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UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS FACULTAD DE ODONTOLOGÍA E.A.P. DE ODONTOLOGÍA Adherencia del Streptococcus mutans después del uso de la IgY extraído de la yema de huevo de gallinas hiperinmunizadas Tesis para obtener el título profesional de Cirujano Dentista Bach. EDITH ROSARIO CHAVEZ ALVARADO Lima – Perú 2009
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UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS
FACULTAD DE ODONTOLOGÍA
E.A.P. DE ODONTOLOGÍA
Adherencia del Streptococcus mutans después del
uso de la IgY extraído de la yema de huevo de
gallinas hiperinmunizadas
Tesis para obtener el título profesional de
Cirujano Dentista
Bach. EDITH ROSARIO CHAVEZ ALVARADO
Lima – Perú
2009
JURADO DE SUSTENTACIÓN
Presidente: Mg. Blga. Hilda Moromi Nakata
Miembro: MSc. Blgo. César Augusto Bonilla Ferreyra
Miembro Asesor: Blga. Elba Estefanía Martínez Cadillo
DEDICATORIA:
A Dios, quien ilumina y guía los pasos de
aquellos que creen en él, brindándonos su amor incondicional.
A mis padres, Javier e Inocencia, y a mi hermano Ronald,
a quienes debo todo en esta vida ya que gracias a su apoyo e infinita confianza supieron darme las armas para enfrentarme a la vida.
A mi hermanito Wilder Rolando, quien
como un angelito siempre nos iluminará y cuidará desde el cielo, ya que siempre vivirá en el corazón de quienes lo aman.
AGRADECIMIENTOS
Al Blgo. Julio César Mendoza Fernández, gracias a su apoyo incondicional y extrema paciencia,
porque me demostró lo valioso e importante de la amistad, ya que sus conocimientos, aporte
científico y entrega por la ciencia contribuyeron a la realización del presente trabajo de principio a
fin. Gracias infinitas amigo Ulito.
Al. MSc. Blgo. César Augusto Bonilla Ferreyra, por la confianza y las oportunidades brindadas que
me han permitido desarrollarme aún más como profesional.
A la Blga. Elba Estefanía Martínez Cadillo por su asesoría y paciencia en la elaboración de la
presente investigación.
A la Mg. Blga. Hilda Moromi Nakata, responsable del Laboratorio de Microbiología de la
Facultad de Odontología de la UNMSM y a todo el equipo humano que trabaja por su acogida y
apoyo.
Al Blgo. Alejandro Patiño Gabriel, por su apoyo desinteresado y su gran ayuda en la parte
microbiológica.
Al Dr. Armando Yarlequé Chocas, responsable del Laboratorio de Biología Molecular de la
Facultad de Ciencias Biológicas de la UNMSM y a todo el equipo que trabaja en dicho laboratorio,
por las facilidades, apoyo y la amistad brindada durante la ejecución del presente proyecto.
Al Dr. Abad Flores Paucarima, responsable del Laboratorio de Biotecnología Microbiana y
Microbiología Ambiental de la Facultad de Ciencias Biológicas de la UNMSM.
ÍNDICE DE CONTENIDOS
I. INTRODUCCIÓN 1
II. MARCO TEÓRICO 2
II.1 Antecedentes 2
II.2 Bases Teóricas 5
II.2.1 Streptococcus mutans y Caries Dental 5
II.2.1.1 Factores de virulencia 5
a) Producción de Polisacáridos extracelulares 5
b) Acidogenicidad, aciduricidad y acidofilicidad 7
c) Síntesis de polisacáridos intracelulares 7
d) Producción de dextranasas y fructanasas 8
II.2.1.2 Adherencia microbiana 8
II.2.1.3 Factores de adhesión 9
a) Elementos bacterianos 9
b) Receptores 9
II.2.1.4 Mecanismos de adhesión, agregación y
coagregación 10
a) Uniones tipo lectina carbohidratos 10
b) Uniones tipo proteína proteína 11
c) Uniones mediadas por glucanos 11
d) Uniones por ácidos lipoteicoicos (ALT) 12
II.2.2 Inmunoglobulina de yema de huevo (IgY) 13
II.2.2.1 Propiedades moleculares de IgY 13
a) Estructura molecular de IgY 13
b) Propiedades físico químicas de IgY 16
c) Estabilidad de IgY 16
II.2.2.2 Transferencia de IgY en la yema de huevo 16
II.2.2.3 Aplicaciones de la IgY en investigaciones
biomédicas y en medicina humana y
veterinaria 17
II.2.2.4 Usos y ventajas de la IgY 18
II.2.3 Producción de IgY 21
II.2.3.1 Inmunización de gallinas 21
a) Antígeno 21
b) Adyuvantes 21
c) Ruta de aplicación 23
d) Frecuencia de inmunización e intervalo entre las
inmunizaciones 23
II.2.3.2 Extracción de IgY 23
II.3 Planteamiento del Problema 25
II.4 Justificación 25
II.5 Objetivos de la Investigación 26
II.5.1 Objetivo general 26
II.5.2 Objetivos específicos 26
II.6 Hipótesis 26
III. MATERIALES Y MÉTODOS 27
III.1 Tipo de Estudio 27
III.2 Población y Muestra 27
III.2.1 Población 27
III.2.2 Muestra 27
III.2.3 Unidad de Análisis 27
III.3 Operacionalización de variables 28
III.4 Materiales 29
III.5 Métodos 30
III.5.1 Procedimientos y Técnicas 30
III.5.2 Recolección de datos 34
IV. RESULTADOS 35
V. DISCUSIÓN 39
VI. CONCLUSIONES 42
VII. RECOMENDACIONES 43
RESUMEN 44
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 46
ANEXOS 50
1
I. INTRODUCCIÓN
A pesar del avance en odontología, la caries dental continúa siendo una
enfermedad pandémica. En la cavidad oral encontramos un gran número de
microorganismos. Una amplia evidencia científica propone a la bacteria
Streptococcus mutans como principal causante de la caries dental en el ser humano.
Una de las principales características cariogénicas de Streptococcus mutans
es su gran afinidad sobre las superficies dentales debido a fenómenos de adhesión,
agregación y coagregación. Solo los microorganismos que pueden adherirse y
permanecer en la boca tienen la oportunidad de comenzar a crecer, multiplicarse,
sobrevivir y establecerse como miembros de la microbiota bucal. Después de
adherirse a los tejidos del hospedero y colonizarlos, las bacterias, de especies
similares o diferentes, se agregan entre sí para organizarse en placas o biopelículas y
desencadenar así la iniciación de las enfermedades prevalentes en la cavidad bucal,
vale decir la caries y la enfermedad periodontal.
La prevención de la caries dental por inmunización se basa en que la mayor
parte de las lesiones cariosas en el hombre tienen su origen en los estreptococos del
grupo mutans. Por lo tanto, muchas investigaciones relacionadas con estos
microorganismos han sido desarrolladas durante años en búsqueda de nuevos
medios eficaces que combatan la caries dental.
Los anticuerpos de yema de huevo (Inmunoglobulinas Y) han sido en los
últimos años una novedosa alternativa frente al uso de anticuerpos de origen
mamífero debido a las ventajas que ofrecen sus propiedades bioquímicas, cantidad
obtenida y a las diferentes aplicaciones que se le está dando en el campo de la
medicina contra infecciones intestinales humanas y como tratamiento antiviral en
veterinaria, siendo por tanto un campo de investigación prometedor en odontología.
Los anticuerpos IgY podrían ser una alternativa para el tratamiento profiláctico de la
caries dental que podría ayudar a la inmunización pasiva contra esta enfermedad.
2
II. MARCO TEÓRICO
II.1 Antecedentes
• Perez Lozano, S; Chacana, P y Terzolo, H (2006) realizaron un estudio donde
observaron el efecto de la IgY específica para S. mutans. En el estudio
sembraron en tubos de vidrio inclinados la cepa de S. mutans en caldo BHI
(Cerebro corazón) al 5% de sacarosa. Las colonias adheridas a las paredes del
tubo fueron resuspendidas con PBS pH 7,2 hasta obtener una absorbancia en
600 nm de 1,4. A partir de esta suspensión realizaron diluciones seriadas en base
10 que fueron enfrentadas con igual volumen de una solución de IgY específica
contra S. mutans o con PBS (grupo control). Luego sembraron en placas de agar
Mitis Salivarius, incubadas a 37ºC con 30% de CO2 durante 48 hs A la vez .
Luego sembraron ambas muestras en placas de agar Mitis Salivarius incubadas
durante 48 horas. Registraron el número de colonias adheridas a la superficie
del agar, tanto para las suspensiones tratadas con IgY como para las incubadas
con PBS. Encontraron diferencias significativas en el número de colonias de
Streptococcus mutans adheridas y un cambio en la morfología de las colonias
cuando fueron tratadas con la IgY.(1)
• Hatta, H et al (1997) realizó estudios en humanos utilizando un enjuague bucal
conteniendo anticuerpos de yema de huevo (IgY) de gallinas inmunizadas con
células enteras de S. mutans. Se realizaron estudios in vitro e in vivo en
voluntarios. Discos de hidroxiapatita impregnados en muestras de saliva de los
voluntarios después de los enjuagues con IgY anti S. mutans fueron cultivados
en un medio con sacarosa. La IgY impidió en un 59% la adherencia a estos
discos mientras que en las mismas condiciones, un enjuague con una IgY
control, que había sido obtenida a partir de gallinas sin inmunizar, sólo produjo
una reducción del 8%. En los ensayos in vivo, después de 4 horas de realizado el
enjuague bucal conteniendo 10% de sacarosa, la IgY anti S. mutans disminuyó
la proporción del porcentaje de S. mutans respecto al total de estreptococos
presentes en saliva. (2)
3
• Jian,Q; Bian, M y col. (2002) realizaron un estudio del efecto de anti S. mutans
de IgY de yema de huevo sobre el S. mutans y caries dental artificial in vitro. 25
gallinas fueron inmunizadas usando cepas de S. mutans como antígeno. El
crecimiento y adherencia de S. mutans fue observado después de incubar con y
sin IgY. Las cantidades de desmineralización fueron medidas después que
partes de esmalte dental fueron incubados con o sin IgY durante el periodo de
formación de caries artificial. Se demostró que la IgY disminuyó
significativamente la adherencia del S. mutans a la superficie del esmalte.
