AUTOREFERAT

dr Anna Żaczek

Zakład Biologii Komórki Katedra Biotechnologii Medycznej

Międzyuczelniany Wydział Biotechnologii Uniwersytet Gdański i Gdański Uniwersytet Medyczny

Gdańsk 2014

Autoreferat Załącznik nr 2

1

1. Imię i Nazwisko: Anna Żaczek 2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe – z podaniem nazwy, miejsca i roku ich uzyskania oraz tytułu rozprawy doktorskiej: 2000 magister biotechnologii; Międzyuczelniany Wydział Biotechnologii Uniwersytetu

Gdańskiego i Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego; praca magisterska pt.: „Molecular marker analysis and in vitro chemosensitivity testing in non-small cell lung cancer patients”; promotor: prof. dr hab. Krzysztof Bielawski

2004 dyplom ukończenia szkoły doktorskiej Studium Medycyny Molekularnej w Warszawie, specjalność: medycyna molekularna

2004 doktor nauk biologicznych w zakresie biochemii, specjalność: biologia molekularna; Międzyuczelniany Wydział Biotechnologii Uniwersytetu Gdańskiego i Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego; rozprawa doktorska pt.: „Analiza występowania zaburzeń onkogenów z rodziny erbB w polskiej populacji chorych na raka piersi”; promotor: prof. dr hab. Anna J. Podhajska (praca obroniona z wyróżnieniem)

3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych: 2000-2004 Studia doktoranckie, Międzyuczelniany Wydział Biotechnologii Uniwersytetu

Gdańskiego i Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego

2000-2004 Szkoła doktorska, Studium Medycyny Molekularnej w Warszawie

2004-2005 Klinika Onkologii i Radioterapii, Gdański Uniwersytet Medyczny, stanowisko: koordynator badań klinicznych

2006 Trójmiejska Akademicka Zwierzętarnia Doświadczalna – Centrum Badawczo-Usługowe Akademii Medycznej w Gdańsku; stanowisko: biolog

Od 2007 Zakład Biologii Komórki, Katedra Biotechnologii Medycznej, Międzyuczelniany Wydział Biotechnologii Uniwersytetu Gdańskiego i Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego; stanowisko: adiunkt

4. Osiągnięcie naukowe wynikające z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.):

Osiągnięcie naukowe wynikające z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki stanowi cykl 8 powiązanych tematycznie publikacji dotyczących identyfikacji markerów molekularnych o znaczeniu klinicznym u chorych na raka piersi. Cykl zawiera 7 prac oryginalnych, 1 przeglądową. Prace te, publikowane w latach 2010-2014, są rezultatem wieloletniej interdyscyplinarnej współpracy z ośrodkami naukowymi w Polsce i za granicą.

Badania i powstałe w ich wyniku publikacje były prowadzone zgodnie z wytycznymi REMARK

(ang. REporting recommendations for tumor MARKer prognostic studies)[1] i MIQE (ang. Minimum Information for publication of Quantitative real-time PCR Experiments)[2].

Autoreferat Załącznik nr 2

2

Łączna wartość współczynnika oddziaływania IF prac składających się na osiągnięcie wynosi 20,168. Łączna liczba punktów MNiSW prac składających się na osiągnięcie wynosi 232. a) tytuł osiągnięcia naukowego: Identyfikacja markerów molekularnych o znaczeniu prognostycznym i predykcyjnym w pierwotnych

i przerzutowych ogniskach raka piersi b) publikacje wchodzące w skład osiągnięcia naukowego:

4.1. Żaczek A#, Markiewicz A, Jaśkiewicz J, Pieńkowski T, Rhone P, Jassem J, Wełnicka-Jaśkiewicz M. Clinical evaluation of developed PCR-based method with hydrolysis probes for TOP2A copy number evaluation in breast cancer samples. Clin Biochem 2010; 43:891-8. IF 2,043; MNiSW 32. Udział w pracy: 70%.

4.2. Żaczek A#, Markiewicz A, Supernat A, Bednarz-Knoll N, Brandt B, Seroczynska B, Skokowski J, Szade J, Czapiewski P, Biernat W, Welnicka-Jaskiewicz M, Jassem J. Prognostic value of TOP2A gene amplification and chromosome 17 polysomy in early breast cancer. Pathol Oncol Res 2012; 18:885-94. IF 1,555; MNiSW 20. Udział w pracy: 65%.

4.3. Żaczek A#, Markiewicz A, M, Seroczyńska B, Skokowski J, Jaśkiewicz J, Pieńkowski T, Olszewski WP, Szade J, Rhone P, Wełnicka-Jaśkiewicz, Jassem J. Prognostic significance of TOP2A gene dosage in HER2-negative breast cancer. Oncologist 2012; 17:1246-1255. IF 4,095; MNiSW 40. Udział w pracy: 70%.

4.4. Markiewicz A, Wełnicka-Jaśkiewicz M, Skokowski J, Jaśkiewicz J, Szade J, Jassem J, Żaczek AJ#*. Prognostic significance of ESR1 amplification and ESR1 PvuII, CYP2C19*2, UGT2B15*2 polymorphisms in breast cancer patients. PLoS One 2013; 8:e72219. IF 3,534; MNiSW 40. Udział w pracy: 70%.

4.5. Książkiewicz M, Markiewicz A, Żaczek AJ#*. Epithelial-mesenchymal transition: A hallmark in metastasis formation linking circulating tumor cells and cancer stem cells [praca przeglądowa]. Pathobiology 2012; 79:195-208. IF 1,948; MNiSW 25. Udział w pracy: 34%.

4.6. Markiewicz A, Ahrends T, Wełnicka-Jaśkiewicz M, Seroczyńska B, Skokowski J, Jaśkiewicz J, Szade J, Biernat W, Żaczek AJ#*. Expression of epithelial to mesenchymal transition-related markers in lymph node metastases as a surrogate for primary tumor metastatic potential in breast cancer. J Transl Med 2012; 10:226. IF 3,459; MNiSW 35. Udział w pracy: 70%.

4.7. Markiewicz A, Książkiewicz M, Seroczyńska B, Skokowski J, Szade J, Wełnicka-Jaśkiewicz M, Żaczek AJ#*. Heterogeneity of mesenchymal markers expression — molecular profiles of cancer cells disseminated by lymphatic and hematogenous routes in breast cancer. Cancers 2013; 5:1485-1503. IF brak; MNiSW brak. Udział w pracy: 51%.

4.8. Markiewicz A, Książkiewicz M, Wełnicka-Jaśkiewicz M, Seroczyńska B, Skokowski J, Szade J, Żaczek AJ#*. Mesenchymal phenotype of CTC-enriched blood fraction and lymph node metastasis formation potential. PLoS One 2014; 9:e93901. IF 3,534; MNiSW 40. Udział w pracy: 51%. # - autor korespondencyjny, * - od 2012 roku dla jednoznacznej identyfikacji Anny Żaczek w publikacjach stosowane są inicjały dwóch imion (AJ).

Autoreferat Załącznik nr 2

3

Oświadczenia współautorów publikacji określające indywidualny wkład każdego autora w powstanie poszczególnych publikacji zamieszczono w załączniku nr 8. Oświadczenia habilitantki dotyczące wykonanych prac oraz procentowego w nich udziału znajdują się w załączniku nr 4.

W pracach zawarto wyniki uzyskane podczas realizacji pięciu projektów badawczych:

1. NCBiR LIDER/13/117/L-1/09/NCBiR/2010 (2010-2013) – program Lider. Analiza wybranych czynników molekularnych związanych z inwazją i przerzutowaniem u chorych na raka piersi;

2. MNiSW N N402 686240 (2012-2013) – program Iuventus Plus. Porównanie profili ekspresji markerów związanych z fenotypem macierzystym i mezenchymalnym komórek w guzach pierwotnych i przerzutach do węzłów chłonnych u chorych na raka piersi;

3. MNiSW IP2010 050370 (2010-2011) – program Iuventus Plus. Fenotyp macierzysty i mezenchymalny komórek a zdolność tworzenia przerzutów u chorych na raka piersi;

4. KBN N N401 2334 33 (2007-2010) – Badanie zaburzeń topoizomerazy IIα (amplifikacji i nadekspresji) u chorych na raka piersi w odniesieniu do leczenia antracyklinami;

5. NCN N N402 686240 (2011-2013) – Wykorzystanie polimorfizmów genów CYP2D6 i CYP19 jako markerów predykcyjnych w hormonoterapii raka piersi.

W projektach 1-4 pełniłam rolę kierownika, w projekcie 5 byłam wykonawcą.

c) omówienie celu naukowego ww. prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania

W ostatnim dziesięcioleciu dokonała się istotna zmiana w leczeniu przeciwnowotworowym, polegająca przede wszystkim na jego indywidualizacji w odniesieniu do każdego chorego. W tym celu konieczne jest zidentyfikowanie wiarygodnych wskaźników, które umożliwią zarówno lepszą diagnostykę, jak i dobór właściwej terapii. Markery molekularne odgrywają coraz ważniejszą rolę w chorobach nowotworowych, umożliwiając precyzyjniejszą diagnostykę (markery diagnostyczne), dokładniejsze rokowanie (markery rokownicze), przewidywanie i monitorowanie odpowiedzi na leczenie (markery predykcyjne). Mimo wielu badań prowadzonych na przestrzeni ostatnich lat, w raku piersi wciąż poszukuje się wiarygodnych i klinicznie użytecznych markerów molekularnych.

Dobry marker musi spełniać szereg kryteriów: I) być znaczący biologicznie i klinicznie; II) decyzje podjęte na podstawie jego statusu skutkować powinny korzystnym efektem w postaci większej korzyści klinicznej i/lub mniejszej toksyczności leczenia; III) być wiarygodnie oznaczany, tj. w oparciu o czuły i powtarzalny test diagnostyczny, sprawdzony w dobrze zaprojektowanym badaniu oceniającym jego wartość kliniczną i zwalidowany w niezależnym badaniu [3].

