdzony test degradacji in vivo, który monitoruje nawet niewielkie defekty proteostazy u C. elegans (Segref and Hoppe, 2012; Segref et al., 2011). System ten opiera się na krótkotrwałych białkach fuzyjnych ubikwityny (zwanych substratami UFD) i był szeroko stosowany do


19

Autoreferatdefiniowania podstawowych mechanizmów i, co ważne, fizjologicznie istotnych ścieżek degradacji UPS w badaniach jednokomórkowych (Johnson et al., 1995; Richly et al., 2005). Robaki produkujące substrat UFD oparty na GFP, UbV-GFP pod kontrolą wszechobecnego promotora sur-5 nie wykazują zielonej fluorescencji ze względu na niskie poziomy białka fuzyjnego spowodowany przez poliubikwitylację N-końcowej ubikwityny i następującą szybką degradacją w proteasomach. Użyliśmy tego reporterowego szczepu do monitorowania defektów proteolitycznych, a tym samym stabilizacji sygnału GFP, w badaniach przesiewowych. Robaki wykorzystane do badań przesiewowych poza UbV-GFP, produkowały stabilne białko mCherry jako kontrolę wykluczająca zmiany transkrypcyjne i translacyjne. Dziesięć tysięcy robaków poddano mutagenezie przy użyciu metanosulfonianu etylu (EMS) i przeszukiwano w pokoleniu F2 pod kątem żywotnych, pozytywnych dla GFP mutantów o podwyższonych poziomach substratów UbV-GFP (Ryc. 1).

Rycina 1. Schemat badania przesiewowego opartego o mutagenezę nieukierunkowaną w celu identyfikacji genów zaangażowanych w obrót białkami za pośrednictwem UPS. (A) Zarys eksperymentów przesiewowych wykonanych na nicieniach C. elegans ekspresjonujących reporter UbV-GFP wraz z białkiem kontrolnym mCherry.

Nasze badania przesiewowe pokazały, że utrata funkcjonalnych białek IVD-1 i ACS-19 ogranicza degradację substratu UbV-GFP zależnej od ubikwityny (Ryc. 2A). IVD-1 jest ortologiem ludzkiej dehydrogenazy izowalerylo-CoA (IVD) (Mohsen et al., 2001), enzymu mitochondrialnego o określonej roli w szlaku katabolizmu leucyny. ACS-19 jest syntetazą acetylo-CoA, przewidywanym ortologiem ludzkiego ACSS2, enzymem cytozolowym, który katalizuje konwersję octanu do acetylo-COA wymaganą dla cyklu kwasów tłuszczowych w macierzy mitochondrialnej (Starai and Escalante-Semerena, 2004). Ponieważ IVD-1 i ACS-19 wydają się być powiązane z funkcjonalnością mitochondriów, jednym z powodów zmniejszenia aktywności UPS jest być może stres oksydacyjny związany z mitochondriami. Rzeczywiście, zaobserwowaliśmy, że usunięcie ivd-1 i acs-19 przez metodę RNAi spowodowało łagodny, ale znaczący wzrost poziomu reaktywnych form tlenu (ROS) w robakach, co było skorelowane z defektami degradacji substratu UFD (Ryc. 2B).


20

Autoreferat Rycina 2. Mutacje w ivd-1 i acs-19 indukują ROS i defekt degradacji UbV-GFP. (A) Zdjęcia fluorescencji i obrazowanie Nomarskiego nicieni typu dzikiego (WT) lub mutantów ivd-1(hh6) czy robaków typu dzikiego hodowanych na kontrolnych RNAi (ctrl (RNAi) lub płytkach ivd-1 (RNAi), analizowanych pod kątem stabilizacja UbV-GFP. Skala 100 μm. (B) Poziomy ROS w nicieniach typu WT traktowanych wskazanymi RNAi przez 48 godzin (kontrola, acs-19, ivd-1). Dane są średnimi pochodzącymi z dwóch niezależnych eksperymentów ± SEM; ∗∗∗ p ≤ 0,001. Ponieważ nasze obserwacje łączą produkcję ROS z defektami degradacji zależnymi od ubikwityny, stwierdziliśmy, że dysfunkcja mitochondriów może być przyczyną lub przyczyniać się do tych zaburzeń. Dlatego przeanalizowaliśmy stabilizację substratu UbV-GFP po usunięciu techniką RNAi kluczowych białek dla fosforylacji oksydacyjnej. Rzeczywiście, hamowanie funkcji łańcucha oddechowego lub zahamowanie rozczepiania się mitochondriów i jak i odpowiedzi mitochondrialnej UPR (odpowiedz białek niesfałdowanych) spowodowało silną stabilizację substratu UbV-GFP (wyniki nie pokazane). Ponadto, traktowanie antymycyną A i azydkiem sodu, dwoma związkami, o których wiadomo, że hamują czynność kompleksu oddechowego III i IV (Chen et al., 1999; Rotsaert et al., 2008) również spowodowało silną stabilizację UbV-GFP. Natomiast rotenon generujący ROS w kompleksie I wyłącznie w macierzy mitochondrialnej (Sena and Chandel, 2012) nie spowodował defektów w degradacji substratu UFD (wyniki nie pokazane). Tak więc stres oksydacyjny i metaboliczny w mitochondriach wpływa na zależny od ubikwityny obrót białkami w cytozolu. Ponieważ nasze dane sugerują, że stres mitochondrialny upośledza aktywność UPS u C. elegans, zapytaliśmy, czy ta obserwacja odzwierciedla zachowany ewolucyjnie związek między metabolizmem mitochondrialnym a komórkową proteostazą zależną od ubikwityny. Aby odpowiedzieć na to pytanie, użyliśmy linii komórkowych MelJuSo konstytutywnie produkujących substrat UFD lub reguły N-końca (Menendez-Benito et al., 2005). Podczas gdy N-końcowa ubikwityna służy jako sygnał degradacji dla substratu UFD, deubikwitylacja substratów reguły końca N definiuje okres półtrwania pozostałego białka, co jest związane z tożsamością jego reszty na końcu aminowym (Johnson et al., 1995;

A B


21

AutoreferatVarshavsky, 1992). Podobnie jak w przypadku robaków, traktowanie antymycyną A spowodowało silną stabilizację obu ubikwitylowanych substratów (Ryc. 3A). W rzeczywistości ten defekt degradacji białek można przywrócić przez dodanie przeciwutleniacza NAC, co wskazuje, że jest on oparty na zwiększonym poziomie ROS (Ryc. 3B). Mutacje w genie IVD kodującym ludzki ortolog IVD-1 powodują autosomalne zaburzenie recesywne zwane kwasicą izowalerianową (IVA). Byliśmy zainteresowani badaniem komórek pierwotnych pochodzących od pacjentów z IVA pod kątem wad zależnego od ubikwityny obrotu białkami. Co ciekawe, transfekcja fibroblastów IVA substratem reguły ujawniła silną stabilizację UbR-GFP, zwłaszcza w komórkach pacjenta IVA (c.IVS4 + 2T> C) (Ryc. 3C). Stabilizacja obserwowana w fibroblastach IVA (c.IVS4 + 2T> C) jest podobna do stabilizacji w kontrolnych fibroblastach traktowanych bortezomibem, inhibitorem aktywności proteasomów (Ryc. 3D). Te defekty UPS korelują ze zwiększonymi poziomami ROS w komórkach pacjentów (Ryc. 3E). Zatem, oprócz wcześniej zidentyfikowanej akumulacji metabolitów, pacjenci cierpiący na IVA wykazują również defekty w degradacji białek zależnej od ubikwityny, co koreluje ze stopniem upośledzenia enzymatycznego i patologią choroby. Podobne zaburzenie degradacji substratu odnotowano w komórkach od pacjentów z defektem w genie COX1 wpływającym na kompleks oddechowy I (G6930A) (Bruno et al., 1999). Wydaje się zatem, że zarówno u C. elegans jak i u ludzi dysfunkcja mitochondriów wpływa na aktywność UPS.

Rycina 3. Chorobotwórcze mutacje w ludzkich białkach mitochondrialnych zakłócają degradację za pośrednictwem UPS. (A) Linie komórkowe MelJuSo stabilnie ekspresjonujące substraty UbR-YFP lub UbG76V-YFP traktowano wstępnie przez 18 godzin etanolem jako kontrola (-) lub 100 μM antymycyną A (w etanolu), a następnie 100 μg/ml cykloheksymidu przez wskazane punkty


22

Autoreferatczasowe. Lizaty komórkowe analizowano metodą Western blot względem YFP i tubuliny. (B) Linie komórkowe z (A) wstępnie potraktowano H2O (-) lub wskazanymi stężeniami N-acetylocysteiny (NAC), a następnie 18-godzinną inkubacją w 100 µM antymycyny A z lub bez NAC. Lizaty komórkowe analizowano jak w (A). (C i D) Pierwotne ludzkie kontrolne fibroblasty (C) i fibroblasty od pacjentów z niedoborem IVD (c.IVS4 + 2T> C) lub (c.932C> T) transfekowano substratem UbR-GFP lub UbG76V- GFP i mCherry jako kontrolę transfekcji. Lizaty komórkowe analizowano metodą Western blot wobec GFP, mCherry i tubuliny. (E) Zawartość mitochondrialnego ROS mierzono w komórkach fibroblastów opisanych w (C) stosując barwienie MitoSOX. Średnie intensywności fluorescencji znormalizowane do średniej fluorescencji mierzonej w kontrolnej linii komórkowej pokazano za pomocą SEM (c: 1,00 ± 0,04; c.IVS4 + 2T> C: 1,59 ± 0,06 (∗∗∗p ≤ 0,001); c.932C> T: 1,16 ± 0,06 (∗ p ≤ 0,05)); (nc = 166; nc.IVS4 + 2T> C = 139; nc.932C> T = 132). Podsumowując, zidentyfikowaliśmy ewolucyjnie zachowany związek między metabolizmem mitochondrialnym a proteostazą zależną od ubikwityny. Zmniejszona aktywność UPS podczas stanów patologicznych związanych z dysfunkcja mitochondriów może nasilać postęp choroby, a tym samym stanowi cenny cel interwencji terapeutycznej. Ligaza ubikwityny UFD-2 koordynuje proces naprawy DNA z odpowiedzią apoptotyczną (Publikacja 4) Pomimo dużej liczby strukturalnie niespokrewnionych substratów, koniugacja ubikwityny jest niezwykle selektywna. Ta selektywność jest dostarczana głównie przez ligazy ubikwityny (E3). E3 stanowią największą grupę białek w systemie UPS, co jest związane z ich kluczową rolą w wyborze substratów. Szczegółowa analiza kilku klas ligaz E3 zidentyfikowała specyficzne substraty i ścieżki molekularne, które regulują (Kerscher et al., 2006b; Kuhlbrodt et al., 2005). Oprócz białek E1, E2 i E3, które są zazwyczaj wystarczające do katalizowania ubikwitylacji substratu, zidentyfikowano dodatkowe czynniki wydłużające łańcuch polubikwitynowy i nazwano E4. Pierwszym zidentyfikowanym E4 jest białko drożdżowe Ufd2p, wymagane do wydajnej poliubikwitylacji modelowego substratu UPS i czynnika transkrypcyjnego SPT23 (Richly et al., 2005). Badania genetyczne i biochemiczne ujawniły, że Ufd2p wiąże poliubikwitylowane substraty w celu katalizowania dodawania dalszych grup ubikwityny co prowadzi do wydłużenia jej łańcucha, kluczowego do późniejszej degradacji tak znakowanych substratów (Koegl et al., 1999; Saeki et al., 2004). Zatem, Ufd2p definiuje nową aktywność enzymatyczną, wymaganą do późniejszej degradacji proteasomalnej. Białka Ufd2p występują w wielu organizmach jak drożdże, nicienie, myszy czy ludzie co sugeruje istnienie ewolucyjnie zachowanych, alternatywnych szlaków degradacji zależnych od E4. Inna ligaza ubikwityny nazwana CHIP również wykazuje aktywność E4 (Jiang et al., 2001; Murata et al., 2001). CHIP jest ligazą ubikwityny funkcjonującą głównie


