678 Przegl¹d Lekarski 2011 / 68 / 10 M. Bodnar i wsp.

PRACE ORYGINALNE

Ocena ekspresji tkankowych inhibitorówmetaloproteinaz (TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3) jakoczynników prognostycznych w rakup³askonab³onkowym krtani

Evaluation of expression of tissue inhibitors ofetalloproteinases (TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3) as aprognostic markers in laryngeal squamous cellcarcinoma

1Katedra i Zak³ad Patomorfologii Klinicznej,Uniwersytet Miko³aja Kopernika, Toruñ,Collegium Medicum, BydgoszczKierownik:Dr hab. Andrzej Marsza³ek prof. UMK

2Katedra i Klinika Otolaryngologii,Uniwersytet Miko³aja Kopernika, Toruñ,Collegium Medicum, BydgoszczKierownik: Prof. dr hab. Henryk Ka�mierczak

3Katedra i Zak³ad Patomorfologii Klinicznej,Uniwersytet Medycznyim. Karola Marcinkowskiego, PoznañKierownik: Prof. dr hab. Przemys³aw Majewski

Dodatkowe s³owa kluczowe:rak p³askonab³onkowy krtanitkankowe inhibitory metaloproteinazimmunohistochemia

Additional key words:laryngeal squamous cell carcinomatissue inhibitors of matrix metalloproteinasesimmunohistochemistry

Adres do korespondencji:Dr hab. Andrzej Marsza³ek, prof. UMKKatedra i Zak³ad Patomorfologii KlinicznejUniwersytet Miko³aja Kopernika w ToruniuCollegium Medicum im. L. Rydygieraw Bydgoszczyul. M. Sk³odowskiej-Cuire 985-094 BydgoszczTel.: 52 585 42 00; Faks: 52 585 40 49e-mail: amars@cm.umk.pl

Magdalena BODNAR1

£ukasz SZYLBERG1

Wojciech KA�MIERCZAK2

Andrzej MARSZA£EK1,3

Raki krtani wci¹¿ stanowi¹ powa¿-ny problem terapeutyczny, wynikaj¹cyg³ównie z pó�nego rozpoznania no-wotworu. Utrzymanie równowagi miê-dzy aktywno�ci¹ enzymów proteoli-tycznych i ich inhibitorów odgrywaistotn¹ rolê w utrzymaniu prawid³owejstruktury tkanek oraz zapobiega degra-dacji sk³adników macierzy zewn¹trzko-mórkowej. Nadmierna ekspresja enzy-mów proteolitycznych oraz brak aktyw-no�ci odpowiednich inhibitorów pro-wadzi do destabilizacji wspomnianejpowy¿ej równowagi, co w konsekwen-cji u³atwia migracjê komórek nowo-tworowych. Celem niniejszej pracyby³a ocena lokalizacji i poziomu eks-presji tkankowych inhibitorów metalo-proteinaz (TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3) wraku p³askonab³onkowym krtani. Ba-dania immunohistochemiczne prze-prowadzono na 78 reprezentatywnychwycinkach tkankowych obejmuj¹cych60 wycinków z rakiem p³askonab³on-kowym krtani oraz 18 wycinków pra-wid³owej b³ony �luzowej. Stwierdzo-no ekspresjê oznaczanych czynnikówzarówno w komórkach nowotworo-wych, jak i pod�cielisku nowotworu.Stwierdzono cytoplazmatyczn¹ eks-presjê oznaczanych bia³ek, odpowied-nio w 91% (71/78) dla TIMP-1, 22% (17/78) TIMP-2, 100% (78/78) TIMP-3 przy-padków raka p³askonab³onkowegokrtani. Stwierdzono ró¿nicê istotn¹ sta-tystycznie pomiêdzy ekspresj¹ TIMP-1, TIMP-2 oraz TIMP-3 pomiêdzy eks-presj¹ tych parametrów w komórkachnowotworu a pod�cieliskiem (p<0,05).Uwzglêdniaj¹c stopieñ zajêcia wêz³ówch³onnych (N0 vs. N+) wykazano ró¿-nice istotne statystycznie w pozio-mach ekspresji TIMP-1 i TIMP-3 w zrê-bie. Natomiast dla poziomów ekspre-sji TIMP-1, TIMP-2 TIMP-3 w nowotwo-rze nie stwierdzono ró¿nic istotnychstatystycznie pomiêdzy pacjentami N0vs. N+. Ocena wzajemnych interakcjipomiêdzy wyszczególnionymi parame-