Rak piersi jest najczęstszym nowotworem wśród kobiet w krajach rozwiniętych. W Polsce stanowi drugą przyczynę zgonów z powodu nowotworów wśród kobiet, zaraz po raku płuca. W roku 2011 w Polsce na raka piersi zachorowało 16 534 kobiet i zmarło 5 437 [4]. Szacuje się, że zachorowalność na raka piersi będzie wciąż rosnąć, osiągając w Polsce 2025 roku około 21 000 nowych przypadków rocznie [wg raportu „Obecny stan zwalczania nowotworów w Polsce”, http://www.pto.med.pl/ 2014].

Zastosowanie systemowego leczenia uzupełniającego przyczyniło się do spektakularnej

poprawy wyników leczenia raka piersi. Uzupełniająca chemioterapia lub hormonoterapia są zgodnie z aktualnie obowiązującymi zaleceniami stosowane u większości chorych na wczesnego raka piersi. Jednak do nawrotu choroby dochodzi jedynie u części chorych, podczas gdy znaczna grupa nie odnosi korzyści z uzupełniającego leczenia systemowego, a jest narażona na jego efekty toksyczne. Niestety obecnie stosowane kliniczne czynniki rokownicze, oparte na uśrednionym a nie indywidualnym

Autoreferat Załącznik nr 2

4

ryzyku niepowodzenia leczenia, nie pozwalają na precyzyjne wskazanie tylko tych chorych, u których z dużym prawdopodobieństwem dojdzie do nawrotu choroby i które mogą odnieść korzyść z zastosowania leczenia systemowego. Prowadzi to do niepotrzebnego obniżenia jakości życia wielu kobiet i stanowi poważne obciążenia finansowe dla systemu ochrony zdrowia. Stąd wynika pilna potrzeba znalezienia wiarygodnych czynników rokowniczych i predykcyjnych w raku piersi, które mogłyby pozwolić dokładniej przewidzieć przebieg choroby oraz zastosować najbardziej skuteczne leczenie.

W ciągu ostatnich 30 lat wyniki leczenia raka piersi bardzo się poprawiły, ale w niewielkim

stopniu dotyczy to chorych w stadium choroby rozsianej [5]. Przerzuty odległe wciąż stanowią główną przyczynę zgonów z powodu raka piersi. Jednocześnie, mechanizmy kontrolujące poszczególne etapy kaskady metastatycznej są słabo poznane, co ogranicza rozumienie procesu rozsiewu nowotworu i utrudnia skuteczne interwencje diagnostyczno-terapeutyczne.

Celem prowadzonych badań przedstawionych w cyklu powiązanych tematycznie prac była identyfikacja markerów molekularnych o znaczeniu prognostycznym i predykcyjnym w pierwotnych ogniskach guza oraz komórkach nowotworowych rozsianych drogą krwionośną i limfatyczną u chorych na raka piersi.

Prowadzone badania wpisują się w nurt badań translacyjnych, stawiających sobie za cel

przekładanie naukowych odkryć biologii molekularnej w narzędzia przydatne w praktyce klinicznej. W aspekcie poznawczym badania koncentrowały się na biologii samego guza, jak również biologicznych podstawach procesu rozsiewu i formowania przerzutów. Aplikacyjnie, badania skupiały się na opracowaniu wiarygodnego warsztatu analizy markerów molekularnych na poziomie genu, mRNA, białka i całych komórek, izolowanych z materiału tkankowego świeżo mrożonego, jak i pochodzącego z utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie skrawków oraz krwi obwodowej.

Prezentowane prace są odzwierciedleniem ewolucji podejścia w badaniu nowotworów, jaka

dokonała się na świecie na przestrzeni ostatniej dekady. Pierwsze prace dotyczą analizy właściwości guza pierwotnego [prace 4.1-4.4], ostatnie wskazują na kompleksowy obraz choroby: guza pierwotnego i komórek nowotworowych rozsianych drogą krwionośną i limfatyczną [prace 4.5-4.8]. Wynika to z szybko narastającej wiedzy, która dostarcza dowodów na heterogenność nowotworów, w tym przypadku raka piersi [6,7]. W ostatnich latach wyodrębniono w całej grupie chorych na raka piersi molekularne podtypy: luminalny A i B, HER2-dodatni i bazalny [8]. Również w obrębie samego guza opisano występowanie genetycznie i fenotypowo różnych subpopulacji komórek nowotworowych, o zróżnicowanym potencjale samoodnowy i przerzutowania. Znaczną heterogenność obserwuje się także pomiędzy guzem pierwotnym a krążącymi komórkami nowotworowymi (CTC, ang. circulating tumor cells), rozsianymi komórkami nowotworowymi w węzłach chłonnych i szpiku kostnym oraz przerzutami odległymi. Co więcej, stopień heterogenności w obrębie guza i uwolnionych z niego komórek zmienia się w czasie, np. pod wpływem terapii czy w miarę postępu choroby, co może się wiązać z niepowodzeniem terapii ukierunkowanych molekularnie (zarówno inhibitorów drobnocząsteczkowych, jak i przeciwciał). W świetle obecnej wiedzy wydaje się, że analiza jakichkolwiek markerów na podstawie pojedynczej biopsji czy wycinka z jednego miejsca guza pierwotnego może być niewystarczająca, ponieważ nie daje pełnego obrazu guza. Heterogenność w obrębie samego guza pierwotnego, jak również pomiędzy nim a przerzutami stanowi wielkie wyzwanie przy planowaniu terapii. Jednocześnie, jest to zjawisko wciąż mało poznane i wymagające wielu badań dla zrozumienia biologii nowotworu, jak i potencjalnego zastosowania w klinice.

W prezentowanych w ramach niniejszego cyklu pracach stosowano szerokie spektrum metod biologii molekularnej i cytopatologii, służących analizie markerów molekularnych na poziomie DNA,

Autoreferat Załącznik nr 2

5

RNA, białka i krążących komórek nowotworowych. Zależnie od rodzaju badanego markera opracowano i stosowano odpowiednie metody:

Analiza zmian na poziomie DNA: opracowano dwa własne protokoły badawcze: 1) do oznaczania liczby kopii genu (amplifikacji) topoizomerazy (TOP2A) [praca 4.1] i receptora estrogenowego (ESR1) [praca 4.4], oparte na ilościowej reakcji PCR (qPCR, ang. quantitative PCR) z użyciem sond hydrolizujących; 2) do analizy wybranych polimorfizmów pojedynczych nukleotydów z wykorzystaniem polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP, ang. restriction fragment length polymorphism) i denaturacji DNA z wysoką rozdzielczością (HRM, ang. high resolution melting) [praca 4.4].

Analiza zmian na poziomie RNA: technika RT-PCR w czasie rzeczywistym (RT-qPCR, ang. reverse transcription – quantitative PCR) – specjalnie opracowany protokół umożliwia porównanie materiału klinicznego trzech różnych rodzajów (CTC, guz pierwotny i przerzuty) [praca 4.7, 4.8], pozwala na ilościową ocenę ekspresji genów, również w materiale archiwalnym, utrwalonym w formalinie, zatopionym w parafinie (FFPE – ang. formalin-fixed, parafin-embedded) [praca 4.6].

Analiza białek: barwienie immunohistochemiczne mikromacierzy tkankowych (IHC-TMA, ang. immunohistochemistry – tissue microarrays) – stosowane do analizy białek w materiale zatopionym w parafinie (guzy i przerzuty), umożliwia ocenę próbek od kilkudziesięciu chorych na jednym preparacie, co przyspiesza analizy i zwiększa ich powtarzalność; immunofluorescencja – stosowana do obrazowania wyizolowanych CTC, umożliwia charakterystykę fenotypu pojedynczych komórek [praca 4.3, 4.6].

Analiza CTC: własna metoda izolacji CTC – wirowanie w specjalnie dobranym gradiencie gęstości, zagęszczanie immunomagnetyczne, a następnie profilowanie molekularne [zgłoszenie do Urzędu Patentowego RP nr P.403515; praca 4.7, 4.8]; umożliwia izolację różnych fenotypów CTC i ich dokładniejszą charakterystykę.

W omawianym cyklu prac analizowano fragmenty guzów pierwotnych, przerzutów do

węzłów chłonnych oraz próbki krwi obwodowej pochodzące od dwóch grup chorych na raka piersi: retrospektywnej (322 chore; 1999-2007) oraz zebranej w ramach prospektywnych badań naukowych (128 chorych; 2010-2013). Materiał kontrolny stanowiła krew od zdrowych kobiet, fragmenty piersi niezmienionej nowotworowo, niezajęte węzły chłonne, ludzkie linie komórkowe raka piersi o znanej charakterystyce molekularnej (m.in. MDA-MB-231, MDA-MB-361, SKBR3) oraz referencyjne, dostępne komercyjnie DNA i RNA. Badania prowadzono we współpracy z następującymi ośrodkami:

Klinika Onkologii i Radioterapii GUMed (prof. Jacek Jassem, dr hab. Marzena Wełnicka-Jaśkiewicz),

Klinika Chirurgii Onkologicznej GUMed (prof. Janusz Jaśkiewicz),

Katedra Patomorfologii GUMed (prof. Wojciech Biernat, dr Hanna Majewska, Jolanta Szade),

Centralny Bank Tkanek i Materiału Genetycznego GUMed (dr Jarosław Skokowski, dr Barbara Seroczyńska),

Centrum Onkologii w Warszawie (dr Wojciech Olszewski, prof. Tadeusz Pieńkowski),

Regionalne Centrum Onkologii w Bydgoszczy (dr Piotr Rhone),

Department of Tumor Biology, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Niemcy (prof. Burkhardt Brandt, dr Natalia Bednarz-Knoll).

Autoreferat Załącznik nr 2

6

Najważniejsze uzyskane wyniki omówiono poniżej, w podziale na 2 sekcje: A) dotyczącą analizy guzów pierwotnych oraz B) dotyczącą analizy rozsianych komórek nowotworowych.