Además la cantidad de desmineralización del esmalte disminuyó en la caries
dental artificial cuando la IgY fue usada.(3)
• Krüger C y col. (2004) evaluaron los efectos anticariogénicos de la IgY
administrado oralmente en ratas. Utilizaron un anticuerpo de IgY específico
para células asociadas a glucosiltransferasa. Se observó que el número de
lesiones cariosas en superficies lisas de las ratas eran significativamente más
bajos que el grupo control, el número de caries en surcos también disminuyo
significativamente. El estudio sugirió que los anticuerpos asociados a
Glucosiltransferasas de gallinas podría ser utilizado en la profilaxis de pacientes
con alto riesgo de caries dental.(4)
• Hamada, S; Horikoshi, T y col. (1991) realizaron un estudio en ratas con el uso
de IgY de yema de huevo de gallinas específico para células asociadas a
glucosiltransferasa (GTF) de S. mutans. In vitro la IgY demostró una clara
supresión de la adherencia de colonias del S. mutans en la superficie del vidrio.
Un grupo de ratas fueron sometidas a una dieta altamente cariogénica y a otro
grupo se le adiciono la IgY. Se observó que en el grupo en el que se adicionó
IgY en la dieta mostró una reducción en la acumulación de placa dental
estadísticamente significativa.(5)
4
• Otake, S; Makimura M; Hatta H y col. (1991) realizaron un estudio por
inmunización pasiva con IgY frente a la caries dental en ratas. Las ratas fueron
infectadas con cepas de S. mutans y alimentadas con una dieta cariogénica
conteniendo 2% de polvo de yema de huevo inmune. Se observó que los
niveles de caries disminuyeron significativamente en el grupo al que se le
adiciono la IgY a diferencia del grupo control.(6)
• Smith et al. (2001) en su estudio demostró que la administración dietética a
corto plazo de anticuerpo de IgY contra la proteína fijadora de glucanos B
disminuyó la acumulación bacteriana y redujo el número de caries en ratas.(7)
• Machado Andrea, Rudnik Liliane y col. (2005) realizarón un estudio sobre el
uso de yemas de huevo contra Escherichia coli en el control de diarrea de
lechones. Se demostró que en los lechones tratados con la IgY anti Escherichia
coli aumentaron de peso de manera significativa a diferencia del grupo control,
lo que demostró que el uso de yemas de huevos de aves hiperinmunizadas con
Escherichia coli era efectivo en la prevención de la diarrea de los lechones. (8)
• Moromi Nakata, H; Martínez Cadillo, E (2006) realizaron un estudio con el
objetivo de determinar el efecto de la infusión del té verde al 10% w/v en la
formación de placa bacteriana por S. mutans. Realizaron cultivos sucesivos
cada 24 horas hasta los 7 días, en caldo sacarosa al 5%. Los resultados
mostraron una notoria disminución y falta de adherencia en la formación de la
placa en el alambre de nichrone de los cultivos con infusión de té verde en
relación al cultivo control.(9)
5
II.2 Bases Teóricas
II.2.1 Streptococcus mutans y Caries Dental
La caries dental resulta de la interacción entre el hospedero, la dieta, tiempo
y la microflora en la superficie del diente. Factores de virulencia de S. mutans
incluyen la aciduridad, acidogenicidad y la habilidad de la bacteria de adherirse y
acumularse en las superficies del diente. (4)
La patogénesis molecular de Streptococcus mutans asociado a caries dental
implica una serie de eventos vinculados que eventualmente conducen a la
acumulación de números suficientes de esta bacteria cariogénica que causa la
enfermedad. (10)
Es bien conocido que la dieta de carbohidratos y la infección con S. mutans son
factores esenciales en el desarrollo de la caries dental. (10)
II.2.1.1 Factores de virulencia
Cuando se habla de virulencia de un microorganismo, se está haciendo
referencia a su capacidad de producir daño, es decir, generar una enfermedad.
Los factores de virulencia son aquellas condiciones o características específicas
de cada microbio que lo hacen patógeno. (11) En el caso de S. mutans los más
involucrados en la producción de caries son:
a) Producción de polisacáridos extracelulares
Los estreptococos del grupo mutans son capaces de sintetizar
homopolisacáridos extracelulares, especialmente a partir de la sacarosa, que
pueden ser de tres tipos: glucanos hidrosolubles (dextranos), glucanos
hidroinsolubles (mutanos y fructanos). (12)
6
La formación de estos polímeros se debe a una o varias enzimas
extracelulares denominadas glucosiltransferasas (GTFS) y
fructosiltransferasas (FTFs) que participan en la síntesis de dextranos y
levanos transfiriendo grupos glucosílicos o fructosílicos, respectivamente, a
aceptores de glucanos o fructanos preexistentes. (12)
Las glucosiltransferasas que determinan glucanos insolubles son de
peso molecular elevado (GTF-I) mientras que las que lo hacen con glucanos
solubles poseen un peso molecular bajo (GTF-S). Estas proteínas
enzimáticas pueden aparecer localizadas en las superficies bacterianas, libres
en el medio ambiente, o adsorbidas a la película adquirida; en todos estos
casos mantienen su actividad de sintetizar glucanos, y pueden, de esta forma,
ser nexo de unión con otras bacterias que posean proteínas fijadoras de
glucanos. (12)
Las glucosiltransferasas han demostrado ser uno de los mayores
factores de virulencia en la patogénesis de la caries dental. (4)
Se ha discutido mucho acerca de la importancia de polímeros
extracelulares. En general, los glucanos solubles y los fructanos son más
fácilmente degradables por enzimas tipo glucanasas y fructanasas,
rompiendo los enlaces α (1-6), β (2-6) y β (1-2). Esto hace que se
obtengan productos más sencillos, utilizables por las mismas bacterias que
los sintetizan o por otras que posean tales enzimas. Por ello, suelen
desaparecer con facilidad del material abiótico que constituyen las placas
dentales. Por el contrario, los glucanos insolubles son degradados con
dificultad por las bacterias, poseen propiedades adherentes y forman parte
importante de la matriz acelular de la placa; de esta manera, al ser
difícilmente retirados, se convierten en los principales glucanos que se
unirán a proteínas fijadoras, y son los que más intervienen en los fenómenos
de acumulación bacteriana.(12)
7
b) Acidogenicidad, aciduricidad y acidofilicidad
Streptococcus mutans puede producir y tolerar ácido para ayudar a su
sobrevivencia en la cavidad oral. S. mutans es una bacteria
homofermentativa de ácido láctico, pero cuando el suministro de
carbohidratos es limitado, esta bacteria también produce formato, acetato y
etanol. Esto implica que S. mutans es una bacteria acidogénica. (13) La
acidogenicidad de S. mutans se debe a que el estreptococo puede fermentar
los azúcares de la dieta para producir ácido láctico como producto final del
metabolismo. Esto hace que baje el pH y desmineralice el esmalte dental. (11)
La aciduricidad del microorganismo se debe a que es capaz de seguir
produciendo ácido con un pH bajo. El S. mutans también es acidófilo o
tolerante al ácido ya que puede resistir la acides del medio bombeando
protones (H+) fuera de la célula. (11)
c) Síntesis de polisacáridos intracelulares
La síntesis de polisacáridos intracelulares por S. mutans y su
capacidad de metabolizarlos son factores de virulencia, ya que proporcionan
a la célula un sustrato de donde obtener la energía y mantener la producción
de ácido durante largos periodos de tiempo. (12)
En presencia de glucosa y sacarosa extracelular, S. mutans sintetiza
polisacáridos intracelulares tipo glucógeno (IPSs). Estos IPSs son
homopolímeros de glucosa con enlaces α (1-4) y α (1-6). La síntesis de IPS
es linealmente proporcional a la concentración de carbohidratos
extracelulares (glucosa o sacarosa). El metabolismo de IPS puede promover
el desarrollo de caries por la prolongación del tiempo de exposición a ácidos
orgánicos cuando la bacteria carece de una fuente de alimentación externa.
Numerosos reportes confirman a los IPSs como un importante contribuyente
de la cariogenicidad de S. mutans. (13)
8
d) Producción de dextranasas y fructanasas
Las dextranasas y fructanasas son enzimas capaces de metabolizar los
polisacáridos extracelulares, sobre todo los glucanos solubles, favoreciendo
la producción de ácido y constituyendo un sustrato en los periodos en que
disminuye el aporte exógeno. (12)
II.2.1.2 Adherencia microbiana
El paso más importante en la formación de la caries, es la adhesión del S.
mutans a la superficie dental. (12)
Sólo los microorganismos que pueden adherirse y permanecer en la boca
tienen la oportunidad de comenzar a crecer, multiplicarse, sobrevivir y establecerse
como miembros de la microbiota bucal. (12)
El desarrollo del biofilm se produce en dos distintas fases: durante la
primera, mediada por la interacción entre la proteína Ag I/II y algunas de la saliva
adsorbidas por el esmalte. En la segunda fase, formas de biofilm como
acumulaciones de bacterias por agregación con la misma bacteria u otras especies y
la producción de una matriz extracelular de polisacáridos.(14) S. mutans produce
glucanos solubles e insolubles a partir de los azúcares de la dieta, utilizando la
enzima glucosiltransferasa (GTF), formando acumulaciones bacterianas; de este
modo la unión se hace más fuerte, las bacterias degradan la sacarosa a ácidos que
desmineralizan el diente, formando las cavidades que se encuentran en la caries. (11)
Diferencias genéticas podrían relacionarse con diferencias en la virulencia
entre cepas de S. mutans. (14)
LA ADHESIÓN es la interrelación que se establece entre los
microorganismos y los tejidos del hospedador, lo que permite la colonización
microbiana. (12)
LA AGREGACIÓN Y COAGREGACIÓN, son procedimientos que tienen
las bacterias de las mismas o diferentes especies, respectivamente, de adherirse
entre sí, dando lugar a la formación de microcolonias o acumulaciones bacterianas,
que fortalecerán y estabilizarán la colonización. (12)
9
II.2.1.3 Factores de Adhesión
a. Elementos bacterianos
Son las adhesinas o moléculas superficiales bacterianas, cuya función es la
de fijar los microorganismos a una superficie, ya sea tejido del hospedador,
material artificial biocompatible o a las propias bacterias.
Las principales adhesinas que intervienen en los procesos de adhesión,
agregación y coagregación en la cavidad oral son: (12)
- Residuos de carbohidratos y proteínas parietales superficiales.
- Glucanos solubles e insolubles del glococálix.