23

Autoreferatw systemach kontrolującej jakość białek, ponieważ wraz z białkami opiekuńczymi reguluje równowagę między fałdowaniem białek a ich degradacją (Arndt et al., 2007a; Connell et al., 2001; Cyr et al., 2002). Co ciekawe, funkcjonalna interakcja między ortologami CHIP i Ufd2p, CHN-1 i UFD-2 łączy degradację ko-chaperonu UNC-45 z rozwojem włókien mięśniowych w nicieniu C. elegans (Hoppe et al., 2004b). W tym badaniu odkryliśmy proces zależny od ubikwityny, który ułatwia komunikację między naprawą DNA a odpowiedzią apoptotyczną. Zidentyfikowaliśmy UFD-2 jako centralny regulator do czasoprzestrzennej koordynacji obu procesów. Dwuniciowe pęknięcia DNA (DSB) są wysoce cytotoksyczne i wymagają złożenia kompleksów sygnalizacji uszkodzeń DNA i maszynerii naprawy DSB w miejscach pęknięć DNA (Hoeijmakers, 2001). W tkance rozrodczej C. elegans DSB są głównie usuwane przez rekombinację homologiczną (HR) (Clejan et al., 2006). Odpowiedź apoptotyczna ułatwia usuwanie komórek zarodkowych C. elegans, gdy DSB lub półprodukty rekombinacji nie są w nich naprawiane. Sygnalizacja uszkodzenia DNA prowadzi do aktywacji białka CEP-1, będącego robaczym homologiem p53, a następnie do indukcji apoptozy (Derry et al., 2001; Schumacher et al., 2001). Zatem apoptoza jest inicjowana tylko wtedy, gdy nieprawidłowe półprodukty rekombinacji lub indukowane promieniowaniem jonizującym DSB utrzymują się w komórkach tkanki rozrodczej. Pozostaje jednak niejasne, w jaki sposób aktywny proces naprawy koordynuje się z wykonaniem apoptozy, aby zapewnić wystarczający czas na usunięcie półproduktów HR. W celu identyfikacji nowych regulatorów odpowiedzi apoptotycznej na uszkodzenie DNA, wykonaliśmy badania przesiewowe w oparciu interferencję RNA (RNAi). RNAi zostało ukierunkowane na 770 genów, które są wysoce ekspresjonowane w tkance rozrodczej C. elegans (Ryc. 1A). Skupiliśmy się na tych genach, ponieważ u C. elegans apoptoza wywołana uszkodzeniem DNA występuje tylko w komórkach zarodkowych. Zidentyfikowaliśmy UFD-2 jako potencjalny kandydat regulujący odpowiedz apoptotyczną. RNAi przeciwko ufd-2 lub allel delecyjny ufd-2(tm1380) doprowadziły do zależnej od dawki promieniowania jonizującego redukcji apoptozy (Ryc. 1B).


24

Autoreferat Rycina 1. UFD-2 jest wymagany do wykonania apoptozy. (A) Schematyczna ilustracja badań przesiewowych RNAi w celu identyfikacji mediatorów apoptozy wywołanej uszkodzeniem DNA. Po traktowaniu RNAi robaki poddawano IR i oceniano pod kątem formowania się ciał apoptotycznych 24 godziny później (wskazanych przez wypełnione groty strzałek) używając mikroskopię DIC. (B) Reprezentatywne obrazy komórek z późnego pachytenu linii zarodkowej typu dzikiego C. elegans oraz mutanta ufd-2(tm1380) 24 godziny po traktowaniu IR. Wypełnione groty wskazują na apoptotyczne ciała. Pasek skali 5 µm. (C) UFD-2 tworzy skupiska po traktowaniu IR. Reprezentatywne obrazy linii zarodkowej robaków wskazanych genotypów napromieniowanych 60 Gy IR i wybarwionych przeciwciałem α-UFD-2 i DAPI. Wypełniony grot wskazywał jądro komórkowe z nagromadzonym UFD-2. Pasek skali, 5 µm. (D) odpowiadającą kwantyfikacją skupisk UFD-2 w pachytenowym obszarze linii zarodkowych. Dane pokazują średnie ± s.e.m. 12 niezależnych eksperymentów. Po zapoczątkowaniu homologicznej rekombinacji (HR) w DSB, UFD-2 tworzy skupiska (Fig. 1C), które zawierają również inne białka, w tym selektywną segregazę ubikwityny CDC-48, enzym deubikwitylacji ATX-3/Ataxin-3 i proteasom. Tworzenie się skupisk UFD-2 wymaga rekombinazy RAD-51, a ich obecność zachowuje się, aż rezolwazy połączenia Hollidaya (HJ) usuną pośrednie rekombinacje. W przypadku braku UFD-2, usunięcie ognisk naprawy DSB jest opóźnione, co wskazuje na nieefektywną naprawę. Tworzenie się skupisk UFD-2 zależy również od proapoptotycznego białka CEP-1, co sugeruje skomplikowaną koordynację między przetwarzaniem DSB a odpowiedzią apoptotyczną (Ryc. 2A).

A B

C D


25

Autoreferat

Rycina 2. Model przedstawiający sposób w jaki UFD-2 integruje naprawę DNA i sygnalizację apoptotyczną. UFD-2 koncentruje się późno po IR (rekrutując dodatkowo czynniki proteolityczne, takie jak CDC-48 i proteasom - nie pokazano), co jest zależne od aktywnej naprawy DNA i apoptotycznej sygnalizacji pod kontrolą CEP-1. Koncentracja UFD-2 w miejscach naprawy DNA jest regulowana przez inną ligazę E3 HECD-1 i enzym deubikwitylujący ATX-3. W późniejszych etapach po indukcji DSB, UFD-2 obsługuje dysocjację RAD-51 z miejsca DSB i pośredniczy w szlaku sygnałowym apoptozy. W tych badaniach udowodniliśmy centralną rolę UFD-2 w koordynacji procesu naprawy DNA z odpowiedzią apoptotyczną. Nie tylko podczas rekombinacji mejotycznej i naprawy DSB w komórkach zarodkowych, ale także podczas utrzymywania integralności tkanki po uszkodzeniu DNA, odpowiedź apoptotyczna wymaga szybkiego dostosowania do bieżącej aktywności procesów naprawy DNA, szczególnie gdy są one tak złożone, jak HR. Wady zarówno naprawy DNA, jak i apoptozy są szczególnie istotne w tworzeniu nowotworu. Zatem zrozumienie ewolucyjnie zachowanej roli UFD-2 w odpowiedzi na uszkodzenia DNA wywołane IR może otworzyć nowe kierunki terapeutyczne dla rozwoju leków przeciwnowotworowych. Ligaza ubikwityny CHIP moduluje szlak insulinowy i długowieczność (Publikacja 5) Komórka eukariotyczna jest stale konfrontowana z obsługą wadliwych, niesfałdowanych czy toksycznych białek. Eliminacja uszkodzonych białek jest prowadzona dzięki współpracy wyspecjalizowanych ligazy ubikwityny z białkami opiekuńczymi. Jak dotąd opisano tylko kilka kompleksów białek opiekuńczych i ligaz E3. Ilościowa analiza interakcji


26

Autoreferatbiałek sugeruje, że ponad 30% wszystkich ludzkich ligaz E3 oddziałuje z chaperonem Hsp90 (Taipale et al., 2014). Białko CHIP/STUB1 scharakteryzowano jako pierwszą ligazę ubikwityny E3 kontrolującą jakość innych białek co jest kluczowe dla sieci proteostazy komórkowej. CHIP wiąże chaperony molekularne Hsp70/Hsp90, aby koordynować równowagę komórkową między fałdowaniem białka a degradacją (Arndt et al., 2007b; Connell et al., 2001; Cyr et al., 2002; Murata et al., 2003; Petrucelli, 2004). W zgodzie z jego rolą w kontroli jakości białka, myszy z nokautem CHIP wykazują zmniejszoną długość życia związaną z patofizjologicznymi defektami związanymi z wiekiem (Min et al., 2008). Jednak myszy z delecją CHIP wykazują normalny rozwój zarodkowy i niezmieniony obrót wielu znanych substratów CHIP, co sugeruje redundancję funkcjonalną wśród ligaz E3 (Min et al., 2008; Morishima et al., 2008). Natomiast niedobór CHIP indukuje przyspieszone starzenie, co sugeruje istnienie co najmniej jednego krytycznego substratu specyficznego dla CHIP, który kontroluje długowieczność. Ostatnie obserwacje kwestionują koncepcję, że związany z wiekiem spadek aktywności szlaków kontroli jakości białek faktycznie inicjuje akumulację nieprawidłowo sfałdowanych białek i ostatecznie zapaść proteostazy i przyśpieszone starzenie (Walther et al., 2015). Aby wyjaśnić, w jaki sposób agregacja białek przyspiesza proces starzenia się, zajęliśmy się mechanistyczną regulacją sieci kontroli jakości białek z perspektywy organizmu i ligazy CHIP. Ze względu na fakt, że CHIP istnieje w wielu organizmach eukariotycznych, jego rola w regulacji starzenia może być ewolucyjnie zachowana. W naszych badaniach wykazaliśmy, że delecja robaczego genu chn-1 lub dCHIP u D. melanogaster (homologii ssaczego CHIP) skraca czas życia modelowych organizmów (Ryc. 1A, B). Interesującym jest, iż delecja chn-1, dCHIP lub CHIP w komórkach ludzkich prowadzi do stabilizacji receptora insuliny (INSR) i zwiększenia aktywności szlaku insuliny, prezentowanej jako wysoki poziom fosforylowanej formy kinazy AKT (Ryc. 1C, D). Starzenie się jest modulowane przez zmiany środowiskowe i fizjologiczne, obejmujące szlaki genetyczne, które są zachowane od komórek drożdży do organizmów ssaków. W szczególności szlak insuliny (IIS) przyczynia się do integralności proteomu komórkowego, a tym samym określa proces starzenia i początek chorób związanych z wiekiem. Receptor insuliny o nazwie DAF-2 u C. elegans lub INSR u ssaków reguluje aktywność różnych czynników transkrypcyjnych, w tym DAF-16/FOXO, HSF-1/HSF i SKN-1/Nrf, które kontrolują szlaki odpowiedzi na stres i długowieczność (Kenyon, 2010). Co ważne, wysoka aktywność szlaku insuliny zaburza metabolizm i skraca długość życia organizmów modelowych jak C. elegans czy D. melanogaster (Kenyon, 2010).