A. Analiza markerów molekularnych o znaczeniu prognostycznym i predykcyjnym w pierwotnych ogniskach raka piersi

Markerem, który wydaje się mieć znaczenie zarówno rokownicze, jak i predykcyjne jest

topoizomeraza II alfa (TOP2A), enzym występujący w jądrze komórkowym i biorący udział w replikacji DNA. Stanowi cel molekularny grupy leków przeciwnowotworowych o szczególnym zastosowaniu

w raku piersi – antracyklin. Wysoka ekspresja TOP2A związana jest z szybką proliferacją komórek raka piersi. Podwyższony poziom białka TOP2A w komórce może wynikać z amplifikacji genu zlokalizowanego na chromosomie 17. w regionie q12-q21 – obszarze wykazującym często złożony wzór rearanżacji interchromosomalnych, obejmujących także jeden z najczęściej amplifikowanych w raku piersi genów – HER2 (ang. human epidermal growth factor receptor 2). Podobnie jak w przypadku HER2, zaobserwowano związek pomiędzy występowaniem amplifikacji/nadekspresji TOP2A i krótszym czasem przeżycia wolnego od nawrotu choroby (DFS, ang. disease free survival) i całkowitego przeżycia (OS, ang. overall survival) u chorych na raka piersi [9,10]. Sprawia to, że TOP2A jest uważana za potencjalny czynnik rokowniczy i predykcyjny w raku piersi, choć jej wartość nie została dotychczas ostatecznie potwierdzona.

Niejednoznaczne znaczenie kliniczne TOP2A częściowo wynika z różnorodnych metod używanych do jej oznaczania na poziomie DNA, mRNA i białka, co utrudnia porównywanie wyników uzyskiwanych przez poszczególne grupy badawcze. Najczęściej stosowana technika oceny liczby kopii genu TOP2A – fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) – pozwala na ilościowe oznaczenia, jest bardziej dokładna i powtarzalna niż IHC wykrywająca ilość białka. Mimo iż FISH uważany jest za złoty standard, technika ta ma pewne ograniczenia, a sposób oceny liczby kopii genu TOP2A oparty na proporcji liczby sygnałów z sondy komplementarnej do regionu zawierającego gen TOP2A i sekwencji centromeru 17. jest ostatnio kwestionowany [11]. Ponadto, ze względu na swoją niską rozdzielczość, metoda ta wydaje się oceniać raczej regionalne niż swoiste dla genu rearanżacje, stąd może niedokładnie przedstawiać status genu TOP2A.

Celem prowadzonych badań było opracowanie metody oznaczania liczby kopii genu TOP2A opartej na technice PCR w czasie rzeczywistym oraz zastosowanie jej do oznaczenia poziomu TOP2A w próbkach klinicznych pochodzących od chorych na raka piersi. Liczba kopii genu TOP2A została również określona techniką FISH, a wyniki obu metod porównane ze sobą i odniesione do poziomu białka TOP2A zbadanego metodą barwienia IHC mikromacierzy tkankowych.

Opracowana metoda oznaczania liczby kopii genu TOP2A opiera się na zastosowaniu

zaprojektowanych we własnym zakresie starterów oraz sond hydrolizujących. Liczba kopii genu TOP2A oznaczana była w sposób względny, wg metody Pfaffl’a (uwzględniającej wydajność amplifikacji każdego genu), w odniesieniu do liczby kopii genu referencyjnego APP (ang. amyloid precursor protein) w DNA badanej próbki nowotworowej i w odniesieniu do kalibratora (DNA wyizolowane ze krwi zdrowych kobiet). Sposób opracowania metody, wyznaczenia wartości odcięcia, a także parametry takie jak powtarzalność, odtwarzalność, zakres czy granica oznaczalności zostały przedstawione w pracy 4.1. Następnie metodę tę porównano z techniką FISH [praca 4.2-4.3] i z powszechnie stosowaną, łatwo dostępną i niedrogą techniką barwienia IHC [praca 4.3].

Gdy oznacza się amplifikację genu techniką FISH, odnosząc sygnał sondy dla danego genu do

sygnału dla centromeru, jak w przypadku pomiaru sygnału dla TOP2A, trudno ocenić, na ile potencjalne zaburzenia w rejonie centromerowym wpływają na ostateczny wynik. Dlatego kierowany przeze mnie zespół oznaczył dodatkowo polisomię chromosomu 17 [praca 4.2]. Amplifikacja i delecja TOP2A wykryte zostały odpowiednio w 31% i 11% badanych próbek w przypadku qPCR oraz w 23%

Autoreferat Załącznik nr 2

7

i 7% w przypadku zastosowania techniki FISH. Polisomia wystąpiła w 40% przypadków (59/149), z czego w większości przypadków nie towarzyszyły jej zaburzenia TOP2A (35/59, 59%). Zwiększoną ilość białka TOP2A odnotowano w 32% przypadków [praca 4.3]. Status TOP2A oznaczany metodą qPCR korelował z krótszym DFS i OS. Status TOP2A oznaczany metodą FISH ani polisomia nie niosły informacji rokowniczej [praca 4.2].

Porównanie wyników uzyskanych różnymi metodami ujawniło korelację wyników uzyskanych techniką qPCR i FISH (R=0,34; p=0,00002) [praca 4.3]. Poziom białka TOP2A nie korelował z liczbą kopii genu TOP2A.

Ponieważ uzyskane wstępnie wyniki, zaprezentowane w pracach 4.1 i 4.2, sugerowały

związek zaburzeń TOP2A oznaczanych metodą qPCR z czasem przeżycia chorych, postanowiłam poszerzyć badaną grupę, by zweryfikować kliniczne znaczenie obserwowanych zaburzeń. Znaczenie rokownicze statusu TOP2A, oznaczonego wcześniej opracowaną metodą, oceniono więc w grupie 322 chorych leczonych w kilku ośrodkach onkologicznych w Polsce [praca 4.3]. Podwyższony poziom genu TOP2A korelował z krótszym OS i DFS zarówno w analizie jednoczynnikowej, jak i wieloczynnikowej. Co ważne, korelacje z przeżyciem były szczególnie silne w grupie HER2-ujemnej, czego wcześniej nie opisywano. W pracy tej po raz pierwszy pokazałam, że u chorych na HER2-ujemnego raka piersi obserwuje się podwyższoną liczbę kopii genu TOP2A, która jest niekorzystnym czynnikiem rokowniczym. Ponieważ gen TOP2A leży w bliskości często amplifikowanego w raku piersi genu HER2, do tej pory uważano, że amplifikacja TOP2A współwystępuje z amplifikacją HER2. Stąd też większość prac analizowała TOP2A w grupie raków HER2-dodatnich [12,13]. Wcześniejsze prace z wykorzystaniem techniki FISH analizowały długie fragmenty chromosomu 17., na którym leży gen TOP2A. Sondy hybrydyzacyjne stosowane w FISH pozwalają wykryć rearanżacje wielkości 300 tysięcy par zasad (wielkość samego genu TOP2A – 30 tysięcy par zasad). Amplifikując krótsze fragmenty techniką qPCR, można wykryć małe zmiany w obrębie samego genu TOP2A, niewykrywalne techniką FISH. Stanowi to przyczynę, dla której zaproponowana przeze mnie metoda pozwoliła wykryć tak małe zmiany i opisać ich rokownicze znaczenie [praca 4.3].

Pokazałam również, że opracowana metoda może być stosowana w wycinkach nowotworu zatopionych w parafinie. Wyniki oznaczeń poziomu genu TOP2A oznaczonego w materiale mrożonym i FFPE silnie ze sobą korelowały (R=0,851; p<0,00001), a zgodność wyników wynosiła 92%.

Ze względu na wagę opisanych wyników praca "Prognostic Significance of TOP2A Gene Dosage in HER2-negative Breast Cancer" [praca 4.3] została zakwalifikowana jako materiał szkoleniowy Towarzystwa Onkologii Translacyjnej (Society for Translational Oncology) do programu „Continuing Medical Education” dla lekarzy.

Markerem molekularnym o szczególnym znaczeniu w raku piersi jest receptor estrogenowy (ER). W około 60-70% przypadków raka piersi obserwuje się obecność w guzie pierwotnym jądrowej formy ER, co jest czynnikiem zarówno rokowniczym, jak i predykcyjnym (warunkującym odpowiedź na terapię hormonalną). Nawet jednak w obrębie guzów ER-dodatnich zaobserwowano dużą heterogenność biologiczną i różne rokowanie. Analizując ekspresję 97 [14] lub 21 genów [15], związanych odpowiednio ze stopniem molekularnej złośliwości (tzw. GGI, genomic grade index) i wskaźnikiem nawrotu choroby (tzw. RS, recurrence score), wykazano istnienie różnic w rokowaniu chorych na ER-dodatniego raka piersi. Chore z niskim GGI lub niskim RS miały lepsze rokowania i odnosiły większe korzyści z mniej agresywnej terapii, natomiast u chorych z wysokimi wskaźnikami obserwowano korzyści związane z bardziej intensywnym leczeniem. Badania zespołu Holsta [16] wykazały, że analiza amplifikacji tylko jednego genu – genu receptora estrogenu (ESR1) kodującego białko ER, także pozwala na wykazanie różnic w prognozie i odpowiedzi na terapię, podobnie jak przy użyciu wspomnianych wyżej testów analizujących ekspresję 97 czy 21 genów. Wyników prac zespołu Holsta nie udało się jednak powtórzyć, a późniejsze prace wskazały na metodologiczne uchybienia, które mogły wpłynąć na błędną interpretację wyników [17].

Autoreferat Załącznik nr 2

8

W związku z niejednoznacznymi wynikami i niewielką liczbą prac podejmujących temat amplifikacji genu ESR1, zaprojektowałam badanie, którego celem było porównanie statusu genu ESR1 w grupie ER-dodatniej i ER-ujemnej (identyfikowanych IHC) i ocena jego znaczenia klinicznego [praca 4.4].

Do oznaczenia amplifikacji genu ESR1 opracowałam technikę PCR w czasie rzeczywistym, z użyciem krótkich hydrolizujących sond oligonukleotydowych typu LNA (ang. locked nucleic acids, Universal ProbeLibrary Probes), które charakteryzują się wyższą specyficznością i zakresem detekcji niż tradycyjne sondy hydrolizujące typu TaqMan. Analiza została wykonana zmodyfikowaną metodą Pfaffl’a, odnosząc liczbę kopii genu ESR1 w tkance guza do liczby kopii genu referencyjnego APP (którego amplifikacji nie obserwuje się w rakach piersi) oraz do kalibratora (DNA z leukocytów) [praca 4.4].

