Zeszyt Studentów Biotechnologii

numer 10

Kraków, wrzesień 2016

Od redakcji

DRODZY CZYTELNICY!

W dziesiątym numerze Zeszy-tów Naukowych zachęcamy dozapoznania się z  bardzo cieka-wymi publikacjami z zakresubiotechnologii oraz biochemiii  fizjologii roślin. W pierwszymartykule Marta Fifielska przed-stawi naukowe aspekty zyskują-cej na popularności alternatywiedla cukru - stewii. NastępnieSara Nawrocka przybliży nammetodę analizy parametrów fi-zjologiczno-biochemicznych ro-ślin za  pomocą chormatografiigazowej oraz cieczowej . WiktorTokarek zapozna nas z mniejznanymi chlorofilami, a MariiaBorbuliak przedstawi nowator-skie narzędzie do  badania pHwe wnętrzu komórki. Zaprasza-my także do  wzięcia udziałuw  międzynarodowej konferencjiBioChemMed Session organi-zowanej przez AkademickieStowarzyszenie Studentów Bio-technologii.

Życzymy miłej lektury!

ZESPÓŁ REDAKCYJNY

3

Zespół redakcyjny

Dobrochna DolickaAgnieszka Seretny

Irma Gryniuk

Okładka

Irma GryniukZdjęcie kryształów lizozymu zostało wykonane przez dra Rafała Dolota

w  lipcu 2015 (Zakład Chemii Bioorganicznej , Centrum BadańMolekularnych i Makromolekularnych PAN w Łodzi), białka lizozymu

zostały wykrystalizowane przez Agnieszkę Dąbrowsk

Skład

Dobrochna Dolicka

Korekta

Zespół redakcyjny

Wydawca

KNSB Mygen

Nakład 500 szt

Kontakt

dobrochna_d@wp.pl

ISSN 1899-5535

Sfinansowane przez:

Spis treści:

Stewia jako alternatywa dla wysokokalorycznego cukru

Marta Fifielska, Karolina Hulisz 7

Wykorzystanie chromatografii gazowej oraz cieczowej w analizie

wybranych parametrów fizjologiczno-biochemicznych roślin

Sara Nawrocka 14

Od c do f, czyli mniej znane chlorofile

Wiktor Tokarek 23

pHluorins – a tool to measure intracellular pH

(artykuł w j. angielskim)

Mariia Borbuliak, Wiktor Tokarek 38

Zaproszenie na BioChemMed Session 46

5

Wstęp

Stewia wykorzystywana już była setki

lat temu przez Indian Guarani za-

mieszkujących Amerykę Południową

[19]. Tradycyjna metoda stosowania

tej rośliny przez paragwajskich Indian

polegała na suszeniu jej liści i użyciu

ich do słodzenia napojów. Stosowano

ją także w lecznictwie oraz jako słodką

przekąskę [9]. Japończycy wykorzystu-

ją stewię i jej produkty do pieczenia,

gotowania, w żywności przetworzonej ,

sokach owocowych, wyrobach tytonio-

wych czy gumach do żucia. Obecnie,

główne kraje, które zajmują się upra-

wą stewii to: Tajwan, Chiny, Japonia,

Korea w Azji oraz Brazylia i Paragwaj

w Ameryce Południowej [24].

Stewia jest rośliną jednoroczną, o roz-

budowanym systemie korzeniowym.

Charakteryzuje się dość długim pędem

sięgającym nawet do 120 cm wysoko-

ści [12]. Kwiatostan stanowią balda-

chogrona ułożone w luźne wiechy.

Drobne kwiaty są barwy białej lub ja-

snofioletowej . Niewielkie liście mają

kształt lancetowaty, owalny lub łopat-

kowy. Ich powierzchnię mogą pokry-

wać włoski [24]. Liście są organem

o  najwyższej zawartości glikozydów.

Jednakże, związki te występują także

w mniejszych ilościach w kwiatach,

nasionach, łodygach czy korzeniach

[5].

Rozmnażanie stewii przez nasiona,

Stewia jako alternatywa dla wysokokalorycznego

cukruMarta Fifielska, Karolina HuliszKoło Naukowe Biotechnologii BioXKatedra Genetyki, Fizjologii i Biotechnologii RoślinWydział Rolnictwa i BiotechnologiiUniwersytet Technologiczno - Przyrodniczy w BydgoszczyPraca napisana pod opieką dr inż. Iwony Jędrzejczyk i dr inż. MagdalenyTomaszewskiej-Sowy

W ostatnim czasie obserwuje się wzrost zainteresowania zdrowym trybem

odżywiania. Coraz częściej konsumenci zwracają uwagę na skład

i  kaloryczność produktów spożywczych. Nadmierna konsumpcja cukru

powoduje wiele dolegliwości i chorób, takich jak: cukrzyca, nadwaga, czy

nadciśnienie. Z tego względu, poszukiwane są niskokaloryczne produkty

obniżające ilość spożywanej sacharozy. Syntetyczne środki słodzące, takie

jak sukraloza czy sacharyna, budzą pewne obawy dotyczące ewentualnego,

negatywnego wpływu na zdrowie człowieka. W związku z tym faktem,

dobrą i zdrową alternatywą jest wykorzystanie stewii. Jest to roślina zielna

z rodziny Asteraceae, pochodząca z górskiego regionu Amambay leżącego

na pograniczu Brazylii i Paragwaju. Dzięki właściwościom słodzącym

określana jest jako "miodowy liść" lub "słodkie zioło". Za walory smakowe

odpowiada grupa związków nazywanych glikozydami stewiolowymi.

7

ogranicza zmienność genetyczna

oraz  niska zdolność kiełkowania na-

sion. Sadzonkowanie, czyli metoda

rozmnażania wegetatywnego jest cza-

sochłonna i pozwala na uzyskanie ma-

łej liczby sadzonek otrzymanych

z  pojedynczych roślin. Dlatego dobrą

alternatywą mogą okazać się kultury

tkankowe in vitro [1 1 ]. Mikrorozmna-

żanie pozwala na szybkie i masowe

namnażanie roślin identycznych gene-

tycznie. Uzyskany materiał roślinny

jest jednakowy pod względem składu i

zawartości glikozydów stewiolowych

[18].

Właściwości biologiczne

Glikozdydy stewiolowe, to grupa dzie-

więciu związków chemicznych, odpo-

wiadających za silne właściwości

słodzące stewii. Wśród nich wyróżnić

można stewiozyd i rebaudiozyd A

[Rys.   1 ] . Stanowią one odpowiednio

65% i 25% mieszaniny w ekstrakcie

z  liści. Do pozostałych glikozydów zali-

cza się: rebaudiozyd B, C, D, E, F, duc-

lozyd A i C oraz stewiolbiozyd. Związki

te są pochodnymi stewiolu, połączone-

go wiązaniami glikozydowymi z gluko-

zą, ramnozą i ksylozą. Najbardziej

stabilny termicznie okazuje się rebau-

diozyd A, który stanowi 2-4% świeżej

masy liści. Jego potencjał słodzący

w  porównaniu do sacharozy jest 150-

350 razy wyższy. Charakteryzuje się

najlepszą jakością sensoryczną i walo-

rami smakowymi, ma najmniej gorzka-

wy posmak. Nie ulega fermentacji

i  odróżnia się od stewiozydu nieco lep-

szą rozpuszczalnością w wodzie.

Stewiozyd jest 200-450 razy słodszy

od  sacharozy. Ma postać białego, bez-

wonnego, krystalicznego proszku. Wy-

ekstrahowany został z liści stewii,

a  jego zawartość wynosi 6-18% ich

świeżej masy. Ze względu na to, że po-

woduje gorzkawy, lukrecjowy posmak,

jest mniej pożądany niż rebaudiozyd A.

Jednakże podobnie jak on, stewiozyd

pozostaje stabilny w wysokich tempe-

raturach i nie ulega fermentacji. Bar-

dzo dobrze rozpuszcza się

w  alkoholach i wodzie. Proces pozy-

skiwania glikozydów stewiolowych od-

bywa się poprzez ekstrakcję

z  surowców roślinnych. Polega to na

wymywaniu substancji z rozdrobnio-

nych i suchych liści. W celu rozpusz-

czenia, stosowana jest gorąca woda

lub rozpuszczalnik organiczny, np. al-

kohol. Ekstrakcji sprzyja wcześniejsza

hydroliza enzymatyczna surowca.

Obejmuje ona struktury tworzące

ściany komórkowe w budowie liścia

tj .   pektyny, celulozy lub hemicelulozy.

Uzyskany ekstrakt poddaje się rożnym

metodom oczyszczania tak, aby otrzy-

mać koncentrat wysokiej jakości

[1 ,   1 2].

Stewia, stanowiąca naturalny słodzik,

swoją niskokaloryczność zawdzięcza

właściwościom, jakie posiadają gliko-

zydy stewiolowe. Nie są one trawione,

tylko ulegają rozkładowi do glukozy

i  stewiolu. Ich hydrolizę przeprowa-

dzają bakterie z rodzaju Bacteroides

sp. , które bytują w jelicie grubym.

Ze  względu na to, że katabolizm tych

związków odbywa się dopiero na eta-

pie jelita grubego, mikroflora bakte-

ryjna wykorzystuje uwolnioną z nich

glukozę. Stewiol natomiast ulega

wchłonięciu w jelitach, następnie

transportowany jest do wątroby i tam8

9

Rys. 1 Struktura chemiczna glikozydów stewiolowych [13].

przekształcany do pochodnej glukuro-

nidu. W końcowym etapie wydalany

jest z moczem [3].

Korzyści zdrowotne

Obecnie znanych jest wiele roślin

zdolnych do wytwarzania substancji

glikozydowych. Wśród nich można

wyróżnić Stevia rebaudiana , która wy-

kazuje potencjał do syntezy chemicz-

nej pewnej grupy związków

posiadających wartościowe właściwo-

ści biologiczne. Wyciągi z liści Stevia

rebaudiana zawierają mieszaninę nie-

kancerogennych, niskokalorycznych,

niemutagennych glikozydów stewiolo-

wych, których konsumpcja wywiera

korzystny wpływ na zdrowie człowieka

[17]. Nie bez powodu od wielu lat

w  Ameryce Południowej stosuje się

ekstrakty z liści stewii jako skuteczny

środek do leczenia cukrzycy ty-

pu  2   [1 5]. Ich regularne spożywanie

pozwala na zmniejszenie cukru

oraz  cholesterolu we krwi. Badania

wykazały, że spożycie glikozydów ste-

wiolowych wpływa na obniżenie glu-

kozy we krwi. Jest to związane z pod-

niesieniem wrażliwości insulinowej

i  tym samym zwiększoną aktywnością

komórek β wysp trzustki. W przypadku

cukrzycy wydzielanie hormonu pepty-

dowego przez wysepki Largenhansa

jest zaburzone, co powoduje wahania

poziomu glukozy we krwi [10, 21 , 22].

Spożycie glikozydów stewiolowych

przyczynia się również do łagodnego

obniżenia nadciśnienia tętniczego po-

przez wpływ na rozluźnienie skurczu

mięśniówki naczyń krwionośnych

[4,   20]. W przypadku glikemii, jak

i  nadciśnienia tętniczego, dawka tera-

peutyczna glikozydów stewiolowych

powinna wynosić nie mniej niż 1000

mg/dobę. Kumari i Chandra [16]

w  przeprowadzonych badaniach udo-

wodnili zarówno antyoksydacyjny,

przeciwbakteryjny, jak i przeciwdrob-

noustrojowy wpływ wyciągów stewii

w  stosunku do szerokiej gamy patoge-

nów obecnych w żywności, tj . : Bacillus

subtilis, Klebsiella pneumoniae, Sal-

10

krzepnięcie krwi, wzmacnia naczynia

krwionośne oraz wpływa na odnowę

komórkową organizmu [17]. Roślina

może być spożywana przez osoby cho-

re na fenyloketonurię, ponieważ

nie  zawiera w swoim składzie fenylo-

alaniny [2, 20].

Zastosowanie w przemyśle

Stewia, jako naturalny środek słodzą-

cy, jest dostępna i powszechnie stoso-

wana w technologii produktów

spożywczych w różnych rejonach

świata, tj . w Chinach (największy eks-

porter stewiozydu na świecie), Korei,

Japonii, Południowo-Wschodniej Azji,

czy w Ameryce Południowej . Wyjąt-

kiem są Stany Zjednoczone, gdzie za-

równo ekstrakt roślinny, jak

i  sproszkowane liście wykorzystywane

są jako suplementy diety oraz składni-

ki produktów do pielęgnacji skóry [17].

Wszelkiego rodzaju substancje słodzą-

ce, takie jak tradycyjny cukier (sacha-

roza, syrop kukurydziany, glukoza, czy

fruktoza) i sztuczne środki słodzące

(aspartam, cykloaminiany, acesulfam

K), są często stosowane w przemyśle

spożywczym. Ze względu na ich szko-

dliwy oraz, w przypadku sztucznych

słodzików, kontrowersyjny wypływ

na  zdrowie człowieka stopniowo zo-

stają one eliminowane z żywności i za-

stępowane przez niskokaloryczne

glikozydy stewiolowe [13]. Naturalne

źródło substancji słodzących znajduje

zastosowanie w wielu produktach spo-

żywczych, takich jak: słodycze bezcu-

krowe, czekolady, cukierki, lody,

ciastka, dżemy, owoce morza, fermen-

towane produkty mleczne, ogórki kon-

serwowe, gotowe do jedzenia zboża,

monella typhimurium, Pseudomonans

aeurginosa, Aspergillus niger, Alterna-

ria solani oraz Penicillium chryzoge-

num . Dzięki przeciwbakteryjnemu

działaniu glikozydy zapobiegają po-

wstawaniu owrzodzeń w przewodzie

pokarmowym oraz są przydatne w le-

czeniu oparzeń i ran. Ekstrakty z liści

stewii wykazują szerokie spektrum in-

hibicj i w stosunku do czterech seroty-

pów ludzkiego rotawirusa (HRV)

przyczyniającego się do zapaleń żołąd-

kowo-jelitowych [6, 17].

Stewia wywiera korzystny wpływ

na  dziąsła oraz hamuje wzrost płytki

nazębnej [8]. Ekstrakty stewii przeja-

wiają działanie przeciwko szczepom

jamy ustnej , tj . Streptococcus mutans

stanowiących czynnik etiologiczny

próchnicy zębów. Dzięki działaniu

przeciwbakteryjnemu jest coraz czę-

ściej stosowana jako składnik past

do  zębów [10, 23].

Stevia rebaudiana Bertoni będąca źró-

dłem mikroelementów, takich jak se-

len, żelazo, cynk, czy witamina C,

zapobiega nawrotom infekcji wiruso-

wych i bakteryjnych. W dodatku ste-

wiozydy stosowane jako zamienniki

sacharozy stają się świetną alternaty-

wą w leczeniu otyłości. Ich niski in-

deks glikemiczny, w porównaniu

z  wysokokalorycznym cukrem, spra-

wia, że organizm ludzki zużywa zapasy

energetyczne z tkanki tłuszczowej ,

czego rezultatem jest spadek masy

ciała [20]. Badania kliniczne wykazały

również inne, prozdrowotne właściwo-

ści ekstraktów z liści stewii. Obejmują

one działanie przeciwnowotworowe,

przeciwzapalne, przeciwbiegunkowe

i  diuretyczne. Ekstrakt poprawia

kawa, herbaty ziołowe, czy słodziki

stołowe [9, 14]. Od niedawna stewia

jest wykorzystywana również do pro-

dukcji pieczywa przeznaczonego dla

cukrzyków. Jej dodatek wpływa na tek-

sturę, miękkość i trwałość produktu

piekarniczego [9].