27

Autoreferat Rycina 1. CHIP wpływa na długość życia organizmów modelowych poprzez szlak insulinowy. (A) Robaki posiadające allel delecyjny chn-1(by155) lub chn-1(tm2692) wykazują krótką żywotność. (B) Usunięcie dCHIP przez RNAi powoduje skrócenie długości życia D. melanogaster. (C) Utrata dCHIP zwiększa ufosforylowanie kinazy AKT (S505, p-AKT) i stabilizuje dINSR (średnie wartości uzyskano w n = 5 niezależnych eksperymentach). (D) Usunięcie ligazy CHIP w komórkach HEK293 aktywuje fosforylację AKT (fosforylowany AKT [S473, p-AKT]). Kwantyfikacje są średnimi ± SEM otrzymanymi w n = 5 niezależnych eksperymentach. ∗ p <0,05, ∗∗ p <0,01 Ponieważ poziom receptora insuliny wzrósł w odpowiedzi na delecję dCHIP (Ryc. 1C), zastanawialiśmy się, czy oba białka bezpośrednio oddziałują ze sobą. Rzeczywiście, odkryliśmy, że CHN-1/CHIP wiąże się i ubikwityluje receptor insuliny DAF-2/INSR (Ryc. 2A). Udział w tym procesie chaperonów nie jest wymagany, co odróżnia regulację IIS od kontroli jakości białek wspomaganej przez chaperony. Regulacja DAF-2/INSR jest wysoce selektywna i nawet pokrewny receptor insulinopodobnego czynnika wzrostu 1 (IGF1R) nie jest celem CHIP (Ryc. 2A). Wykazaliśmy również, że DAF-2/INSR ulega stabilizacji w komórce w odpowiedzi na mutacje miejsc, które w normalnych warunkach są ubikwitylowane, albo przez zmniejszenie aktywności ligazy CHIP. W konsekwencji ubikwitylacja INSR indukuje jego degradacje w lizosomach, gdyż inhibicja szlaku endocytarno-lizosomalnego przez traktowanie komórek ludzkich chlorochiną prowadzi do stabilizacji INSR (Ryc. 2B).

A B

C D


28

Autoreferat

Rycina 2. Ubikwitylacja za pośrednictwem CHIP inicjuje degradację endocytarną INSR. (A) CHIP specyficznie ubikwityluje INSR. Przeprowadzono reakcje ubikwitylacji IGF1R i INSR, jak wskazano, przy użyciu CHIP jako ligazy ubikwityny. Detekcja ubikwitylowanych form INSR lub IGF1R była przeprowadzona przy użyciu metody Western blot i przeciwciał anty-INSR lub anty-IGF1R. (B) Reszta lizyny 1047 (K1047), zlokalizowana w domenie cytoplazmatycznej INSR, jest wymagana do ubikiwtylacji i lizosomalnej degradacji receptora. Komórki HEK293 transfekowano przez 48 godzin plazmidami do ekspresji INSR i INSR-K1047R lub pustym wektorem i traktowano 100 µM chlorochiny (hamowanie degradacji lizosomów) przez 16 godzin przed lizą, jak wskazano. poziom INSR i CHIP analizowano metodą Western blot i przeciwciałami anty-INSR i anty-CHIP. α-tubulinę zastosowano jako kontrolę ładowania. Kwantyfikacje są średnimi ± SEM otrzymanymi w n = 5 niezależnych eksperymentach. ∗ p <0,05, ∗∗ p <0,01 Aby potwierdzić ścisłą zależność między proteostazą zależną od CHIP a regulacją długości życia, zbadaliśmy wpływ stresu proteotoksycznego na stabilność proteomu i długowieczność. Zaobserwowaliśmy, że robaki pozbawione chn-1 są bardzo wrażliwe na stres oksydacyjny (wywołany parakwatem), zwłaszcza w późnych stadiach dorosłości. Zgodnie z tą obserwacją usunięcie dCHIP prowadzi do dramatycznej akumulacji oksydacyjnie uszkodzonych białek u starszych much. Co interesujące, stres oksydacyjny powoduje stabilizację receptora insulinowego, co jest najprawdopodobniej wynikiem ograniczonej aktywności ligazy ubikwityny koncentrującej się na usuwaniu uszkodzonych białek, ponieważ degradacja INSR została przywrócona przez nadekspresję CHIP (Ryc. 3A, B). Nasza obserwacja może mieć związek z faktem zaburzenia homeostazy białkowej wraz ze starzeniem się, a tym samym ze zwiększaniem się ilości źle sfałdowanych białek i ich toksycznych agregatów (Powers et al., 2009; Vilchez et al., 2014a), co przekierowałby aktywność CHN-1/CHIP w kierunku ich degradacji. Rzeczywiście, nadekspresja podatnych na agregację ciągów poliglutaminowych (poliQ) sprzyja rekrutacji CHIP, tym samym

A B


29

Autoreferatzmniejszając wolną pulę E3. W konsekwencji, wraz z wiekiem, aktywność CHIP jest przesunięta z regulacji IIS do wspomaganego przez chaperony systemu kontroli jakości białek. Ta zmiana preferencji substratowych ligazy CHIP powoduje stabilizację INSR związanego z błoną, zwiększenie aktywność szlaku insuliny a tym samym zmniejszoną ekspresję genów związanych z długowiecznością (Ryc. 3 C, D). Rycina 3. Regulacja stabilności INSR konkuruje z degradacją uszkodzonych białek. (A) Traktowanie parakwatem prowadzi do znaczącej stabilizacji dINSR (średnie wartości uzyskano w n = 3 niezależnych eksperymentach). (B) Stres oksydacyjny wywołany parakwatem powoduje stabilizację INSR w komórkach HEK293, co jest kompensowane przez nadekspresję CHIP (średnie wartości uzyskano w n = 5 niezależnych eksperymentach). (C) CHIP rekrutuje się do ciał inkluzyjnych utworzonych przez podatne na agregację poliQ-103 w komórkach HeLa, zobrazowanych za pomocą mikroskopii konfokalnej. Pasek skali reprezentuje 10 μm. (D) Ekspresja podatnego na agregację poliQ-103 w komórkach HEK293 powoduje stabilizację INSR, ale nie stabilizację IGF1R (średnie wartości określono w n = 5 niezależnych eksperymentach). Podsumowując, CHIP odpowiada za skomplikowaną równowagą między proteostazą a długowiecznością. W normalnych warunkach CHIP zapewnia zdrowy proteom poprzez regulację ilości nieprawidłowo sfałdowanych białek oraz receptora insuliny DAF-2/INSR. Jednak stres lub starzenie się rekrutuje większość dostępnego CHIP do szlaków

A B

D C


30

Autoreferatkontrolujących jakość pozostałych białek i degradacje toksycznych ich agregatów co ostatecznie prowadzi do nadaktywności szlaku insulinowego, w związku z zaburzona degradacją a tym samym akumulacją receptorów insuliny. Konsekwencją jest zapaści proteostazy i skrócenia długości życia. Dodatkowo, zwiększony poziom DAF-2/INSR i nadaktywacja IIS obniża transkrypcję genów odpowiedzi na stres, co jeszcze bardziej przyspiesza proces agregacji uszkodzonych białek i starzenie się komórek (Ryc. 4). Rycina 4. Model wzajemnego regulowania proteostazy i długowieczności. Związany z błoną DAF-2/INSR wyzwala IIS, a tym samym dostosowuje reakcję na stres i długość życia. W normalnych warunkach (bez stresu) CHIP wiąże DAF-2/INSR, aby inicjować endocytarno-lizosomalny obrót receptora poprzez jego ubikwitylację. W warunkach stresu proteotoksycznego i starzenia aktywność CHIP jest ukierunkowana na szlak kontroli jakości białek w celu degradacji uszkodzonych białek i ich agregatów. Tak więc utrzymanie proteomu konkuruje z ubikwitylacją i degradacją INSR, co z kolei wpływa na aktywność IIS, metabolizm i długość życia. Ligaza ubikwityny UBR5 jest modulatorem wydajnej proteostazy indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (Publikacja 6) Podczas gdy sieci transkrypcyjne, epigenetyczne i sygnalizacyjne pluripotencji były głównym celem wysiłków badawczych, nowe dowody wskazują, że pluripotencjalne komórki macierzyste wykazują również wewnętrzne mechanizmy bardzo skutecznie chroniące ich proteostazę (Buckley et al., 2012; Garcia-Prat et al., 2017; Noormohammadi et al., 2016; Vilchez et al., 2012b). W związku z tym wszechstronne zrozumienie mechanizmów tak skutecznie utrzymujących proteostazę może być konieczne, aby w