Analizując grupę guzów pierwotnych pochodzących od 281 chorych na raka piersi, amplifikację genu ESR1 stwierdzono w 12% przypadków [praca 4.4]. Co ciekawe, amplifikacja ESR1 wystąpiła również w podgrupie ER-ujemnej (w 18% przypadków). Amplifikacja wiązała się z gorszym rokowaniem zarówno w całej badanej grupie, jaki i u chorych z ER-ujemnymi guzami piersi, czego do tej pory nie opisywano.

Poza znaczeniem rokowniczym, obecność ER stanowi wskazanie do hormonoterapii. Lekiem

pierwszego wyboru u większości chorych, jeśli nie ma przeciwwskazań, jest tamoksyfen. Niestety, u około 35% chorych kwalifikujących się do leczenia tamoksyfenem obserwuje się brak korzyści związanej z leczeniem. Stąd wynika pilna potrzeba znalezienia czynników predykcyjnych, które mogłyby pomóc przewidzieć wrażliwość na leczenie tamoksyfenem. Na skuteczność terapii tamoksyfenem może wpływać nie tylko status receptora ER, ale również polimorfizmy genów kodujących produkty zaangażowane w jego metabolizm takich jak CYP2D6, CYP2C19, UGT2B15 czy polimorfizm genu kodującego ER (ESR1).

W pracy 4.4 przedstawiono wstępne wyniki analizy wybranych polimorfizmów genów związanych z metabolizmem tamoksyfenu: ESR1, CYP2C19, UGT2B15. Białko CYP2C19 to monooksygenaza uczestnicząca w bioaktywacji tamoksyfenu, natomiast UGT2B15 jest enzymem zaangażowanym w usuwanie aktywnych metabolitów tamoksyfenu z organizmu.

Polimorfizmy ESR1 Pvu II (rs2234693, zmiana nukleotydu T na C) oraz CYP2C19*2 (rs4244285, zmiana nukleotydu G na A) analizowane były techniką RFLP. Obecność polimorfizmu UGT2B15*2 (rs1902023, zmiana nukleotydu C na A) analizowana była techniką HRM. Wszystkie oznaczenia zostały wykonane na DNA izolowanym z leukocytów krwi obwodowej chorych na raka piersi.

W analizowanej podgrupie chorych leczonych tamoksyfenem amplifikacja genu ESR1 nie miała znaczenia rokowniczego. Chore z genotypem ESR1 Pvu II wt/wt oraz UGT2B15 wt/wt lub wt/*2 charakteryzowały się gorszymi wskaźnikami przeżycia, wyrażonymi zarówno krótszym DFS, jak i OS [praca 4.4]. Można przypuszczać, że jest to związane z niedostatecznym hamowaniem receptora ER (u chorych z genotypem ESR1 Pvu II wt/wt występuje podwyższona liczba kopii genu ESR1) oraz szybszym usuwaniem z organizmu aktywnych metabolitów tamoksyfenu w wyniku zwiększenia szybkości reakcji katalizowanej przez glukuronidazę UGT2B15 typu dzikiego.

B. Analiza markerów molekularnych w komórkach nowotworowych rozsianych drogą krwionośną i limfatyczną u chorych na raka piersi

Przedmiotem moich badań były nie tylko znane markery rokownicze i predykcyjne, takie jak

TOP2A czy ER oceniane w guzie pierwotnym, ale również potencjalne markery zaangażowane w proces przerzutowania. W kolejnych badaniach podjęłam próbę identyfikacji nowych czynników molekularnych o potencjalnym znaczeniu klinicznym w oparciu o analizę pierwotnych ognisk raka piersi i komórek nowotworowych rozsianych drogą krwionośną i limfatyczną u chorych na wczesnego raka piersi. Celem badań przedstawionych w pracach 4.5-4.8 było lepsze poznanie roli procesu przemiany epitelialno-mezenchymalnej (EMT, ang. epithelial-mesenchymal transition) w formowaniu przerzutów nowotworowych w raku piersi.

Autoreferat Załącznik nr 2

9

Główne zadania badawcze obejmowały 3 obszary:

1) badanie zdolności miejscowego naciekania guza pierwotnego i zmian w ekspresji genów, odpowiedzialnych za nabywanie przez komórki nowotworowe fenotypu mezenchymalnego, związanego z mobilnością i inwazyjnością;

2) molekularna charakterystyka krążących we krwi obwodowej komórek nowotworowych w poszukiwaniu czynników odpowiedzialnych za ich przeżycie, aktywację, a w efekcie proliferację i kolonizację nowego miejsca;

3) molekularna charakterystyka wyselekcjonowanych komórek nowotworowych obecnych w węzłach chłonnych pod kątem wyłonienia markerów pozwalających na wykrycie szczególnie agresywnych, zdolnych tworzyć przerzuty, subpopulacji.

Powstawanie przerzutów odległych jest główną przyczyną zgonów z powodu raka piersi.

Mimo to proces tworzenia przerzutów jest wciąż niedostatecznie poznanym aspektem choroby nowotworowej. Przerzutowanie jest skomplikowanym procesem, który dzieli się na kilka głównych etapów: (1) uwolnienie komórek nowotworowych z guza pierwotnego i inwazja otaczających tkanek, (2) wnikanie komórek nowotworowych do naczyń krwionośnych i limfatycznych – (intrawazacja) i ich przemieszczanie, (3) adhezja krążących komórek nowotworowych do śródbłonka naczyniowego i przenikanie na zewnątrz naczynia (ekstrawazacja), (4) kolonizacja nowego miejsca, utworzenie mikro- i makroprzerzutów w miejscach odległych. Do niedawna większość badań skupiała się na analizie ognisk pierwotnych guza, opierając się na liniowości procesu progresji nowotworu i przerzutach jako ostatnim, oddalonym w czasie, etapie kaskady metastatycznej. Jednak coraz więcej badań dostarcza dowodów na niezależny od guza pierwotnego, równoległy rozwój przerzutów odległych [18], co wskazuje na konieczność badania zarówno guza pierwotnego, jak i przerzutów.

Zdolność przemieszczania się komórki nowotworowej od miejsca wzrostu guza pierwotnego do narządu stanowiącego miejsce przerzutu zależy od wielu właściwości nabytych przez komórki rakowe, nawet już we wczesnych etapach kancerogenezy. Inwazyjność i ruchliwość komórek wiąże się z nabyciem przez nie fenotypu mezenchymalnego w procesie EMT [19]. W czasie tego procesu komórki nabłonkowe tracą polarność i połączenia międzykomórkowe, zyskując zdolność uwolnienia się z guza pierwotnego, aktywnej migracji oraz przenikania przez błonę podstawną. Proces EMT jest indukowany przez sygnały z mikrośrodowiska guza, takie jak czynniki produkowane przez komórki zrębu, niedotlenienie lub stan zapalny. Prowadzi to do obniżenia ekspresji białek epitelialnych (np. cytokeratyna 19, E-kadheryna) i jednoczesnego nabycia ekspresji białek mezenchymalnych (np. wimentyna, N-kadheryna)[20]. Zmiany fenotypowe komórek zachodzące podczas EMT są indukowane i podtrzymywane przez czynniki transkrypcyjne, takie jak TWIST, SNAIL i SLUG. Aktywacja procesu EMT w nowotworach wiązana jest także z takimi cechami jak: ekspresja metaloproteinaz, hamowanie śmierci komórkowej, wzrost oporności na atak ze strony układu immunologicznego oraz indukcja fenotypu komórek macierzystych [21,22].

Zrozumienie roli przerzutów do węzłów chłonnych w kaskadzie przerzutowania jest wciąż

marginalne. Zdolność nowotworu do tworzenia przerzutów do regionalnych węzłów chłonnych jest potwierdzonym czynnikiem rokowniczym w raku piersi i świadczy o zwiększonej agresywności guza i jego zdolności do formowania przerzutów odległych. Niemniej jednak, u około jednej trzeciej chorych bez zajętych węzłów chłonnych obserwuje się przerzuty odległe, natomiast jedna trzecia chorych z przerzutami do węzłów nie rozwija przerzutów odległych w okresie 10 lat od terapii [23,24]. Nie wiadomo, co dokładnie odróżnia rozsiane komórki nowotworowe zdolne do utworzenia mikro- a następnie makroprzerzutu od komórek nie posiadających tej cechy.

Celem prowadzonych badań było porównanie poziomu markerów związanych ze zjawiskiem

EMT w guzach pierwotnych i przerzutach do węzłów chłonnych [praca 4.5, 4.7]. Wyniki uzyskane zarówno w grupie retrospektywnej [praca 4.5], jak i prospektywnej [praca 4.7] pokazują, że status

Autoreferat Załącznik nr 2

10

czynników transkrypcyjnych indukujących EMT: TWIST1, SNAIL i SLUG różni się pomiędzy guzem pierwotnym a przerzutami do węzłów chłonnych na poziomie mRNA i białka. Poziom tych markerów był znacząco wyższy w węzłach chłonnych [prace 4.5, 4.7]. Podwyższona ekspresja TWIST1 i SNAIL w węzłach chłonnych korelowała z niekorzystnym rokowaniem chorych na raka piersi [praca 4.5]. Z kolei ekspresja tych samych czynników w guzie pierwotnym nie niosła żadnej informacji prognostycznej. Obserwowane zależności sugerują, że przerzuty zawierają wyselekcjonowaną populację komórek nowotworowych o zwiększonej złośliwości, które z powodzeniem oderwały się od guza pierwotnego i dzięki aktywacji procesu EMT skolonizowały nowe miejsce. Wydaje się, że profilowanie ekspresji genów w przerzutach może nieść dodatkową wartość prognostyczną i służyć za wyznacznik agresywności guza pierwotnego.