- Glucosiltransferasas (GTFs)
- Proteínas que unen o fijan glucanos
- Proteínas que se fijan a la película adquirida
- Moléculas protéicas contenidas en las fimbrias
- Ácidos lipoteicoicos (ALT)
- Cadenas de polisacáridos de LPS
b. Receptores
Compuestos que interactúan con las adhesinas. Entre ellos se encuentran los
carbohidratos del glicocalix y glucoproteínas como la fibronectina de las células
epiteliales, la película adquirida o conjunto de proteínas y glucoproteínas
salivales adsorbidas de forma selectiva al esmalte, cemento o materiales
artificiales, los cálculos dentales supra y subgingivales o la mayor parte de los
complejos bacterianos superficiales señalados como adhesinas que en este caso
actuarían como receptores en los fenómenos de agregación y congregación.(12)
10
II.2.1.4 Mecanismos de adhesión, agregación y coagregación
Es el fenómeno por el que los elementos del hospedador, tisulares o de otra
índole, y bacterias o bacterias entre sí se aproximan. En ambos casos las
superficies que interactúan están cargadas negativamente, creándose unas
fuerzas de repulsión que deben ser neutralizadas para que el contacto se lleve a
cabo. Aunque la naturaleza íntima del proceso no se conoce, en muchas
ocasiones pueden intervenir los siguientes mecanismos:(12)
- Una cierta avidez entre las superficies como ocurre por ejemplo entre
moléculas lipofílicas de las células eucarióticas e hidrófobas de células
procariotas, o entre las glucosiltransferasas (GTFs) y los glucanos
(enzimas unidas a sustratos).
- Complementariedad entre los elementos que contactan.
- Orgánulos bacterianos que se alejan de las zonas más electronegativas y
que, por su longitud, acortan los espacios.
- Presencia de cationes en el medio que, bien directamente o a través de
glucoproteínas salivales, atraen las superficies.
- Fuerzas débiles tipo enlaces de hidrógeno, enlaces iónicos, interacciones
hidrófobas y fuerzas de Van der Waals.
Los principales tipos de adhesión, agregación y coagregación en la
cavidad oral son:
a. Uniones tipo lectina carbohidratos
Suponen el reconocimiento y fijación por péptidos de proteínas (lectinas) de
residuos glúcidos que, al igual que en la reacciones antígeno – anticuerpo,
necesitan cierta complementariedad entre las superficies que interactúan. En la
película adquirida (porciones glucosídicas), pueden formarse estas uniones
mediante fimbrias y proteínas parietales superficiales de algunas bacterias
(lectinas). Así ocurre con los antígenos superficiales proteicos de Streptococcus
mutans I/II, hecho que se ve favorecido por intermediarios salivales al contrario
11
de los Streptococcus sobrinus, o por proteínas similares de Streptococcus
sanguis. Estas lectinas estreptocócicas parecen tener sus receptores glúcidos
en la película adquirida, en residuos de galactosa para S. mutans, y de ácido
siálico para S. sanguis. Del mismo modo, este tipo de uniones pueden
producirse en los fenómenos de coagregación bacteriana, existiendo una amplia
gama de ejemplos en la cavidad oral; así las fimbrias tipo 2 de Actinomyces
viscosus interactúan con residuos de galactosa de S. sanguis, o fimbrias de esta
última especie que reconocen carbohidratos superficiales de Fusobacterium
nucleatum sspp., R. dentocariosa o Corynebacterium matruchotii. (12)
b. Uniones tipo proteína – proteína
Al igual que en el caso anterior, pueden determinar la adhesión a la película
adquirida, como las fimbrias tipo 1 de A. viscosus que interactúan con residuos
de prolina de la película, o fenómenos de congregación. Los resultados son las
típicas imágenes en mazorcas de maíz, en las que sobre un bacilo central se fijan
cocos, o las de tipo pilosos, con un bacilo central sobre el que se unen otras
bacterias de igual morfología. En estos coagregados pueden participar especies
muy diferentes, lo que hace que las masas microbianas que surgen tengan un
carácter heterogéneo. (12)
Los análisis electroforéticos han demostrado que las proteínas salivales que
primero promueven la adhesión son las ricas en prolina, seguidas por las que
contienen proteína estaterina. (15)
c. Uniones mediadas por glucanos
Constituye un proceso especial de adhesión a superficies duras, con un cierto
de grado de agregación y coagregación. En él intervienen además de glucanos
especialmente los insolubles ya que los solubles son fácilmente degradables y
persisten poco tiempo, las proteínas superficiales que fijan glucanos, y las
glucosiltransferasas. Todos estos atributos los poseen los estreptococos del
12
grupo mutans, lo que hace que sea un fenómeno casi exclusivo de estos
microorganismos. (12)
Las glucosiltransferasas sintetizan los glucanos, pudiendo quedar unidas a
las superficies bacterianas o ser excretadas al medio circundante, conservando
su actividad y permaneciendo unido a los aceptores glucosídicos de los
homopolisacáridos. Los glucanos liberados al medio, por otra parte, pueden
fijarse a proteínas superficiales parietales (proteínas que unen glucanos) y actuar
no sólo de nexo de unión entre glucosiltransferasas, sino también entre
bacterias que posean dichas proteínas; otro tanto ocurrirá cuando queden
rodeando a las superficies bacterianas.(12)
Se forman así acumulaciones que quedarán adheridas a las superficies
dentarias cuando las bacterias posean las proteínas tipo lectinas, que se fijaban a
la película adquirida, o cuando las glucosiltransferasas o los propios glucanos
queden adsorbidos en la misma. (12)
o Proteínas Fijadoras de Glucanos (GBPs)
S. mutans sintetiza al menos dos GBPs. Estas proteínas fijan los glucanos
libres del medio, sirviendo de nexo entre las bacterias, forman
acumulaciones que quedan adheridas a los dientes (16)
Anticuerpos contra GBPs pueden interferir en la patogénesis de S.
mutans induciendo inmunidad contra caries. (16)
d. Uniones por ácidos lipoteicoicos (ALT)
Este ácido que es un polímero aniónico, compuesto por fosfatos
azucarados, generalmente glicerol y ribitol fosfato, deriva de la membrana
plasmática y penetra en la pared celular de los estreptococos grampositivos.
De este modo el microorganismo se presenta con una potente carga
electronegativa que le permite adherirse al ion calcio de la saliva y a través
de éste, que actúa como puente, a la película acelular adquirida. (15)
13
Este mecanismo de adhesión, que es el que utiliza S. sanguis cuando hay
sacarosa en el medio, origina una placa con bajo potencial acidogénico y no
cariogénica. (15)
II.2.2 Inmunoglobulina de yema de huevo (IgY)
El huevo es la célula más grande originada de una división celular. Es una
importante fuente de nutrientes, conteniendo todas las proteínas, lípidos, vitaminas,
minerales y factores de crecimiento requeridos para el desarrollo embrionario, así
como factores de defensa contra infecciones virales y bacterianas. (17)
A pesar que se conoce por alrededor de cien años que las gallinas
inmunizadas transfieren sus inmunoglobulinas del suero a la yema de huevo, esta
posible alternativa de producir anticuerpos ha llamado la atención solo en la última
década. Técnicas para la producción de anticuerpos monoclonales y policlonales de
pollos, así como técnicas para su aislamiento de diferentes formas, manipulación y
uso son comparables completamente a la producción de anticuerpos mamíferos. (18)
II.2.2.1 Propiedades moleculares de IgY(19)
a) Estructura molecular de IgY (19)
La inmunoglobulina Y (IgY) tiene una masa molecular de
aproximadamente 180 kDa la cual es más pesada que IgG de mamíferos cuyo
peso molecular es de alrededor 160 kDa. La estructura general de la molécula de
IgY consiste en dos cadenas pesadas idénticas (H) y dos cadenas ligeras también
idénticas, las cuales están unidas por puentes disulfuro. La cadena ligera de IgY
consta de un dominio variable (VL) y un dominio constante (CL), como IgG de
mamíferos. Pero, los enlaces disulfuros intracatenarios entre la región VL y la
región CL de la cadena ligera, la cual estabiliza la estructura de la cadena ligera
de IgG de mamíferos está ausente en la cadena ligera de IgY y por lo tanto las
14
fuerzas intermoleculares de IgY son más débiles que los de IgG mamífera
(Figura 1).
La cadena pesada de IgY contiene un dominio variable (VH), cuatro
dominios constantes (CH1; CH2; CH3 y CH4), a diferencia de la IgG la cual tiene
tres dominios constantes (CH1; CH2 y CH3).
En la cadena pesada de IgG, los dominios CH1 y CH2 están separados por
una región bisagra, la cual le da una considerable flexibilidad al fragmento Fab
(la porción que contiene la actividad de unión con el antígeno). En contraste, la
cadena pesada de IgY no tiene una región bisagra, pero hay regiones cercanas a
los límites de los dominios CH1- CH2 y CH2- CH3 que contienen residuos de
prolina y glicina. Estas regiones tienen la posibilidad de conferir flexibilidad
limitada sobre la molécula.
Comparaciones entre las secuencias del dominio C en IgG e IgY han
mostrado que los dominios CH2 y CH3 de IgG son equivalentes a los dominios
CH3 y CH4 de IgY, respectivamente. El equivalente del dominio CH2 de IgY
está ausente en la cadena pesada de IgG.
El contenido de la estructura de hoja plegada β en los dominios C de IgY
es más bajo que el de IgG.
La parte Fc de IgY es el sitio de casi todas las funciones biológicas
efectoras. Esta parte contiene dos cadenas laterales de carbohidratos, en
contraste con IgG que posee solo una.
15
Figura 1. Comparación de la estructura molecular de IgY de gallina e
IgG de conejo V: dominio variable de la cadena ligera (VL) y de la cadena pesada (VH); C: dominio
constante de la cadena ligera (CL) y de la cadena pesada (CH); HR: región bisagra, los
puntos negros simbolizan las cadenas de carbohidratos; Fab: Fragmento de Unión al
Antígeno; Fc: Región cristalizable (constante) de la molécula de anticuerpo.
16
b) Propiedades físico químicas de IgY (19)
El punto isoeléctrico de IgY es mas bajo que el de IgG. Se encuentra en
el rango de 5.7 y 7.6, mientras que el de IgG está entre 6.1 y 8.5.
Debido a que el fragmento Fc (la fracción más hidrofóbica del
anticuerpo) de IgY es más grande que el de IgG, la molécula IgY es más
hidrofóbica que la molécula IgG.
c) Estabilidad de IgY (19)
La estabilidad de IgY a pH ácido y alcalino ha sido estudiada bajo
diversas condiciones. Se encontró que la actividad de IgY disminuye a un pH
3.5 e inferior y se pierde casi completamente con cambios irreversibles a pH 3.
Una disminución rápida de la actividad de IgY a un pH bajo indica cambios y
daños conformacionales en la porción Fab incluyendo el sitio de unión al
antígeno.
Bajo condiciones alcalinas, la actividad de IgY no cambia hasta que el pH
aumenta a 11. Sin embargo, es marcadamente reducida a pH 12 o más altos.
IgY es relativamente resistente a la digestión de tripsina o quimotripsina,
pero es bastante sensible a la digestión por pepsina.