31

Autoreferatpełni wykorzystać możliwości pluripotencjalnych komórek macierzystych w medycynie regeneracyjnej. Jako nieocenione źródło generowania ostatecznie zróżnicowanych komórek (np. neuronów), pluripotencjalne komórki macierzyste mogą ułatwiać badania chorób ludzkich i badań przesiewowych leków. Jest to szczególnie obiecujące w kontekście zaburzeń związanych z proteostazą. Co najmniej 30 różnych ludzkich chorób jest bezpośrednio związanych z nieprawidłowym fałdowaniem się białek, ich degradacją i agregacją (Cuanalo-Contreras et al., 2013). Podczas gdy zapaść w proteostazie komórek somatycznych może leżeć u podstaw tych chorób, pluripotencjalne komórki macierzyste wykazują uderzającą zdolność do korygowania i tłumienia niedoborów proteostazy. Jednak proces ich różnicowania zmienia właściwości mechanizmów utrzymujących proteostazę, co w konsekwencji zmniejsza zdolność zróżnicowanych komórek do podtrzymywania integralności ich proteomu (Garcia-Prat et al., 2017; Noormohammadi et al., 2017; Vilchez et al., 2014b). Ponadto komórki postmitotyczne i progenitorowe, a także somatyczne komórki macierzyste, z wiekiem wykazują spadek aktywności chaperonów i procesów proteolitycznych białek (Garcia-Prat et al., 2017; Lopez-Otin et al., 2013; Vilchez et al., 2014a). Takie zaburzenia proteostazy są związane z wystąpieniem chorób związanych z wiekiem, takich jak choroba Alzheimera, Parkinsona i Huntingtona (HD) (Lopez-Otin et al., 2013; Powers et al., 2009). Zatem badanie pluripotencjalnych komórek macierzystych może przyczynić się do identyfikacji wyspecjalizowanych mechanizmów proteostazy tych komórek, które mogłyby być naśladowane w tkankach somatycznych w celu złagodzenia patologii. HD jest śmiertelnym zaburzeniem neurodegeneracyjnym charakteryzującym się deficytami poznawczymi, psychozą i dysfunkcją ruchową. Choroba jest dziedziczona w sposób dominujący i jest spowodowana mutacjami w genie huntingtyny (HTT), co przekłada się na powielenie powtórzeń aminokwasu glutaminy (poliQ) w strukturze białka (Finkbeiner, 2011). Białko HTT posiadające powielenie poliQ jest podatne na agregację, a rodzaj nagromadzenia się zmutowanych HTT (włókien czy oligomerów pośrednich HTT utworzonych podczas procesu agregacji/dezagregacji) przyczynia się do neurodegeneracji (Bates, 2003; Finkbeiner, 2011; Zuccato et al., 2010). Jednak patologiczne poliQ nie wpływa na przeżycie, samoodnawianie i pluripotencję indukowanych pluripotencjalnych komórkek macierzystych (iPSC) pochodzących od pacjentów HD (HD-iPSC), które mogą się rozmnażać w nieskończoność jako kontrolne iPSC (Consortium, 2012; Park et al., 2008). Wyniki te wskazują, że iPSC mają ulepszone mechanizmy utrzymywania proteostazy w obecności zmutowanego HTT. Analiza asocjacyjna całego genomu wykazała, że zmiany genetyczne w regionie chromosomu zawierającego gen UBR5 kodujący ligazę ubikwityny przyspieszają kliniczny


32

Autoreferatpoczątek HD (Genetic Modifiers of Huntington's Disease, 2015). Ponadto, utrata UBR5 zmniejsza ubikwitylację białka HTT w ludzkiej linii komórkowej (Yau et al., 2017). Tak więc zwiększona endogenna ekspresja UBR5 mogłaby odpowiadać za proteostazę i regulacją poziomu toksycznego HTT w pluripotencjalnych komórkach macierzystych.

Rycina 1. Poziom UBR5 zmniejszają się podczas różnicowania iPSC. Western blot poziomów UBR5 w liniach kontrolnych # 1 (A) HD Q71 # 2 (B) iPSC w porównaniu z ich neuronalnymi komórkami progenitorowymi (NPC) i odpowiednikami neuronów. Wykresy przedstawiają względne wartości procentowe UBR5 dla odpowiednich iPSC skorygowanych o kontrolę β-aktyny (średnia ± s.e.m. z trzech niezależnych doświadczeń dla każdej linii komórkowej).

Ponieważ komórki iPSC wykazują zwiększoną aktywność proteasomu (Vilchez et al., 2012a), wysnuliśmy hipotezę, że komórki te posiadają również nadaktywna sieć ligaz ubikwityny do regulacji proteostazę np. HTT z rozszerzonym poliQ. Rzeczywiście, odkryliśmy, że iPSC mają zwiększony poziom ligazy UBR5, który jest związany z efektywną degradacją dzikiego jak i zmutowanego białka HTT (Ryc. 1A, B, 2A-C). Warto zauważyć, że upośledzenie degradacji zmutowanych HTT w związku z obniżeniem poziomu UBR5 powoduje nagromadzenie agregatów poliQ w HD-iPSC (Fig. 2A-C). Na poparcie bezpośredniej roli UBR5 w modulacji HTT, zaobserwowaliśmy, że nadekspresja UBR5 zmniejsza poziom białka zmutowanej HTT (dane nie pokazane). Podsumowując, nasze dane wskazują, że aktywność ligazy ubikwityny UBR5 moduluje degradację proteasomalną zmutowanej HTT, procesu, który łagodzi agregację zależna od rozszerzeń poliQ.

A B


33

Autoreferat Rycina 2. Utrata UBR5 zwiększa poziom toksycznego białka HTT w iPSC. (A) Analiza Western blot wskazanych kontrolnych linii iPSC z przeciwciałami przeciwko białkom HTT i ekspandowanym poliQ. Traktowanie inhibitorem proteasomu: 5 µM MG-132 przez 12 godzin. Wykresy przedstawiają względne wartości procentowe HTT dla traktowanych DMSO NT shRNA iPSC skorygowanych o kontrolę ładowania β-aktyny (średnia ± s.e.m. z trzech niezależnych eksperymentów). (B) Analiza Western blot linii Q71-iPSC HD # 2 po usunięciu UBR5. Wykresy przedstawiają względne wartości procentowe traktowanych DMSO NT shRNA iPSC (skorygowanych względem β-aktyny) HTT i zmutowane HTT wykrytych za pomocą przeciwciał przeciwko całkowitym białkom HTT i ekspandowanym poliQ (średnia ± s.e.m. z czterech niezależnych doświadczeń). Traktowanie inhibitorem proteasomu: 5 µM MG-132 przez 12 godzin. (C) Immunocytochemia kontrolnej linii iPSC # 1 (Q21), kontrolnej linii iPSC # 2 (Q33) i linii HD Q71-iPSC # 1 po usunięciu UBR5. Barwienie poliQ i Hoechst 33342 zastosowano odpowiednio jako markery agregatów i jąder komórkowych. Pasek skali reprezentuje 10 μm. Obrazy reprezentują cztery niezależne eksperymenty. Pod wpływem tych odkryć sprawdziliśmy, czy modulacja poziomem UBR5 wpływa na agregację rozszerzeń poliQ w modelu zwierzęcym. Ponieważ neurony pochodzące z HD

A

B

C


34

AutoreferatiPSC pozbawione są agregatów nawet po zahamowaniu proteasomu, ocenialiśmy nicienie C. elegans, które gromadzą agregaty poliQ. Zaobserwowaliśmy, że delecja UBR5 (ubr-5 RNAi) przyspiesza szkodliwe zmiany indukowane przez ekspresję rozszerzeń poliQ w robakach, zapewniając bezpośredni dowód związku między aktywnością UBR5 i agregacją rozszerzeń poliQ (Fig. 3A, B). Rycina 3. Utrata UBR5 przyspiesza agregację i neurotoksyczność w robaczym modelu HD. (A) Utrata UBR-5 (ubr-5 RNAi) spowodowała zwiększenie poziomu poliQ (Q67) z towarzyszącą agregacją. Reprezentatywne obrazy agregacji Q67-YFP w odpowiedzi na ubr-5 RNAi w dorosłych robakach. (B) Powiększenie neuronów odcinka głowowego C.elegans uwidaczniające poziom agregacji poliQ w odpowiedzi na utratę UBR-5. Obrazy reprezentują pięć niezależnych eksperymentów. Pasek skali reprezentuje 100 μm. Białe strzałki i czerwone strzałki wskazują odpowiednio pierścień nerwowy i procesy chemosensoryczne. DIC, kontrast interferencji różnicowej Chociaż nasze wyniki sugerują specyficzność UBR5 w regulacji HTT, nie możemy odrzucić jego ogólnej roli w proteostazie innych białek podatnych na agregację. Rzeczywiście, obniżenie poziomu UBR5 jest wystarczające do wywołania znacznej akumulacji białek (formowanie agresomów) w kontrolnych ludzkich zarodkowych komórkach macierzystych (hESC) jak i w komórkach iPSC w odpowiedzi na stres (temperatura 42 °C). Ponieważ agresomy powstają z akumulacji nieprawidłowo sfałdowanych różnych białek, gdy systemy proteolityczne są niewydolne, UBR5 może również uczestniczyć w degradacji uszkodzonych białek wynikających z normalnego metabolizmu iPSC (Fig. 4).

A B


35

Autoreferat Rycina 4. Utrata UBR5 powoduje tworzenie się agresomów w pluripotencjalnych komórkach macierzystych. Barwienie agresomów w komórkach hESC H9 i iPSC # 2 (na czerwono). Barwienie Hoechst 33342 zastosowano jako marker jąder komórkowych (na niebiesko). Stres cieplny: 42°C przez 4 godziny. Pasek skali reprezentuje 10 μm. Obrazy są reprezentatywne dla dwóch niezależnych eksperymentów dla każdej linii. Podsumowując, nasze badania na nieśmiertelnych pluripotencjalnych komórkach macierzystych zidentyfikowały ligazę ubikwityny UBR5 jako wyznacznik wysoce efektywnego mechanizmu utrzymującego ich proteostazę komórkową. Podsumowanie Publikacja 1 * pierwszy współautor Gazda L, Pokrzywa W*, Hellerschmied D, Loewe T, Forné I, Mueller-Planitz F, Hoppe T, Clausen T. (2013). The myosin chaperone UNC-45 is organized in tandem modules to support myofilaments formation in C. elegans. Cell, 1: 183-195. (IF2013 = 33.116, punkty MNiSW2017 = 50, cytowane 38 razy) Aktywność i składanie różnych podtypów miozyny są koordynowane przez białka zawierające domenę UCS. Jednym z pierwszych opisanych członków rodziny UCS jest białko UNC-45 obecne w nicieniu Caenorhabditis elegans, niezbędne do organizacji filamentów grubych miozyny w mięśniach. Nasze wyniki strukturalne i biochemiczne wykazały, że UNC-45 tworzy łańcuch białkowy o określonej okresowości domen odpowiedzialnych za odziaływanie z miozyna jak i chaperonami. Co ciekawe, łańcuch UNC-45 służy jako platforma dokująca i fałdująca dla cząsteczek miozyny, która sprzyja uporządkowanemu włączeniu nowych jednostek miozyny do rosnących włókien kurczliwych mięśni.