By wiarygodnie porównać ekspresję genów w materiale klinicznym z dwóch różnych źródeł

(guzów pierwotnych i przerzutów do węzłów chłonnych), kierowany przeze mnie zespół opracował dedykowany protokół reakcji qPCR, optymalizując sposób deparafinizacji (w przypadku materiału FFPE), izolacji RNA, odwrotnej transkrypcji i amplifikacji. Oznaczenia ekspresji genów wykonywane były w sposób względny (zmodyfikowaną metodą ΔΔCt) w odniesieniu do dwóch genów referencyjnych: GAPDH i YWHAZ oraz zdrowej tkanki. Geny referencyjne zostały wybrane na podstawie stabilności ich ekspresji (analizowanej programem geNorm) w danym materiale biologicznym. Dodatkowo dzięki zastosowaniu kalibratora (ang. inter-run calibrator), uwzględniano zmienność mierzonej ekspresji genów między eksperymentami. Analiza wyników wykonywana była w programie qBase PLUS 2.0, który umożliwia obliczenie współczynnika kalibrującego (ang. calibration factor), co pozwala na zminimalizowanie zmienności między analizowanymi płytkami [praca 4.5, 4.7].

Krążące komórki nowotworowe są bezpośrednimi mediatorami w procesie przerzutowania,

jednakże wiedza na ich temat jest wciąż niewystarczająca. Nowe odkrycia związane z plastycznością fenotypową warunkowaną procesem EMT zmieniły sposób patrzenia na CTC, co zostało podsumowane w pracy przeglądowej 4.6. Praca ta została opublikowana jako artykuł tytułowy w czasopiśmie Pathobiology i w ciągu niecałych 2 lat od ukazania się zacytowano ją 43 razy.

Obecność CTC stanowi uznany niekorzystny czynnik rokowniczy zarówno w zaawansowanym

[25,26], jak i wczesnym raku piersi [27,28]. W związku z tym, że pobranie krwi do badania CTC jest prostym nieinwazyjnym zabiegiem, możliwe jest wielokrotne pobieranie materiału i powtarzanie analiz w określonych przedziałach czasowych (tzw. płynna biopsja). Pozwala to na wykorzystanie CTC nie tylko do przewidywania przebiegu choroby, ale również do optymalizacji doboru terapii czy śledzenia skuteczności leczenia.

Równie duże znaczenie jak liczba CTC ma ich charakterystyka molekularna [29]. CTC mogą się różnić genotypowo i fenotypowo od guza pierwotnego [30,31,32]. Takie różnice pomiędzy guzem pierwotnym a CTC mogą wpływać na odpowiedź na leczenie, które według obecnego standardu postępowania ustala się na podstawie charakterystyki guza pierwotnego. Wyniki pierwszych badań klinicznych dotyczących zastosowania CTC w doborze leczenia, takich jak: GEPARQuattro czy SUCESS wskazują na możliwość indywidualizacji leczenia raka piersi w oparciu o profil molekularny CTC [33].

Wykrywanie CTC stanowi duże wyzwanie ze względu na ich niski odsetek we krwi obwodowej

oraz biologiczną heterogenność [34,35]. Wiele zagadnień związanych z wiarygodnym wykryciem CTC jest wciąż przedmiotem debaty. Dotyczą one precyzji, czułości i specyficzności metod, optymalnych punktów odcięcia do liczbowego oznaczania CTC czy zdolności określenia stanu CTC (żywe vs apoptotyczne, dzielące vs niedzielące). Do tej pory nie zidentyfikowano też markera dostatecznie specyficznego, by wykryć wszystkie CTC. Najczęściej wykorzystywany jest marker epitelialny EpCAM (np. przez metody CellSearch czy Adna). Jednak w świetle doniesień o roli EMT w nabywaniu przez komórki nowotworowe mobilności i inwazyjności, identyfikacja tylko CTC o fenotypie epitelialnym

Autoreferat Załącznik nr 2

11

jest niewystarczająca. Nie pozwala wykryć CTC o fenotypie mezenchymalnym, które wydają się być szczególnie agresywne ze względu na swe wyjątkowe właściwości (ucieczka przed śmiercią komórkową, oporność na atak ze strony układu immunologicznego, cechy komórek macierzystych), zdolność do przeżycia w krwiobiegu oraz kolonizacji nowego miejsca. Coraz powszechniej postuluje się konieczność profilowania molekularnego CTC, co mogłoby pozwolić na lepsze zrozumienie procesu przerzutowania i wskazanie, które spośród heterogennej populacji wykrywanych CTC są w stanie utworzyć przerzuty odległe. Ponadto charakterystyka molekularna CTC może pozwolić na ciągłe monitorowanie odpowiedzi chorych na leczenie i zmianę jego schematu przed pojawieniem się klinicznych objawów nawrotu choroby.

W ramach badań kierowanego przeze mnie zespołu opracowaliśmy własną metodę

wykrywania CTC. Stanowi ona część rozprawy doktorskiej Aleksandry Markiewicz, której jestem promotorem pomocniczym. Metoda pozwala nie tylko stwierdzić obecność CTC we krwi obwodowej chorych, ale również scharakteryzować je molekularnie. Umożliwia izolację większej liczby fenotypów CTC niż wyłącznie epitelialny oraz pozwala ocenić ich stopień złośliwości i zdolności do kolonizacji nowego miejsca. Metoda izolacji opiera się na rozdziale pełnej krwi na dwufazowym gradiencie gęstości, a następnie negatywnej selekcji immunomagnetycznej i profilowaniu molekularnemu uzyskanej frakcji z użyciem RT-qPCR. Do analizowanych markerów należą: czynniki transkrypcyjne indukujące EMT (TWIST1, SNAIL, SLUG), markery związane z fenotypem mezenchymalnym (wimentyna), z fenotypem inwazyjnym (HER2, CXCR4, uPAR) oraz markery potwierdzające epitelialne pochodzenie CTC (cytokeratyna 19, mammaglobina). Do zalet metody należy to, że jest oparta o detekcję kilku markerów molekularnych, co zwiększa jej wartość diagnostyczną. Dodatkowo, dzięki detekcji RNA pozwala na wykrycie żywych komórek.

Opracowaną, metodę po zgłoszeniu patentowym (nr P.403515), po raz pierwszy

przedstawiono w pracy 4.7, przygotowanej na zaproszenie komitetu redakcyjnego specjalnego wydania Cancers dotyczącego CTC, kierowanego przez prof. Klausa Pantela, światowego eksperta zajmującego się tymi komórkami. Szczegółowe dane dotyczące charakterystyki fenotypów identyfikowanych nowo opracowaną metodą zostały zawarte w pracy opublikowanej w PlosOne [praca 4.8]. W grupie chorych na wczesnego raka piersi stwierdzono występowanie zarówno fenotypu epitelialnego, jak i mezenchymalnego CTC. CTC o fenotypie mezenchymalnym charakteryzowały się kilkukrotnie wyższym (w porównaniu do fenotypu epitelialnego) poziomem markerów związanych z inwazyjnością (uPAR, CXCR4). CTC wykrywano częściej u chorych z przerzutami do węzłów chłonnych (N+) niż u chorych bez zajętych węzłów (N-), co wskazuje, że u chorych N+ potencjał guza do „rozsiewania” komórek nowotworowych jest wyższy. Co ciekawe, mezenchymalny fenotyp CTC korelował z zajęciem większej liczby węzłów chłonnych. Wydaje się więc, że podwyższona zdolność do tworzenia przerzutów przez CTC o fenotypie mezenchymalnym może wynikać z wyższej ekspresji receptorów CXCR4 i uPAR [praca 4.8]. Wyniki wstępnej analizy wskazują, że obecność CTC, zwłaszcza o fenotypie mezenchymalnym korelowała z większą liczbą zgonów wśród chorych (praca w recenzji).

W przestawionym powyżej cyklu prac można wyróżnić 2 obszary o znaczeniu praktycznym:

1. Opracowanie nowych procedur wiarygodnego badania uznanych i potencjalnych markerów molekularnych, z uwzględnieniem analitycznej i klinicznej wiarygodności metody, jak również jej klinicznej użyteczności (standaryzacja metod, walidacja, badania retrospektywne na archiwalnym materiale klinicznym, badania prospektywne na bieżąco gromadzonych próbkach klinicznych, obejmujące badania typu „proof of concept”). Wśród nowo opracowanych procedur badawczych należy wymienić:

a. Protokół badania amplifikacji genu TOP2A, pozwalający na analizę rearanżacji w obrębie samego genu TOP2A, a nie zmian regionalnych jak w przypadku zastosowania techniki FISH [praca 4.1, 4.2]. Amplifikacja genu TOP2A oznaczona tym protokołem niesie

Autoreferat Załącznik nr 2

12

informację prognostyczną, informując o niekorzystnym rokowaniu u chorych na raka piersi. Po raz pierwszy opisaliśmy niekorzystne znaczenie rokownicze amplifikacji TOP2A również w grupie bez amplifikacji HER2 [praca 4.3].

b. Protokół badania amplifikacji genu ESR1 pozwolił w sposób szybki i specyficzny (dzięki zastosowaniu sond LNA) określić częstość występowania amplifikacji i jej kliniczne znaczenie. Amplifikacja ESR1 wiązała się z gorszym rokowaniem zarówno w całej badanej grupie, jaki i u chorych z ER-ujemnym rakiem piersi [praca 4.4].

c. Protokół oznaczania wybranych polimorfizmów genów związanych z metabolizmem tamoksyfenu pozwolił na zidentyfikowanie wariantów polimorficznych (ESR1 Pvu II wt/wt i UGT2B15 wt/wt lub wt/*2) związanych z gorszą odpowiedzią na leczenie tamoksyfenem [praca 4.4].

d. Protokół oznaczania amplifikacji [praca 4.3] i ekspresji [praca 4.6] genów w archiwalnym materiale. Dzięki wysokiej dokładności i precyzji, dobrej powtarzalności wyników, które są porównywalne z wynikami uzyskanymi dla materiału mrożonego, protokół pozwala na profilowanie molekularne materiału w bloczkach parafinowych, łatwo dostępnych w szpitalnych zbiorach. Analiza archiwalnych tkanek od chorych, dla których często są dostępne wskaźniki przeżycia, mogłaby znacząco przyspieszyć tempo identyfikacji i walidacji nowych czynników rokowniczych i predykcyjnych wykorzystywanych w doborze bardziej spersonalizowanych terapii.

e. Protokół izolacji i profilowania molekularnego CTC (oryginalne rozwiązanie zgłoszone w Urzędzie Patentowym RP). Metoda ta pozwala nie tylko stwierdzić obecność tych komórek, ale również je scharakteryzować molekularnie. Jej wyjątkowość polega na tym, że w odróżnieniu od komercyjnie dostępnych metod, wychwytuje również komórki o szczególnie agresywnym fenotypie mezenchymalnym [praca 4.7, 4.8]. Podkreślić należy, że badanie to jest nieinwazyjne, wymaga tylko pobrania krwi od chorej, może być więc wykonywane wielokrotnie w czasie leczenia. Może być zatem ważnym narzędziem w rękach lekarzy, wspomagając indywidualizację leczenia chorych na raka piersi, dokładniejsze monitorowanie przebiegu choroby i odpowiedzi na leczenie.