II.2.2.2 Transferencia de IgY en la yema de huevo
La IgA como la IgM es transferida desde las células plasmáticas del
oviducto hacia la clara. En general se considera que la IgY es la inmunoglobulina
predominante en la yema mientras que la IgA y la IgM prevalecen en la clara del
huevo. De acuerdo con información reciente, la IgY se transfiere exclusivamente
a la yema por un proceso activo mediado por receptores. La cantidad de IgY
transferida se relaciona con su concentración en el suero sanguíneo de las
gallinas y aparentemente la IgY se transfiere sin ningún tipo de selección previa
relativa a sus especificidades. A pesar de ello hay observaciones inéditas que
revelan distintas especificidades entre las IgY provenientes del suero y de la
17
yema de una misma gallina, aún cuando ambas hayan sido obtenidas durante el
mismo periodo. (20)
La IgY demora aproximadamente unos 5 días en aparecer en un huevo
desde el momento en que es activamente transportada desde la circulación
sanguínea al ovocito hasta que es puesto por la gallina. Sin embargo este período
varía según los distintos autores y los anticuerpos específicos séricos pueden
aparecer en la yema de los huevos con un retraso de 3 a 4 días o bien prolongarse
hasta 5 a 7 días. Durante este período de tiempo el ave ovula y el ovocito, a
medida que pasa por las distintas secciones del oviducto, va adquiriendo
sucesivamente la clara, las membranas internas y finalmente en su porción
engrosada o útero se forma la cáscara. En las gallinas de alta postura la
maduración de los ovocitos y la producción de huevos es seriada, de modo de
casi todos los días producen un huevo. Probablemente, el tiempo que una IgY
sérica demora en aparecer en el huevo depende del número de huevos procesados
en ese momento. La cantidad de IgY transportada parecería ser independiente del
tamaño del huevo. (20)
II.2.2.3 Aplicaciones de la IgY en investigaciones biomédicas y en
medicina humana y veterinaria
Existen muchas publicaciones que describen el uso exitoso de la IgY en
diferentes campos de la investigación. Los inmunoensayos basados en la IgY
son utilizados para medir la concentración de proteínas o péptidos mediante
pruebas de ELISA, RIE y otras pruebas de diagnóstico clínico ó investigación
básica. La IgY es utilizada con mucho éxito en inmunoquímica para detectar
antígenos virales o bacterianos de plantas o animales. La IgY también ha sido
empleada para evaluar la incidencia de parásitos intestinales en animales
domésticos como los porcinos y para determinar el grado de contaminación de
los alimentos, ya sea con toxinas o drogas. Se han realizado varios estudios
comparando las propiedades de la IgY con la de las IgG producidas en animales
18
idénticamente inmunizados. En la mayoría de los casos se ha confirmado que la
IgY puede ser utilizada de la misma manera que la IgG. Muchas veces, la IgY
presenta ventajas con respecto a la especificidad, reacciones cruzadas o
sensibilidad. Durante la década pasada, se ha incrementado el uso de la IgY en la
terapia o profilaxis de enfermedades mediante el nuevo concepto de alimento
funcional o nutracéutico. Dado que la IgY es parte de la dieta normal no existe
peligro de complicaciones alérgicas, y dado el gran incremento de la resistencia
de las bacterias a los antibióticos, el uso de la IgY se presenta como una
importante alternativa para el tratamiento de enfermedades infecciosas. Además
estos tratamientos resultan muy económicos y para enfermedades
gastrointestinales estos anticuerpos actúan in situ mediante una administración no
traumática como es la vía oral. (20)
II.2.2.4 Uso y ventajas de las IgY
Los anticuerpos son componentes importantes de muchos reactivos de
diagnóstico que son usados como herramientas en diferentes investigaciones
biomédicas. Normalmente, tales anticuerpos se obtienen de los mamíferos (IgG),
siendo monoclonales (ratón) o policlonales (conejo, cabra, oveja). Sin embargo,
en los últimos años, los anticuerpos de pollo (IgY) se usan cada vez más debido a
la creciente preocupación sobre el bienestar animal. (20)
Puesto que los anticuerpos de pollo simplemente pueden extraerse de la
yema del huevo de la gallina, no es necesario sangrar al ave para obtenerlos.
Además de los aspectos referentes al bienestar animal, la cantidad de anticuerpos
producida por una gallina es mucho mayor que la cantidad de anticuerpos que
pueden obtenerse de un conejo. (20)
Debido a la distancia filogenética entre aves y mamíferos, los anticuerpos
de pollo no tienen reacciones cruzadas con las IgG de mamífero. Por ejemplo, a
diferencia de la IgG, la IgY no produce reacciones cruzadas con los factores
reumatoideos, pudiendo así minimizarse las falsas reacciones positivas cuando se
19
evalúan marcadores de inflamación (proteína C-reactiva). Esta característica
puede ser valiosa para el estudio y seguimiento de los procesos inflamatorios. (20)
Por otro lado el sistema inmune de los pollos es capaz de responder con
producción de anticuerpos específicamente dirigidos contra antígenos mamíferos
altamente conservados (antígenos que no sufrieron cambios sustanciales durante
la filogenia). De esta manera, la IgY puede reconocer ciertas partes de una
molécula que son no reconocidas por la IgG, lo cual puede tener importancia
para la construcción de herramientas de diagnóstico. (20)
Además del uso en la elaboración de inmunoreactivos para el diagnóstico,
la posibilidad de producir grandes cantidades de IgY específicas con costos
mucho menores cuando se compara con las IgG mamíferas, permite el uso de
anticuerpos con fines profilácticos y terapéuticos. Por ejemplo en enfermedades
diarreicas de terneros o lechones neonatos. (20)
El huevo puede ser considerado un alimento funcional. Los huevos
forman parte de la alimentación diaria de gran parte de la población y, por lo
tanto, también los anticuerpos que naturalmente se encuentran en la yema del
huevo. Por esta razón, el concepto de consumir anticuerpos IgY puede ser
fácilmente aceptado por la gente. Esto representa una gran ventaja en el momento
de intentar elaborar nuevos productos profilácticos y terapéuticos basados en la
tecnología IgY. (21)
Se han realizado diversos e interesantes ensayos en donde se ha
administrado IgY para la profilaxis o terapia de distintas infecciones humanas. (21)
También se ha demostrado que puede lograrse la prevención y terapéutica
de la úlcera gástrica mediante la administración de IgY específica contra
Helicobacter pylori. El efecto de la IgY es la constante remoción de la bacteria,
impidiendo entonces la colonización y posterior crecimiento del patógeno en el
epitelio estomacal. También se han realizado investigaciones para determinar la
20
mejor manera de vehiculizar la IgY para que luego de su administración oral,
siga manteniendo su potencial poder profiláctico en el estómago. (21)
Se han realizado algunos estudios clínicos que demuestran que la
administración de IgY a pacientes humanos que padecen distintas infecciones
bacterianas, puede reducir el grado de la enfermedad. Por ejemplo, la
administración oral de IgY específica anti Pseudomona aeruginosa aumenta el
tiempo que necesita la bacteria para colonizar el tracto intestinal y por lo tanto
permite la disminución de la infección. De esta manera, el tratamiento con IgY
específica se presenta como una alternativa o complemento al uso de
antibióticos, reduciendo la aparición de cepas resistentes. (21)
Considerando todos estos puntos las ventajas del uso de las IgY pueden
resumirse:
• Bienestar animal: Debido a la gran cantidad de anticuerpos que pueden
obtenerse a partir de la yema de huevo, el desarrollo de la tecnología IgY se
presenta como una alternativa que no sólo tendrá un gran impacto sobre los
aspectos económicos de la producción de anticuerpos. La extracción de los
anticuerpos del animal se realiza de una manera no invasiva, minimizando el
sufrimiento del animal, así como también permite la reducción en el número
de animales necesarios para obtener una cantidad de anticuerpos
determinada. (21)
• Científicas: El desarrollo de metodologías de purificación específicas para
las IgY permitirá el uso de estas inmunoglobulinas en sistemas de
investigación y diagnóstico, permitiendo la obtención de anticuerpos contra
antígenos mamíferos muy conservados filogenéticamente y la minimización
de la difusión de la inmunoprofilaxis y la inmunoterapia como alternativa al
uso de antimicrobianos. (21)
• Económicas: El desarrollo de metodologías de purificación adecuadas y
simples es uno de los requisitos necesarios para la expansión del uso de la
IgY. El uso de anticuerpos IgY se presenta como una alternativa que permite
21
la reducción de costos en la producción de anticuerpos policlonales, ya que
la cantidad de inmunoglobulinas que pueden obtenerse a partir de la yema de
huevo de las aves es similar a la producida por animales grandes, mientras
que el costo de mantenimiento de una gallina es similar al de un animal
pequeño. (21)
II.2.3 Producción de IgY
II.2.3.1 Inmunización de gallinas
El desarrollo y producción de IgY específica por inmunización de gallinas
ponedoras con el antígeno blanco puede ser mejorado. Sin embargo, el resultado
de la respuesta inmune de las gallinas inmunizadas no puede ser predecible.