W przemyśle kosmetycznym jest uży-

wana jako składnik maseczek, działa-

jących leczniczo na wrzody i skórę

problematyczną (trądzikową). Przy-

spiesza gojenie się ran, dezynfekuje

skórę i zamyka rozszerzone pory [8].

Stewia może być stosowana w postaci

koncentratów, wyciągów oraz świe-

żych bądź suszonych liści, Do żywności

dodawana jest w formie tabletek,

proszku oraz płynu, roztworu skon-

centrowanego ekstraktu glikozydów

stewiolowych lub soku z liści [2, 13].

Glikozydy stewiolowe jako dodatki do

żywności zostały oznaczone na opako-

waniach symbolem E960 [13].

Podsumowanie

Stevia rebaudiana Bertoni jest staro-

żytną roślina wytwarzająca diterpeny

glikozydowe, które są naturalnymi,

bezkalorycznymi substancjami o wiel-

kim potencjale słodzącym, co odgrywa

ogromne znaczenie w produkcji nisko-

energetycznej żywności [7]. Stewia

jest również źródłem błonnika pokar-

mowego oraz związków o charakterze

antyoksydacyjnym. W porównaniu

z  cukrem, charakteryzuje się ona

ogromną zawartością mikroelementów

(żelazo, mangan, cynk, selen, miedź),

których największa ilość zmagazyno-

wana jest w młodych liściach [8, 15].

Glikozydy stewiolowe nie ulegają fer-

mentacji. Co więcej , wykazują stabil-

ność w temperaturze 200°C,

co  oznacza, że mogą być używane jako

słodzik do ciast, a intensywność słody-

czy nie ulega spadkowi [17]. Roślinne

związki wykazują działanie przeciw-

bakteryjne, antynowotworowe, immu-

nosupresyjne. Nie są mutagenne,

ani  genotoksyczne, dzięki czemu moż-

liwe jest ich wykorzystanie w dietote-

rapii [15].

Uprawa w naturalnych warunkach

Stevia rebaudiana niesie ze sobą wiele

problemów. Jednym z nich jest hetero-

zygotyczność i samoniezgodność. Na-

siona tego gatunku odznaczają się

bardzo niską zdolnością kiełkowania,

co znacznie ogranicza jej uprawę.

Rozmnażanie przez nasiona nie po-

zwala na wytworzenie jednorodnych

populacji zarówno pod względem fe-

notypowym, jak i genotypowym. Roz-

wiązaniem dla tradycyjnych metod

rozmnażania, stają się roślinne kultury

tkankowe in vitro. Pozwalają one na

masowe i szybsze uzyskanie roślin

wolnych od patogenów, a otrzymane w

ten sposób rośliny są jednorodne pod

względem zawartości glikozydów ste-

wiolowych i składu chemicznego.

Bibliografia:

[1 ] Bugaj B. , Leszczyńska T., Pysz M.,

Kopeć A., Pacholarz J. , Pysz-Izdebska K.

2013. Charakterystyka i prozdrowotne

właściwości Stevia rebaudiana Bertoni.

Żywność, Nauka, Technologia, Jakość, 3

(88), 27-38.

[2] Brahmachari G. , Mandal, L.C. , Roy R.,

Mondal S. , Brahmachari A.K. 2011 .

11

Stevisoide and related compounds

molecules of pharmaceutical promise: A

critical review. Arch. Pharm. Chem. Life

Sci. , 1 , 5-19.

[3] Carakostas M.S. , Curry C.C. , Boielau

A.C. , Brusick D.J. 2008. Overview: The

history, technical function and safety of

rebaudioside A, a naturally occurring

steviol glycoside, for use in food and

beverages. Food and Chemical Toxicology,

46 (7): 1 -10

[4] Chan P., Tomlinson B., Yi-Jen C., Ju-Chi

L. , Ming-Hsiung H., Juei-Tang C. 2000. A

double-blind placebo-controlled study of

the effectiveness and tolerability of oral

stevioside in human hypertension. Br. J.

Clin. Pharmacol. , 50, 215-220.

[5] Christaki E. 2013. Stevia rebaudiana as

a novel source of food additives. Journal of

Food and Nutrition Research, 52 (4), 195-

202.

[6] De S. , Mondal S. , Banerjee S. 2013.

Stevioside – technology, applications and

health. Wiley Blackwell, II, 27-43.

[7] Debnath M. 2008. Clonal propagation

and antimicrobial activity of an endemic

medicinal plant of Stevia rebaudiana.

Journal of Medicinal Plant Research, 2 (2),

45-51 .

[8] Gęsiński K., Majcherczak E., Gozdecka

G. 2013. Stewia (Stevia rebaudiana

Bertoni) jako źródło wybranych

makroelementów. Inżynieria i Aparatura

Chemiczna, 52 (2), 74-75.

[9] Goyal, S. , Goyal, R. 2010. Stevia

(Stevia rebaudiana) a bio-sweetener: A

review. International Journal of Food

Sciences and Nutrition, 61 , 1 –10.

[10] Gregersen S., Jeppesen P.B. , Holst J.J. ,

Hermansen K. 2004. Antihyperglycemic

effects of stevioside in type 2 diabetic

subjects. Metabol. , 53 (1 ), 73-76.

[1 1 ] Hassanen S.A. , Khalil R.M.A. 2013.

Biotechnological Studies for Improving of

Stevia (Stevia rebaudiana Bertoni) in vitro

Plantlets. Middle-East Journal of Scientific

Research, 14 (1 ), 93-106.

[12] Kobus-Moryson M., Gramza-

Michałowska A., Kobus-Cisowska J. ,

Korczak J. 2014. Zawartość wybranych

pierwiastków w ekstraktach stewii (Stevia

rebaudiana Bertoni) [Contents of selected

elements in extracts from sweetleaf (Stevia

rebaudiana Bertoni)] . Probl. Hig.

Epidemiol. , 95 (2), 445–448.

[13] Kolanowski W. 2013.Glikozydy

stewiolowe – Właściwości i zastosowanie w

żywności. Bromat. Chem. Tokstkol. , XLVI

(2), 140-150.

[14] Koyama E., Kitazawa K., Ohori Y. ,

Izawa O., Kakegawa K., Fujino A., Ui M.

2003. In vitro metabolism of the glycosidic

sweeteners, stevia mixture and

enzymatically modified stevia in human

intestinal mikroflora. Food Chem. Toxicol. ,

41 , 359-374.

[15] Kulczyński M., Gramza-Michałowska

A., Człapka-Matysiak. 2015.

Charakterystyka żywieniowa stewii.

Aktualny stan wiedzy. Bromat. Chem.

Toksykol. , XLVIII (1 ), 1 1 -18.

[16] Kumari M., Chandra S. 2014. A sweet

medicinal herb Stevia rebaudiana:

perspectives in therapeutics. BMR

Phytomedicine, 1 (1 ), 1 -10.

[17] Lemus Mondaca R., Vega Galvez A.,

Zura Bravo L., Ah-Ken K. 2012. Stevia

rebaudiana Bertoni, source of high-

potencynatural sweetener: A

comprehensive review on the biochemical,

nutritional and functional aspects. Food

Chemistry, 132 (3), 1 121 -1 132.

[18] Luwańska A., Perz A., Mańkowska G.,

Wielgus K. 2015. Application of in vitro

12

stevia (Stevia rebaudiana Bertoni) cultures

in obtaining steviol glycoside rich material.

Herba Polonica Journal, 61 (1 ), 50-62.

[19] Madan S., Ahmad S., Singh G.N., Kohli

K. , Kumar y. , Singh R., Garg M. 2010.

Stevia rebaudiana Bertoni - A review.

Indian Journal of Natural Products and

Resources, 1 (3), 267-286.

[20] Maki K.C. , Curry L.L. , Carakostas M.,

Tarka S., Reeves M.S. , Farmer M.V. 2008.

The hemodynamic effects of rebaudioside

A in healthy adults with normal and

lownormal blood pressure. Food

Chem.Toxicol. , 47, 40-46.

[21 ] Prakash I. , Clos J.F. , Prakash

Chaturvedula V.S. 2012. Stability of

rebaudioside A under acidic conditions and

its degradation products. Food Res. Int. ,

48, 65-75.

[22] Prakash I. , Dubois G.E. , Clos J.F. ,

Wilkens K.L. , Fosdick L.E. 2008.

Development of rebiana, a natural, non-

caloric sweetener. Food Chem. Toxicol. 46,

75-82.

[23] Roberts, A. , Renwick, A.G. , 2008.

Comparative toxicokinetics and

metabolism of rebaudioside A, stevioside,

andsteviol in rats. Food Chem.Toxicol. , 46,

31 -S39.

[24] Yadav A.K., Singh S., Dhyani D., Ahuja

S. 2011 . A review on the improvement of

stevia (Stevia rebaudiana Bertoni).

Canadian Journal of Plat Science, 91 , 1 -27.

13

Wstęp

Charakteryzując procesy biochemicz-

ne, biofizyczne i fizjologiczne w rośli-

nach warto zwrócić uwagę

na  transpirację (proces biofizyczny),

metabolizm komórkowy, w tym foto-

syntezę (procesy biochemiczne), cał-

kowitą ilość chlorofilu znajdującą się

w  nadziemnych częściach rośliny, po-

ziom kwasu askorbinowego oraz roz-

puszczalnych cukrów, przekładające

się na  wzrost i prawidłowe funkcjono-

wanie roślin. Dane literaturowe wska-

zują na zainteresowanie badaczy

analizą procesów metabolicznych

i  komponentów w nie zaangażowa-

nych, a także gazów uczestniczących

w  przemianach fizjologicznych oraz fi-

tohormonów [1 , 3]. Co więcej ostatnie

lata wskazują na intensywny rozwój

metod analitycznych, które warunkują

precyzyjną i kompleksową analizę ca-

łego spektrum związków występują-

cych w badanej matrycy. Dążenie

do  oznaczania największej liczby

związków chemicznych na coraz niż-

szym poziomie stężeń w coraz bardziej

złożonych matrycach i coraz krótszym

czasie pociąga za sobą konieczność

zoptymalizowania procedury badaw-

czej , także w kierunku jak najmniejszej

ilości wykorzystywanego materiału

badanego. Podstawą sukcesu oznacze-

nia ilościowego i jakościowego danego

komponentu na niskim poziomie stę-

Wykorzystanie chromatografii gazowej oraz

cieczowej w analizie wybranych parametrów

fizjologiczno-biochemicznych roślin

Sara NawrockaKoło Naukowe „BIO-TECH”Pozawydziałowy Zamiejscowy Instytut Biotechnologii Stosowanej i NaukPodstawowychUniwersytet Rzeszowskinawrocka.nawrocka@gmail.comPraca napisana pod opieką dr Magdaleny Duda

Chromatografia gazowa oraz cieczowa z powodzeniem są wykorzystywane

w analizie fizjologicznej oraz biochemicznej roślin. Wybór procedury

badawczej i techniki rozdziału zależy od rodzaju badanego materiału

roślinnego. Oba rodzaje omawianych w pracy technik dają szeroki

wachlarz możliwości w aspekcie rozdzielania składowych mieszanin

związków lotnych, stałych lub cieczy. Pozwala to na dokładniejsze

poznanie ich budowy, a w konsekwencji możliwości przypisania im

nowych, wcześniej niepoznanych właściwości.

W pracy przedstawiono wybrane aspekty zastosowania chromatografii

gazowej i cieczowej w analizie podstawowych parametrów fizjologiczno-

biochemicznych wpływających na wzrost, rozwój i plonowanie roślin.

14

żeń są z całą pewnością metody pobie-

rania próbek oraz zastosowane techni-

ki analityczne [13, 14].

Najczęściej wykorzystywanymi meto-

dami instrumentalnymi są między in-

nymi techniki chromatograficzne,

spektrofotometryczne i spektrome-

tryczne (m.in. atomowa spektrometria

absorpcyjna ASA) [1 ]. W pracy przed-

stawiono przykłady zastosowania

chromatografii gazowej i cieczowej

w  wybranych obszarach analizy roślin.

System chromatografii gazowej (GC)

i  cieczowej (LC) składa się z kilku pod-

stawowych elementów: układu dozo-

wania, termostatu, kolumny

chromatograficznej , detektora

oraz  rejestratora otrzymanych wyni-

ków. W GC wykorzystywany jest on do

dokładnego oznaczenia ilościowego

badanej substancji przy wykorzystaniu

odpowiedniego gazu nośnego np. azo-

tu lub helu. Z kolei w LC, dzięki wyso-

kiemu wskaźnikowi czułości oraz

niezawodności, służy przede wszyst-

kim do analiz metabolitów pochodze-

nia roślinnego [4]. Wszystkie rodzaje

analiz chromatograficznych warunkują

rozdzielenie poszczególnych składni-

ków próbki dzięki różnicom w ich wła-

ściwościach fizykochemicznych [5, 13,

14]. Jak już wspomniano, chromato-

grafia gazowa oraz cieczowa łączą

w  sobie elementy niezbędne do analizy

procesów fizjologicznych oraz bioche-

micznych przebiegających w roślinie.

Sposób wykonania procedury zależy

m.in. od rodzaju badanego materiału

roślinnego, który zostaje poddany sze-

regowi procesów, od inaktywacji prób-

ki po ekstrakcję, w celu uwidocznienia

związków chemicznych, które w na-

stępstwie zostają poddane analizom

chromatograficznym [2].

W pracy omówiono wybrane aspekty

chromatografii wykorzystywanej

w  oznaczeniach ilościowych i jakościo-

wych komponentów zaangażowanych

w przemiany fizjologiczno-biochemicz-

ne w roślinach.

Przygotowanie próbek do analiz

chromatograficznych

W pierwszej kolejności podczas prze-

prowadzania analiz należy pamiętać

o  określeniu problemu oraz potrzeb

planowanych badań. Kolejnym etapem

jest wybór metody, którą będziemy

wykorzystywać. Dobierana ona zostaje

w zależności od rodzaju próbki

oraz  zawartego w niej analitu. Następ-

nie dochodzi do pobrania analizowanej

próbki, jej wstępnej obróbki oraz kon-

dycjonowania. Właściwe analizy mogą

być analizami jakościowymi oraz ilo-

ściowymi i wykonywane są odpowied-

nio w celu przeprowadzenia prób

analogicznych w porównaniu z bada-

nym materiałem oraz przygotowania

wzorców czystych, tj . bez analitu lub

z  jego znaną ilością. Po zakończeniu

procedury analitycznej dochodzi

do  sprawdzenia otrzymanych wyników,

oceny problemu badawczego oraz we-

ryfikacji końcowych rezultatów

(Rys.   1 ).