36

AutoreferatPublikacja 2 Bonizec M, Hérissant L, Pokrzywa W, Geng F, Wenzel S, Howard G.C, Rodriguez P, Krause S, Tansey W.P, Hoppe T, Dargemont C. (2014). The ubiquitin-selective chaperone Cdc48/p97 associates with Ubx3 to modulate monoubiquitylation of histone H2B. Nucleic Acids Research, 42: 10975-10986. (IF2014 = 9.112, punkty MNiSW2017 = 40, cytowane 7 razy) Cdc48/p97 jest ewolucyjnie zachowanym białkiem opiekuńczym zależnym od ubikwityny, zaangażowanym w szeroką gamę funkcji komórkowych ze względu na jego zdolność do asocjacji z wieloma kofaktorami. W naszych badaniach pokazujemy, że Cdc48 moduluje ekspresję genów poprzez rekrutację do chromatyny w sposób sprzężony z transkrypcją. Tam Cdc48 wraz z kofaktorem Ubx3 kontroluje ubikwitylację histonu H2B, modyfikacji regulującej dynamikę nukleosomów i organizację chromatyny. Wpływ Cdc48/p97 na poziom ubikiwtylacji H2B jest kluczowy w procesie rearanżacji chromatyny i wpływa na różnicowanie komórkowe. Publikacja 3 Segref A, Kevei E, Pokrzywa W, Mansfeld J, Schmeisser K, Livnat-Levanon N, Ensenauer R, Glickman M.H, Ristow M, Hoppe T. (2014). Pathogenesis of human mitochondrial diseases is modulated by reduced activity of the ubiquitin/proteasome-system. Cell Metabolism, 4: 642-652. (IF2014 = 17.565, punkty MNiSW2017 = 50, cytowane 49 razy) Molekularne podstawy szkodliwych skutków nadmiernego tworzenia się reaktywnych form tlenu (ROS) są nadal niewystarczająco poznane. W tych badaniach zidentyfikowaliśmy powiązanie między funkcjonalnością mitochondriów a zaburzeniami funkcji systemu ubikwityny-proteasom. Poza tym zaobserwowaliśmy defekty proteolityczne zależne od ubikwityny w wypadku wywołujących choroby mutacji w genach IVD i COX1 związanych z niewydolnością mitochondrialną u ludzi. Nasze wyniki pokazują ewolucyjnie zachowany związek między metabolizmem mitochondrialnym, generacja ROS a proteostazą zależną od ubikwityny. Publikacja 4 Ackermann L, Schell M, Pokrzywa W, Gartner A, Schumacher B, Hoppe T. (2016). E4 ubiquitin ligase specific degradation hubs coordinate DNA double strand break repair and apoptosis. Nature Structural & Molecular Biology, 23: 995-1002. (IF2016 = 12.595, punkty MNiSW2017

= 45, cytowane 7 razy) Naprawa pęknięć dwuniciowych DNA (DSB) wymaga ścisłej regulacji z odpowiedzią na uszkodzenie DNA, która pośredniczy w indukcji śmierci apoptotycznej uszkodzonych komórek. Ubikwitylacja wielu białek w miejscach DSB reguluje procesy rozpoznawania uszkodzeń i naprawy. Jednakże czasoprzestrzenna kalibracja naprawy DNA i odpowiedzi apoptotycznej pozostaje słabo poznana. W czasie tych badań zidentyfikowaliśmy ligazę ubikwityny UFD-2 jako kluczowa dla koordynacji między procesem naprawy DNA a odpowiedzią apoptotyczną w tkance rozrodczej.


37

AutoreferatPublikacja 5 * pierwszy współautor Riga T, Pokrzywa W*, Kevei E, Akyuz M, Balaji V, Adrian S, Hoehfeld J, Hoppe T. (2017). The ubiquitin ligase CHIP integrates proteostasis and aging by regulation of insulin receptor turnover. Cell, 169: 470-482. (IF2017 = 31.398, punkty MNiSW2017 = 50, cytowane 28 razy) Mechanistyczne zasady leżące u podstaw zaburzenia proteostazy i jej wpływ na oczekiwaną długość życia nie są dobrze poznane. W tym manuskrypcie opisujemy, że na tę zależność wpływa ubikwitylacja receptora insuliny przez ligazę ubikiwtyny CHIP, która tym samym kontroluje aktywność szlaku insulinowego, który znacząco wpływa na długość życia komórek i organizmów. W normalnych warunkach (bez stresu) CHIP wiąże DAF-2/INSR, aby inicjować endocytarno-lizosomalny obrót receptora poprzez jego ubikwitylację. Jednak w warunkach stresu proteotoksycznego i starzenia się niemal cała aktywność CHIP jest ukierunkowana na szlak kontroli jakości białek w celu degradacji uszkodzonych białek i ich agregatów. Tak więc utrzymanie proteomu konkuruje z ubikwitylacją i degradacją INSR, co z kolei wpływa na aktywność szlaku insulinowego a tym samym długość życia. W świetle tych ustaleń przedstawiamy nową koncepcję zrozumienia wpływu braku równowagi w proteomie komórkowym na żywotność organizmów. Publikacja 6 (publikacja z afiliacją mojego laboratorium) Koyuncu S, Saez I, Lee HJ, Gutierrez-Garcia R, Pokrzywa W, Fatima A, Hoppe T, Vilchez D. (2018). The ubiquitin ligase UBR5 suppresses proteostasis collapse in pluripotent stem cells from Huntington's disease patients. Nature Communications, 9:2886. (IF2018 = 12.353, punkty MNiSW2017 = 45, cytowane 3 razy) Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) podlegają nieograniczonemu samoodnowieniu, zachowując jednocześnie swój potencjał do różnicowania się w komórki postmitotyczne z nienaruszonym proteomem. Jako takie, iPSC tłumią agregację toksycznego białka huntingtyny (HTT), którego mutacja leży u podstaw choroby Huntingtona (HD). W tych badaniach pokazujemy, że iPSC wykazują wysokie poziomy UBR5, ligazy ubikwityny wymaganej do degradacji proteasomalnej zarówno normalnej, jak i zmutowanej HTT. Poza kontrolowaniem HTT, wzmocniona ekspresja UBR5 określa globalną proteostazę iPSC, zapobiegając agregacji nieprawidłowo sfałdowanych białek wynikających z normalnego metabolizmu. Zatem nasze odkrycia wskazują UBR5 jako modulator bardzo wydajnych mechanizmów utrzymujących proteostazę w komórkach iPSC. Podsumowując i podkreślając moją rolę w badaniu systemów kontrolujących homeostazę białkowa, napisałem również dwie prace przeglądowe dotyczące tych procesów. Publikacja przeglądowa 1 (publikacja z afiliacją mojego laboratorium) * pierwszy współautor


38

AutoreferatKevei É, Pokrzywa W*, Hoppe T. (2017). Repair or destruction-an intimate liaison between ubiquitin ligases and molecular chaperones in proteostasis. FEBS Letters, 591: 2616-2635. (IF2017 = 2.999, punkty MNiSW2017 = 30, cytowane 5 razy) Wiele ligaz ubikwityny (E3) ściśle współpracuje z białkami opiekuńczymi w celu utrzymania jak najlepszego stanu proteomu komórkowego. W tej pracy omawiamy rolę specjalistycznych ligaz współpracujących z chaperonami w celu degradacji uszkodzonych białek. Omawiamy proces rozpoznawania substratu i jego usunięcia, typ chaperonów, z którymi E3 współpracują, oraz sytuacje patologiczne związane z ich nieprawidłowym funkcjonowaniem. Publikacja przeglądowa 2 (publikacja z afiliacją mojego laboratorium) * pierwszy współautor Balaji V, Pokrzywa W*, Hoppe T. (2018). Ubiquitylation pathways in insulin signaling and organismal homeostasis. BioEssays, 40: e1700223. (IF2015 = 4.419, punkty MNiSW2017=40, cytowane 2 razy) Szlak sygnałowy insuliny i insulinopodobnego czynnika wzrostu 1 (IIS) jest kluczowym programem genetycznym regulującym wzrost komórek, rozwój tkanek, metabolizm i długowieczność organizmów wielokomórkowych. System ubikwityna-proteasom (UPS) wpływa na funkcjonalność IIS poprzez indukowalne ścieżki ubikwitylacji, które regulują internalizację receptora insuliny/IGF-1, stabilność docelowych celów szlaku IIS oraz aktywność receptorów jądrowych kontrolujących ekspresję genów. Związany z wiekiem spadek aktywności UPS jest często związany z upośledzeniem IIS, przyczyniając się do patologii, takich jak rak, cukrzyca, choroby układu krążenia i choroby neurodegeneracyjne. W niniejszej pracy omówiliśmy interakcję między UPS a IIS w kontekście homeostazy komórkowej. 5. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo – badawczych 5.1 Udział w projektach naukowych / granty naukowe

Skutecznie aplikowałem o indywidualne stypendium doktorskie oraz o granty na stworzenie własnej grupy badawczej. Obecnie, w ramach grantów, zatrudniam dwóch młodych doktorów, czterech doktorantów (na stypendiach) i jednego magistranta.