Principalmente cinco factores influyen en esta respuesta: el antígeno (dosis y
peso molecular), el tipo de adyuvante usado, la ruta de aplicación, la frecuencia
de inmunización y el intervalo entre las inmunizaciones. (19)
a) Antígeno
La respuesta inmune es desencadenada por el contacto del organismo con el
antígeno, cuya estructura es reconocida por el sistema inmune como extraño. La
dosis de antígeno influye significativamente en la respuesta inmune y el título
del anticuerpo que es esperado. Demasiado o muy poco antígeno puede inducir
supresión, sensibilización, tolerancia u otros no deseados efectos. Diversas
investigaciones han reportado que la inyección de concentraciones de antígenos
en el rango de 10µg y 1 mg provoca buena respuesta de anticuerpos. (19)
Es usual vacunar gallinas que tienen al menos 7 semanas de edad,
preferiblemente en dos sitios de inyección, con volúmenes de 0.5 – 1 ml. El
total de volumen inyectado afectaría la inducción de la reacción del tejido. (22)
Básicamente para cada antígeno, varias concentraciones han sido probadas y
el tipo de antígeno debe también ser considerado. El antígeno puede ser
presentado al sistema inmune como un complejo multiantígeno (ej., bacterias,
virus y parásitos) o un único antígeno (ej., proteínas o polisacáridos). Se
22
reconoce que las proteínas son los inmunógenos más eficientes por causa del
polimorfismo de su estructura y las diferencias existentes entre especies e
individuos. Como regla general, solo 10 – 100 µg de antígeno de proteínas
debería ser usado. (19)
Péptidos (con peso molecular menor de 10 kDa) puede también ser usado
como antígeno, pero ellos deberían ser asociados a transportadores (ej. Albúmina
sérica bovina, o hemocianina de lapa). Antígenos de polisacáridos son también
eficientes. Sin embargos, lípidos y ácidos nucléicos no son potentes
inmunógenos a menos que ellos estén asociados a proteínas o polisacáridos. (19)
b) Adyuvante
La inducción de altas y sostenibles títulos de anticuerpos necesita el uso de
adyuvantes. Existen más de 100 adyuvantes conocidos, los cuales difieren en sus
características químicas, su eficacia en estimular el sistema inmune y sus efectos
secundarios. El adyuvante completo de Freund’s (FCA) permanece como el
más efectivo adyuvante para la producción de anticuerpos animales en
laboratorio. En mamíferos, el uso de este adyuvante conduce sistemáticamente
a la inflamación severa en el sitio de inyección. En aves, el uso de FCA no
parece ejercer las mismas lesiones severas que produce en mamíferos. Diversas
investigaciones sugieren que los pollos muestran una mejor resistencia al
potencial de daño tisular de FCA que los conejos. Para evitar una eventual
reacción local del tejido, el adyuvante incompleto de Freund’s (FIA), el cual es
el más efectivo sustituto encontrado a la fecha, se convierte ahora en el más
común adyuvante usado para producir anticuerpos de yema de huevo. Debido a
que FIA es menos eficiente que FCA, algunos investigadores prefieren el uso de
una combinación de los dos adyuvantes: FCA para la primera inmunización y
FIA para las inmunizaciones de refuerzo. Diversos estudios demostraron buenos
resultados y no se reportaron reacciones adversas. (19)
23
c) Ruta de aplicación
La ruta más común para la inyección de antígeno en gallinas para la
producción de IgY es la vía intramuscular. La inyección es usualmente
desarrollada en el músculo del pello. Algunos autores inyectan el antígeno en la
pierna, pero la recomendación general plantea que la inyección en la pierna
debería ser evitada, ya que puede llevar a cojera. (19)
Las gallinas pueden también ser inyectadas subcutáneamente en el cuello.
Con animales muy jóvenes, es preferible inyectar intramuscularmente dentro del
músculo del pecho, porque la inyección subcutánea es más difícil de desarrollar
y puede además causar más dolor. (19)
d) Frecuencia de inmunización e intervalo entre las inmunizaciones
El número total de inmunizaciones requerido depende del tipo y dosis del
antígeno así como el tipo de adyuvante empleado. Al menos dos inmunizaciones
deben ser aplicadas. El título de anticuerpo de la yema debería ser observada a los
14 días después de la última inmunización. Si los títulos de anticuerpos comienzan
a disminuir, inmunizaciones de refuerzo pueden ser aplicadas durante el periodo de
postura para mantener la producción de altos niveles de anticuerpos en todo el año.
(19)
El éxito del protocolo de inmunización depende también del intervalo entre
la primera y segunda inmunización. Se reporta frecuentemente que el intervalo
debe ser entre 2 a 4 semanas. (19)
II.2.3.2 Extracción de IgY
Lípidos y proteínas son los mayores constituyentes de la yema de huevo. la
fracción lipídica, incluyendo triglicéridos, fosfolípidos y colesterol, constituye
aproximadamente una tercera parte de la yema. Las proteínas constituyen el 15 a
17 % de la yema, que pueden ser separadas por centrifugación en dos principales
fracciones, los gránulos (precipitado en la centrifugación) y el plasma (fluido
supernadante claro en la centrifugación). (19)
24
Los gránulos son cerca del 22% del total de las proteínas de la yema y están
compuestos por un 70 % de lipoproteínas de alta densidad (HDL: α- y β-
lipovitelinas), 16 % de fosvitina (glicofosfoproteína) y un 12 % de lipoproteínas de
baja densidad (LDL). (19)
El plasma constituye cerca del 78 % del total de las proteínas de la yema y
está compuesto por un 86 % de LDL y un 14 % de livetinas. Las livetinas son
glicoproteínas globulares libres de lípidos, las cuales son divididas en tres claes: α-,
β- y γ-livetinas. (19)
En IgY predomina la fracción de γ livetina. La separación de IgY requiere
además la remoción de las lipoproteínas y la recuperación de la fracción acuosoluble
(WSF) seguido por purificación de la IgY de otras livetinas. (19)
La recuperación de la fracción acuosoluble puede ser seguida por un paso
adicional para separar IgY (γ-livetinas) de otras proteínas acuosolubles (α- y β-
livetinas) y el restante LDL. Tres clases de separación pueden ser utilizados para
eliminar estos contaminantes: precipitación, cromatografía y filtración. Muchas de
estas técnicas podrían ser incluidas en un procedimiento efectivo. (19)
La remoción de las lipoproteínas y la recuperación de la WSF pueden ser
desarrolladas por diversos métodos, y kits comerciales para la extracción de IgY
están disponibles. Uno de los más frecuentes procedimientos usados consta de la
precipitación de proteínas con Sulfato de Amonio (NH4)2SO4, dextran sulfato o
polietilenglicol (PEG); la separación por cromatografía de intercambio iónico
también es usada. Existe, en efecto, muchos métodos efectivos de extracción que
podrían ser un problema en que los potenciales usuarios de la tecnología de IgY
pueden tener bases no racionales para la elección de un método y otro. En la
práctica, la elección de un procedimiento específico es usualmente influenciada por
el propósito de la aplicación del anticuerpo, así como por la experiencia del
laboratorio interesado. (22)
La elección de un adecuado método de extracción de IgY es principalmente
influenciado por la calidad de la extracción (preservación de la actividad de los
anticuerpos, pureza y recuperación de proteínas) la escala de extracción (laboratorio
o industrial), efectividad y tecnología. (19)
25
II.3 Planteamiento del Problema
¿Cuál es la adherencia del Streptococcus mutans después del uso de la IgY extraído
de la yema de huevo de gallinas hiperinmunizadas?
II.4 Justificación de la Investigación
Para la prevención de caries dental se han desarrollado diversas estrategias,
incluyendo estudios de vacunas contra esta enfermedad. La mayoría de estos estudios
han estado especialmente dirigidas a la búsqueda de nuevas alternativas que
disminuyan la actividad cariogénica de Streptococcus mutans.
Los anticuerpos de gallinas vienen siendo utilizados en los distintos campos de la
medicina y sus ramas. El uso de la IgY presenta grandes ventajas, ya que estos
anticuerpos se pueden extraer de la yema de huevo de las gallinas en cantidades
mayores a las obtenidas en mamíferos y preservando el bienestar animal. Además, se ha
demostrado que presenta especificidad y afinidad similares e incluso mayores a la
inmunoglobulina G.
La utilización de esta Inmunoglobulina se presenta como una alternativa para el
tratamiento profiláctico de la caries dental utilizándose en inmunización pasiva contra
esta enfermedad.
En nuestro país, aun no se han realizado estudios utilizando esta tecnología. Por este
motivo, la presente investigación busca utilizar la IgY anti – S. mutans para así observar
de que manera influye en la adherencia de este microorganismo.
26
II.5 Objetivos de la Investigación
II.5.1 Objetivo General
• Demostrar que la IgY obtenida de yema de huevos de gallinas hiperinmunizadas
disminuye la adherencia in vitro del Streptococcus mutans.
II.5.2 Objetivos Específicos
• Producir y detectar anticuerpos anti-S. mutans en gallinas hiperinmunizadas.
• Aislar anticuerpos IgY de la yema de huevo de gallina.
• Identificar el grado de adherencia de unidades formadoras de colonias
obtenidas después del uso de la IgY anti-S. mutans.
• Identificar el grado de adherencia de unidades formadoras de colonias
obtenidas después del uso de la IgY Pre- Inmune.
• Identificar el grado de adherencia de unidades formadoras de colonias en un
grupo control.
• Comparar los grados de adherencia de unidades formadoras de colonias
obtenidas después del uso de la IgY anti-S. mutans, IgY Pre-inmune y del
grupo control.
II.6 Hipótesis
“La adherencia de Streptococcus mutans disminuirá después del uso de IgY
extraído de la yema de huevo de gallinas hiperinmunizadas”
27
III. MATERIALES Y MÉTODOS
III.1 Tipo de Estudio
• Experimental
• Analítico
III.2 Población y Muestra
III.2.1 Población
Cepa de Streptococcus mutans ATCC 35668
III.2.2 Muestra
18 caldos de cultivo de Streptococcus mutans divididos en tres grupos:
Grupo 1: 6 caldos de cultivo Control
Grupo 2: 6 caldos de cultivo tratadas con IgY Pre Inmune
Grupo 3: 6 caldos de cultivo tratadas con IgY Anti-S. mutans
III.2.3 Unidad de Análisis
* Unidades formadoras de colonias adheridas de Streptococcus mutans
28
III.3 Operacionalización de Variables
Variables
CONCEPTUALIZACIÓN
DIMENSIONES
INDICADORES
ESCALA
Adherencia de
Streptococcus
mutans
Fenómeno de interrelación que se
establece entre S. mutans y los tejidos del
hospedador debido a características
estructurales del microorganismo
(proteínas fijadoras de glucanos,
glucosiltransferasas) y del polimorfismo
de los receptores del huésped
(glicoproteínas y proteínas salivales)
* S. mutans vs. IgY
Pre Inmune
* S. mutans vs. IgY
Anti S. mutans
* S. mutans control
UFC
% UFC Adheridas
% UFC No adheridas
Inmunoglobulina
aviar
Anticuerpo aviar tipo IgG encontrado en
yema de huevo de aves, reptiles y
algunos anfíbios utilizada en sistemas de
investigación y diagnóstico, permiten la
obtención de anticuerpos contra
antígenos mamíferos muy conservados
filogenéticamente y la difusión de la
inmunoprofilaxis y la inmunoterapia
como alternativa al uso de
antimicrobianos.
Acción de la IgY
Pre inmune é
inmune sobre
cultivo de S. mutans
- Efecto de la IgY Pre
Inmune
-Efecto de la IgY Anti-S.
mutans
29
III.4 Materiales
- 04 gallinas ponedoras raza Light Brown Leghorn
- Alimento para aves
- Jaulas para aves
- Cepa de Streptococcus mutans ATCC 35668
- Caldo Cerebro Corazón (BHI) 5% sacarosa
- Placas con Agar Mitis Salvarius
- Placas con Agar Sangre
- Adyuvante de Freud completo e incompleto
- Reactivos
- Placas de vidrio
- Jeringas 10 mL, 5 mL
- Jeringas de tuberculina
- Agua destilada
- Sulfato de Amonio
- Ácido caprílico
- Tris 1M
- PBS 0.1M pH 7.4
- Ácido acético 60%
- Cintas de PH
- Placas de vidrio con Gel Agarosa
- Haza de siembra.