Uwzględniając występowanie substan-

cj i na poziomie śladów lub ultraśladów,

należy starannie zaplanować etap

przygotowywania próbek do analizy,

procedurę izolacj i kluczowego skład-

nika/składników (w tym usunięcie

składników interferujących) oraz

wzbogacania. Właściwe przygotowanie15

tego etapu zapewni polepszenie wy-

krywalności składnika, selektywne od-

dzielenie analitów od innych

składników próbki, czy wprowadzenie

do układu chromatograficznego czy-

stej matrycy. W celu ograniczenia strat

analitu podczas przygotowywania pró-

bek stosuje się techniki, które łączą

w  sobie dwa lub więcej etapów w pro-

cedurze przygotowywania do analiz

próbek, np. izolację i wzbogacanie

próbki. Przykładem może być zastoso-

wanie do przygotowania próbek o cha-

rakterze ciekłym ekstrakcji w układzie

ciecz-ciecz; ciecz-ciało stałe, techniki

Quechers, czy mikroekstrakcji do fazy

stałej [13, 15]. Klejdus i in. już w

1999  roku wskazywali na efektywność

zastosowania techniki HPLC poprze-

dzonej ekstrakcją do fazy stałej

do  oznaczania izoflawonoidów (da-

idzeiny, genisteiny, biochaniny A i bio-

chaniny B) wyizolowanych z koniczyny

łąkowej [21 ]. Należy zwrócić uwagę,

16

że związki analizowane przy użyciu GC

muszą odznaczać się odpornością ter-

miczną i odpowiednią lotnością. Nie

znaczy to, że związki trudnolotne

i  nielotne nie będą analizowane tą

techniką, jednak ich oznaczanie musi

poprzedzić derywatyzacja (w tym

przypadku przeprowadzenie związku

nielotnego w bardziej lotny). Koniecz-

ność derywatyzacji badanych związ-

ków skierował zainteresowania

badaczy w kierunku chromatografii

cieczowej [10]. Obok derywatyzacji

do  popularnych metod przygotowania

próbki przed analizą z wykorzystaniem

chromatografii gazowej należy także

estryfikacja kwasów tłuszczowych

(FAME), czy ekstrakcja z fazy gazowej

(nadpowierzchniowej) [12].

Oznaczanie ilościowe związane jest

z  koniecznością wykorzystania wzorca

(standardu) wewnętrznego, który do-

daje się do analizowanej próbki. Po-

zwala to na wyznaczenie odzysków, co

ma szczególne znaczenie w analizie

pozostałości pestycydów, czy metabo-

litów. Wzorcem wewnętrznym może

być czysta forma komponentu, którego

spodziewamy się w analizowanej

próbce, jego izotopowe formy np. izo-

flawonoidów, czy substancja o podob-

nej strukturze i właściwościach

albo  wręcz składnik niewystępujący

w  badanej próbce [11 ].

Chromatografia gazowa i przykłady

jej zastosowania w analizie roślin

Chromatografia gazowa jest jedną

z  najczęściej stosowanych w praktyce

laboratoryjnej metod, pozwalających

na określenie ilościowego i jakościo-

wego składu mieszanin. Umożliwia

szybką i dokładną analizę złożonych

mieszanin o charakterze gazów

lub  par, a w zasadzie substancji gazo-

wych, ciekłych i stałych, których tem-

peratura wrzenia lub sublimacji nie

przekracza 350-400°C [3, 5]. Rozwój

chromatografii gazowej datuje się

na  1980 r. , kiedy nastąpiło gwałtowne

zainteresowanie dziedzinami nauk, ta-

kimi jak medycyna, farmacja, chemia,

nauki środowiskowe oraz przemysł.

Zasada metody opiera się na fizycznym

rozdziale mieszanin na dwa zasadnicze

elementy, z których jeden z nich jest

fazą ruchomą, a drugi stałą (stacjo-

narną). Złożony proces chromatogra-

ficzny to cyklicznie powtarzane

mechanizmy sorpcji oraz desorpcji,

w  trakcie których badany materiał

przemieszcza się wzdłuż nieruchome-

go złoża znajdującego się w kolumnie

chromatograficznej (Rys. 2). Rozdział

następuje na podstawie zróżnicowanej

odpowiedzi specyficznych substancji

wchodzących w skład analizowanej

mieszaniny na warunki rozdziału [5].

Chromatografia gazowa może być wy-

korzystywana do wnikliwych badań

nad procesami fizjologicznymi

oraz  przemianami metabolicznymi ro-

ślin. Analizy metaboliczne muszą zo-

stać poprzedzone ekstrakcją, w celu

uzyskania jak największej ilości mate-

riału poddawanego dalszym badaniom.

Chromatografia gazowa najlepiej

sprawdza się w badaniach lotnych me-

tabolitów wtórnych, mono- i seskwi-

terpenów wchodzących w skład np.

olejków eterycznych roślin, a także

w  analizach flawonoidów, prostych li-

pidów oraz alkaloidów. Jednymi z nie-

licznych związków, które nie mogą17

zostać poddane analizom chromato-

graficznym są glikozydy, co jest spo-

wodowane ich dużą masą oraz niskim

poziomem lotności. Niestety z uwagi

na konieczność derywatyzacji, tj . pro-

ces postępowania podczas analizy

chemicznej doprowadzający do otrzy-

mania pochodnej badanego związku

o  korzystniejszych parametrach, chro-

matografia gazowa jest rzadziej wyko-

rzystywana do wykrywania

flawonoidów, związków występujących

naturalnie w roślinach oraz pochod-

nych bezno-ɣ-pironu (chromonu),

w  porównaniu do chromatografii cie-

czowej . Także w pracy badawczej Ma-

chowskiego [10] do analizy

flawonoidów zastosowano wysoko-

sprawną chromatografię cieczową

HPLC, która według autora jest ko-

rzystniejsza z uwagi na obniżenie

kosztów procedury badawczej

oraz  czasu analizy. Metoda derywaty-

zacji została wskazana jako wymagana

w analizie hormonów roślinnych,

np.   IAA [26], kwasu abscysynowego

[27], czy brassinosteroidów [28].

Analiza olejków eterycznych pod ką-

tem ich składu ilościowego i jakościo-

wego daje najlepsze efekty przy

wykorzystaniu chromatografii gazowej

sprzężonej ze spektrometrią mas, po-

przedzonej właściwym przygotowa-

niem próbki – z zastosowaniem

hydrodestylacj i [22]. Co więcej , chro-

matografię gazową z detektorem

płomieniowo-jonizacyjnym (FID) za-

stosowano do diagnozowania jakości

olejów roślinnych. W tym celu określa-

no lotne związki będące produktami

utleniania olejów roślinnych [23].

Fiehn i in. wskazali na możliwość wy-

korzystania GC-MS w analizie jako-

ściowej ekstraktów metanolowych

uzyskanych z liści Arabidopsis thalia-

na. W swoich badaniach wykryli ponad

300 pików odpowiadających określo-

nym związkom, z czego zidentyfikowali

tylko 30 aktywnych komponentów ro-

ślinnych, takich jak cukry (np. frukto-

18

za, glukoza), aminokwasy (np. lizyna,

alanina), kwas nikotynowy i innych

podobnych substancji mających udo-

kumentowane znaczenie w procesach

fizjologicznych roślin [29].

Chromatografia cieczowa i jej od-

miany w przemianach biochemicz-

nych i metabolizmie roślin

Chromatografia cieczowa (LC), podob-

nie jak gazowa, opiera się na fizycz-

nym rozdziale składników badanej

mieszaniny dzięki dwóm niemieszają-

cym się ze sobą fazom; ruchomej , czyli

eluentu, oraz stacjonarnej , którą może

być rozpuszczalnik odpowiednio dopa-

sowany do analizowanej mieszaniny.

Odmianą LC jest HPLC – wysoko-

sprawna chromatografia cieczowa,

która została opracowana przez Ho-

rvatha w latach 60-tych XX wieku

i  służy do badania czystości lub iden-

tyfikacji związków chemicznych [24].

Zasadniczą różnicą między dwiema

pokrewnymi odmianami chromatogra-

fii jest ciśnienie zastosowane do prze-

pływu eluentu (faza ruchoma) przez

kolumnę. Z reguły różnica ciśnień

między LC a HPLC wynosi 100 atm.

Zasada działania LC jest podobna

do  GC: próbka wstrzykiwana jest dzię-

ki otworowi wtryskowemu do fazy ru-

chomej , następnie dochodzi

do  dostarczenia fazy ruchomej na ko-

lumnę przez pompę wysokociśnienio-

wą, a końcowy etap to transfer

do  kolumny, gdzie następuje ostatecz-

ny rozdział [7]. Jedną z najważniej -

szych zalet chromatografii cieczowej

jest możliwość oznaczania związków

polarnych i wielkocząsteczkowych,

związków nielotnych o masie atomo-

wej nawet do kilku tysięcy Daltonów,

polimerów i związków nieorganicz-

nych. Ponadto analizowane są ciecze

i  ciała stałe, w tym związki łatwo ule-

gające rozkładowi termicznemu. Pod-

stawowym warunkiem zastosowania

LC jest rozpuszczalność analitów

[13,14], a w przypadku związków

o  podobnej polarności zastosowanie

wysokosprawnej (HPLC) lub ultra-

sprawnej (UHPLC) chromatografii cie-

czowej [13].

Chromatografia cieczowa znajduje za-

stosowanie w diagnostyce medycznej ,

farmacji, badaniach dotyczących bez-

pieczeństwa żywności, badaniach śro-

dowiskowych i podstawowych

analizach biochemicznych materiału

roślinnego, w tym do analizy metaboli-

tów roślinnych [13]. Analiza metabolo-

mów tkanek roślinnych wymaga

obróbki badanych tkanek, a biorąc pod

uwagę występowanie kluczowych

komponentów w niewielkich ilościach

i  obecność ściany komórkowej utrud-

niającej izolację wybranych składni-

ków i ich swobodną migrację

do  rozpuszczalnika, próbkę homogeni-

zuje się i poddaje działaniu ultradź-

więków. W materiale roślinnym obok

wysoce polarnych związków (np. sole

mineralne, witaminy B i C, monosa-

charydy, krótkołańcuchowe amino-

kwasy) odnotowuje się związki

niepolarne (tłuszcze i kwasy tłuszczo-

we, tokoferole, czy karotenoidy) [16].

Skowron i in. [16] opisali zastosowanie

LC z detektorem MS do oznaczania

ilościowego i jakościowego wybranych

cytokinin (cis- i trans-zeatyny), ich ry-

bozydów, kinetyny, rybozydu kinetyny

i  izopentenyladeniny w liściach roślin19

wyższych. Dane literaturowe potwier-

dzają wykorzystanie LC w analizie fi-

tohormonów roślinnych – kwasu

jasmonowego, kwasu salicylowego, czy

kwasu abscysynowego [17-18]. Spo-

śród związków aktywnych w przemia-

nach biochemicznych i fizjologicznych

roślin o aktywnościach przeciwutle-

niających, owadobójczych i przeciw-

bakteryjnych analizuje się flawonoidy

i  saponiny [10]. Pawłowski [19] pro-

wadząc badania nad analizą ziaren

słonecznika, wykorzystał technikę LC-

MS/MS do identyfikacji białek, co po-

zwoliło na stworzenie odmian odpo-

wiednich do uprawy pod względem

zawartości olejów i plonowania. Ta sa-

ma technika pozwoliła na identyfikację

białek w nasionach rzepaku ozimego

związanych ze szlakami metaboliczny-

mi [20]. Najczęściej analizowanymi

związkami przy użyciu chromatografii

cieczowej są prolina, gamma-amino

maślan oraz poliaminy [8].

Z kolei Kucharski i Sadowski [9]

w  swoich badaniach wykazali zastoso-

wanie HPLC do analizy pozostałości

herbicydów takich jak fenmedifam,

desmedifan oraz lenacyl. Zastosowanie

HPLC do analizy pozostałości pestycy-

dów (bezpośrednio związanych z plo-

nowaniem roślin) pozostawała długo

w  cieniu GC, ale ostatecznie zdolność

oznaczania związków labilnych ter-

micznie, o niskiej lotności, czy możli-

wość zastosowania praktycznie

nieograniczonej rozmaitości wypełnień

kolumn przeważyła nad zastosowa-

niem chromatografii cieczowej

do  analizy składników występujących

w żywności i pestycydów [24]. Dzisiaj

z  zastosowaniem HPLC i różnych de-

tektorów analizuje się pestycydy

z  grupy syntetycznych pyretroidów,

karbaminianów, pochodnych fenylo-

mocznika, triazyn, pochodnych benzi-

midazolu [25].

Podsumowanie

Istnieje wiele metod, które umożliwia-

ją precyzyjną identyfikację i określenie

intensywności procesów biochemicz-

nych oraz zaangażowanych w nie

składników/biokomponentów charak-

terystycznych dla roślin. Jednak

to  techniki chromatograficzne stały się

nieodzownym elementem pracy labo-

ratorium środowiskowego, przyrodni-

czego, czy diagnostyki medycznej .

Wykorzystywane są głównie pod ką-

tem oznaczeń analitycznych, lecz także

coraz częściej preparatywnych

lub  procesowych. Ich głównym atutem

jest zdolność do rozdzielania wielo-

składnikowych substancji posiadają-

cych takie same, lub bardzo podobne

właściwości. Aktualny stan wiedzy po-

zwala na możliwie duże wykorzystanie

potencjału chromatografii gazowej

oraz cieczowej . Techniki chromatogra-

ficzne, dzięki szerokim możliwościom

wykrywania analizowanej substancji

oraz oznaczania jej nawet gdy wystę-

puje w minimalnych ilościach w obec-

ności szeregu innych nieoznaczonych

substancji, stały się jedną z najbardziej

rozpowszechnionych metod instru-

mentalnych w biotechnologii. Reasu-

mując, GC oraz HPLC najczęściej

stosowane są do jakościowej oraz ilo-

ściowej analizy mieszanin związków

organicznych i nieorganicznych;

w  procesach takich jak kontrola zanie-

czyszczeń środowiska lub kontrola20

Bibliografia:

[1 ] Profiling Methods to Identify Cold-

Regulated Primary Metabolites Using Gas

Chromatography Coupled to Mass

Spectrometry, red. Dirk K. Hincha, E.

Zuther. , Springer New York, New York,

2014, str. 171 -172.

[2] Khoddami A., Techniques for Analysis

of Plant Phenolic Compounds, Molecules,

2013, 18(2), 2328-2375.

[3] Lisec J. , Gas chromatography mass

spectrometry-based metabolite profiling in

plants, Nature, 2006, 387-396.

[4] Qualitative Analysis of Flavor and

Fragrance Volatiles by Glass Capilary, Gas

Chromatography, red. W. Jennings,

Academic Press, A Subsidiary of Harcourt

Brace Jovanovich, 1980, str. 5-1 1 , str. 15-

16.

[5] Chromatography Today, red. C.F. Poole,

S.K. Poole. , Elsevier Science Publishers

B.V. , New York, 1991 , str. 1 -6.

[7] Liquid Chromatography: Mass

Spectrometry, Second Edition, red.