2. Identyfikacja nowych nowotworowych markerów molekularnych w oparciu o lepsze zrozumienie biologii nowotworów (badania typu „hypothesis generating studies”):

a. Analiza profili molekularnych komórek nowotworowych rozsianych drogą limfatyczną pokazała, że poziom mRNA czynników transkrypcyjnych koordynujących EMT (TWIST1, SNAIL, SLUG) był wyższy w przerzutach do węzłów chłonnych niż w guzach pierwotnych i korelował ze skróconym czasem przeżycia chorych. Takiej zależności nie obserwowano w guzie pierwotnym, co potwierdza hipotezę o selekcji szczególnie agresywnych klonów komórek nowotworowych poza pierwotnym ogniskiem guza. Uzyskane wyniki wskazują, że profilowanie ekspresji genów w przerzutach może nieść dodatkową wartość prognostyczną i służyć za wyznacznik agresywności guza pierwotnego [praca 4.6].

b. Analiza profili molekularnych CTC wyłoniła podgrupy tych komórek zarówno o fenotypie epitelialnym, jak i mezenchymalnym. Występowanie fenotypu mezenchymalnego CTC korelowało z podwyższonym poziomem markerów związanych z inwazyjnością (uPAR, CXCR4) i większą liczbą przerzutów do węzłów chłonnych. Wydaje się więc, że podwyższona zdolność do tworzenia przerzutów CTC o fenotypie mezenchymalnym może wynikać z wyższej ekspresji receptorów CXCR4 i uPAR. Uzyskane wyniki wskazują, że opracowano wiarygodną metodę izolacji CTC z krwi obwodowej, która pozwala określić profil molekularny komórek i wychwycić szczególnie agresywne komórki o zwiększonym potencjale tworzenia przerzutów [praca 4.7, 4.8].

Autoreferat Załącznik nr 2

13

Podsumowując, przedstawione prace stanowią ważny wkład w pogłębienie wiedzy na temat biologii i kliniki raka piersi. W pracach pokazano nowe dane dotyczące znanych już markerów molekularnych oznaczanych w guzie pierwotnym, takie jak: negatywna wartość rokownicza TOP2A w grupie chorych z HER2-ujemnym rakiem piersi, czy znaczenie rokownicze amplifikacji ESR1. Co ważne, uzyskane wyniki wskazują, że profilowanie ekspresji genów w ogniskach przerzutowych może nieść dodatkową wartość prognostyczną i służyć za wyznacznik agresywności guza pierwotnego. Dokładniejsza charakterystyka rozsianych drogą limfatyczną i krwionośną komórek nowotworowych umożliwiła wytypowanie nowych biomarkerów charakterystycznych dla szczególnie agresywnych, zdolnych tworzyć przerzuty komórek, które posiadły już zdolność do oderwania się od guza pierwotnego i kolonizacji nowego miejsca. Biomarkery te będą poddawane walidacji w kolejnych badaniach. Lepsze zrozumienie istoty procesu przerzutowania może pozwolić na opracowanie nowych ukierunkowanych molekularnie, dopasowanych indywidualnie strategii diagnostyczno-terapeutycznych w raku piersi. Bibiografia 1. McShane LM, Altman DG, Sauerbrei W, Taube SE, Gion M, et al. (2005) REporting recommendations for

tumour MARKer prognostic studies (REMARK). Br J Cancer 93: 387-391. 2. Bustin SA, Benes V, Garson JA, Hellemans J, Huggett J, et al. (2009) The MIQE guidelines: minimum

information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical chemistry 55: 611-622. 3. Febbo PG, Ladanyi M, Aldape KD, De Marzo AM, Hammond ME, et al. (2011) NCCN Task Force Report:

Evaluating the Clinical Utility of Tumor Markers in Oncology. Journal of the National Comprehensive Cancer Network 9: S-1-S-32.

4. Didkowska J, Wojciechowska U, Zatoński W (2013) Nowotwory złośliwe w Polsce w 2011 roku. Warszawa: Krajowy Rejestr Nowotworów.

5. Tevaarwerk AJ, Gray RJ, Schneider BP, Smith ML, Wagner LI, et al. (2013) Survival in patients with metastatic recurrent breast cancer after adjuvant chemotherapy. Cancer 119: 1140-1148.

6. Stephens PJ, Tarpey PS, Davies H, Van Loo P, Greenman C, et al. (2012) The landscape of cancer genes and mutational processes in breast cancer. Nature 486: 400-404.

7. TCGA (2012) Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature 490: 61-70. 8. Perou CM, Sorlie T, Eisen MB, van de Rijn M, Jeffrey SS, et al. (2000) Molecular portraits of human breast

tumours. Nature 406: 747-752. 9. Knoop AS, Knudsen H, Balslev E, Rasmussen BB, Overgaard J, et al. (2005) Retrospective Analysis of

Topoisomerase IIa Amplifications and Deletions As Predictive Markers in Primary Breast Cancer Patients Randomly Assigned to Cyclophosphamide, Methotrexate, and Fluorouracil or Cyclophosphamide, Epirubicin, and Fluorouracil: Danish Breast Cancer Cooperative Group Journal of Clinical Oncology 23: 7483-7490.

10. O’Malley F, Chia S, Tu D, Shepherd L, Levine M, et al. (2011) Topoisomerase II alpha protein and responsiveness of breast cancer to adjuvant chemotherapy with CEF compared to CMF in the NCIC CTG randomized MA.5 adjuvant trial. Breast Cancer Research and Treatment 128: 401-409.

11. Vanden Bempt I, Van Loo P, Drijkoningen M, Neven P, Smeets A, et al. (2008) Polysomy 17 in breast cancer: clinicopathologic significance and impact on HER-2 testing. J Clin Oncol 26: 4869-4874.

12. Leo AD, Gancberg D, Larsimont D, Tanner M, Jarvinen T, et al. (2002) HER-2 Amplification and Topoisomerase II alpha Gene Aberrations as Predictive Markers in Node-positive Breast Cancer Patients Randomly Treated Either with an Anthracycline-based Therapy or with Cyclophosphamide, Methotrexate, and 5-Fluorouracil. Clinical Cancer Research 8: 1107–1116.

13. Tanner M, Isola J, Wiklund T, Erikstein B, Kellokumpu-Lehtinen P, et al. (2006) Topoisomerase IIα Gene Amplification Predicts Favorable Treatment Response to Tailored and Dose-Escalated Anthracycline-Based Adjuvant Chemotherapy in HER-2/neu–Amplified Breast Cancer: Scandinavian Breast Group Trial 9401. Journal of Clinical Oncology 24: 2428-2436.

14. Loi S, Haibe-Kains B, Desmedt C, Lallemand F, Tutt AM, et al. (2007) Definition of clinically distinct molecular subtypes in estrogen receptor-positive breast carcinomas through genomic grade. J Clin Oncol 25: 1239-1246.

Autoreferat Załącznik nr 2

14

15. Paik S, Tang G, Shak S, Kim C, Baker J, et al. (2006) Gene expression and benefit of chemotherapy in women with node-negative, estrogen receptor-positive breast cancer. J Clin Oncol 24: 3726-3734.

16. Holst F, Stahl PR, Ruiz C, Hellwinkel O, Jehan Z, et al. (2007) Estrogen receptor alpha (ESR1) gene amplification is frequent in breast cancer. Nat Genet 39: 655-660.

17. Ooi A, Inokuchi M, Harada S, Inazawa J, Tajiri R, et al. (2012) Gene amplification of ESR1 in breast cancers—fact or fiction? A fluorescence in situ hybridization and multiplex ligation-dependent probe amplification study. The Journal of Pathology 227: 8-16.

18. Klein CA (2009) Parallel progression of primary tumours and metastases. Nat Rev Cancer 9: 302-312. 19. Hanahan D, Weinberg RA (2011) Hallmarks of cancer: the next generation. Cell 144: 646-674. 20. Klymkowsky MW, Savagner P (2009) Epithelial-mesenchymal transition: a cancer researcher's conceptual

friend and foe. The American journal of pathology 174: 1588-1593. 21. Thiery JP, Acloque H, Huang RYJ, Nieto MA (2009) Epithelial-Mesenchymal Transitions in Development and

Disease. Cell 139: 871-890. 22. Mani SA, Guo W, Liao MJ, Eaton EN, Ayyanan A, et al. (2008) The epithelial-mesenchymal transition

generates cells with properties of stem cells. Cell 133: 704-715. 23. Rosen PP, Groshen S, Saigo PE, Kinne DW, Hellman S (1989) Pathological prognostic factors in stage I

(T1N0M0) and stage II (T1N1M0) breast carcinoma: a study of 644 patients with median follow-up of 18 years. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology 7: 1239-1251.

24. Hellman S (1994) Karnofsky Memorial Lecture. Natural history of small breast cancers. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology 12: 2229-2234.