Laryngeal cancer is still a therapeu-tic problem mainly become of late di-agnosis. Balance between the activityof proteolytic enzymes and their inhibi-tors plays an important role in main-taining normal tissues structure andprevents the degradation of extracel-lular matrix components. Proteolyticenzymes overexpression and/or lackof activity of their inhibitors lead todestabilization of tissue structure,which in turn facilitates the migrationof cancer cells. The aim of this studywas to assess the localization andlevel of expression of tissue inhibitorsof metalloproteinases (TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3) in lanyngeal squamous cellcarcinoma. The immunohistochemicalstudy was performed on 78 representa-tive tissue samples including: 60 sec-tions of squamous cell carcinoma ofthe larynx and 18 sections of normalmucosa. Expression of determinedparameters was found in both tumorcells and tumor stroma. We have foundcytoplasmic expression of studied pro-teins, respectively in 91% (71/78) forTIMP-1, 22% (17/78) for TIMP-2, 100%(78/78) for TIMP-3 cases of squamouscell carcinoma of the larynx. Statisti-cally significant difference between theexpression of TIMP-1, TIMP-2 andTIMP-3 was found between tumor cellsand tumor stroma (p<0.05). Analyzingthe lymph node involvement (N0 vs. N+) we found statistically significant dif-ference (p<0.05) in the levels of expres-sion of TIMP-1 and TIMP-3 betweenthose groups in the primary tumorstroma. However, for expression lev-els of TIMP-1, TIMP-2 TIMP-3 in thetumor cells there was no statisticallysignificant differences between pa-tients N0 vs. N +. Assessment of inter-actions between parameters involvedin the process of tumor invasion maycontribute to the development of thera-pies based on the inhibition of inva-sion. Understanding the mechanisms

679Przegl¹d Lekarski 2011 / 68 / 10

Intensywno�æ ekspresji

[SI]

Komórki/obszar o pozytywnej ekspresji

[PP]

Skala IRS

[SI] x [PP]

0 � brak ekspresji

1 � s³aba ekspresja

2 � umiarkowana ekspresja

3 � silna ekspresja

0 = brak komórek

1 = < 5% komórek

2 = 6 - 20% komórek

3 = 21 - 50% komórek

4 = 51 - 80% komórek

5 = > 81% komórek

Tabela ISkala oceny reakcji immunohistochemicznej wg Remmele-Stegner w modyfikacji w³asnej.The immunohistochemical reaction scale of Remmel-Stegner with own modification.

WstêpRak krtani wci¹¿ pozostaje istotnym pro-

blemem diagnostycznym jak i terapeutycz-nym. W obszarze krtani, najczê�ciej wystê-puj¹cym nowotworem jest rak p³askonab³on-kowy, stanowi¹cy ok. 90% rozpoznawanychnowotworów z³o�liwych w tej lokalizacji. Etio-logia tego nowotworu �ci�le zwi¹zana jest zekspozycj¹ na czynniki �rodowiskowe,w�ród których podkre�la siê palenie tytoniuoraz nadu¿ywanie wysokoprocentowychalkoholi [2,32]. W Polsce w 2008 roku od-notowano 2075 nowych zachorowañ naraka krtani oraz 1423 zgony spowodowanetym typem nowotworu u mê¿czyzn. U ko-biet dane te w 2008 roku przedstawia³y siênastêpuj¹co: 308 nowych zachorowañ i 182zgony spowodowane rakiem krtani [Krajo-wy Rejestr Nowotworów].

Przerzuty powstaj¹ce w wyniku proce-su transformacji nowotworowej stanowi¹jedn¹ z g³ównych przyczyn zgonów. W pro-cesie tworzenia przerzutów istotn¹ rolê od-grywa zdolno�æ komórek do migracji, którauwarunkowana jest degradacj¹ sk³adnikówmacierzy zewn¹trzkomórkowej determino-wana obecno�ci¹ ró¿nych enzymów nale-¿¹cych do rodziny endopeptydaz (tzw. me-taloproteinaz, MMP). W szczególno�ci pod-kre�la siê rolê MMP-2 oraz MMP-9. Udo-wodniono lokalizacjê tych enzymów nie tyl-ko na powierzchni komórek nowotworo-wych, ale tak¿e zdolno�æ ich wydzielaniaprzez komórki pod�cieliska nowotworu[13,19].