Wilfried M.A. Niessen, Marcel Dekker,

New York, 1999, str. 125-136.

[8] Obata T., Fernie A.R., The use of

metabolomics to dissect plant responses to

abiotic stresses, Cellular and Molecular

Life Sciences, 2013, 69(19), 3225-3243.

[9] Kucharski M., Sadowski J. , Herbicyde

residues in sugar beet roots. , Progress In

Plant Protection, 2014, 54(1 ), 6-7.

[10] Machowski M., Kaliszewska D., Kiss

A., Chromatograficzne metody izolacj i i

identyfikacji flawonoidów i saponin, Biul.

Wydz. Farm. WUM, 2010, 4, 27-37.

[1 1 ] Kaniewska J. , Przegląd metod

oznaczania izoflawonoidów, 2012,

Inżynieria Przetwórstwa Spożywczego,

4(4), 25-30.

[12] Snow N.H., Snack G.C. , Head-space

analysis on modern gas chromatography,

Trends Anal. Chem., 2002, 21 (9+10), 608-

617.

[13] Podstawy chromatografii i technik

elektromigracyjnych, Z. Witkiewicz, J.

Kałużna, Wydawnictwo Naukowo

Techniczne, Warszawa, 2012, str. 167-169

[14] Chemia analityczna. Chromatografia

cz. I-III, K. Hierasimczyk, W. Wardencki, J.

Namieśnik, Wydawnictwo Wydziału

Chemii, Politechnika Gdańska, 2002, str. 1 -

19, 1 -23, 1 -15

[15] Przygotowanie próbek

środowiskowych do analizy, J. Namieśnik,

Z. Jamrógiewicz, M. Pilarczyk, L. Torres,

Wydawnictwo Naukowo Techniczne,

Warszawa, 2000, str. 3-128.

[16] Skowron M., Grabowska-Polanowska

B., Waligórksi P. , Faber J. , Śliwka I. ,

Chromatografia cieczowa z tandemową

spektrometrią mas (LC-MS/MS), jako

przykład techniki łączonej – podstawy

teoretyczne i przykłady zastosowania,

Raport Nr 2089/Ch, Kraków, 2016, str. 1 -

44.

[17] Koojima K., Characteristics of HPLC

columns and mass spectra of LC-MS for

phytohormone analysis, JARQ, 2001 , 35(3),

149-154.

[18] Yu J. , Meng Q., Liu E. , Lu Y., Ren X.,

Analysis of acidic endogenous

21

procesów przemysłowych. Ponadto są

nieodzownym elementem badań fizy-

kochemicznych oraz badań struktural-

nych związków organicznych

występujących w roślinach, pozwalając

na śledzenie przebiegu procesów me-

tabolicznych i ich wpływu na wzrost

i  rozwój roślin.

phytohormones in grapes by using online

SPE extraction coupled with LC-MS/MS,

Journal of Chromatographic Science, 2013,

7, 1 -5.

[19] Pawłowski T. , Proteomika nasion,

Biotechnologia, 2009, 1 (84), 104-118.

[20] Hajduch M., Casteel J.E. , Hurrelmeyer

K.E. , Song Z., Agrawal G.K. , Thelen J.J. ,

Proteomic analysis of seed filling in

Brassica napus. Developmental

characterization of metabolic isozymes

using high-resolution two-dimentional gel

electrophoresis, Plant Physiology, 2006,

141 (1 ), 32-46.

[21 ] Klejdus B., Vitamvasova D., Kuban V.,

Reversed-phase high-performance liquid

chromatographic determination of

isoflavones in plant materials after

isolation by solid-phase extracton, Journal

of Chromatography A, 1999, 839(1 -2), 261 -

263.

[22] Kwaśny J. , Vogt O., Lason E., Analiza

instrumentalna kompozycji olejków

eterycznych z roślin baldaszkowatych

(Apiaceae) na przykładzie olejku

anyżowego, 2012, Chemia. Czasopismo

Techniczne, 16(109), 71 -83.

[23] Gromadzka J. , Wardencki W.,

Opracowanie procedury oznaczania

lotnych produktów utlenienia olejów

roślinnych techniką statycznej analizy fazy

nadpowierzchniowej , 2009, 30, 103-1 17.

[24] Jędrzejczuk A., Góralczyk K., Czaja K.,

Struciński P. , Ludwicki J.K. ,

Wysokosprawna chroamtografia cieczowa

– jej zastosowanie w analizie pozostałości

pestycydów, Roczniki PZH, 2001 , 52(2),

1 27-138.

[25] Kryteria Zdrowotne Środowiska. Tom

78. Pestycydy ditiokarbaminianowe,

etylenotiomocznik i propylenotiomocznik.

Wprowadzenie ogólne, Instytut Medycyny

Pracy, Łódź, 1994.

[26] Edlund A., Eklof S. , Sundberg B.,

Moritz T. , Sandberg G., A microscale

technique for gas chromatography-mass

spectrometry measurements of picogram

amounts of indole-3-acetic acid in plant

tissues, Plant Physiology, 1995, 108, 1043-

1047.

[27] Duffield P.H., Netting A.G. , Methods

for the quantitation of abscisic acid and its

precursors from plant tissues, Anal.

Biochem., 2001 , 289, 251 -259.

[28] Shimada Y., Goad H., Nakaumra A.,

Takatsuto S. , Fujioka S. , Yoshida S. , Organ-

specific expression of brassinostreoid-

biosynthetic genes and distribution of

endogenius brassinosteroids in

Arabidopsis, Plant Physiology, 2003, 131 ,

287-297.

[29] Fiehn O., Kopka J. , Trethewey R.N.,

Willmitzer L. , Identification of uncommon

plant metabolites based on calculation if

elemental composition using gas

chromatography and quadrupole mass

spectrometry, Anal. Chem., 2000, 72, 3573-

3580.

22

Wstęp

Chlorofile (Rys. 1 -3) to dość szeroka

grupa barwników tetrapirolowych,

pełniących niezmiernie ważną rolę

w  procesie fotosyntezy oksygenicznej .

Najogólniej , proces ten polega na za-

mianie energii promieniowania sło-

necznego na energię chemiczną, która

jest wykorzystana przez organizmy fo-

tosyntetyzujące do asymilacj i CO2. Pod

względem strukturalnym, większość

chlorofili jest chlorynami, czyli po-

chodnymi porfiryn o częściowo zredu-

kowanym układzie porfirynowym,

zawierającymi dodatkowy izocykliczny

pierścień (oznaczany jako E; Rys. 1 ).

Centralne miejsce w układzie chlory-

Od c do f, czyli mniej znane chlorofile

Wiktor TokarekZakład Fizjologii i Biochemii RoślinWydział Biochemii, Biofizyki i BiotechnologiiUniwersytet Jagielloński w KrakowiePraca napisana pod opieką dr hab. Beaty Myśliwej-Kurdziel

Chlorofile są grupą barwników fotosyntetycznych, występujących

w  roślinach, glonach i sinicach. Są to związki tetrapirolowe, zawierają

w  swojej strukturze układ porfirynowy lub chlorynowy. Ich struktura

chemiczna odpowiada za ich właściwości spektralne – chlorofile są zdolne

do absorpcji widzialnego promieniowania elektromagnetycznego

w  zakresie niebieskiej i czerwonej barwy. Spośród wszystkich znanych

chlorofili, chlorofil a jest najbardziej rozpowszechniony w przyrodzie.

Często występuje w parze z chlorofilem b, jak ma to miejsce w przypadku

roślin. Oprócz chlorofili a i b naturalnie występują także chlorofile c, d i f,

odróżniające się od chlorofilu a podstawnikami i nasyceniem układu

tetrapirolowego. Barwniki te występują w komórkach glonów i sinic.

Chlorofile c, pośród których wyróżnia się 11 różnych form, pełnią rolę

barwników antenowych w kompleksach zbierających światło. Cechą

charakterystyczną tych barwników jest względnie słaba absorpcja

w  czerwonym zakresie światła widzialnego. Chlorofil d i niedawno odkryty

chlorofil f charakteryzują się absorpcją przesunięta ku czerwieni

w  porównaniu z innymi chlorofilami. Własności te umożliwiają

wykorzystanie światła z zakresu czerwieni i bliskiej podczerwieni

organizmom żyjącym w środowiskach odznaczających się niskim

natężeniem światła z zakresu widzialnego. Ponadto, cząsteczki chlorofilu

d są zaangażowane w przeprowadzanie kluczowej reakcji fotochemicznej

w centrach reakcji kompleksów fotosyntetycznych. Niniejszy artykuł

przytoczy najważniejsze fakty dotyczące odkryć i właściwości chlorofili c,

d i f, z uwzględnieniem ich występowania, budowy chemicznej

i  charakterystyk spektralnych.

23

nowym zajmuje jon magnezu (Mg2+)

[1 ]. Cząsteczki chlorofili odznaczają

się występowaniem sprzężonego ukła-

du wiązań podwójnych. Pozwala to na

absorpcję promieniowania elektroma-

gnetycznego z zakresu widzialnego.

W  widmie absorpcji tych związków ob-

serwuje się dwa złożone pasma – jedno

położone jest w zakresie długości fal

odpowiadających barwie niebieskiej ,

a  drugie – czerwonej . Z powodu zniko-

mego pochłaniania światła o barwie

zielonej , roztwory i organizmy zawie-

rające chlorofile charakteryzują się

właśnie tą barwą. Kluczową rolę

w  procesie fotosyntezy oksygenicznej

odgrywają kompleksy fotosyntetyczne

składające się z fotosystemu

oraz  układu antenowego. Zadaniem

barwników antenowych jest pochła-

nianie światła i przekazywanie energii

wzbudzenia na chlorofil w centrum re-

akcji (tj . części rdzeniowej fotosyste-

mu). Wzbudzenie chlorofilu w centrum

reakcji prowadzi do zmiany jego po-

tencjału redoks i uwolnienia elektronu

(rozdział ładunku), co zapoczątkowuje

fotosyntetyczny łańcuch transportu

elektronów [2]. Chlorofil a jest najsze-

rzej występującym chlorofilem.

Do  niedawna uważano ten barwnik za

jedyny chlorofil aktywny w reakcjach

redoks in vivo (w fotosyntezie oksyge-

nicznej) w centrach reakcji fotosyste-

mów I i II [1 ,2]. Oprócz chlorofilu a

(uniwersalnego barwnika fotosynte-

tycznego) i chlorofilu b (występujące-

go u roślin i niektórych glonów)

wyróżnia się także chlorofile c, d i f,

które znacznie różnią się od poprzed-

nich pod względem struktury che-

micznej , właściwości spektralnych

i  znaczenia w fotosyntezie. Poniżej za-

prezentowane zostaną najnowsze in-

formacje dotyczące tej mniej znanej

grupy barwników, będących przedmio-

tem tej pracy.

Chlorofile c

Chlorofile c (Rys. 2, Tab. 1 ) stanowią

grupę barwników należących do porfi-

ryn. Oznacza to, że posiadają one

w  pełni nienasycony układ tetrapirolo-

wy (także w pierścieniu D), a rozłoże-

nie sprzężonych wiązań podwójnych

jest symetryczne. Jest to cecha odróż-

niające te barwniki od pozostałych

Rys. 1 . Struktura chemiczna chlorofili a i b.

Uwzględniono oznaczenia pierścieni (A-E)

i  numerację atomów węgla (za [38]). Gru-

bymi liniami zaznaczono układ chlorynowy,

wzbogacony o pierścień E. Zacieniowano

podstawniki boczne tego układu, mogące

się zmieniać w strukturach chlorofili c, d

i  f. Przedstawiono także strukturę reszty

fitolu, oznaczanej na rycinach jako „fitol”.

24

chlorofili, będących chlorynami. Po-

nadto, chlorofile c w pozycji C-17

(pierścień D) posiadają resztę nieze-

stryfikowaną przez fitol (długołańcu-

chowy alkohol diterpenowy, zob.

Rys.   1 ). Pod względem strukturalnym,

chlorofile c posiadają budowę proto-

chlorofilidu, czyli produktu pośrednie-

go biosyntezy chlorofili a i b. Pomimo

tego, związki te są nazywane „chloro-

filami” z uwagi na to, że pełnią one

funkcję barwników fotosyntetycznych

w układach antenowych [3].

Chlorofil c został odkryty jako trzeci,

po chlorofilach a i b. Pierwsze donie-

sienia na temat tego barwnika, nazwa-

nego wtedy chlorofucyną, pochodzą

z  roku 1873 [4]. Inne używane w prze-

szłości nazwy to chlorofilina γ i chlo-

rofil γ [5]. Struktura chemiczna

chlorofilu c została po raz pierwszy

zaproponowana w roku 1949, kiedy to

Granick przeprowadził badania z wy-

korzystaniem alkacymetrii i oznacza-

Rys. 2. Ogólna struktura chemiczna chlo-

rofili c. Podstawniki R1, R2 i R3 zostały

rozpisane w Tab. 1 . Strzałką zaznaczono

położenie wiązania odróżniającego układ

porfirynowy (w pełni nienasycony układ te-

trapirolowy) od układu chlorynowego, wi-

docznego na Rys. 1 .

Tabela 1 . Podstawniki w strukturach chemicznych chlorofili c (oznaczenia R1, R2 i R3 wg

Rys. 2); za [3]. Objaśnienia skrótów w tekście.

25

nia magnezu metodą żółcieni tytano-

wej [6]. Ostateczne potwierdzenie

struktur chemicznych nierozdzielo-

nych mieszanin chlorofili c (c1 i c2,

zob. Rys. 2 i Tab. 1 ) i rozdzielonych

estrów metylowych chlorofili c zostało

osiągnięte z wykorzystaniem technik

NMR i spektrometrii masowej [7-9].

Barwniki z grupy chlorofili c występują

głównie w glonach, takich jak okrzem-

ki czy bruzdnice [3,8,10-13], przy

czym zawartość chlorofili c w danym

organizmie zależy od warunków śro-

dowiskowych [14-16].

Obecnie wyróżnia się 11 form chloro-

filu c – c1 , c2, c3, monowinylo-chlorofil

c3 ([MV]-Chl c3]), cCS-170, 3,8-diwinylo-

protochlorofilid ([DV]-Pchlid), c2 typu

Pavlova gyrans , c1 typu Kryptoperidi-

nium , c2-MGDG (18:4/14:0), c2-MGDG

(14:0/14:0) oraz niepolarny c1 typu

Prymnesium parvym [3] (Tab. 1 ).

Pierwsze sześć związków to tak zwane

polarne chlorofile c, niezestryfikowane

w pozycji C-17, co sprawia, że są one

cząsteczkami hydrofilowymi.

Chlorofile c1 i c2 zostały opisane naj-

wcześniej i są najbardziej rozpo-

wszechnionymi przedstawicielami

chlorofili c. Pod względem struktural-

nym, chlorofil c1 posiada resztę etylo-

wą w pozycji C-8 (-CH2-CH3),

natomiast chlorofil c2 – winylową

(-CH=CH2) (Tab. 1 ) [17,18].

Właściwości spektralne chlorofili c zo-

stały podsumowane w tabeli 2. Barw-

niki te odznaczają się niską

intensywnością pasma absorpcji

w  czerwieni (pasmo Qy), w porównaniu

do pozostałych chlorofili, oraz przesu-

nięciem maksimum absorpcji Qy w

stronę fal krótszych (Rys. 4, Tab. 2).