- Espectofotómetro Shimadzu
- Centrífuga
- Cámara de electroforesis vertical
- Materiales de vidrio de laboratorio, etc
30
III.5 Métodos III.5.1 Procedimientos y Técnicas
III.5.1.1 Cultivo de S. mutans
La Cepa S. mutans ATCC 35668 fue activada en placas de Agar Sangre y
mantenidas a 4oC. Esta cepa fue utilizada durante la ejecución del trabajo.
III.5.1.2 Cuantificación del antigeno
Para calcular las Unidades Formadoras de Colonias (UFC) como una
función de Absorbancia de una suspensión de células, se construyó una curva
patrón, con diluciones de S. mutans desarrolladas en 5 mL de caldo BHI con 5% de
sacarosa durante 48 horas a 37Cº en condiciones de microaerofilia.
Se registró las absorbancias de cada una de las diluciones en luz visible a
660nm en un espectrofotómetro Shimadzu. Posteriormente, se sembró 0.1mL de
cada dilución en placas de Agar Mitis Salivarius (37ºC por 48 horas en
microaerofilia) y se procedió al conteo de UFC de cada placa. Para construir la
curva patrón, se tabularon los datos obtenidos del conteo en placa y los datos de
Absorbancia a 660nm, se graficaron los puntos utilizándose para el análisis de
regresión lineal el software Microsoft Office Excel 2007. Con esta curva patrón, se
determinó el número de UFC que le correspondía a cada absorbancia en todo el
trabajo.
III.5.1.3 Preparación del antígeno
La cepa S. mutans ATCC 35668 fue cultivada por 48 h en caldo BHI
conteniendo 5% sacarosa a 37 oC en aerobiosis. Los microorganismos fueron
tratados con 0.5% de formol por 24 h y luego colectados por centrifugación (5 000
rpm por 30 min). El pellet fue lavado tres veces con agua salina estéril (NaCl 0.9 %)
y homogenizadas. Las muestras fueron congeladas hasta su uso y su concentración
ajustada a 1 x 106 UFC/mL. (6) Para ajustar la concentración de la muestra se utilizó
la curva patrón elaborada, leyendo las absorbancias y registrando el volumen total
de caldo utilizado por muestra.
31
III.5.1.4 Protocolo de inmunización.
Se inocularon 0.5 x 106 UFC por vía intramuscular en gallinas de la raza
Light Brown Leghorn utilizando adyuvante completo de Freud (contiene bacterias
atenuadas de Mycobacterium tuberculosis) para la dosis inicial e incompleto para
los siguientes refuerzos (22). Las inoculaciones se realizaron a intervalos de dos
semanas durante un mes.
Los huevos se recolectaron a partir de la primera semana de iniciado el
protocolo de inmunización y se almacenaron a 4oC hasta su procesamiento. Los
huevos pre inmunes correspondieron a una semana antes de iniciado el protocolo de
inmunización.
III.5.1.5 Detección de anticuerpos
Para este ensayo se utilizaron los anticuerpos aislados de la yema de huevo
en diluciones seriadas. 50µL de antígeno (0.5x103 UFC) fueron enfrentados con
50µL de dilución de anticuerpos aislados en placas excavadas para observar
aglutinación, usando como control anticuerpos de huevos pre inmunes.
III.5.1.6 Aislamiento de IgY
Se utilizó la metodología descrita por R. Guang-Ping et al. 2007(23) y
modificada en el laboratorio de Biología Molecular de la Facultad de Ciencias
Biológicas de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Se trataron los
huevos recolectados por semanas de inmunización. La yema de huevo fue separada
cuidadosamente de la clara, lavada con agua destilada y se le retiró el vitelo
rompiendo cuidadosamente la membrana con ayuda de una jeringa anotando el
volumen obtenido. La yema extraída fue diluida con 2 volúmenes de PBS pH 7.4 y
ajustada con ácido acético al 60% a pH 5. Se agregó ácido caprílico por goteo
(64µL/mL de dilución) a una velocidad de 600µL/min y se dejo en agitación por 2
horas a temperatura ambiente. Luego se filtró utilizando papel Watman No 1, se
ajustó a pH 7 con Tris 1M y se centrifugó a 5000 rpm por 30 minutos. Al
sobrenadante obtenido se le agregaron lentamente cristales de Sulfato de Amonio
(NH4)2SO4 (0.231g/mL de dilución) y se dejo en agitación lenta por 1 hora a 4ºC.
32
Finalmente, se centrifugó a 5000rpm durante 30 minutos, el precipitado fue
resuspendido en el mismo volumen de yema extraída y luego dializado contra PBS
pH 7.4. De cada paso fue separada una alícuota para su análisis electroforético en
geles de poliacrilamida.
III.5.1.7 Electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS
Para preparar los geles de poliacrilamida al 10% se utilizaron los siguientes
reactivos en los volúmenes indicados:(24)
Reactivo Gel de Resolución Reactivo Gel Stacking
Sol Stock de
Acrilamida (30%)
2.0mL Sol Stock de
Acrilamida
(30%)
0.415
ddH2O 2.4mL ddH2O 1.7
Tris 1.5M (pH8.8) 1.5mL Tris 1.5M
(pH6.8)
0.330
10% SDS 60µL 10% SDS 25µL
TEMED 2.5µL TEMED 2.5µL
Persulfato de amonio
10%
60µL Persulfato de
amonio 10%
25 µL
Las muestras (40µg) fueron preparadas con Buffer de muestra no reductor
(Tris-HCl 0.05M, pH6.8; SDS 2%, azul de bromofenol 0.1%, glicerol 10%),
calentadas por 5 minutos y corridas en una cámara de electroforesis CVS10D de
Cleaver Scientific que contenía Buffer de corrida (Tris-HCl 0.025M, pH 8.3,
Glicina 0.192 M, SDS 0.1%) durante 1h a 100V.
Se tiñeron los geles con Azul Brillante de Coomasie R-250 0.05% durante 1
hora, y se procedió al revelado con solución decolorante (4 metanol: 3 ácido
acético: 4 agua).
33
III.5.1.8 Ensayos de adherencia
Adherencia de Streptococcus mutans en paredes del tubo
• Día 1: Se cultivó 0.1 mL de S. mutans en 5 mL de caldo cerebro corazón (BHI) al
5% de sacarosa por 48 horas a 37oC en condiciones de microaerofilia.
• Día 3: Se procedió a hacer el enfrentamiento con los distintos tipos de tratamiento
con IgY en tres grupos con 6 tubos de vidrio cada uno y se procedió a sembrar de la
siguiente forma:
o Grupo Control: 1.9 mL BHI + 0.1 mL del cultivo de 48 horas + 1 mL
de NaCl
o Grupo Pre Inmune: 1.9 mL BHI + 0.1 mL del cultivo de 48 horas + 1 mL
de IgY Pre Inmune (concentración final 1mg/mL IgY)
o Grupo IgY Anti-S. mutans: 1.9 mL BHI + 0.1 mL del cultivo de 48
horas + 1 mL de IgY Anti-S. mutans (concentración final 1mg/mL IgY)
TODOS LOS CULTIVOS FUERON COLOCADOS EN UN
ÁNGULO DE 30o POR 18 HORAS A 37oC EN CONDICIONES
DE MICROAEROFILIA. (5,25.26)
• Día 4: Se procedió a separar los microorganismos adheridos y no adheridos para
su posterior lectura de absorbancia. En todos los grupos se trabajó de la
siguiente manera:
o Microorganismos No Adheridos: Se extrajo el caldo sin tocar las
paredes del tubo y se leyó la absorbancia a 620 nm.
o Microorganismos Adheridos: Se desprendieron las colonias adheridas
a las paredes del tubo y se las resuspendió en 3 mL de caldo fresco BHI,
posteriormente se leyó su absorbancia.
o Los resultados de la absorbancia se trasladaron a una curva patrón para
determinar el número de UFC que correspondía.
34
III.5.2 RECOLECCIÓN DE DATOS
El procesamiento de los datos se realizó mediante la utilización de una computadora
Pentium D, en el sistema operativo Windows XP con el programa SPSS versión 17.
Primero se organizaron los datos en tablas y gráficas, usando estadística descriptiva,
hallando porcentajes; además de pruebas estadísticas inferenciales no paramétricas. Se
realizaron las pruebas ANOVA y TUKEY para el análisis de los resultados.
35
IV. RESULTADOS IV.1 AISLAMIENTO DE INMUNOGLOBULINAS
Los perfiles electroforéticos mostraron tres bandas proteicas acompañantes
en la muestra final junto a la banda de mayor peso molecular correspondiente a la
masa de anticuerpos IgY. La figura 2 muestra el perfil electroforético de cada paso
durante el protocolo de purificación. El cambio de pH no elimina ninguna banda
proteica mientras que la precipitación con sulfato de amonio separa completamente
la masa de anticuerpos IgY presentes en la yema.
Figura 2. PAGE-SDS del protocolo de aislamiento.
1. Extracto obtenido luego de la metodología con ácido caprílico a pH 5.
2. Extracto obtenido luego de la metodología con ácido caprílico a pH 7.
3. Sobrenadante.
4. Precipitado obtenido por salting out con Sulfato de Amonio.
La flecha indica la banda correspondiente a IgY.
36
IV.2 DETECCIÓN DE ANTICUERPOS REACTIVOS
La IgY anti – S. mutans demostró una gran capacidad aglutinante al ser
enfrentado con el antígeno, a diferencia del control en el que no se observó ningún
cambio, lo que demuestra la especificidad del anticuerpo aislado frente a S. mutans.
Figura 3. Aglutinación en placa.
Enfrentamiento de IgY Anti S. mutans con cepas de S. mutans para detectar la
especificidad del anticuerpo
IgY Pre inmune
IgY anti S. mutans
37
IV.3 DETECCIÓN DE ANTICUERPOS POR SEMANA SEGÚN
PROTOCOLO DE INMUNIZACIÓN
El mayor título de anticuerpos se da desde la segunda semana de iniciado el
protocolo de inmunización y se mantiene con niveles bajos hacia la 15va. Semana.
Estos anticuerpos pudieron aglutinar la suspensión celular de Streptococcus mutans.