25. Cristofanilli M, Budd GT, Ellis MJ, Stopeck A, Matera J, et al. (2004) Circulating Tumor Cells, Disease Progression, and Survival in Metastatic Breast Cancer. New England Journal of Medicine 351: 781-791.

26. Giuliano M, Giordano A, Jackson S, Hess K, De Giorgi U, et al. (2011) Circulating tumor cells as prognostic and predictive markers in metastatic breast cancer patients receiving first-line systemic treatment. Breast Cancer Research 13: R67.

27. Lucci A, Hall CS, Lodhi AK, Bhattacharyya A, Anderson AE, et al. (2012) Circulating tumour cells in non-metastatic breast cancer: a prospective study. The Lancet Oncology 13: 688-695.

28. Ignatiadis M, Kallergi G, Ntoulia M, Perraki M, Apostolaki S, et al. (2008) Prognostic Value of the Molecular Detection of Circulating Tumor Cells Using a Multimarker Reverse Transcription-PCR Assay for Cytokeratin 19, Mammaglobin A, and HER2 in Early Breast Cancer. Clinical Cancer Research 14: 2593-2600.

29. Lianidou ES, Mavroudis D, Georgoulias V (2013) Clinical challenges in the molecular characterization of circulating tumour cells in breast cancer. British journal of cancer 108: 2426-2432.

30. Ignatiadis M, Rothé F, Chaboteaux C, Durbecq V, Rouas G, et al. (2011) HER2-Positive Circulating Tumor Cells in Breast Cancer. PLoS ONE 6: e15624.

31. Fehm T, Muller V, Aktas B, Janni W, Schneeweiss A, et al. (2010) HER2 status of circulating tumor cells in patients with metastatic breast cancer: a prospective, multicenter trial. Breast cancer research and treatment 124: 403-412.

32. Georgoulias V, Bozionelou V, Agelaki S, Perraki M, Apostolaki S, et al. (2012) Trastuzumab decreases the incidence of clinical relapses in patients with early breast cancer presenting chemotherapy-resistant CK-19mRNA-positive circulating tumor cells: results of a randomized phase II study. Annals of Oncology 23: 1744-1750.

33. Bidard F-C, Fehm T, Ignatiadis M, Smerage J, Alix-Panabières C, et al. (2013) Clinical application of circulating tumor cells in breast cancer: overview of the current interventional trials. Cancer and Metastasis Reviews 32: 179-188.

34. Lianidou ES, Markou A (2011) Circulating Tumor Cells in Breast Cancer: Detection Systems, Molecular Characterization, and Future Challenges. Clinical Chemistry 57: 1242-1255.

35. Alix-Panabieres C, Pantel K (2014) Challenges in circulating tumour cell research. Nature Reviews Cancer 14: 623-631.

Autoreferat Załącznik nr 2

15

5. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo - badawczych Dorobek naukowy (szczegółowo w załączniku nr 4) Łączna liczba publikacji pełnotekstowych (z wyłączeniem prac z cyklu habilitacyjnego): 22 (w tym pierwszy autor w 3 pracach, autor korespondencyjny w 8 pracach), suma IF = 36,695, MNiSW = 308, w tym:

przed doktoratem 5 publikacji o IF = 5,057, MNiSW = 35;

po doktoracie 17 publikacji (w tym pierwszy autor w 3 pracach, autor korespondencyjny w 8 pracach) o IF=31,638, MNiSW = 273;

Cykl habilitacyjny: 8 publikacji (w tym pierwszy autor w 3 pracach, autor korespondencyjny w 8 pracach) o IF = 20,168, MNiSW = 232. Sumaryczna liczba publikacji pełnotekstowych (z pracami z cyklu habilitacyjnego): 30 (w tym pierwszy autor w 6 pracach, autor korespondencyjny w 16 pracach), suma IF = 56,863, MNiSW = 540. Łączna liczba streszczeń zjazdowych 63 (16 przed uzyskaniem stopnia doktora, 47 po uzyskaniu stopnia doktora): 38 na konferencjach zagranicznych i 25 na konferencjach krajowych. Prace były cytowane 177 razy, a wyłączając autocytowania 159 razy. Indeks Hirsha wynosi 6 (dane z Web of Science z dnia 23.09.2014).

Projekty badawcze poza projektami wymienionymi w pkt. 4 autoreferatu:

1. FNP MISTRZ (2014-2016) – Prognostic and predictive significance of microRNA in colon cancer (doradca z zakresu biologii molekularnej);

2. FNP FOCUS (2012-2014) – Parallel progression model of sporadic breast cancer in the context of early stage somatic mosaicism for genomic structural alterations (wykonawca);

3. NCN N N402 686240 (2011-2013) – Wykorzystanie polimorfizmów genów CYP2D6 i CYP19 jako markerów predykcyjnych w hormonoterapii raka piersi (wykonawca);

4. UG-BW 538-M030-0743-1 (2011) – Zdolność tworzenia mammosfer w warunkach in vitro przez komórki raka piersi uzyskane z guzów pierwotnych (kierownik projektu);

5. MNiSW N407 571538 (2010-2013) – Znaczenie kliniczne badań genomicznych i proteomicznych w raku trzonu macicy – implikacje diagnostyczne, prognostyczne i predykcyjne (wykonawca);

6. Grant LSHC-CT-2004-503426 (2004-2009) – 6. Program Ramowy Badań i Rozwoju Technicznego pt: „Tranlating molecular knowledge into early breast cancer management: building on the BIG (Breast International Group) network for improved treatment tailoring – TRANS-BIG” (współkoordynator części polskiej projektu);

7. KBN (2002-2004) – Polimorfizm sekwencji mikrosatelitarnych (CA)n onkogenu erbB-1 (egfr) jako nowy marker zaburzeń genetycznych w raku sutka (główny wykonawca);

8. KBN (2002-2003) – Amplifikacja onkogenów erbB-1 i erbB-2 w niedrobnokomórkowym raku płuc (główny wykonawca);

9. KBN (2002-2003) – Amplifikacja genów z rodziny erbB w rakach gruczołu tarczowego u ludzi (główny wykonawca);

Autoreferat Załącznik nr 2

16

10. KBN (2000-2001) – Amplifikacja genów z rodziny erbB w ludzkich guzach chromochłonnych (pheochromocytoma) (główny wykonawca);

11. B000-5-0134-9 (1999-2000) – Grant przygotowawczy BW UG. Badanie mutacji genów vhl, ret i genów rodziny erbB (erbB-1, erbB-2, erbB-3, erbB-4) w guzach chromochłonnych (pheochromocytoma). Porównanie i standaryzacja metod izolacji DNA z bloczków parafinowych oraz ocena przydatności izolowanego DNA do analizy mutacji metodami SSCP i ddPCR (wykonawca).

Przebieg pracy naukowej przed uzyskaniem stopnia doktora

Działalność naukową rozpoczęłam podczas badań związanych z pracą magisterską realizowaną w Katedrze Biotechnologii na Międzyuczelnianym Wydziale Biotechnologii Uniwersytetu Gdańskiego i Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego (MWB UG-GUMed) pod opieką prof. dr hab. Krzysztofa Bielawskiego. Wiodącym tematem była analiza markerów molekularnych i chemiowrażliwości in vitro u chorych na niedrobnokomórkowego raka płuca. Część doświadczalna pracy została wykonana w Ibbenbüren w Niemczech w laboratorium należącym do sieci European Laboratory Association, zajmującym się molekularną diagnostyką chorób nowotworowych. Uzyskane wyniki zostały opublikowane w pracy:

Vogt U, Żaczek A, Klinke F, Granetzny A, Bielawski KP, Falkiewicz B. p53 gene status in relation to ex vivo chemosensitivity of non-small cell lung cancer. J Cancer Res Clin Oncol 2002; 128: 141-147. IF 2,197; MNiSW 11.

Bezpośrednio po obronie pracy magisterskiej w 2000 roku rozpoczęłam studia doktoranckie na MWB UG-GUMed, będąc równocześnie słuchaczką Studium Medycyny Molekularnej w Warszawie. Rozprawę doktorską zatytułowaną „Analysis of occurrence of erbB oncogene abnormalities in Polish population of breast cancer patients” przygotowaną pod opieką prof. dr hab. Anny Podhajskiej, obroniłam w październiku 2004 roku, uzyskując stopień doktora nauk biologicznych w zakresie biochemii. Przedmiotem mojej pracy doktorskiej była kompleksowa analiza występowania i znaczenia zaburzeń onkogenów rodziny erbB u chorych na raka piersi. Część pracy doktorskiej została wykonana we współpracy z laboratorium prof. dr hab. B. Brandta z Instytutu Chemii Klinicznej i Medycyny Laboratoryjnej w Münster w Niemczech w ramach projektu naukowego mającego na celu zbadanie polimorfizmu populacyjnego sekwencji powtórzonych (CA)n w genie ERBB1 i jego roli jako potencjalnego markera prognostycznego. W realizacji tego projektu uczestniczyły również zespoły klinicystów z Kliniki Chirurgii Plastycznej i Leczenia Oparzeń Akademii Medycznej w Gdańsku (AMG), Kliniki Onkologii i Radioterapii AMG, z Centrum Onkologii w Warszawie oraz z Regionalnego Centrum Onkologii w Bydgoszczy. Rezultatem prac prowadzonych w ramach doktoratu są następujące publikacje (ukazały się po obronie pracy doktorskiej):

Bielawski KP, Klos P, Welnicka-Jaskiewicz M, Tidow N, Brandt B, Falkiewicz B, Żaczek A. An epidermal growth factor receptor intron 1 polymorphism in healthy women in Poland. Int J Biol Markers 2005; 20:184-188. IF 1,098; MNiSW 15.

Żaczek A, Welnicka-Jaskiewicz M, Brandt B, Bielawski KP. Modified direct-double-differential PCR for gene dosage quantification of HER2. Oncol Rep 2005; 13: 971-975. IF 1,572; MNiSW 10.

Żaczek A, Brandt B, Bielawski KP. The diverse signaling network of EGFR, HER2, HER3 and HER4 tyrosine kinase receptors and the consequences for therapeutic approaches [review]. Histology and Histopathology, 2005; 20:1005-1015. IF 2,023; MNiSW 20.