Wynika to z pełnego nienasycenia

wszystkich czterech pierścieni rdzenia

porfirynowego [2]. Widmo fluorescen-

cyjne chlorofilu c2 w stanie sześcio-

skoordynowanym, zmierzone

w  tetrahydrofuranie w temperaturze

pokojowej , odznacza się maksimum

położonym przy 640 nm. Rozważania

teoretyczne przeprowadzone przez

Etinskiego i wsp. wykazały, że widma

fluorescencyjne chlorofili c1 i c2 po-

winny odznaczać się podobną struktu-

rą [19,20].

W rozważaniach nad właściwościami

widmowymi barwników fotosyntetycz-

nych należy także wziąć pod uwagę

otoczenie molekularne, np. białkowe

[2] lub rozpuszczalnik [21 ]. Przykłado-

wo Premvardhan i wsp. [22] wykazali,

że rezonansowe widma Ramana chlo-

rofilu c2 znajdującego się w białko-

wych kompleksach fukoksantyna-

-chlorofil a/c2 (FCP), wyizolowanych

z  okrzemki Cyclotella maneghiniana ,

różnią się od tych zarejestrowanych

w  90% acetonie. Pomiary wykonywane

były w temperaturze ciekłego azotu

(77 K). Wyniki uzyskane przez Auto-

rów sugerują, że gdy barwnik ten jest

rozpuszczony w 90% acetonie, cen-

tralny atom magnezu przybiera formę

sześcioskoordynowaną. Zdefiniowane

otoczenie białkowe kompleksów FCP

ogranicza swobodę konformacyjną

chlorofilu c2, który przybiera formę

pięcioskoordynowaną. Co więcej , od-

działywania z owymi kompleksami

białkowymi wpływają na większe roz-

dzielenie maksimów absorpcji chloro-

fili a i c, w porównaniu do widm tych

barwników w acetonie. Autorzy

stwierdzili także, że wewnątrz FCP26

chlorofil c2 odznacza się większym

stopniem solwatacji niż chlorofil a

[22].

Niedawno opublikowane zostały wyni-

ki badań sugerujące, że chlorofil c2może zostać wykorzystany do łagodze-

nia objawów reakcji alergicznych.

Yoshioka i wsp. [23] wykazali, że za-

równo frakcja ekstraktu z brunatnicy

Sargassum horneri, wzbogacona

o  chlorofil c2, jak i sam barwnik w czy-

stej postaci, są zdolne do ograniczenia

degranulacji szczurzych komórek RBL-

2H3 (bazofile, wyprowadzone od osob-

ników chorych na białaczkę bazofilo-

wą) in vitro. Jako że bazofile są

komórkami zaangażowanymi w odpo-

wiedź alergiczną, wyniki tych badań

mogą sugerować potencjalne zastoso-

wanie chlorofilu c2 w leczeniu chorób

alergicznych [23]. Ponadto, Fujiwara

i  wsp. [24] przeprowadzili badania kli-

niczne na pacjentach cierpiących

na  sezonowy alergiczny nieżyt nosa.

Otrzymywali oni chlorofil c2 w postaci

kapsułek w dawkach 0,7 mg dziennie.

Wyniki pokazały, że przyjmowanie ta-

kiej dawki chlorofilu c2 przez 8 tygodni

ogranicza potrzebę stosowania innych

leków przeciwalergicznych [24]. Nale-

ży jednak wspomnieć, że to badanie

zostało przeprowadzone w ograniczo-

nym stopniu i uzyskanych w nim wyni-

ków nie można łatwo przełożyć na

kliniczne znaczenie tego związku.

Chlorofil c3 został po raz pierwszy za-

obserwowany w ekstraktach z komó-

rek haptofitów Emiliania huxleyi.

Badania metodą chromatografii cien-

kowarstwowej pokazały, że barwnik

ten jest bardziej polarny niż chlorofile

c1 i c2 [25], a badania z wykorzysta-

niem technik NMR i spektrometrii ma-

sowej wykazały, że chlorofil c3 jest

7-desmetyl-7-metoksykarbonylową po-

chodną chlorofilu c2 [26] (Rys. 2,

Tab.   1 ). To dodatkowe ugrupowanie

przekłada się na zmianę właściwości

spektralnych tej formy chlorofilu c,

konkretnie na obniżenie intensywności

pasma absorpcyjnego w pasmie Qy [3].

Opisano także monowinylową pochod-

ną chlorofilu c3 ([MV]-Chl c3), posiada-

jącą resztę etylową zamiast winylowej

w pozycji C-8 [27,28], oraz chlorofil

cCS-170 (wyizolowany z glonów szczepu

Micromonas pusilla CS-170) będący

propionianową pochodną chlorofilu c3([7-metoksykarbonyl-8-winylo]-proto-

chlorofilid a) (Rys. 2, Tab. 1 ) [29-31 ].

[DV]-Pchlid (Rys. 2, Tab. 1 ), oznaczany

także jako MgDVP, został po raz

pierwszy zidentyfikowany w zielenicy

Mantoniella squamata [32], jednak ist-

nienie tego barwnika było początkowo

kwestionowane, z powodu koelucji

z  parą chlorofili c1 i c2 [3]. Dopiero

późniejsze badania spektroskopowe

i  chromatograficzne pozwoliły na jed-

noznaczne określenie natury tego

związku [29,33]. [DV]-Pchlid został

także wykryty w komórkach zielenic

Micromonas pusilla oraz sinic Pro-

chloron sp. i Prochlorococcus marinus

[33].

Oprócz opisanych powyżej polarnych

(niezestryfikowanych) form chlorofilu

c, opisano także związki posiadające

ugrupowanie przyłączone wiązaniem

estrowym do reszty w pozycji C-17

(Rys. 2, Tab. 1 ). Niepolarny chlorofil c2wyizolowany z E. huxleyi został ziden-

tyfikowany jako ester chlorofilu c2i  monogalaktozylodiacyloglicerolu

27

opisanie ich właściwości fotochemicz-

nych oraz mechanizmów syntezy [3].

Chlorofil d

Pierwsze doniesienia o istnieniu kolej -

nego barwnika chlorofilowego pocho-

dzą z roku 1943, kiedy to wykryto

obecność nowego chlorofilu, oznaczo-

nego jako chlorofil d, w izolatach

z  krasnorostów [41 ]. Okrycie to było

przez długi czas podważane, jako że

jeden z produktów utlenienia chlorofi-

lu a posiadał widmo identyczne z wid-

mem nowego barwnika [42]. Istnienie

chlorofilu d jako barwnika ważnego

w  procesie fotosyntezy zostało osta-

tecznie potwierdzone w roku 1996,

kiedy to odkryto sinicę (nazwaną Aca-

ryochloris marina), zawierającą chlo-

rofil d jako główny barwnik [43].

W  komórkach tego organizmu zawar-

tość chlorofilu d może sięgać 95-99%

całkowitej zawartości wszystkich chlo-

rofili. Chlorofil a jest także obecny

w  tych komórkach, ale w znacząco

niższych ilościach niż chlorofil d

[44,45]. Zagadka obecności chlorofilu

d w krasnorostach została rozwiązana,

gdy wykazano, że Acaryochloris sp.

szczep Awaji jest zdolny do wzrostu

na  plesze krasnorostów, co tłumaczy

obecność pochodzącego z tej sinicy

chlorofilu d w izolatach z krasnoro-

stów [42,46]. Późniejsze badania wy-

kazały, że fotoautotrofy produkujące

chlorofil d występują w bardzo szero-

kim zakresie warunków środowisko-

wych i są bardzo rozpowszechnione

[47]. Nowi przedstawiciele rodzaju

Acaryochloris są w dalszym ciągu od-

krywani [40,48,49].

Pod względem chemicznym, chlorofil d

(MGDG), zawierającego reszty kwasów

mirystylowego (14:0) i oktadekatetra-

enowego (18:4) [34]. Drugą bardzo

niepolarną formą chlorofilu c był chlo-

rofil c2-MGDG wyizolowany z haptofi-

tów Chrysochromulina polylepis,

w  którym wykryto obecność dwóch

reszt kwasu mirystylowego (14:0) w

reszcie MGDG [35]. Ponadto opisano

występowanie estrów chlorofilu c1i  MGDG w komórkach haptofitów

Prymnesium parvum [3,27]. Zasugero-

wano, że rolą estryfikacji chlorofili c

przez MGDG jest ułatwienie transpor-

tu chlorofilu c z miejsca jego syntezy

(bogatej w MGDG wewnętrznej błony

chloroplastów) do tylakoidów [36].

Właściwości chromatograficzne

i  spektralne chlorofilu c wyizolowane-

go z haptofitów Pavlova gyrans suge-

rują, że barwnikiem tym jest chlorofil

c2 zestryfikowany niezidentyfikowa-

nym jeszcze ugrupowaniem [3,37].

Co  więcej , opisano także estrową po-

chodną chlorofilu c1 z bruzdnic z ro-

dzaju Kryptoperidinium . Także w tym

przypadku określenie natury chemicz-

nej grupy przyłączonej do cząsteczki

chlorofilu wymaga dalszych badań

(Rys. 2, Tab. 1 ) [3].

Chlorofile c są bardzo heterogenną

grupą barwników, co wynika z przy-

stosowań syntezujących je organi-

zmów do różnych warunków

środowiskowych. Pełne poznanie funk-

cj i tych związków w procesach foto-

syntetycznych i znaczenia dla

adaptacji środowiskowej różnych or-

ganizmów wymaga dalszych badań.

W  szczególności konieczne jest pełne

poznanie struktur chemicznych nie-

dawno odkrytych form chlorofilu c,28

jest 3-deswinyl-3-hydroksymetylową

pochodną chlorofilu a , posiadającą

grupę formylową w pozycji C-3

(Rys.   3) [50,51 ]. Ścieżka biosyntezy

chlorofilu d nie jest jeszcze poznana,

ale sugeruje się, że w reakcję syntezy

chlorofilu d z a może być zaangażowa-

na oksygenaza - cytochrom P450 [52].

Widmo absorpcyjne chlorofilu d jest

o  tyle niezwykłe, że szczyt absorpcji

w  paśmie Qy (światło czerwone) prze-

wyższa szczyt w paśmie Soreta (świa-

tło niebieskie; zob. Tab. 2 i Rys. 4).

Ponadto, szczyt ten jest znacznie prze-

sunięty ku czerwieni w porównaniu

z  chlorofilem a. Umożliwia to rozsze-

rzenie zakresu promieniowania wyko-

rzystywanego w reakcjach

fotosyntetycznych. Jednak pomimo ab-

sorpcji większej ilości fotonów w tym

zakresie, całkowita zaabsorbowana

energia przez chlorofil d jest mniejsza

niż w przypadku chlorofilu a , co wyni-

ka z mniejszej energii przenoszonej

przez fotony odpowiadające większym

długościom fal. Kolejnym czynnikiem

odróżniającym chlorofil d od chlorofilu

a jest jego bardziej dodatni potencjał

redoks [51 ].

Chlorofil f

Ostatni z dotychczas opisanych rodza-

jów chlorofili – chlorofil f – został od-

kryty w 2010 roku podczas analiz

ekstraktów ze stromatolitów pocho-

dzących z Zatoki Rekina (Australia)

[53]. Później został on wykryty jeszcze

w sinicach szczepu KC1 [54], Halomi-

cronema hongdechloris [55], Lepto-

lyngbya sp. szczep JSC-1 [56] i nowo

opisanej sinicy z okolicy Jenolan Caves

w Australii [57].

Nowy barwnik został zidentyfikowany

jako [2-formyl]-chlorofil a (Rys. 3)

w  oparciu o badania wykorzystujące

spektrometrię mas i spektroskopię

NMR [38,53].

Najnowsze badania przeprowadzone

przez Ho i wsp. [58] wykazały, że chlo-

rofil f jest syntezowany poprzez enzy-

Rys. 3. Struktury chemiczne chlorofili d i f.

29

Rys. 4. Widmo absorpcji ekstraktu z zielonego liścia, zawierającego chlorofile a i b, po roz-dziale Krausa, zmierzone w benzynie ekstrakcyjnej. Zaznaczono położenie pasm Soreta i Qoraz ogólne zmiany położenia szczytu w paśmie Qy w przypadku chlorofili c, d i f. Dokładnedane nt. położenia i intensywności poszczególnych szczytów absorpcji są wyszczególnionew  tabeli 2.

Tabela 2. Właściwości absorpcyjne chlorofili c, d i f.

30

matyczne, czteroelektronowe utlenie-

nie chlorofilu a. Reakcję tę przepro-

wadza enzym syntaza chlorofilu f

(ChlF). Co ciekawe, ChlF jest foto-

oksydoreduktazą, bezpośrednio wyko-

rzystującą światło do utlenienia chlo-

rofilu a. Czyni to z tego białka drugi

opisany do tej pory fotoenzym w ścież-

kach biosyntezy chlorofili. Pierwszym

odkrytym białkiem o takich właściwo-

ściach była światłozależna oksydore-

duktaza protochlorofilidu [59].

Zhao i wsp. [60] odkryli, że w komór-

kach sinic Chlorogloeopsis fritschii

PCC 9212 i Chroococcidiopsis therma-

lis PCC 7203 biosynteza chlorofilu f

jest regulowana przez białka RfpA,

RfpB i RfpC, biorące udział w przeka-

zie sygnału związanego z odpowiedzią

na warunki oświetlenia daleką czer-

wienią. RfpA jest kinazą histydynową

pełniącą rolę fitochromu reagującego

na daleką czerwień. RfpB jest regula-

torem odpowiedzi mogącym wiązać się

do DNA. RfpC także zawiera domenę

umożliwiającą wiązanie do DNA i może

przenosić resztę fosforanową z RfpA

na RfpB [60].

Widmo absorpcyjne chlorofilu f posia-

da szczyt w paśmie Qy, który jest prze-

sunięty ku czerwieni najbardziej

ze  wszystkich znanych chlorofili (za-

chodzi na zakres bliskiej podczerwieni;

Tab. 2, Rys. 4) [40]. Stanowi to adap-

tację do warunków środowiskowych,

które nie pozwalają na prowadzenie

fotosyntezy w oparciu o zakres spek-

tralny chlorofilu a. Widmo emisj i flu-

orescencji chlorofilu f odznacza się

maksimum położonym przy 714 nm

(aceton, temperatura pokojowa) [40].

Znaczenie chlorofili c, d i f w foto-

syntezie

Chlorofilom c przypisuje się funkcję

barwników wspomagających, których

rolą jest zaabsorbowanie fotonów

i  przekazanie energii wzbudzenia

na  cząsteczki chlorofilu a w centrum

reakcji. Do tej pory wykazano, że chlo-

rofile c1 , c2, c3, c-MGDG z E. huxleyi,

[DV]-Pchlid i chlorofil c z P. gyrans

znajdują się w kompleksach zbierają-

cych światło (ang. light-harvesting

complex, LHC) organizmów zdolnych

do fotosyntezy, w których dany chloro-

fil jest syntezowany [3,34,37,61 -63].