Granty na stworzenie własnej grupy badawczej:

01/2019 - EMBO Small Grant (edycja 2018) - 10 000 €/rok - wnioskodawca / kierownik projektu / pomysłodawca projektu

12/2018 - FIRST TEAM grant finansowany przez Fundację na Rzecz Nauki Polskiej (edycja 03/2018) - 1 999 823 zł – wnioskodawca / kierownik projektu / pomysłodawca projektu

04/2018 - EMBO Installation Grant (edycja 2018) – Europejska Organizacja Biologii Molekularnej (edycja 2017) - 50 000 €/rok (na okres 3 do 5 lat) – wnioskodawca / kierownik projektu / pomysłodawca projektu

09/2017 - OPUS12 grant finansowany przez Narodowe Centrum Nauki (edycja 09/2016) - 1 116 875 zł – wnioskodawca / kierownik projektu / pomysłodawca projektu


39

AutoreferatUdział w międzynarodowym konsorcjum badawczym

03/2018 - Laboratorium Metabolizmu Białek w Rozwoju i Starzeniu pod moim kierownictwem jest częścią grupy badawczej FOR 2743 koordynowanej przez prof. Jörga Höhfelda z Uniwersytetu w Bonn, Niemcy. Konsorcjum badawcze otrzymało 3 000 000 € (na okres 3 lat) od Niemieckiej Fundacji Badawczej (DFG). Adres strony internetowej: https://www.for2743.uni-bonn.de/?set_language=de

Indywidualne stypendia:

05/2005 - Stypendium Belgijskiego Narodowego Funduszu Badań Naukowych FNRS/FRIA (na okres trzech lat)

5.2 Wkład w naukę po doktoracie

A. Mechanizm składania i rola specyficznych par ligazy E3

Podczas mojej pracy w laboratorium na Uniwersytecie w Kolonii (Niemcy) moim zadaniem było zidentyfikowanie regulatorów i substratów dla specyficznych ligaz ubikwityny oraz określenie interakcji między dwoma różnymi enzymami E3. Optymalizowałem testy w celu wykrycia par substratu E3 u C. elegans, a także metod biochemicznych, które umożliwiają badanie szczegółowego procesu ubikwitylacji i aktywności ligaz E3. Jako inicjator projektu zasugerowałem innowacyjny pogląd na mechanizm powstawania i funkcję kompleksów utworzonych przez dwie różne ligazy ubikwityny. Wyniki prac nad konkretnymi parami E3, a także ich rola w regulacji metabolizmu komórkowego i starzenia się, były podstawą wniosków o dofinansowanie. Otrzymałem dofinansowanie z Narodowego Centrum Nauki, Fundacji na rzecz Nauki Polskiej (Pierwszy Zespół) i Europejskiej Organizacji Biologii Molekularnej (EMBO Installation Grant), aby rozpocząć moją grupę badawczą.

Obecnie pracujemy nad rolą kompleksów ligazy E3 w integracji homeostazy białkowej i starzenia. Głównym celem proponowanych badań jest opisanie roli i mechanizmów składania alternatywnych kompleksów E3 opartych na CHIP. Szczegółowe badania procesów fizjologicznych regulowanych przez te systemy w połączeniu z analizą biochemiczną i proteomiczną pomogą rozszyfrować, w jaki sposób rekrutacja substratu i tworzenie łańcucha ubikwityny są określone przez specyficzne homo lub heterooligomeryczne pary ligazy E3. Badamy również regulację metabolizmu metioniny przez system ubikwityna-proteasom (UPS). Długofalowym celem tego projektu jest zrozumienie, w jaki sposób szlaki degradacji modulują potencjał metylacyjny komórki poprzez metabolizm metioniny. Ewolucyjnie zachowana regulacja aktywności metabolicznej przez układ UPS jest badana


40

Autoreferatz wykorzystaniem modelu C. elegans oraz komórek ludzkich w hodowli. Proponowane badania będą miały szerokie implikacje dla zrozumienia regulacji cyklu metioniny w zdrowiu i chorobie oraz ogólnie mechanizmów proteostazy. Wierzę, że charakterystyka nowego powiązania między epigenetyką a metabolizmem umożliwi identyfikację nowych celów molekularnych w rozwoju terapii przeciwnowotworowych. B. Mechanizmy składania i składania miozyny wywołane stresem

Stabilność proteomu jest kluczowa dla funkcji komórkowych i długości życia organizmu. Jest to widoczne w komórkach mięśniowych, gdzie nieprawidłowe podtrzymanie funkcji sarkomerów mięśni szkieletowych przyczynia się do sarkopenii. Oprócz białka UNC-45, ko-chaperony specyficznego dla miozyny, sieć białek opiekuńczych zaangażowanych w składanie i utrzymanie tkanki mięśniowej jest obecnie nieznana. Aby zidentyfikować dodatkowe czynniki wymagane do kontroli jakości sarkomeru, wykonaliśmy genetyczne badania przesiewowe oparte na tłumionych lub syntetycznych defektach ruchliwości w Caenorhabditis elegans. Zidentyfikowaliśmy specyficzna rolę regulatorów białek opiekuńczych Hsp90 kluczowych w prawidłowym rozwoju i naprawie mięśni.

Frumkin A, Dror S, Pokrzywa W, Bar-Lavan Y, Karady I, Hoppe T, Ben-Zvi A. (2014) Challenging muscle homeostasis uncovers novel chaperone interactions in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Molecular Biosciences, 6: 1:21.

W oparciu o wyniki tych badań stworzyłem projekt, który ma na celu zrozumienie, jak określone chaperony chronią mięśnie w odpowiedzi na stres mechaniczny. Projekt został sfinansowany w ramach współpracy międzynarodowej, w której moje laboratorium dołączyło do międzynarodowego konsorcjum badawczego pracującego nad mechanizmami chroniącymi różne typy komórek i tkanek przed uszkodzeniami mechanicznymi. Integralność struktur sarkomerów jest trwale naruszana przez wzrost mięśni i stres mechaniczny. W odpowiedzi na wysiłek lub uszkodzenie włókien mięśniowych, UNC-45 wraz z chaperonem Hsp90 przemieszczają się wzdłuż filamentów grubych miozyny prawdopodobnie koordynując jej naprawę. Jednak niewiele wiadomo na temat funkcji i regulacji tych szlaków homeostazy białkowej po obciążeniu mechanicznym. Dlatego długoterminowym celem mojego projektu jest zrozumienie, w jaki sposób równowaga między fałdowaniem białek i szlakami degradacji jest skoordynowana z montażem miozyny i integralnością mięśni. W tym celu połączymy podejścia genetyczne i biochemiczne by zbadać ewolucyjnie zachowaną funkcję UNC-45 w formowaniu filamentów miozyny i zbadamy, w jaki sposób ta funkcja jest modulowana podczas stresu mechanicznego. W szczególności planujemy wykorzystać ukierunkowane strategie


41

Autoreferatprzesiewowe, aby odkryć mechanosensoryczne białka, białka opiekuńcze, komponenty UPS i autofagii, które są wymagane do funkcjonowania mięśni. Regulacja systemów proteostazy zostanie przebadana w C. elegans, mioblastach mysich C2C12 i ludzkich mięśniach szkieletowych. Uważam, że proponowane badania będą miały szerokie implikacje dla zrozumienia dysfunkcji filamentów grubych miozyny w rozwoju i starzeniu, miopatii ludzkich i ogólnie mechanizmów proteostazy.


42

Autoreferat6.BibliografiaAmerik, A., Swaminathan, S., Krantz, B.A., Wilkinson, K.D., and Hochstrasser, M. (1997). In vivo disassembly of free polyubiquitin chains by yeast Ubp14 modulates rates of protein degradation by the proteasome. EMBO J 16, 4826-4838. Ao, W., and Pilgrim, D. (2000). Caenorhabditis elegans UNC-45 is a component of muscle thick filaments and colocalizes with myosin heavy chain B, but not myosin heavy chain A. J Cell Biol 148, 375-384. Arndt, V., Rogon, C., and Hohfeld, J. (2007a). To be, or not to be--molecular chaperones in protein degradation. Cell Mol Life Sci 64, 2525-2541. Arndt, V., Rogon, C., and Höhfeld, J. (2007b). To be, or not to be — molecular chaperones in protein degradation. Cellular and Molecular Life Sciences 64, 2525-2541. Barral, J.M., Bauer, C.C., Ortiz, I., and Epstein, H.F. (1998a). Unc-45 mutations in Caenorhabditis elegans implicate a CRO1/She4p-like domain in myosin assembly. J Cell Biol 143, 1215-1225. Barral, J.M., Bauer, C.C., Ortiz, I., and Epstein, H.F. (1998b). Unc-45 mutations in Caenorhabditis elegans implicate a CRO1/She4p-like domain in myosin assembly. Journal of Cell Biology 143, 1215-1225. Barral, J.M., Hutagalung, A.H., Brinker, A., Hartl, F.U., and Epstein, H.F. (2002). Role of the myosin assembly protein UNC-45 as a molecular chaperone for myosin. Science 295, 669-671. Bates, G. (2003). Huntingtin aggregation and toxicity in Huntington's disease. Lancet 361, 1642-1644. Brehme, M., Voisine, C., Rolland, T., Wachi, S., Soper, J.H., Zhu, Y., Orton, K., Villella, A., Garza, D., Vidal, M., et al. (2014). A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease. Cell Rep 9, 1135-1150. Bruno, C., Martinuzzi, A., Tang, Y., Andreu, A.L., Pallotti, F., Bonilla, E., Shanske, S., Fu, J., Sue, C.M., Angelini, C., et al. (1999). A stop-codon mutation in the human mtDNA cytochrome c oxidase I gene disrupts the functional structure of complex IV. Am J Hum Genet 65, 611-620. Buckley, S.M., Aranda-Orgilles, B., Strikoudis, A., Apostolou, E., Loizou, E., Moran-Crusio, K., Farnsworth, C.L., Koller, A.A., Dasgupta, R., Silva, J.C., et al. (2012). Regulation of pluripotency and cellular reprogramming by the ubiquitin-proteasome system. Cell Stem Cell 11, 783-798. Chen, Y.R., Sturgeon, B.E., Gunther, M.R., and Mason, R.P. (1999). Electron spin resonance investigation of the cyanyl and azidyl radical formation by cytochrome c oxidase. J Biol Chem 274, 24611-24616. Chou, T.F., Brown, S.J., Minond, D., Nordin, B.E., Li, K., Jones, A.C., Chase, P., Porubsky, P.R., Stoltz, B.M., Schoenen, F.J., et al. (2011). Reversible inhibitor of p97, DBeQ, impairs both ubiquitin-dependent and autophagic protein clearance pathways. Proc Natl Acad Sci U S A 108, 4834-4839. Clejan, I., Boerckel, J., and Ahmed, S. (2006). Developmental modulation of nonhomologous end joining in Caenorhabditis elegans. Genetics 173, 1301-1317. Connell, P., Ballinger, C.A., Jiang, J., Wu, Y., Thompson, L.J., Hohfeld, J., and Patterson, C. (2001). The co-chaperone CHIP regulates protein triage decisions mediated by heat-shock proteins. Nat Cell Biol 3, 93-96. Consortium, H.D.i. (2012). Induced pluripotent stem cells from patients with Huntington's disease show CAG-repeat-expansion-associated phenotypes. Cell Stem Cell 11, 264-278. Craig, E.A., and Marszalek, J. (2017). How Do J-Proteins Get Hsp70 to Do So Many Different Things? Trends Biochem Sci 42, 355-368. Craig, R., and Woodhead, J.L. (2006). Structure and function of myosin filaments. Curr Opin Struct Biol 16, 204-212. Cuanalo-Contreras, K., Mukherjee, A., and Soto, C. (2013). Role of protein misfolding and proteostasis deficiency in protein misfolding diseases and aging. Int J Cell Biol 2013, 638083.