Cuadro 1. Capacidad de aglutinación en placa de los anticuerpos
aislados por semana a distintas diluciones
Semana de
Inmunización
Diluciones
PURO
1/10
1/50
1/100
1/1000
2da. semana + + + + -
3ra. semana + + + - -
4ta. semana + + + + -
10ma. semana + + - - -
13va. semana + + - - -
15va. semana + - - - -
%UFC
IV.4 AD
L
adherencia
presentó u
presento I
significativ
Figura
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Adheridas
No Adherid
% UFC
DHERENCI
La presenci
a de las UF
un 75.5% de
IgY pre inm
vas entre los
4. Grado
0
0
0
0
0
0
0
0
0
ContInmuno
75
das 24
IA EN TUBO
ia de IgY
C en compa
e UFC adhe
mune que p
tres grupos
o de Adher
del trata
rol (Sin globulina)5.55
4.45
O
anti S. mut
aración con
eridas a la
presentó un
(p<0.01).
rencia del
miento co
IgY Pre Inm
66.69
33.3
tans redujo
el grupo c
superficie d
66.6%. Se
Streptococ
n IgY
mune Ig
al 49.6%
ontrol sin a
del tubo y
e encontraro
ccus muta
gY Anti S. muta
49.67
50.33
el grado
anticuerpo q
al grupo q
on diferenci
ans despué
ns
38
de
que
que
ias
és
39
V. DISCUSIÓN
Muchos procedimientos han sido descritos para el aislamiento y purificación
de IgY de yema de huevo (27-32) .En los últimos años la metodología que utiliza ácido
caprílico (octanoico) está siendo utilizada con mayor frecuencia debido a la
propiedad que sirve como agente precipitante de proteínas que no son
inmunoglobulinas, dejando solo a los anticuerpos en el sobrenadante. El
procedimiento descrito combina dos metodologías; precipitación negativa con ácido
caprílico, seguido de precipitación positiva con sulfato de amonio, que proporcionan
anticuerpos aislados de manera homogénea con pocos contaminantes y en la misma
concentración en la que están presentes en la yema.
Los geles de electroforesis al 10% revelan que el paso con ácido caprílico
proporciona un primer extracto crudo en el que los anticuerpos IgY están en la
misma proporción que las bandas acompañantes. Luego del paso de precipitación
con cristales de sulfato de amonio la banda de alto peso molecular correspondiente a
dichos anticuerpos esta enriquecida de manera notable, siendo completamente
retirada de la fracción sobrenadante.
El tipo de metodología utilizada para extraer los anticuerpos IgY depende de
la aplicación que tendrán. Los extractos obtenidos utilizando solventes orgánicos
como cloroformo (31) tienen buen rendimiento pero no son aplicables en ensayos in
vivo o en inmunoterapia oral. Generalmente estos métodos tienen también
objeciones medioambientales por las cantidades excesivas necesaria de dichos
solventes, es por ello que no pueden tomarse en cuenta si se desea utilizar la IgY
como ingrediente en los alimentos.
Los procedimientos desarrollados utilizando Polietilenglicol (PEG) (33) y con
Xantanos y Carragenanos (34) son caros y de rendimiento considerado aceptable.
La metodología utilizada en el presente trabajo, no consume mucho tiempo y
pueden procesarse pooles de hasta 6 huevos por día con equipamiento mínimo de
laboratorio.
Streptococcus mutans mostró ser antigénico en los animales de
experimentación utilizados.
40
Para la preparación del antígeno, en el presente estudio se utilizó la bacteria
S. mutans entera, produciéndose anticuerpos que reaccionaron frente a toda la
superficie bacteriana, demostrando ser efectivo, concordando con el estudio
realizado por Otake(6) el cual obtuvo una respuesta antigénica efectiva en los
animales de experimentación. Sin embargo, existen varios estudios que han
producido anticuerpos específicos para alguno de los distintos factores de virulencia
del microorganismo, como para la glucosiltransferasa (4,5) y para las proteínas
fijadoras de glucanos (7), los cuales han mostrado resultados satisfactorios al ser
enfrentados con el microorganismo.
La IgY anti S. mutans demostró capacidad de unión a las bacterias, por lo
que el porcentaje de adherencia en tubos disminuyó significativamente; sin
embargo, los tres grupos presentaron diferencias significativas en el grado de UFC
adheridas.
Los resultados de este estudio indican que la IgY anti S. mutans es efectiva
inhibiendo la adherencia del S. mutans a las paredes del tubo. Estos resultados
coinciden con los realizados por diversos autores, que demuestran la efectividad del
tratamiento con IgY sobre la adherencia de la bacteria.
Pérez (1) encontró diferencias significativas entre dos diluciones de S.
mutans enfrentadas con IgY anti S. mutans y un grupo control, registrando una
disminución en el número de colonias adheridas en el grupo tratado con la IgY
específica. De igual modo, concluyó que la diferencia en la morfología de las
colonias tratadas con IgY se debía probablemente al efecto aglutinante del
microorganismo frente al anticuerpo, lo cual es corroborado con este estudio, ya
que S. mutans demostró una gran capacidad aglutinante al ser enfrentado con el
antígeno en las pruebas de aglutinación.
Krüger (4) demostró que los anticuerpos dirigidos contra la enzima
responsable de la adherencia llamada glucosiltranferasa podía inhibir la adherencia
del Streptococcus mutans a la superficie del diente, lo que sugiere que los
anticuerpos que hemos obtenido podrían reconocer ésta enzima en la pared
bacteriana inhibiendo de esta forma su adherencia. Nuestros anticuerpos
41
desarrollados pueden servir como herramienta para purificar glucosiltransferasa y
de esta manera estudiar profundamente el fenómeno de adherencia y patogenicidad
del microorganismo en la población peruana.
Hamada (5) demostró que los anticuerpos desarrollados contra
glucosiltransferasa asociadas a células inhibían la adherencia de S. mutans
disminuyendo marcadamente el índice de caries dental inducido en ratas, lo cual
indica la efectividad de estos anticuerpos sobre la adherencia del microorganismo,
efecto que fue demostrado en el presente estudio.
42
VI. CONCLUSIONES
Se demostró que Streptococcus mutans es suficientemente antigénico para producir
respuesta inmunológica en las gallinas.
La metodología combinada de ácido caprílico y sulfato de amonio proporciona
anticuerpos activos y suficientemente puros de la yema de huevo de gallinas.
Con el procedimiento descrito se pueden producir, detectar y aislar anticuerpos IgY
anti- S. mutans en la yema de huevo de gallinas a partir de la segunda semana de
inoculación de la bacteria usada
Los anticuerpos IgY anti S. mutans aislados de la yema de huevo disminuyen el
grado de adherencia de UFC in vitro.
43
VII. RECOMENDACIONES
El presente estudio logró aislar anticuerpos Anti – S. mutans por métodos físico
químicos; sin embargo, se podrían obtener anticuerpos con mayor pureza
utilizando métodos inmunológicos como cromatografía de afinidad.
Se recomienda utilizar la metodología descrita para la obtención de anticuerpos
específicos para los distintos factores de virulencia del S. mutans.
Realizar más estudios utilizando diferentes concentraciones de IgY para
observar la efectividad y diferencias entre los tratamientos y determinar una
concentración final ideal efectiva.
Realizar estudios en animales para observar si la IgY anti S. mutans es efectiva
para prevenir caries dental in vivo.
Producir anticuerpos IgY para los distintos microorganismos orales ampliando
el campo de investigación en odontología.
44
RESUMEN
Streptococcus mutans ha sido reconocido como el principal microorganismo
implicado en el desarrollo de caries dental en humanos. Una de las principales estrategias
para combatir a S. mutans es mediante la administración oral de anticuerpos. Los
anticuerpos IgY producidos en yema de huevo de gallinas han mostrado gran capacidad
neutralizante con relación a las IgG producidas en mamíferos, además de la elevada masa
proteica que se obtiene. Su uso contra infecciones intestinales humanas y tratamiento
antiviral en veterinaria, abre un campo de investigación promisorio en odontología. El
objetivo del trabajo fue demostrar que los anticuerpos IgY producidos contra S. mutans
disminuyen la adherencia de la bacteria. Se inmunizaron gallinas de raza Light Brown
Leghorn de 20 semanas de edad con 0,5x107 UFC/mL de S. mutans tratadas con
formaldehido al 0,5% y emulsificados con adyuvante de Freud. Las IgY fueron aisladas de
la yema de huevo por tratamientos sucesivos con ácido caprílico al 6% y fraccionamiento
con sulfato de amonio al 23%. La presencia de anticuerpos fue analizada en ensayos de
aglutinación en placa, con la IgY aislada de las yemas de huevos. La pureza de los
anticuerpos obtenidos fue comprobada usando SDS-PAGE. Se detectaron las IgY reactivas
contra S. mutans, a partir de la segunda semana de iniciado el protocolo de inmunización.
Los electroferogramas mostraron la IgY acompañada de 3 bandas contaminantes, lo que
implica una purificación parcial de las inmunoglobulinas. En los ensayos in vitro pudo
demostrarse el efecto inhibitorio de la IgY anti-S. mutans sobre su el grado de adherencia
de las UFC, encontrándose diferencias significativas entres los grupos con diferente
tratamiento (p<0.01)
La metodología combinada de ácido caprílico y sulfato de amonio producen un
mayor rendimiento de anticuerpos aislados de la yema de huevo de gallina. Con el
procedimiento descrito se pueden producir, aislar y detectar anticuerpos IgY anti-S.mutans
en la yema de huevo a partir de la segunda semana de inoculación de la bacteria usada.
La IgY anti S. mutans disminuye la adherencia de la bacteria, y podría ser usada
para la prevención de caries dental mediante inmunización pasiva con este anticuerpo.
ABSTRACT
45
Streptococcus mutans has been recognized as the main microorganism involved in
the development of dental caries in humans. One of the main strategies to combat S. mutans
is by oral administration of antibodies. IgY antibodies produced in chicken egg yolk
showed high neutralizing capacity in contrast with IgG produced in mammals, as well a
high protein mass obtained. Its use against intestinal infections in human and veterinary
antiviral treatment opens a promising research field in dentistry. The objective of this study
was to demonstrate that IgY antibodies produced against S. mutans decreases the adhesion
of the bacteria. Light Brown Leghorn hens (20 weeks old) were immunized with 0.5 x107
UFC / mL of S. mutans treated with formaldehyde at 0.5% and emulsified with Freund's
adjuvant. IgY were isolated from egg yolk by successive treatments with 6% caprylic acid
and ammonium sulfate fractionation at 23%. The presence of antibodies was examined in
slide agglutination tests, with IgY isolated from egg yolks. The purity of the antibodies
obtained was verified using SDS-PAGE. Uncovered the IgY reactive against S. mutans
from the second week of the immunization protocol started. The electropherograms
showed the IgY accompanied with 3 bands pollutants, which implies a partial purification
of immunoglobulins. In vitro tests showed the inhibitory effect of IgY anti-S. mutans on
their degree of adherence of the UFC, found significant differences between the different
treatment groups (p <0.01)
The combined methodology caprylic acid and ammonium sulfate produced a higher
yield of antibodies isolated from chicken egg yolk. With the procedure described, we can
produce, isolate and detect IgY anti - S. mutans in egg yolk from the second week of
inoculation of the bacteria used.
The IgY anti S. mutans decreases the adhesion of the bacteria, and could be used for
the prevention of dental caries by passive immunization with this antibody.