Niedawne badania pokazały, że trans-

fer energii wzbudzenia z chlorofilu c2na chlorofil a zachodzi w czasie 60 fs

[64]. Dodatkową postulowaną rolą

chlorofilu c jest wpływ na składanie

LHC poprzez tworzenie silnych wiązań

koordynacyjnych z ligandami we-

wnątrz białek LHC [65].

Zgodnie z najnowszymi badaniami,

chlorofil f także funkcjonuje jako

barwnik antenowy [54]. Jednakowoż

istnieją doniesienia dotyczące możli-

wości bezpośredniego przekazania

energii z chlorofilu f na chlorofil a

[66].

Chlorofil d wyróżnia się spośród pozo-

stałych omawianych chlorofili, gdyż

może on występować nie tylko w ukła-

dach antenowych, ale także w cen-

trach reakcji fotosystemów, co

do  niedawna było opisywane jedynie

w  przypadku chlorofilu a [2]. Wykaza-

no, że specjalna para chlorofili w foto-

systemie I A. marina jest

heterodimerem składającym się

z  chlorofili d i d’ (który jest epimerem

132 chlorofilu d) [51 ,67,68]). W przy-31

Bibliografia:

[1 ] Sheer H. An Overview of chlorophylls

and bacteriochlorophylls: biochemistry,

biophysics, functions and applications. [w:]

Chlorophylls and bacteriochlorophylls, red.

Grimm B, Porra RJ, Rüdiger W, Scheer H,

Springer Netherlands, 2006, str. 1 -26.

[2] Björn LO, Papageorgiou GC,

Blankenship RE, Govindjee. A viewpoint:

why chlorophyll a? Photosynth Res.

2009;99(2):85-98.

[3] Zapata M, Garrido JL, Jeffrey W.

Chlorophyll c pigments: current status.

[w:] Chlorophylls and bacteriochlorophylls,

red. Grimm B, Porra RJ, Rüdiger W, Scheer

H, Springer Netherlands, 2006, str. 39-53.

[4] Sorby HC. On comparative vegetable

chromatology. Proc R Soc Lond.

1872;21 (139):139-47.

padku fotosystemu II tego organizmu,

natura chemiczna specjalnej pary

chlorofili nadal pozostaje niejasna

[51 ]. Sugeruje się, że może ona być

homodimerem dwóch cząsteczek chlo-

rofilu d [68,69] lub heterodimerem

złożonym z cząsteczki chlorofilu a

i  chlorofilu d [70,71 ].

Rozszerzenie zakresu, w jakim możli-

wa jest absorpcja fotonów przez chlo-

rofil jest strategią ułatwiającą

przeżycie organizmom w warunkach

niskiej intensywności światła z zakresu

widzialnego, jak ma to miejsce

na  przykład w przypadku A. marina

[72]. Wykorzystanie zakresu promie-

niowania o długościach fal 700-750 nm

zwiększa ilość dostępnych fotonów

o  19% [52,73]. Dzięki temu wydajność

gromadzenia energii w procesach fo-

tochemicznych przez sinice nie spada,

nawet pomimo mniejszej energii foto-

nów absorbowanych przez chlorofile d

i f [51 ,74,75].

Istnieją także organizmy, takie jak si-

nica Leptolyngbya sp. szczep JSC-1 ,

która zawiera w swoich komórkach

zarówno chlorofil d, jak i f. Oba te

barwniki są syntezowane w warunkach

oświetlenia daleką czerwienią, co po-

zwala tej sinicy przeżyć w takich, nor-

malnie niekorzystnych, warunkach

[56]. Fotoaklimatyzację w warunkach

oświetlenia bliską lub daleką czerwie-

nią opisano także dla innych organi-

zmów [76,77].

Podsumowanie

W ostatnim czasie ukazało się niewiele

prac przeglądowych dotyczących chlo-

rofili c, d i f [2 ,3,51 ], mimo ich dużego

znaczenia dla prowadzenia fotosyntezy

oksygenicznej . Działają one jako barw-

niki antenowe w LHC lub w przypadku

chlorofilu d – w centrach reakcji foto-

systemów. Ponadto, umożliwiają one

prowadzenie fotosyntezy przez organi-

zmy żyjące w środowiskach odznacza-

jących się bardzo niską intensywnością

promieniowania z zakresu światła wi-

dzialnego. Jednak pełne zrozumienie

i  scharakteryzowanie korzystnych

z  punktu widzenia fotosyntezy właści-

wości oraz szlaków biosyntezy tych

barwników i jej regulacji wymaga dal-

szych badań i ciągłego nakładu pracy.

Pozwoli to na dogłębne opisanie ko-

rzyści, jakie przynosi organizmom

zdolnym do fotosyntezy rozszerzanie

dostępnego dla nich zakresu promie-

niowania elektromagnetycznego.

32

[5] Strain HH, Manning WM. Chlorofucine

(chlorophyll γ), a green pigment of diatoms

and brown algae. J Biol Chem.

1942;144:625-36.

[6] Granick S. The pheoporphyrin nature of

chlorophyll c. J Biol Chem. 1949;179:505.

[7] Dougherty RC, Strain HH, Svec WA,

Uphaus RA, Katz JJ. Structure of

Chlorophyll c1 . J Am Chem Soc.

1966;88(21 ):5037-8.

[8] Dougherty RC, Strain HH, Svec WA,

Uphaus RA, Katz JJ. Structure, properties,

and distribution of chlorophyll c. J Am

Chem Soc. 1970;92(9):2826-33.

[9] Wasley JWF, Scott WT, Holt AS.

Chlorophyllides c. Canadian J Biochem.

1970;48:376-83.

[10] Jeffrey SW. Properties of two

spectrally different components in

chlorophyll c preparations. Biochim

Biophys Acta. 1969;177(3):456-67.

[1 1 ] Jeffrey SW, Sielicki M, Haxo T.

Chloroplast pigment patterns in

dinoflagellates. J Phycol. 1975;1 1 (4):374-

84.

[12] Zapata M, Jeffrey SW, Wright SW,

Rodriguez F, Garrido JL, Clementson L.

Photosynthetic pigments in 37 species (65

strains) of Haptophyta: implications for

oceanography and chemotaxonomy. Mar

Ecol Prog Ser. 2004;270:83-102.

[13] Zapata M, Rodríguez F, Fraga S, Barra

L, Ruggiero MV. Chlorophyll c pigment

patterns in 18 species (51 strains) of the

genus Pseudo-Nitzschia

(Bacillariophyceae). J Phycol.

2011 ;47(6):1 274-80.

[14] Kosakowska A, Lewandowska J, Stoń J,

Burkiewicz K. Qualitative and quantitative

composition of pigments in Phaeodactylum

tricornutum (Bacillariophyceae) stressed

by iron. Biometals. 2004;17(1 ):45-52.

[15] Bojko M, Brzostowska K, Kuczyńska P,

Latowski D, Olchawa-Pajor M, Krzeszowiec

W, Waloszek A, Strzałka K. Temperature

effect on growth, and selected parameters

of Phaeodactylum tricornutum in batch

cultures. Acta Biochim Pol.

2013;60(4):861 -4.

[16] Garrido JL, Brunet C, Rodríguez F.

Pigment variations in Emiliania huxleyi

(CCMP370) as a response to changes in

light intensity or quality. Environ

Microbiol. 2016 (w druku).

[17] Budzikiewicz H, Taraz K. Chlorophyll

c. Tetrahedron. 1971 ;27:1447-60.

[18] Strain HH, Cope BT, McDonald GN,

Svec WA, Katz JJ. Chlorophylls c1 and c2.

Phytochemistry. 1971 ;10:1 109-114.

[19] Etinsky M, Petković M, Ristić MM,

Marian CM. Electron–vibrational coupling

and fluorescence spectra of tetra-, penta-,

and hexacoordinated chlorophylls c1 and

c2. J Phys Chem B.

2015;1 19(32):10156–69.

[20] Hartzler DA, Niedzwiedzki DM,

Bryant DA, Blankenship RE, Pushkar Y,

Savikhin S. Triplet excited state energies

and phosphorescence spectra of

(bacterio)chlorophylls. J Phys Chem B.

2014;1 18(26):7221 -32.

[21 ] Jaramillo P, Coutinho K, Cabral BJC,

Canuto S. Explicit solvent effects on the

visible absorption spectrum of a

photosynthetic pigment: chlorophyll-c2 in

methanol. Chem Phys Lett. 2011 ;516(4-

6):250-3.

[22] Premvardhan L, Robert B, Beer A,

Büchel C. Pigment organization in

fucoxanthin chlorophyll a/c2 proteins (FCP)

based on resonance Raman spectroscopy

and sequence analysis. Biochim Biophys

Acta. 2010;1797(9):1647-56.

[23] Yoshioka H, Kamata A, Konishi T,

33

Takahashi J, Oda H, Tamai T, Toyohara H,

Sugahara T. Inhibitory effect of chlorophyll

c2 from brown algae, Sargassum horneri,

on degranulation of RBL-2H3 cells. J

Functional Foods. 2013;5(1 ):204-10.

[24] Fujiwara T, Nishida N, Nota J, Kitani T,

Aoishi K, Takahashi H, Sugahara T, Hato N.

Efficacy of chlorophyll c2 for seasonal

allergic rhinitis: single-center double-blind

randomized control trial. Eur Arch

Otorhinolaryngol. 2016 (w druku).

[25] Jeffrey SW, Wright SW. A new

spectrally distinct component in

preparations of chlorophyll c from the

micro-alga Emiliania huxleyi

(Prymnesiophycease). Biochim Biophys

Acta. 1987;894(2):180-8.

[26] Fookes CJR, Jeffrey SW. The structure

of chlorophyll c3, a novel marine

photosynthetic pigment. J Chem Soc Chem

Commun. 1989:1827-1828.

[27] Garrido JL, Zapata M, Muñiz S.

Spectral characterization of new

chlorophyll c pigments isolated from

Emiliania huxleyi (Prymnesiophyceae) by

high-performance liquid chromatography. J

Phycol. 1995;31 (5):761 -8.

[28] Garrido JL, Zapata M. Detection of

new pigments from Emiliania huxleyi

(Prymnesiophyceae) by high-performance

liquid chromatography, liquid

chromatography–mass spectrometry,

visible spectroscopy, and fast atom

bombardment mass spectrometry. J Phycol.

1998;34(1 ):70-8.

[29] Jeffrey SW. Chlorophyll c pigments

and their distribution in the chromophyte

algae. [w:] The chromophyte algae:

problems and perspectives, red. Green JC,

Leadbeater BSC, Diver WL, Clarendon

Press, Oxford, 1989, str. 13-36.

[30] Jeffrey SW. Structural relationships

between algal chlorophylls. [w:]

Phytoplankton pigments in oceanography:

guidelines to modern methods, red. Jeffrey

SW, Mantoura RFC, Wright SW, UNESCO

Publishing, Paris, 1997, str. 566-71 .

[31 ] Álvarez S, Rodríguez F, Riobó P,

Garrido JL, Vaz B. Chlorophyll cCS-170isolated from Ostreococcus sp. is [7-

methoxycarbonyl-8-

vinyl]protochlorophyllide a. Org Lett.

2013;15(17):4430-3.

[32] Wilhelm C. Purification and

identification of chlorophyll c1 from the

green alga Mantoniella squamata. Biochim

Biophys Acta. 1987;892(1 ):23-9.

[33] Helfrich M, Ross A, King GC, Turner

A, Larkum AWD. Identification of [8-vinyl]-

protochlorophyllide a in phototrophic

prokaryotes and algae: chemical and

spectroscopic properties. Biochim Biophys

Acta. 1999;1410(3):262-72.

[34] Garrido JL, Otero J, Maestro MA,

Zapata M. The main nonpolar chlorophyll c

from Emiliania huxleyi (Prymnesiophyceae)

is a chlorophyll c2-

monogalactosyldiacylglyceride ester: a

mass spectrometry study. J Phycol.

2000;36(3):497-505.

[35] Zapata M, Edvardsen B, Rodríguez F,

Maestro MA, Garrido JL. Chlorophyll c2monogalactosyldiacylglyceride ester (chl

c2-MGDG). A novel marker pigment for

Chrysochromulina species (Haptophyta).

Mar Ecol Prog Ser. 2001 ;219:58-98.

[36] Jeffrey SW, Anderson M. Emiliania

huxleyi (Haptophyta) holds promising

insights for photosynthesis. J Phycol.

2000;36(3):449-52.

[37] Fawley MW. A new form of chlorophyll

c involved in light-harvesting. Plant

Physiol. 1989;91 (2):727-32.

[38] Willows RD, Li Y, Scheer H, Chen M.

34

Structure of chlorophyll f. Org Lett.

2013;15(7):1588-90.

[39] Jeffrey SW, Mantoura RFC, Bjørnland

T. Data for the identification of 47 key

phytoplankton pigments. [w:]

Phytoplankton pigments in oceanography:

guidelines to modern methods, red. Jeffrey

SW, Mantoura RFC, Wright SW, UNESCO

Publishing, Paris, 1997, str. 449-559.

[40] Li Y, Cai ZL, Chen M. Spectroscopic

properties of chlorophyll f. J Phys Chem B.

2013;1 17(38):1 1309-17.

[41 ] Manning WM, Strain HH. Chlorophyll

d, a green pigment of red algae. J Biol

Chem. 1943;151 :1 -19.

[42] Murakami A, Miyashita H, Iseki M,

Adachi K, Mimuro M. Chlorophyll d in an

epiphytic cyanobacterium of red algae.

Science. 2004;303(5664):1633.

[43] Miyashita H, Ikemoto H, Kurano N,

Adachi K, Chihara M, Miyachi S.

Chlorophyll d as a major pigment.

1996;383:402.

[44] Miyashita H, Adachi K, Kurano N,

Ikemoto H, Chihara M, Miyachi S. Pigment

composition of a novel oxygenic

photosynthetic prokaryote containing

chlorophyll d as the major chlorophyll.

Plant Cell Physiol. 1997;38(3):274-81 .

[45] Loughlin P, Lin Y, Chen M. Chlorophyll

d and Acaryochloris marina: current

status. Photosynth Res. 2013;1 16(2-3):277-

93.

[46] Larkum AW, Kühl M. Chlorophyll d:

the puzzle resolved. Trends Plant Sci.

2005;10(8):355-7.

[47] Kashiyama Y, Miyashita H, Ohkubo S,

Ogawa NO, Chikaraishi Y, Takano Y, Suga

H, Toyofuku T, Nomaki H, Kitazato H,

Nagata T, Ohkouchi N. Evidence of global

chlorophyll d. Science.

2008;321 (5889):658.

[48] Behrendt L, Larkum AW, Norman A,

Qvortrup K, Chen M, Ralph P, Sørensen SJ,

Trampe E, Kühl M. Endolithic chlorophyll

d-containing phototrophs. ISME J.

2011 ;5(6):1072-6.

[49] Larkum AW, Chen M, Li Y, Schliep M,

Trampe E, West J, Salih A, Kühl M. A novel

epiphytic chlorophyll d-containing

cyanobacterium isolated from a mangrove-

associated red alga. J Phycol.

2012;48(6):1320-7.