43

AutoreferatCyr, D.M., Hohfeld, J., and Patterson, C. (2002). Protein quality control: U-box-containing E3 ubiquitin ligases join the fold. Trends Biochem Sci 27, 368-375. Dantuma, N.P., and Hoppe, T. (2012). Growing sphere of influence: Cdc48/p97 orchestrates ubiquitin-dependent extraction from chromatin. Trends Cell Biol 22, 483-491. Derry, W.B., Putzke, A.P., and Rothman, J.H. (2001). Caenorhabditis elegans p53: role in apoptosis, meiosis, and stress resistance. Science 294, 591-595. Du, S.J., Li, H., Bian, Y., and Zhong, Y. (2008). Heat-shock protein 90alpha1 is required for organized myofibril assembly in skeletal muscles of zebrafish embryos. Proc Natl Acad Sci U S A 105, 554-559. Epstein, H.F., and Thomson, J.N. (1974). Temperature-sensitive mutation affecting myofilament assembly in Caenorhabditis elegans. Nature 250, 579-580. Etard, C., Behra, M., Fischer, N., Hutcheson, D., Geisler, R., and Strahle, U. (2007). The UCS factor Steif/Unc-45b interacts with the heat shock protein Hsp90a during myofibrillogenesis. Dev Biol 308, 133-143. Etard, C., Roostalu, U., and Strahle, U. (2008). Shuttling of the chaperones Unc45b and Hsp90a between the A band and the Z line of the myofibril. J Cell Biol 180, 1163-1175. Finkbeiner, S. (2011). Huntington's Disease. Cold Spring Harb Perspect Biol 3. Finley, D. (2009). Recognition and Processing of Ubiquitin-Protein Conjugates by the Proteasome. Annual Review of Biochemistry 78, 477-513. Garcia-Prat, L., Sousa-Victor, P., and Munoz-Canoves, P. (2017). Proteostatic and Metabolic Control of Stemness. Cell Stem Cell 20, 593-608. Gazda, L., Pokrzywa, W., Hellerschmied, D., Lowe, T., Forne, I., Mueller-Planitz, F., Hoppe, T., and Clausen, T. (2013). The myosin chaperone UNC-45 is organized in tandem modules to support myofilament formation in C. elegans. Cell 152, 183-195. Genetic Modifiers of Huntington's Disease, C. (2015). Identification of Genetic Factors that Modify Clinical Onset of Huntington's Disease. Cell 162, 516-526. Hartl, F.U., Bracher, A., and Hayer-Hartl, M. (2011). Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature 475, 324-332. Hawkins, T.A., Haramis, A.P., Etard, C., Prodromou, C., Vaughan, C.K., Ashworth, R., Ray, S., Behra, M., Holder, N., Talbot, W.S., et al. (2008). The ATPase-dependent chaperoning activity of Hsp90a regulates thick filament formation and integration during skeletal muscle myofibrillogenesis. Development 135, 1147-1156. Hoeijmakers, J.H. (2001). Genome maintenance mechanisms for preventing cancer. Nature 411, 366-374. Hoppe, T., Cassata, G., Barral, J.M., Springer, W., Hutagalung, A.H., Epstein, H.F., and Baumeister, R. (2004a). Regulation of the myosin-directed chaperone UNC-45 by a novel E3/E4-multiubiquitylation complex in C. elegans. Cell 118, 337-349. Hoppe, T., Cassata, G., Barral, J.M., Springer, W., Hutagalung, A.H., Epstein, H.F., and Baumeister, R. (2004b). Regulation of the myosin-directed chaperone UNC-45 by a novel E3/E4-multiubiquitylation complex in C. elegans. Cell 118, 337-349. Hubbers, C.U., Clemen, C.S., Kesper, K., Boddrich, A., Hofmann, A., Kamarainen, O., Tolksdorf, K., Stumpf, M., Reichelt, J., Roth, U., et al. (2007). Pathological consequences of VCP mutations on human striated muscle. Brain 130, 381-393. Janiesch, P.C., Kim, J., Mouysset, J., Barikbin, R., Lochmuller, H., Cassata, G., Krause, S., and Hoppe, T. (2007a). The ubiquitin-selective chaperone CDC-48/p97 links myosin assembly to human myopathy. Nat Cell Biol 9, 379-390. Janiesch, P.C., Kim, J., Mouysset, J., Barikbin, R., Lochmüller, H., Cassata, G., Krause, S., and Hoppe, T. (2007b). The ubiquitin-selective chaperone CDC-48/p97 links myosin assembly to human myopathy. Nature cell biology 9, 379-390.


44

AutoreferatJiang, J., Ballinger, C.A., Wu, Y., Dai, Q., Cyr, D.M., Hohfeld, J., and Patterson, C. (2001). CHIP is a U-box-dependent E3 ubiquitin ligase: identification of Hsc70 as a target for ubiquitylation. J Biol Chem 276, 42938-42944. Johnson, E.S., Ma, P.C., Ota, I.M., and Varshavsky, A. (1995). A proteolytic pathway that recognizes ubiquitin as a degradation signal. J Biol Chem 270, 17442-17456. Ju, J.S., Miller, S.E., Hanson, P.I., and Weihl, C.C. (2008). Impaired protein aggregate handling and clearance underlie the pathogenesis of p97/VCP-associated disease. J Biol Chem 283, 30289-30299. Kachur, T.M., and Pilgrim, D.B. (2008). Myosin assembly, maintenance and degradation in muscle: Role of the chaperone UNC-45 in myosin thick filament dynamics. Int J Mol Sci 9, 1863-1875. Kaushik, S., and Cuervo, A.M. (2012). Chaperones in autophagy. Pharmacological Research 66, 484-493. Kenyon, C.J. (2010). The genetics of ageing. Nature 464, 504-512. Kerscher, O., Felberbaum, R., and Hochstrasser, M. (2006a). Modification of Proteins by Ubiquitin and Ubiquitin-Like Proteins. Annual Review of Cell and Developmental Biology 22, 159-180. Kerscher, O., Felberbaum, R., and Hochstrasser, M. (2006b). Modification of proteins by ubiquitin and ubiquitin-like proteins. Annu Rev Cell Dev Biol 22, 159-180. Kettern, N., Dreiseidler, M., Tawo, R., and Hohfeld, J. (2010). Chaperone-assisted degradation: multiple paths to destruction. Biol Chem 391, 481-489. Kevei, E., Pokrzywa, W., and Hoppe, T. (2017). Repair or destruction-an intimate liaison between ubiquitin ligases and molecular chaperones in proteostasis. FEBS Lett 591, 2616-2635. Kim, H.T., Kim, K.P., Uchiki, T., Gygi, S.P., and Goldberg, A.L. (2009). S5a promotes protein degradation by blocking synthesis of nondegradable forked ubiquitin chains. EMBO J 28, 1867-1877. Kim, J., Lowe, T., and Hoppe, T. (2008a). Protein quality control gets muscle into shape. Trends in Cell Biology 18, 264-272. Kim, J., Lowe, T., and Hoppe, T. (2008b). Protein quality control gets muscle into shape. Trends Cell Biol 18, 264-272. Koegl, M., Hoppe, T., Schlenker, S., Ulrich, H.D., Mayer, T.U., and Jentsch, S. (1999). A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly. Cell 96, 635-644. Komander, D., and Rape, M. (2012). The Ubiquitin Code. Annual Review of Biochemistry 81, 203-229. Kuhlbrodt, K., Janiesch, P.C., Kevei, E., Segref, A., Barikbin, R., and Hoppe, T. (2011). The Machado-Joseph disease deubiquitylase ATX-3 couples longevity and proteostasis. Nat Cell Biol 13, 273-281. Kuhlbrodt, K., Mouysset, J., and Hoppe, T. (2005). Orchestra for assembly and fate of polyubiquitin chains. Essays Biochem 41, 1-14. Lee, B.H., Lee, M.J., Park, S., Oh, D.C., Elsasser, S., Chen, P.C., Gartner, C., Dimova, N., Hanna, J., Gygi, S.P., et al. (2010). Enhancement of proteasome activity by a small-molecule inhibitor of USP14. Nature 467, 179-184. Lopez-Otin, C., Blasco, M.A., Partridge, L., Serrano, M., and Kroemer, G. (2013). The hallmarks of aging. Cell 153, 1194-1217. Mammen, A.L., Mahoney, J.A., St Germain, A., Badders, N., Taylor, J.P., Rosen, A., and Spinette, S. (2011). A novel conserved isoform of the ubiquitin ligase UFD2a/UBE4B is expressed exclusively in mature striated muscle cells. PLoS ONE 6, e28861. Melkani, G.C., Bodmer, R., Ocorr, K., and Bernstein, S.I. (2011). The UNC-45 chaperone is critical for establishing myosin-based myofibrillar organization and cardiac contractility in the Drosophila heart model. PLoS One 6, e22579. Menendez-Benito, V., Verhoef, L.G., Masucci, M.G., and Dantuma, N.P. (2005). Endoplasmic reticulum stress compromises the ubiquitin-proteasome system. Hum Mol Genet 14, 2787-2799.