46
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Pérez S. Efecto de las Inmunoglobulinas de yema de Huevo de gallina sobre la
adherencia in vitro de Streptococcus mutans. Póster presentado en el Primer
Congreso de Odontología del Mercosur - Sheraton Mar del Plata Hotel & Convention
Center - 9 al 11 de Noviembre de 2006 - Mar del Plata, Argentina [ONLINE]. Tesis
de doctorado en la Universidad de Buenos Aires. Instituto Nacional de Tecnología
Agropecuaria – Estación Experimental Balcarce. [Acceso 15 de mayo del 2008].
Disponible en: http://www.inta.gov.ar/balcarce/index.htm
2. Hatta H, Tsuda K, Ozeki M, Kim M, Yanamoto T; Otake S et al. Passive
immunization against dental plaque formation in humans: effect of a mouth rinse
containing egg yolk antibodies (IgY) specific to Streptococcus mutans. Caries Res.
1997; 31(4):268-274
3. Qian Z, Ming W, Zhuan B, Wen X, Wen X. The effect of specific anti - S. mutans
IgY on dental caries in vitro. Chin J Dent Res. 2002; 5 (3):36-40
4. Krüger C, Pearson SK, Kodama Y, Vacca S, Bowen W.; Hammarstrom L. The effects
of egg - derived antibodies to glucosyltranserases on dental caries in rats. Caries Res.
2004 En – Feb; 38 (1): 9 -14
5. Hamada S, Horikoshi T, Minami T, Kawabata S, Hiraoka J, Fujiwara T et al. Oral
passive immunization against dental caries in rats by use of hen egg yolk antibodies
specific for cell-associated glucosyltransferase of Streptococcus mutans. Infect
Immun. 1991 Nov; 59(11):4161-7
6. Otake S, Nishihara Y, Makimura M, Hatta H, Kim M, Yanamoto T et al. Protection
of rats against dental caries by passive immunization with hen-egg-yolk antibody
(IgY). J Dent Res. 1991 Mar; 70(3):162-6
7. Smith DJ, King WF, Godiska R. Passive transfer of immunoglobulin Y antibody to
Streptococcus mutans glucan binding protein B can confer protection against
experimental dental caries. Infect Immun. 2001 May; 69(5):3135-42
8. Machado A, Rudnik L, Wageck C, Ribeiro L, Farias C. Uso de gemas de ovos de
aves hiperimunizadas contra Escherichia coli suína no controle da diarréia neonatal
de leitões. Rev. Bras. Zool. 2005; 34 (4):1234 – 1239
47
9. Moromi H, Martinez E. Efecto del té verde en la formación de placa bacteriana por
Streptococcus mutans. Rev Científica Odontología Sanmarquina. 2006; 9 (2)
10. Hamada S, Slade H. Biology, inmunology and cariogenicity of Streptococcus mutans.
Microbiol Rev. 1980 Jun; 4 (2): 331 – 384
11. Duque de Estrada J, Pérez JA, Hidalgo – Gato I. Caries dental y ecología bucal,
aspectos importantes a considerar. Rev Cub de Estomat [Revista en Internet]. 2006;
43 (1) [acceso 10 de setiembre del 2008]. Disponible en: www.imbiomed.com
12. Liébana UJ. Microbiología oral. 2a ed. en español. Madrid. Ed. Iberoamericana- Mc.
Graw-Hill. 2002.
13. Islam B, Khan SN, Khan AU. Dental caries: From infection to prevention. Med Sci
Monit. 2007; 13 (11):196-203
14. Napimoga MH, Höfling Jf, Klein MI, Kamiya RU, Gonçalves RB. Transmission,
diversity and virulence factors of Streptococcus mutans genotypes. J Oral Sci. 2005;
47 (2): 59-64
15. Negroni, M. Microbiología estomatológica. 2ª ed. Fundamentos y guía práctica.
Argentina. Ed. Panamericana. 2009
16. Nima, G. Vacunas Anticaries… ¿Mito o Realidad? Portal Odontología [ONLINE].
2005 [acceso 8 de agosto del 2007]. Disponible en: http://www.odontologia-
online.com/
17. Mine Y, Kovacs – Nolan J. Biologically active gen egg components in human health
and disease. J Poult Sci. 2004; 41:1-29
18. Mojca N. Production of Antibodies in Chikens. Food Technol. Biotechnol. 2003; 41
(3):259 – 267
19. Chalghoumi R, Beckers Y, Portetelle D, Théwis A. Hen egg yolk antibodies (IgY),
production and use for passive immunization against bacterial enteric infections in
chicken: a review. Biotechnol. Agron. Soc. Environ. 2009; 13 (2): 295-308
20. Chacana P, Terzolo H, Gutierrez E, Schade R. Tecnología IgY o aplicaciones de los
anticuerpos de yema de huevo de gallina: biología, propiedades y su aplicación en
medicina humana y veterinaria. Rev. Med. Vet. 2004; 85 (5):179-189
48
21. Chacana, P; Terzolo H. Una introducción a la tecnología IgY, anticuerpos de yema
de huevo. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria - Estación Experimental
Balcarce. Agosto 2003 [acceso 02 de julio del 2007]. . Disponible en:
http://www.inta.gov.ar/
22. Schade R, Dtaak C, Hendriksen C, Erhard M, Hugl H, Koch G et al. The Production
of Avian (Egg Yolk) Antibodies: IgY. ECVAM Workshop Report 21. 1996 ATLA
24: 925-934.
23. Guang – Ping R, Li M, Xiao – Jing M, Min - Jie M, Xiao - Ning W, Ying L et al.
Quantification of antibody (IgY) titers in hen eggs following immunization and their
use in detecting cell surface molecules on nitrocellulose membranes. J Immunoassay
Immunochem. 2007; 28: 35 – 45
24. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4. Nature. 1970; 227(259): 680-5.
25. Ooshima T, Matsumura M, Hoshino T, Kawabata S, Sobue S, Fujiwara T.
Contribution of three glucosyltransferases to sucrose-dependent adherence of
Streptococcus mutans. J Dent Res. 2001; 80(7): 1672-1677
26. Olson GA, Bleiweis AS, Small P Jr. Adherence Inhibition of Streptococcus mutans:
an assay reflecting a possible role of antibody in dental caries prophylaxis. Infect
Immun. 1972; 5 (4): 419 – 427
27. Jensenius J, Andersen I, Hau J, Koch C. Eggs: conveniently packaged antibodies.
Methods for purification of yolk IgG. J Immunol Methods. 1981; 46(1):63-80.
28. Song C, Yu , Bai D, Hester P, Kim H. Antibodies to the a subunit of insulin receptor
from eggs of immunized hens. J. Immunol. 1985; 135: 3354-3359.
29. Hassl A, Aspock H. Purification of egg yolk immunoglobulins. A two-step procedure
using hydrophobic interaction chromatography and gel filtration”. J Immunol
Methods. 1988; 110: 225-228.
30. Gassmann M, Thommes P, Weiser T. Efficient production of chicken egg yolk
antibodies against a conserved mammalian protein. FASEB J. 1990; 4: 2528-2532.
31. Polson, A. Isolation of IgY from the yolks of eggs by a chloroform polyethylene
glycol procedure. Immunol Invest. 1990 Jun; 19(3): 253-258.
49
32. Akita E, Nakai S. Comparison of four purification methods for the production of
immunoglobulins from eggs laid by hens immunized with an enterotoxigenic E. coli
strain. J Immunol Methods. 1993; 160: 207-214
33. Polson A, Von Wechmar MB, Van Regenmortel MH. Isolation of viral IgY
antibodies from yolks of immunized hens. Immunol Commun. 1980; 9(5):475-93
34. Hatta H, Mujo K, Takehiko Y. A novel isolation method for hen egg yolk antibody,
"IgY". Agric. Biol. Chem. 1990; 54(10):2531–2535
50
ANEXOS
51
ANEXO 1
Curva patrón utilizada para determinar el número de UFC según la absorbancia
y = 0.0024x ‐ 0.0043R² = 0.9617
‐0.02
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
0 10 20 30 40 50 60
Absorban
cia
UFC/ml x 10(3)
Curva de concentracion medida por absorbancia de
S. mutans
Dilución Abs UFC/ml x10(6) de la muestra Volumen de caldo UFC totales x 10(6)
52
ANEXO 2
Análisis de varianza (ANOVA) que compara el grado de adherencia entre los tres grupos
ANOVA
% UFC Adheridas
Suma de
cuadrados gl Media cuadrática F Sig.
Inter-grupos 2028,124 2 1014,062 82,193 ,000
Intra-grupos 185,063 15 12,338
Total 2213,187 17
Al realizar la prueba estadística de Análisis de Varianza (ANOVA), se encontraron
diferencias significativas en el grado de adherencia entre los tres grupos (p<0.01)
53
ANEXO 3
Prueba de Tukey que compara el grado de adherencia entre cada tratamiento
Comparaciones múltiples
% UFC Adheridas
HSD de Tukey
(I) IgY (J) IgY
Diferencia
de medias
(I-J) Error típico Sig.
Intervalo de confianza al
99%
Límite
inferior Límite superior
Control IgY Pre Inmune 8,73761* 2,02793 ,002 1,8030 15,6722
IgY Anti S. mutans 25,57662* 2,02793 ,000 18,6421 32,5112
IgY Pre Inmune Control -8,73761* 2,02793 ,002 -15,6722 -1,8030
IgY Anti S. mutans 16,83902* 2,02793 ,000 9,9045 23,7736
IgY Anti S. mutans Control -25,57662* 2,02793 ,000 -32,5112 -18,6421
IgY Pre Inmune -16,83902* 2,02793 ,000 -23,7736 -9,9045
*. La diferencia de medias es significativa al nivel 0.01.
La prueba de Tukey demostró que existen diferencias significativas en el grado de
adherencia entre todos los grupos (p<0.01)
54
ANEXO 4
Inmunización de gallinas
Inoculación con 0.5 x 106 UFC de S. mutans + 0.5 mL de adyuvante de Freud por vía
intramuscular en gallinas de la raza Light Brown Leghorn
Gallina raza Light Brown Leghorn
Recolección de huevos
Antígeno
AN
Aislam
Extra
Tratam
NEXO 5
miento de I
acción de la
miento con á
IgY
a yema
ácido capríli
ico
55
56
Filtrado con papel filtro Watman
IgY aislada
Dializado en PBS
Precipitación con Sulfato de Amonio
57
AN
Ensayos
Cultivo h
Siembe
NEXO 5
de Adher
S. mutans eh 5% sacaro
bras en los gexperimenta
rencia
en BHI 48 osa
grupos de ación
58
59
Incubación en microaerofilia en ángulo de 30o
S. mutans adheridos a las paredes del tubo