[50] Chen M. Chlorophyll modifications

and their spectral extension in oxygenic

photosynthesis. Annu Rev Biochem.

2014;83:317-40.

[51 ] Allakhverdiev SI, Kreslavski VD,

Zharmukhamedov SK, Voloshin RA,

Korol'kova DV, Tomo T, Shen JR.

Chlorophylls d and fand their role in

primary photosynthetic processes of

cyanobacteria. Biochemistry (Mosc).

2016;81 (3):201 -12.

[52] Chen M, Blankenship RE. Expanding

the solar spectrum used by photosynthesis.

Trends Plant Sci. 2011 ;16(8):427-31 .

[53] Chen M, Schliep M, Willows RD, Cai

ZL, Neilan BA, Scheer H. A red-shifted

chlorophyll. Science.

2010;329(5997):1318-9.

[54] Akutsu S, Fujinuma D, Furukawa H,

Watanabe T, Ohnishi-Kameyama M i wsp.

Pigment analysis of a chlorophyll f-

containing cyanobacterium strain

KC1 isolated from Lake Biwa. Photomed

Photobiol. 2001 ;33:35-40.

[55] Chen M, Li Y, Birch D, Willows RD. A

cyanobacterium that contains chlorophyll f

- a red-absorbing photopigment. FEBS

Lett. 2012;586(19):3249-54.

[56] Gan F, Zhang S, Rockwell NC, Martin

SS, Lagarias JC, Bryant DA. Extensive

remodeling of a cyanobacterial

35

photosynthetic apparatus in far-red light.

Science. 2014;345(6202):1312-7.

[57] Behrendt L, Brejnrod A, Schliep M,

Sørensen SJ, Larkum AW, Kühl M.

Chlorophyll f-driven photosynthesis in a

cavernous cyanobacterium. ISME J.

2015;9(9):2108-11 .

[58] Ho MY, Shen G, Canniffe DP, Zhao C,

Bryant DA. Light-dependent chlorophyll f

synthase is a highly divergent paralog of

PsbA of photosystem II. Science.

2016;353(6302).

[59] Gabruk M, Myśliwa-Kurdziel B. Light-

dependent protochlorophyllide

oxidoreductase: phylogeny, regulation, and

catalytic properties. Biochemistry.

2015;54(34):5255-62.

[60] Zhao C, Gan F, Shen G, Bryant DA.

RfpA, RfpB, and RfpC are the master

control elements of Far-Red Light

Photoacclimation (FaRLiP). Front

Microbiol. 2015;6:1303.

[61 ] Wilhelm C, Wiedemann I. Evidence of

protein bound chlorophyll c3 in a light-

harvesting protein isolated from the

flagellate alga Prymnesium parvum

(Prymnesiophyceae). Photosynthetica

1991 ;25:249-255.

[62] Rhiel E, Lange W, Mörschel E. The

unusual light-harvesting complex of

Mantoniella squamata: supramolecular

composition and assembly. Biochim

Biophys Acta. 1993;1 143(2):163-72.

[63] Caron L, Douady D, De Martino A,

Quinet M. Light harvesting in brown algae.

Cah Biol Mar. 2001 ;42:109-124.

[64] Songaila E, Augulis R, Gelzinis A,

Butkus V, Gall A i wsp. Ultrafast energy

transfer from chlorophyll c2 to chlorophyll

a in fucoxanthin-chlorophyll protein

complex. J Phys Chem Lett.

2013;4(21 ):3590-5.

[65] Hoober JK, Eggink LL. A potential role

of chlorophylls b and c in assembly of light-

harvesting complexes. FEBS Lett.

2001 ;489(1 ):1 -3.

[66] Akimoto S, Shinoda T, Chen M,

Allakhverdiev SI, Tomo T. Energy transfer

in the chlorophyll f-containing

cyanobacterium, Halomicronema

hongdechloris, analyzed by time-resolved

fluorescence spectroscopies. Photosynth

Res. 2015;125(1 -2):1 15-22.

[67] Sivakumar V, Wang R, Hastings G.

Photo-oxidation of P740, the primary

electron donor in photosystem I from

Acaryochloris marina. Biophys J.

2003;85(5):3162-72.

[68] Tomo T, Okubo T, Akimoto S, Yokono

M, Miyashita H, Tsuchiya T, Noguchi T,

Mimuro M. Identification of the special

pair of photosystem II in a chlorophyll d-

dominated cyanobacterium. PNAS.

2007;104(17):7283-8.

[69] Itoh S, Mino H, Itoh K, Shigenaga T,

Uzumaki T, Iwaki M. Function of

chlorophyll d in reaction centers of

photosystems I and II of the oxygenic

photosynthesis of Acaryochloris marina.

Biochemistry. 2007;46(43):12473-81 .

[70] Schlodder E, Cetin M, Eckert HJ,

Schmitt FJ, Barber J, Telfer A. Both

chlorophylls a and d are essential for the

photochemistry in photosystem II of the

cyanobacteria, Acaryochloris marina.

Biochim Biophys Acta. 2007;1767(6):589-

95.

[71 ] Tomo T, Kato Y, Suzuki T, Akimoto S,

Okubo T i wsp. Characterization of highly

purified photosystem I complexes from the

chlorophyll d-dominated cyanobacterium

Acaryochloris marina MBIC 11017. J Biol

Chem. 2008;283(26):18198-209.

[72] Swingley WD, Chen M, Cheung PC,

36

Conrad AL, Dejesa LC i wsp. Niche

adaptation and genome expansion in the

chlorophyll d-producing cyanobacterium

Acaryochloris marina. Proc Natl Acad Sci

U S A. 2008;105(6):2005-10.

[73] Blankenship RE, Chen M. Spectral

expansion and antenna reduction can

enhance photosynthesis for energy

production. Curr Opin Chem Biol.

2013;17(3):457-61 .

[74] Mielke SP, Kiang NY, Blankenship RE,

Mauzerall D. Photosystem trap energies

and spectrally-dependent energy-storage

efficiencies in the Chl d-utilizing

cyanobacterium, Acaryochloris marina.

Biochim Biophys Acta. 2013;1827(3):255-

65.

[75] Li Y, Lin Y, Loughlin PC, Chen M.

Optimization and effects of different

culture conditions on growth of

Halomicronema hongdechloris - a

filamentous cyanobacterium containing

chlorophyll f. Front Plant Sci. 2014;5:67.

[76] Airs RL, Temperton B, Sambles C,

Farnham G, Skill SC, Llewellyn CA.

Chlorophyll fand chlorophyll d are

produced in the cyanobacterium

Chlorogloeopsis fritschii when cultured

under natural light and near-infrared

radiation. FEBS Lett. 2014;588(20):3770-7.

[77] Gan F, Shen G, Bryant DA. Occurrence

of Far-Red Light Photoacclimation

(FaRLiP) in diverse cyanobacteria. Life.

2015;5:4-24.

37

Introduction

The homeostasis of intracellular pH

and its regulation are of paramount

importance for the normal physiology

of the cells. Processes such as meta-

bolic pathways, the activity of ion

channels, membrane trafficking

or  protein sorting require pH to be

kept within a well-defined range that

varies between the cytosol and diffe-

rent cellular organelles. pH values can

range from 4.7 in lysosomes to 8.0

in  mitochondria, while the cytoplasmic

pH is close to neutral [1 ,2]. The

utmost importance of pH in numerous

cellular activities makes it a very use-

ful parameter to study in detail. It also

demonstrates the importance of relia-

ble sensors of intracellular pH. This

article will delineate the discovery and

properties of so-called “pHluorins”,

fluorescent proteins that can be used

to monitor the pH changes inside

the  cells, and describe some recent

examples of the use of those proteins.

Green Fluorescent Protein and the

pH dependence of its fluorescence

Green Fluorescent Protein (GFP;

Fig.   1 ) is a fluorescent protein that

was first identified in the jellyfish

Aequorea victoria in 1962 [3]. It consi-

sts of 238 amino acids, corresponding

to a  molecular weight of 26.9 kDa

[4,5]. The amino-acid chain folds into

a  β-barrel structure comprising

of  1 1   β-sheets and one central α-helix.

pHluorins – a tool to measure intracellular pH

Mariia Borbuliak1, Wiktor Tokarek2

1Department of Biochemistry, Faculty of Biology,Ivan Franko National University of Lviv2Department of Plant Physiology and Biochemistry, Faculty of Biochemistry,Biophysics and Biotechnology, Jagiellonian University in KrakówWritten under the supervision of PD Dr. Jost Ludwig

Intracellular pH plays a crucial role in numerous cellular processes,

including protein synthesis and sorting, membrane trafficking and the

activity of ion channels. Moreover, cells must keep pH at certain levels

inside different cellular compartments in order to maintain their

function. Thus, pH values that can be found inside the cell can range

from ~4.7 to ~8.0, with 7.0-7.2 being the pH of the cytosol. Precise

measurements of intracellular pH values, and their changes, can be

extremely useful in elucidating the intricate processes occurring inside

the cells. pHluorins are a useful tool for such purposes. They are a group

of fluorescent proteins, characterized by predictable and measurable

changes in their spectral features in response to changing pH. This

article summarizes the history of the development of pHluorins, and

describes their spectral properties. Additionally it provides examples of

the uses of these genetically encoded sensors in current research.

38

That helical region contains the chro-

mophore formed from three intrinsic

residues – Ser65, Tyr66 and Gly67 –

by  autocatalytic posttranslational mo-

dification: dehydration and oxidation

by atmospheric oxygen [6,7]. This tri-

amino acid structure is responsible for

GFP’s spectral properties. It absorbs

light at 395 nm and emits light with

a  maximum at 508 nm (green flore-

scence). The excitation spectrum also

contains a small peak at 475 nm [8].

The spectral properties of GFP’s flu-

orescence depend on pH – the fluore-

scence intensity is stable within

the  pH range of 6-10. Below that,

the  intensity strongly diminishes.

On  the other hand, it increases in pH

10-12 and decreases again in even hi-

gher pH [9,10]. The shape of the spec-

tra is generally not influenced by pH

changes, although the peaks ratio may

change in a pH-dependent manner

[11 ]. It was proposed that GFP can

exist in two distinct ground states dif-

fering in the protonation of the chro-

mophore. If the phenol group of Tyr66

is uncharged, the excitation peak

is  located at ~395 nm. The charged

phenolate group of this residue corre-

sponds to the GFP variant exited

at  ~475 nm [7,1 1 ,12]. At low pH

the  phenol form is favored, which re-

sults in GFP being excited at

~395  nm. At alkaline pH Tyr66 exists

predominantly in the phenolate form,

which shifts the excitation maximum

to ~475 nm [7,1 1 ]. These properties

of  GFP are remarkable and were used

to develop new mutants with enhan-

ced pH sensitivity.

Development of pHluorins

and  their derivatives

The GFP mutants with enhanced pH

sensitivity were first developed

in  1 998. James Rothman’s group em-

ployed structure-directed combinato-

rial mutagenesis, using S202H GFP

mutant as a starting point. This mu-

tant protein showed slight changes

in  its excitation spectrum in response

to a pH shifts from 7.4 to 6.0. Since

wild-type GFP does not exhibit chan-

ges in fluorescence spectrum in this

pH range, this mutant was a good

starting point for combinatorial muta-

genesis. By mutating key residues in-

volved in GFP’s proton-relay network,

the Authors generated two pH-sensiti-

ve fluorescent proteins, named “ratio-

metric” and “ecliptic” “pHluorins”

[13].

Ratiometric pHluorin (mutations39

Fig. 1 . Structure of Green FluorescentProtein, upon which the pHluorins are ba-sed (PDB: 1EMA).

E132D, S147E, N149L, N164I, K166Q,

I167V, R168H, S202H, L220F) is cha-

racterized by the bimodal excitation

spectrum with significant peaks

at  ~395 and ~475 nm. The ratio

of  fluorescence emission intensities

at  those peaks changes in response

to  pH changes between ~5.5 and

~7.5, and it can be calibrated using

buffers of known pH [13] (Fig. 2).

The  ratiometric nature of the measu-

rement makes in not susceptible to er-

rors caused by wrong assessment

of  protein concentration [2].

Ecliptic pHluorin (mutations S147D,

N149Q, T161 I, S202F, Q204T, A206T;

the original S202H substitution is

no  longer present) is characterized by

a major excitation maximum at ~395

nm and a small one at ~475 nm. This

protein gradually loses its fluorescen-

ce in lower pH. The excitation peak

at  475 nm disappears in pH <6.0 and

the protein becomes invisible (it eclip-

ses) under such excitation [13].

pHluorins can be fused to other prote-

ins to study the pH in different cellular

compartments. Such is the case with

so-called synapto-pHluorins, which

are  used to study neurotransmitters

release and the trafficking of their re-

ceptors. In this setup, pHluorin was

fused, for example, with VAMP-

2/streptabrevin [13,14].

In order to increase the brightness

of  pH-sensitive GFP mutants, a new

derivative of ecliptic pHluorin, termed

“superecliptic pHluorin”, has been de-

veloped. Its primary structure contains

two additional amino acid substitu-

tions, namely F64L and S65T. These

mutations caused a nine-fold increase

in protein fluorescence yield, compa-

red to the original ecliptic pHluorin,

40

Fig. 2. Excitation spectra of ratiometric pHluorin in different intracellular pH va-lues of yeast cells’ cytosol. The intracellular pH was set to a given value by incu-bating yeast cells (Saccharomyces cerevisiae) in a buffer of that pH.

with no changes in the pH dependence

[15]. F64L and S65T substitutions we-

re first used in the development of En-

hanced GFP (EGFP), characterized by

an increased brightness in relation

to  wild-type GFP [16,17]. These muta-

tions were introduced in ratiometric

pHluorin with the same result – an in-

crease in brightness and the mainte-

nance of the pH sensitivity. This novel

version was named “pHluorin2” [18].

Another mutation introduced in ratio-

metric pHluorin’s sequence was

M153R. It resulted in an increased

brightness and stability of its fusion

products [19]. RaVC is a derivative of

ratiometric pHluorin developed for vi-

sualizing and quantifying intracellular

pH in living fungal hyphae [20].

For studying pH changes in plants, yet

another pHluorin-related reporter

protein was created. This protein, na-

med Pt-GFP, was based not on GFP

isolated from A. victoria , but from the

orange sea pen Ptilosarcus gurneyi.

Pt-GFP is readily expressed in model

plant Arabidopsis thaliana without any

codon-usage modifications that were

necessary for the expression of A. vic-

toria GFP-based sensors [21 ,22]. Com-

pared to the original ratiometric

pHluorin, Pt-GFP has a lower pH sen-

sitivity. This is compensated by its

broader pH responsiveness (from pH

~3.8 to pH ~7.8), outstanding dyna-

mic ratio range and increased stability

at low pH [22]. An overview of pHlu-

orins derivatives can be found in

[2,23].