45

AutoreferatMin, J.N., Whaley, R.A., Sharpless, N.E., Lockyer, P., Portbury, A.L., and Patterson, C. (2008). CHIP Deficiency Decreases Longevity, with Accelerated Aging Phenotypes Accompanied by Altered Protein Quality Control. Molecular and Cellular Biology 28, 4018-4025. Mohsen, A.W., Navarette, B., and Vockley, J. (2001). Identification of Caenorhabditis elegans isovaleryl-CoA dehydrogenase and structural comparison with other acyl-CoA dehydrogenases. Mol Genet Metab 73, 126-137. Morimoto, R.I. (2008). Proteotoxic stress and inducible chaperone networks in neurodegenerative disease and aging. Genes & Development 22, 1427-1438. Morishima, Y., Wang, A.M., Yu, Z., Pratt, W.B., Osawa, Y., and Lieberman, A.P. (2008). CHIP deletion reveals functional redundancy of E3 ligases in promoting degradation of both signaling proteins and expanded glutamine proteins. Human Molecular Genetics 17, 3942-3952. Murata, S., Chiba, T., and Tanaka, K. (2003). CHIP: a quality-control E3 ligase collaborating with molecular chaperones. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 35, 572-578. Murata, S., Minami, Y., Minami, M., Chiba, T., and Tanaka, K. (2001). CHIP is a chaperone-dependent E3 ligase that ubiquitylates unfolded protein. EMBO Rep 2, 1133-1138. Nillegoda, N.B., Kirstein, J., Szlachcic, A., Berynskyy, M., Stank, A., Stengel, F., Arnsburg, K., Gao, X., Scior, A., Aebersold, R., et al. (2015). Crucial HSP70 co-chaperone complex unlocks metazoan protein disaggregation. Nature 524, 247-251. Nillegoda, N.B., Stank, A., Malinverni, D., Alberts, N., Szlachcic, A., Barducci, A., De Los Rios, P., Wade, R.C., and Bukau, B. (2017). Evolution of an intricate J-protein network driving protein disaggregation in eukaryotes. Elife 6. Noormohammadi, A., Calculli, G., Gutierrez-Garcia, R., Khodakarami, A., Koyuncu, S., and Vilchez, D. (2017). Mechanisms of protein homeostasis (proteostasis) maintain stem cell identity in mammalian pluripotent stem cells. Cell Mol Life Sci. Noormohammadi, A., Khodakarami, A., Gutierrez-Garcia, R., Lee, H.J., Koyuncu, S., Konig, T., Schindler, C., Saez, I., Fatima, A., Dieterich, C., et al. (2016). Somatic increase of CCT8 mimics proteostasis of human pluripotent stem cells and extends C. elegans lifespan. Nat Commun 7, 13649. Park, C., and Cuervo, A.M. (2013). Selective Autophagy: Talking with the UPS. Cell Biochemistry and Biophysics 67, 3-13. Park, I.H., Arora, N., Huo, H., Maherali, N., Ahfeldt, T., Shimamura, A., Lensch, M.W., Cowan, C., Hochedlinger, K., and Daley, G.Q. (2008). Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell 134, 877-886. Petrucelli, L. (2004). CHIP and Hsp70 regulate tau ubiquitination, degradation and aggregation. Human Molecular Genetics 13, 703-714. Piccirillo, R., and Goldberg, A.L. (2012). The p97/VCP ATPase is critical in muscle atrophy and the accelerated degradation of muscle proteins. EMBO J 31, 3334-3350. Powers, E.T., and Balch, W.E. (2013). Diversity in the origins of proteostasis networks--a driver for protein function in evolution. Nat Rev Mol Cell Biol 14, 237-248. Powers, E.T., Morimoto, R.I., Dillin, A., Kelly, J.W., and Balch, W.E. (2009). Biological and chemical approaches to diseases of proteostasis deficiency. Annu Rev Biochem 78, 959-991. Price, M.G., Landsverk, M.L., Barral, J.M., and Epstein, H.F. (2002). Two mammalian UNC-45 isoforms are related to distinct cytoskeletal and muscle-specific functions. Journal of Cell Science 115, 40134023. Richly, H., Rape, M., Braun, S., Rumpf, S., Hoege, C., and Jentsch, S. (2005). A series of ubiquitin binding factors connects CDC48/p97 to substrate multiubiquitylation and proteasomal targeting. Cell 120, 73-84. Rotsaert, F.A., Ding, M.G., and Trumpower, B.L. (2008). Differential efficacy of inhibition of mitochondrial and bacterial cytochrome bc1 complexes by center N inhibitors antimycin, ilicicolin H and funiculosin. Biochim Biophys Acta 1777, 211-219.


46

AutoreferatSaeki, Y., Tayama, Y., Toh-e, A., and Yokosawa, H. (2004). Definitive evidence for Ufd2-catalyzed elongation of the ubiquitin chain through Lys48 linkage. Biochem Biophys Res Commun 320, 840-845. Schopf, F.H., Biebl, M.M., and Buchner, J. (2017). The HSP90 chaperone machinery. Nat Rev Mol Cell Biol. Schumacher, B., Hofmann, K., Boulton, S., and Gartner, A. (2001). The C. elegans homolog of the p53 tumor suppressor is required for DNA damage-induced apoptosis. Curr Biol 11, 1722-1727. Segref, A., and Hoppe, T. (2012). Analysis of ubiquitin-dependent proteolysis in Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol 832, 531-544. Segref, A., Torres, S., and Hoppe, T. (2011). A screenable in vivo assay to study proteostasis networks in Caenorhabditis elegans. Genetics 187, 1235-1240. Sena, L.A., and Chandel, N.S. (2012). Physiological roles of mitochondrial reactive oxygen species. Mol Cell 48, 158-167. Sowa, M.E., Bennett, E.J., Gygi, S.P., and Harper, J.W. (2009). Defining the Human Deubiquitinating Enzyme Interaction Landscape. Cell 138, 389-403. Srikakulam, R., Liu, L., and Winkelmann, D.A. (2008). Unc45b forms a cytosolic complex with Hsp90 and targets the unfolded myosin motor domain. PLoS One 3, e2137. Srikakulam, R., and Winkelmann, D.A. (2004). Chaperone-mediated folding and assembly of myosin in striated muscle. J Cell Sci 117, 641-652. Stanley, B.A., Shaw, J., Arab, S., Liu, P., Kirshenbaum, L.A., and Van Eyk, J.E. (2007). UNC-45B exhibits increased abundance in heart failure patients and functions as a novel dual regulator of myosin heavy chain transcription and assembly. Circulation 116, 170-170. Starai, V.J., and Escalante-Semerena, J.C. (2004). Acetyl-coenzyme A synthetase (AMP forming). Cell Mol Life Sci 61, 2020-2030. Taipale, M., Tucker, G., Peng, J., Krykbaeva, I., Lin, Z.Y., Larsen, B., Choi, H., Berger, B., Gingras, A.C., and Lindquist, S. (2014). A quantitative chaperone interaction network reveals the architecture of cellular protein homeostasis pathways. Cell 158, 434-448. Tzankov, S., Wong, M.J.H., Shi, K., Nassif, C., and Young, J.C. (2008). Functional Divergence between Co-chaperones of Hsc70. Journal of Biological Chemistry 283, 27100-27109. Varshavsky, A. (1992). The N-end rule. Cell 69, 725-735. Venolia, L., and Waterston, R.H. (1990a). The unc-45 gene of Caenorhabditis elegans is an essential muscle-affecting gene with maternal expression. Genetics 126, 345-353. Venolia, L., and Waterston, R.H. (1990b). The Unc-45 Gene of Caenorhabditis-Elegans Is an Essential Muscle-Affecting Gene with Maternal Expression. Genetics 126, 345-353. Verma, R., Oania, R., Fang, R., Smith, G.T., and Deshaies, R.J. (2011). Cdc48/p97 mediates UV-dependent turnover of RNA Pol II. Mol Cell 41, 82-92. Vethantham, V., Yang, Y., Bowman, C., Asp, P., Lee, J.H., Skalnik, D.G., and Dynlacht, B.D. (2012). Dynamic loss of H2B ubiquitylation without corresponding changes in H3K4 trimethylation during myogenic differentiation. Mol Cell Biol 32, 1044-1055. Vilchez, D., Boyer, L., Morantte, I., Lutz, M., Merkwirth, C., Joyce, D., Spencer, B., Page, L., Masliah, E., Berggren, T.W., et al. (2012a). Increased proteasome activity in human embryonic stem cells is regulated by PSMD11. Nature 489, 304-308. Vilchez, D., Morantte, I., Liu, Z., Douglas, P.M., Merkwirth, C., Rodrigues, A.P., Manning, G., and Dillin, A. (2012b). RPN-6 determines C. elegans longevity under proteotoxic stress conditions. Nature 489, 263-268. Vilchez, D., Saez, I., and Dillin, A. (2014a). The role of protein clearance mechanisms in organismal ageing and age-related diseases. Nat Commun 5, 5659. Vilchez, D., Simic, M.S., and Dillin, A. (2014b). Proteostasis and aging of stem cells. Trends Cell Biol 24, 161-170.


47

AutoreferatWalther, D.M., Kasturi, P., Zheng, M., Pinkert, S., Vecchi, G., Ciryam, P., Morimoto, R.I., Dobson, C.M., Vendruscolo, M., Mann, M., et al. (2015). Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging C. elegans. Cell 161, 919-932. Watts, G.D., Wymer, J., Kovach, M.J., Mehta, S.G., Mumm, S., Darvish, D., Pestronk, A., Whyte, M.P., and Kimonis, V.E. (2004). Inclusion body myopathy associated with Paget disease of bone and frontotemporal dementia is caused by mutant valosin-containing protein. Nat Genet 36, 377-381. Weihl, C.C., Pestronk, A., and Kimonis, V.E. (2009). Valosin-containing protein disease: inclusion body myopathy with Paget's disease of the bone and fronto-temporal dementia. Neuromuscul Disord 19, 308-315. Willis, M.S., Schisler, J.C., and Patterson, C. (2008). Appetite for destruction: E3 ubiquitin-ligase protection in cardiac disease. Future Cardiol 4, 65-75. Wohlgemuth, S.L., Crawford, B.D., and Pilgrim, D.B. (2007). The myosin co-chaperone UNC-45 is required for skeletal and cardiac muscle function in zebrafish. Developmental Biology 303, 483-492. Yau, R.G., Doerner, K., Castellanos, E.R., Haakonsen, D.L., Werner, A., Wang, N., Yang, X.W., Martinez-Martin, N., Matsumoto, M.L., Dixit, V.M., et al. (2017). Assembly and Function of Heterotypic Ubiquitin Chains in Cell-Cycle and Protein Quality Control. Cell 171, 918-933 e920. Zhao, R., Davey, M., Hsu, Y.C., Kaplanek, P., Tong, A., Parsons, A.B., Krogan, N., Cagney, G., Mai, D., Greenblatt, J., et al. (2005). Navigating the chaperone network: an integrative map of physical and genetic interactions mediated by the hsp90 chaperone. Cell 120, 715-727. Zuccato, C., Valenza, M., and Cattaneo, E. (2010). Molecular mechanisms and potential therapeutical targets in Huntington's disease. Physiol Rev 90, 905-981. Zuehlke, A., and Johnson, J.L. (2010). Hsp90 and co-chaperones twist the functions of diverse client proteins. Biopolymers 93, 211-217. Zuiderweg, E.R., Hightower, L.E., and Gestwicki, J.E. (2017). The remarkable multivalency of the Hsp70 chaperones. Cell Stress Chaperones 22, 173-189.

Autoreferat Wojciech... · 2019. 9. 10. · Załącznik #2 Wojciech Mieczysław Pokrzywa 4...

Documents

Transcript of Autoreferat Wojciech... · 2019. 9. 10. · Załącznik #2 Wojciech Mieczysław Pokrzywa 4...