Welnicka-Jaskiewicz M, Żaczek A, Brandt G, Bielawski KP, Jaśkiewicz J, Konopa K, Jassem J. (CA)n Microsatellite polymorphism of ERBB-1 in breast cancer patients. Eur J Cancer, 2006; 42:1698-1701. IF 4,167; MNiSW 20.

Autoreferat Załącznik nr 2

17

Żaczek A, Bielawski KP, Jaśkiewicz J, Badzio A, Olszewski W, Rhone P, Jassem J. Gene copy numbers of HER family in breast cancer. J Cancer Res Clin Oncol, 2008; 134:271-9. IF 2,217; MNiSW 20.

W czasie studiów doktoranckich uczestniczyłam również w realizacji kilku innych projektów

związanych z diagnostyką molekularną nowotworów. Przedmiotem moich badań była amplifikacja genów z rodziny erbB w ludzkich guzach chromochłonnych (pheochromocytoma). Projekt realizowany był we współpracy z Kliniką Chorób Wewnętrznych, Endokrynologii i Zaburzeń Homeostazy AMG. Ponieważ materiał do badań tego rzadkiego schorzenia pochodził z bloczków parafinowych archiwizowanych na przestrzeni ponad 20 lat, tkanki szczególnie trudnej w obróbce w kontekście badań molekularnych, przedmiotem badań było również opracowanie dedykowanej metody izolacji DNA o jakości wystarczającej do analizy zaburzeń DNA metodami SSCP i ddPCR. Opracowanie odpowiedniego dla materiału archiwalnego warsztatu, umożliwiło nam realizację kolejnego projektu. Miał na celu ocenę statusu wszystkich genów z rodziny erbB w rakach gruczołu tarczowego u ludzi, co według naszej wiedzy było największą w tamtym czasie pracą na ten temat w skali międzynarodowej. Wyniki naszych prac zostały opublikowane:

Sworczak K, Żaczek A, Lisowska U, Babińska A, Falkiewicz B, Bielawski KP. Dysregulation of erbB family genes and ErbB (HER) receptors in pheochromocytoma [praca przeglądowa]. Wsp Onkol 2004; 8: 213-218. MNiSW 2.

Sworczak K, Babińska A, Żaczek A, Lisowska U, Bielawski KP, Falkiewicz B. Amplification of erbB family oncogenes in human pheochromocytomas. Oncol Rep 2002; 9: 3373 –3378. IF 1,171; MNiSW 9.

Bielawski KP, Żaczek A, Lisowska U, Dybikowska A, Kowalska A, Falkiewicz B. The suitability of DNA extracted from formalin-fixed, paraffin-embedded tissues for double differential polymerase chain reaction (ddPCR) analysis; comparison of various paraffin removal and DNA isolation procedures. Int J Mol Med 2001; 8: 573-578. IF 1,689; MNiSW 10.

Sworczak K, Żaczek A, Antolak A, Wiśniewski P, Falkiewicz B, Bielawski KP. Zaburzenia genów rodziny erbB i receptorów ErbB (HER) w rakach gruczołu tarczowego u ludzi. Endokrynol Pol 2004; 55:615-624. MNiSW 2.

Przebieg pracy naukowej po uzyskaniu stopnia doktora

Po obronie doktoratu rozpoczęłam pracę w Klinice Onkologii i Radioterapii GUMed kierowanej przez prof. dr hab. Jacka Jassema, zajmując się koordynacją akademickich badań klinicznych o charakterze translacyjnym, takich jak: MINDACT czy TransHERA. Pierwsze z nich realizowane było w ramach projektu o akronimie „TRANSBIG” pod auspicjami 6. Programu Ramowego Unii Europejskiej. Projekt miał na celu prospektywną ocenę klinicznej przydatności molekularnego profilu ekspresji genów w kwalifikacji chorych na raka piersi do pooperacyjnej chemioterapii. Badanie MINDACT, zakładając rekrutację 6000 chorych, stanowiło w tamtym czasie największe przedsięwzięcie typu translational research w onkologii w skali świata. TransHERA to badanie translacyjne powiązane z badaniem klinicznym HERA (badanie skuteczności leczenia preparatem Herceptin®), zakładające analizę wycinków raka piersi i surowicy od chorych włączonych do badania klinicznego HERA w celu określenia charakterystyki molekularnej guza i odniesienia jej do odpowiedzi na leczenie oraz możliwości wykrycia choroby resztkowej albo nawrotu choroby. Miałam również okazję współtworzyć w Klinice Onkologii i Radioterapii bank materiału biologicznego pochodzącego od chorych na raka piersi, opracowując procedury pobierania i gromadzenia próbek, ich przechowywania, transportu do laboratorium, a także gromadzenia danych klinicznych w bazie danych.

Od roku 2007 jestem zatrudniona na stanowisku adiunkta w kierowanym przez prof. dr hab.

Jacka Bigdę Zakładzie Biologii Komórki Katedry Biotechnologii Medycznej na MWB UG-GUMed. Głównym przedmiotem moich zainteresowań naukowych są badania typu translacyjnego oraz

Autoreferat Załącznik nr 2

18

zastosowanie technik diagnostyki molekularnej w optymalnym stosowaniu terapii celowanych, z naciskiem na oznaczanie markerów prognostycznych i ukierunkowujących terapię w raku piersi i innych nowotworach. Wciąż rozwijany warsztat badawczy opiera się na technikach amplifikacji kwasów nukleinowych, analizie immunocytochemicznej i immunofluorescencyjnej białek oraz analizie cytometrycznej całych komórek. Umożliwia badanie danego markera na poziomie DNA, RNA, jak i białka, co znacznie zwiększa wiarygodność uzyskiwanych wyników. Pozwala na opracowywanie nowoczesnych narzędzi diagnostycznych opartych o metody biologii molekularnej, które będą mogły być wykorzystywane w diagnostyce nowotworów. Zbudowana platforma badawcza stanowi dogodną płaszczyznę współpracy z klinicystami z ośrodków onkologicznych, czego wyrazem jest 15 wspólnie realizowanych i zrealizowanych projektów badawczych (z czego kierowałam sześcioma).

Tematem badawczym realizowanym od 2010 roku w ramach współpracy z Katedrą i Kliniką

Ginekologii, Ginekologii Onkologicznej i Endokrynologii Ginekologicznej GUMed są markery molekularne o znaczeniu diagnostycznym, prognostycznym i predykcyjnym w raku trzonu macicy. Projekt, kierowany przez dr Sylwię Łapińską-Szumczyk, zakładał kompleksową analizę markerów molekularnych, które mogłyby lepiej różnicować raka trzonu macicy, korelować z charakterystyką kliniczną, patologiczną i czasem przeżycia oraz pozwolić na optymalizację leczenia chorych. W ramach prowadzonych badań oznaczono: liczbę kopii 10 genów (TOP2A, ERBB1, ERBB2, ERBB3, ERBB4, MYC, CCND1, PI3K, RAD21, ESR1) metodą qPCR; poziom ekspresji 6 genów (MGB1, RAD21, RUNX1, CD133, SNAIL, SLUG) metodą RT-qPCR; poziom ekspresji 14 białek (ESR1, PGR, ERBB1, ERBB2, ERBB3, ERBB4, PIK3CA, pAKT1, MYC, TOP2A, CDKN2A, TP53, RAD21, RUNX1) metodą barwienia IHC. Łącznie zbadano 30 markerów o potencjalnym znaczeniu klinicznym w grupie ponad 450 chorych na raka trzonu macicy.

Na szczególne podkreślenie zasługuje opracowanie dedykowanej platformy badawczej umożliwiającej równoczesne badanie zmian liczby kopii 10 genów. Dzięki użyciu tej metody stwierdzono, że zmiany liczby kopii genów szlaku ERBB-PI3K/AKT wiążą się z bardziej agresywnym przebiegiem choroby i niekorzystnym rokowaniem u chorych na raka trzonu macicy (Supernat i wsp., 2013). Co więcej, analiza heterogenności guzów na poziomie białek wykazała, że wysoki stopień heterogenności koreluje z gorszą prognozą (Supernat i wsp., 2014).

Badania te stanowią podstawę rozprawy doktorskiej Anny Supernat (jestem jej promotorem pomocniczym), a uzyskane wyniki zostały przedstawione w poniższych publikacjach:

Lapińska-Szumczyk S, Supernat A, Żaczek AJ, Majewska H, Gulczyński J, Sawicki S, Biernat W, Wydra D. Rak błony śluzowej trzonu macicy u młodych kobiet – aspekty kliniczne i molekularne. Gin Pol 2014; 85:754-759 [w druku].

Lapińska-Szumczyk S, Supernat A, Majewska H, Gulczyński J, Łuczak A, Biernat W, Wydra D, Żaczek AJ. HER2-positive endometrial cancer subtype carries poor prognosis. Clin Transl Sci 2014, doi:

10.1111/cts.12207. IF 2,11; MNiSW 25.

Supernat A, Lapińska-Szumczyk S, Majewska H, Gulczyński J, Biernat W, Wydra D, Żaczek AJ. Tumour heterogeneity at protein level as an independent prognostic factor in endometrial cancer. Transl Oncol 2014 doi: 10.1016/j.tranon.2014.06.001. IF 2,558; MNiSW 25.

Supernat A, Lapińska-Szumczyk S, Majewska H, Gulczyński J, Biernat W, Wydra D, Żaczek AJ. A multimarker qPCR platform for the characterisation of endometrial cancer. Oncol Rep 2014; 31:1003-13. IF 2,191; MNiSW 20.

Supernat A, Lapińska-Szumczyk S, Majewska H, Gulczyński J, Biernat W, Wydra D, Żaczek AJ. Epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cells in endometrial cancer. Anticancer Res 2013; 33:5461-9. IF 1,783; MNiSW 25.

Supernat A, Łapińska-Szumczyk S, Sawicki S, Wydra D, Biernat W, Żaczek A. Deregulation of RAD21 and RUNX1 expression in endometrial cancer. Oncol Let 2012, 4:727-732. IF 0,237; MNiSW brak.