A new approach to enhance the sensi-

tivity of pHluorin-based assays was

made in 2015. This method is not ba-

sed on modifications of the pH sensiti-

ve proteins themselves, but on a diffe-

rent way of fluorescence

measurement, namely by using syn-

chronously scanned fluorescence

spectra. This allows the measurements

of changes in pH as small as <0.1 unit

[24].

pHluorins in research – a  few

examples

In order to monitor proteins at the

surface of cells, one can employ diffe-

rent techniques, such as surface bioti-

nylation, antibody labelling of

extracellular epitopes in intact cells

for use in immunocytochemical

or  ELISA assays and electrophysiolo-

gical tagging of ion channels. Howe-

ver, the pHluorin fluorescence-based

approach has potentially distinct ad-

vantages over these commonly used

strategies, because it simultaneously

achieves high temporal and spatial re-

solution. This should allow not only

real-time tracking of the delivery and

removal of proteins to and from

the  cell surface, but also the simulta-

neous detection of the cellular regions

where these changes take place [25].

As we mentioned above, ecliptic pHlu-

orins are non-fluorescent at pH 6 un-

der 470 nm excitation, which

eliminates the background due to

the  resting vesicles in synaptic cells

and thus these proteins are potentially

suited for detecting even single vesicle

fusion events. Moreover, ecliptic sy-

napto-pHluorins imaged by two-photon

or confocal microscopy could report

transmission in neural tissue of trans-

genic animals, in a transmitter- or cell41

type-specific manner with high sensi-

tivity [13].

By monitoring changes in fluorescence

of the ratiometric synapto-pHluorins,

it was possible to study exocytosis

in  presynaptic terminals induced

by  depolarization of hippocampal neu-

rons. The ratiometric nature of this

synapto-pHluorin allows consistent

and accurate analysis of changes

in  pH, because it eliminates possible

artifacts introduced by cell movement,

focus changes or photobleaching. [25].

Synapto-pHluorin, a product of the fu-

sion between ecliptic pHluorin and sy-

naptic vesicle v-SNARE synaptobrevin

2, has been extensively used to study

synaptic vesicle recycling. Since pHlu-

orins have a pKa of 7.1 , it makes them

ideal for tracking varying pH of sy-

naptic vesicle lumen following

the  passing of action potential impul-

ses through the plasma membrane.

pHluorins targeted to the synaptic ve-

sicle lumen (synapto-pHluorin) ena-

bled measurements of dynamic

changes in pH of vesicle lumen resul-

ting from exocytosis and endocytosis

of synaptic vesicles during presynaptic

activity. In addition, they provide

an  analytical framework for under-

standing the magnitude of the optical

signals generated by fusion of synaptic

vesicles with the plasma membrane

[15].

Using an improved fluorescent repor-

ter comprising of pHluorin fused

to  synaptophysin, it was found that

only a slow mode of endocytosis

(t  =   1 5 s) operates at hippocampal sy-

napses when vesicle fusion is trigge-

red by a single nerve impulse or short

burst [26]. A new, improved fluore-

scent reporter of exocytosis and endo-

cytosis, sypHy, made by fusing

pH-sensitive GFP [13] to the synaptic

vesicle protein synaptophysin, was

used to measure synaptic vesicle re-

trieval after single action potentials.

While fast "kiss-and-run" mode has

been reported to be the predominant

mode of fusion, only one mode of en-

docytosis, which occurred with a time

constant of 15 s, was found. However,

vesicle fusion is triggered by a single

nerve impulse or short burst. Inhibi-

ting clathrin-mediated endocytosis, the

machinery for retrieving of synaptic

vesicles that can collapse on fusion,

completely blocked vesicle retrieval

after weak stimuli. These results pro-

vide clear evidence against the idea

that fast, clathrin-independent mecha-

nisms play a significant role at hippo-

campal synapses [26].

It was also found that vesicular gluta-

mate transporter VGLUT1 interacts

directly with endophilin, a component

of the clathrin-dependent endocytic

machinery. In the absence of its inte-

raction with endophilin, VGLUT1 re-

cycles more slowly during prolonged,

high-frequency stimulation. To study

VGLUT1 trafficking in real time, a su-

per-ecliptic pHluorin was fused into

the large, first lumenal loop of this

transporter. After expression in hippo-

campal neurons, VGLUT1 -pHluorin

colocalizes in varicosities with the sy-

naptic vesicle protein SV2. In addition,

the fluorescence of VGLUT1 -pHluorin

changes in response to neural activity.

Electrical stimulation (10 Hz for 60 s)

produces a rapid increase in fluore-42

scence, consistent with the relief

of  fluorescence quenching on exposu-

re to higher external pH during sy-

naptic vesicle exocytosis [27].

Apart from studying neural cells,

pHluorins were also be successfully

used in measurements of intracellular

pH values in yeast cells [28]. The first

paper describing the studies on intra-

cellular pH using ratiometric pHluorin

was published in 2005. The Authors

showed that yeast Nhx1 protein,

an  endosomal Na+/H+ exchanger, re-

gulated luminal and cytoplasmic pH,

which is essential for trafficking path-

ways out of the late endosome [29].

Martínez-Muñoz et al. described

the  importance of vacuolar proton-

translocating ATPases for vacuolar

acidification in response to glucose

metabolism and for maintaining

the  pH homeostasis [30]. Maresová et

al. used pHluorin to determine

the  buffering capacity of yeast cells’

cytosol. The results, obtained with

a  microplate reader, suggested that

this capacity is equal to ~52 mM/pH

[28]. Moreover, vacuolar pH was iden-

tified as a crucial regulator of ageing

ans mitochondrial function in yeast

cells [31 ].

Conclusions

The pHluorin technique is a very use-

ful tool for the non-invasive monitoring

of events such as exocytosis, endocy-

tosis and protein surface expression

in  living neurons with high spatial and

temporal resolution [25], determining

the buffering capacity of yeast cyto-

plasm (understood as the ability

of  cells to maintain a relatively stable

cytosolic pH when protons are either

added or withdrawn) in vivo. In seve-

ral studies, pHluorins were used

to  study the cytosolic and intraorga-

nellar pH of S. cerevisiae, describing

the cells’ response to various growth

conditions, glucose pulses, respiratory

chain inhibitors and other treatments.

Furthermore, pHluorins can be used

to dynamically measure the pH of va-

rious intracellular compartments, such

as the cytoplasm, peroxisomes, endo-

somes and the trans-Golgi network,

to  monitor lateral movements of pro-

teins within the plasma membrane li-

pid bilayer following exocytosis,

to  analyze the dynamics and Ca2+-de-

pendency of presynaptic secretory ve-

sicle endocytosis and as a marker

of  presynaptic development. Another

potential use for pHluorins is the study

of lateral protein diffusion within

the  plasma membrane. pHluorin tech-

nique permits dynamic observation

of  cell surface proteins, hence it is po-

ssible to selectively assess the lateral

movement of proteins through the li-

pid bilayer. Photobleaching protocols

can be used to measure the rates

and  directions of protein movement

between different membrane microdo-

mains, such as synapses or lipid rafts

[25,29,30,32].

43

References:

[1 ] Casey JR, Grinstein S, Orlowski J.

Sensors and regulators of intracellular pH.

Nat Rev Mol Cell Biol. 2010;1 1 (1 ):50-61 .

[2] Benčina M. Illumination of the spatial

order of intracellular pH by genetically

encoded pH-sensitive sensors. Sensors.

2013;13(12):16736-58.

[3] Shimomura O, Johnson FH, Saiga Y.

Extraction, purification and properties of

aequorin, a bioluminescent protein from

the luminous hydromedusan, Aequorea. J

Cell Comp Physiol. 1962;59:223-39.

[4] Shimomura O. Structure of the

chromophore of Aequorea green

fluorescent protein. FEBS Letters.

1979;104(2):220-2.

[5] Prasher DC, Eckenrode VK, Ward WW,

Prendergast FG, Cormier MJ. Primary

structure of the Aequorea victoria green-

fluorescent protein. Gene.

1992;1 11 (2):229-33.

[6] Ormö M, Cubitt AB, Kallio K, Gross LA,

Tsien RY, Remington SJ. Crystal structure

of the Aequorea victoria green fluorescent

protein. Science. 1996;273(5280):1392-5.

[7] Campbell TN, Choy FYM. The effect of

pH on Green Fluorescent Protein: a brief

review. Molecular Biology Today.

2001 ;2(1 ):1 -4.

[8] Tsien RY. The green fluorescent

protein. Annu Rev Biochem. 1998;67:509-

44.

[9] Ward WW. Properties of the

coelenterate green-fluorescent proteins.

In: Bioluminescence and

chemiluminenscence: basic chemistry and

analytical applications. DeLuca MA,

McElroy WD eds. Academic Press, New

York, 1981 ;235-42.

[10] Patterson GH, Knobel SM, Sharif WD,

Kain SR, Piston DW. Use of the green

fluorescent protein and its mutants in

quantitative fluorescence microscopy.

Biophysical Journal. 1997;73(5):2782-2790.

[1 1 ] Kneen M, Farinas J, Li Y, Verkman AS.

Green fluorescent protein as a noninvasive

intracellular pH indicator. Biophysical

Journal. 1998;74(3):1591 -9.

[12] Chattoraj M, King BA, Bublitz GU,

Boxer SG. Ultra-fast excited state

dynamics in green fluorescent protein:

multiple states and proton transfer. Proc

Natl Acad Sci USA. 1996;93(16):8362-7.

[13] Miesenböck G, De Angelis DA,

Rothman JE. Visualizing secretion and

synaptic transmission with pH-sensitive

green fluorescent proteins. Nature.

1998;394(6689):192-5.

[14] Miesenböck G. Synapto-pHluorins:

genetically encoded reporters of synaptic

transmission. Cold Spring Harb Protoc.

2012;2012(2):213-7.

[15] Sankaranarayanan S, De Angelis D,

Rothman JE, Ryan TA. The use of

pHluorins for optical measurements of

presynaptic activity. Biophysical Journal.

2000;79(4):2199-208.

[16] Heim R, Cubitt AB, Tsien RY.

Improved green fluorescence. Nature.

1995;373(6516):663-4.

[17] Cormack BP, Valdivia RH, Falkow S.

FACS-optimized mutants of the green

fluorescent protein (GFP). Gene.

1996;173:33-8.

[18] Mahon MJ. pHluorin2: an enhanced,

ratiometric, pH-sensitive green florescent

protein. Advances in bioscience and

biotechnology. 2011 ;2(3):132-7.

[19] Morimoto YV, Kojima S, Namba K,

Minamino T. M153R mutation in a pH-

sensitive green fluorescent protein

stabilizes its fusion proteins. PLoS One.

2011 ;6(5):e19598.

44

[20] Bagar T, Altenbach K, Read ND,

Bencina M. Live-Cell imaging and

measurement of intracellular pH in

filamentous fungi using a genetically

encoded ratiometric probe. Eukaryot Cell.

2009;8(5):703-12.

[21 ] Moseyko N, Feldman LJ. Expression of

pH-sensitive green fluorescent protein in

Arabidopsis thaliana. Plant Cell Environ.

2001 ;24(5):557-63.

[22] Schulte A, Lorenzen I, Böttcher M,

Plieth C. A novel fluorescent pH probe for

expression in plants. Plant Methods.

2006;2:7.

[23] Martinière A, Desbrosses G, Sentenac

H, Paris N. Development and properties of

genetically encoded pH sensors in plants.

Front Plant Sci. 2013;4:523.

[24] Plášek J, Melcrová A, Gášková D.

Enhanced sensitivity of pHluorin-based

monitoring of intracellular pH changes

achieved through synchronously scanned

fluorescence spectra. Anal Chem.

2015;87(19):9600-4.

[25] Ashby MC, Ibaraki K, Henley JM. It’s

green outside: tracking cell surface

proteins with pH-sensitive GFP. Trends in

Neurosciences. 2004;27(5):257-261 .

[26] Granseth B, Odermatt B, Royle SJ,

Lagnado L. Clathrin-mediated endocytosis

is the dominant mechanism of vesicle

retrieval at hippocampal synapses.

Neuron. 2006;51 (6):773–786.

[27] Voglmaier SM, Kam K, Yang H, Fortin

DL, Hua Z, Nicoll RA, Edwards RH.

Distinct endocytic pathways control the

rate and extent of synaptic vesicle protein

recycling. Neuron. 2006;51 (1 ):71 –84.

[28] Maresová L, Hosková B, Urbánková E,

Chaloupka R, Sychrová H. New

applications of pHluorin - measuring

intracellular pH of prototrophic yeasts and

determining changes in the buffering

capacity of strains with affected potassium

homeostasis. Yeast. 2010;27(6):317-25.

[29] Brett CL, Tukaye DN, Mukherjee S,

Rao R. The yeast endosomal Na+ (K+)/H+

exchanger Nhx1 regulates cellular pH to

control vesicle trafficking. Mol Biol Cell.

2005;16(3):1396–1405.

[30] Martínez-Muñoz GA, Kane P. Vacuolar

and plasma membrane proton pumps

collaborate to achieve cytosolic pH

homeostasis in yeast. J Biol Chem.

2008;283(29):20309-19.

[31 ] Hughes AL, Gottschling DE. An early

age increase in vacuolar pH limits

mitochondrial function and lifespan in

yeast. Nature. 2012;492(7428):261 -5.

[32] Roos A, Boron WF. Intracellular pH.

Physiol Rev. 1981 ;61 (2):296–434.

45

46

W dniach 25-27 listopada 2016 Akademickie Stowarzyszenie Stu-dentów Biotechnologii (ASSB), Koło Studentów Biotechnologii(KSB), SKN Heterocyklika oraz SKN Chemii Medycznej organizująI  międzynarodową konferencję pod nazwą „BioChemMed Session”,która odbędzie się w Gdańsku.

Wydarzenie skierowane jest do naukowców, przedzierających szlakitajemnej wiedzy z zakresu nauk medycznych, biologicznychoraz  chemicznych. Jeżeli więc jesteś studentem I czy II stopnia lubjesteś doktorantem na studiach o profilu medycznym, biologicznym,chemicznym, biotechnologicznym lub kierunkach pokrewnychi  chcesz podzielić się swoją wiedzą oraz doświadczeniem z innymimłodymi naukowcami, zarejestruj się na konferencję już dziś!

Prezentacja wyników naukowych będzie możliwa w formie prezen-tacji ustnych i posterowych. Zgłoszenia przyjmowane są do 31 paź-dziernika 2016r. Koszt uczestnictwa wynosi 60 zł dla członkówASSB i 100 zł dla pozostałych osób.

Więcej informacji oraz formularz zgłoszeniowy znajdują na stronieinternetowej http://assb.pl/Bcm_session/

Zaproszenie na BioChemMed Session

Publikacja w Acta Mygenica XI

Zachęcamy do publikacji w kolejnym numerze Zeszytów Naukowych"Acta Mygenica" Koła Naukowego Studentów Biotechnologii"Mygen". Akceptujemy artykuły przeglądowe i badawcze o tematy-ce z zakresu lifescience. Najlepsze z nadesłanych artykułów zostanąopublikowane w XI wydaniu "Acta Mygenica" w styczniu 2017 .

W razie pytań prosimy o kontakt z redaktor naczelną -Dobrochną Dolicką (dobrochna_d@wp.pl).

Poprzednie edycje zeszytów naukowych „Acta Mygenica” sądostępne pod adresem:

www.mygen.wbbib.uj .edu.pl/dzialalnosc/actamygenica

47

ISSN 1899-5535