W licznych badaniach wskazano na in-terakcje zachodz¹ce pomiêdzy komórkaminowotworowymi a otaczaj¹cym je mikro�ro-dowiskiem, tzw. tumor host-reactions (inte-rakcja guz-gospodarz), podkre�laj¹c, ¿e nietylko sam nowotwór powoduje przekszta³-cenie mikro�rodowiska, ale tak¿e reaguje naczynniki pochodz¹ce z pod�cieliska [13].Mikro�rodowisko bierze udzia³ w promocjimutagenezy komórek nowotworowych orazwp³ywa na modyfikacje komórek wchodz¹-cych w sk³ad pod�cieliska guza [10,31].Podkre�laj¹c udzia³ komórek mikro�rodowi-ska guza, zaproponowano model �mikro�ro-dowiskowej� inwazji nowotworu (tumor mi-croenviroment invasion model), wed³ug któ-rej na ka¿dym etapie tworzenia przerzutównastêpuje aktywacja okre�lonych genówwspomagaj¹cych ten proces [11,12,31].

Aktywacja MMP mo¿e odbywaæ siê nadwóch poziomach: zewn¹trz i wewn¹trz-komórkowo. Wiêkszo�æ enzymów proteoli-tycznych aktywowana jest zewn¹trzkomór-kowo. Metaloproteinazy wytwarzane i wy-dzielane s¹ w postaci nieaktywnych proen-zymów, a aktywacja MMP zachodzi poprzezusuniêcie prodomeny, co prowadzi do od-s³oniêcia aktywnego miejsca enzymu. Zmia-ny te zachodz¹ pod wp³ywem specyficznychaktywatorów oraz inhibitorów dzia³aj¹cychna poziomie: ekspresji genów, aktywacjipro-MMP, a tak¿e poprzez udzia³ specyficz-nych i niespecyficznych inhibitorów zakty-

wowanych metaloproteinaz [7,28].W warunkach fizjologicznych aktywno�æ

i ilo�æ MMPs regulowana jest poprzez en-dogenne inhibitory metaloproteinaz, czylitzw. tkankowe inhibitory metaloproteinaz(ang. tissue inhibitors of matrix metallopro-teinases, TIMPs). Dotychczas znane s¹cztery typy inhibitorów tkankowych, odpo-wiednio: TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3, TIMP-4.£¹cz¹ siê one z fragmentem C-koñcowymcz¹steczki MMP wi¹zaniami niekowalencyj-nymi. Powinowactwo poszczególnych inhi-bitorów do odpowiednich enzymów jestzró¿nicowane. Udowodniono, ¿e TIMP-1wykazuje zwiêkszone powinowactwo doMMP-9, w porównaniu z powinowactwemdo MMP-2. Natomiast TIMP-2 wykazujeznacznie wiêksze zdolno�ci zahamowaniaaktywno�ci MMP-2, w porównaniu do efek-tu w przypadku pozosta³ych enzymów wcho-dz¹cych w sk³ad tej rodziny [16]. Udowod-niono, ¿e TIMPs pe³ni¹ tak¿e funkcje ligan-dów dla receptorów czynników wzrostu orazcytokin. Wywieraj¹ tak¿e wp³yw na regula-cjê aktywno�ci komórek nowotworowych,niezale¿nie od aktywno�ci MMPs [4]. Po-nadto tkankowe inhibitory metaloproteinazzaanga¿owane s¹ w degradacjê macierzyzewn¹trzkomórkowej poprzez zdolno�æ doeliminacji MMPs, jak równie¿ zdolno�æ dohamowania aktywacji tych enzymów. Two-rz¹ wi¹zania zarówno z formami aktywny-mi

jak i latentnymi MMPs, powoduj¹c za-blokowanie mo¿liwo�ci od³¹czenia koñca

N okre�lonych metaloproteinaz, co unie-mo¿liwia ich aktywacjê [4,16]. G³ówn¹ funk-cj¹ TIMPs, oprócz zdolno�ci do hamowa-nia aktywno�ci MMPs, jest zdolno�æ do sty-mulowania rozwoju nowotworów. Stwierdzo-no, ¿e TIMPs bior¹ udzia³ zarówno w pro-cesach degradacji jak i syntezy macierzy po-zakomórkowej reguluj¹c oba te procesy. Wwyniku nadmiernego wydzielania MMPs,m.in. przez komórki nowotworowe, docho-dzi do zwiêkszonego wydzielania TIMP.Ponadto w przebiegu procesu nowotworo-wego, wzrost syntezy MMPs, zarówno w ko-mórkach guza, jak i pod�cielisku nowotwo-ru, zwi¹zany jest ze zwiêkszon¹ syntez¹ in-hibitorów metaloproteinaz. Nadmierna syn-

teza MMPs, w porównaniu do syntezy inhi-bitorów tkankowych, powoduje nasilenieprocesów degradacyjnych, co z kolei mo¿epowodowaæ zwiêkszon¹ migracjê komórekguza [7,13,15].

Celem niniejszej pracy by³a ocena loka-lizacji i poziomu ekspresji tkankowych inhi-bitorów metaloproteinaz (TIMP-1, TIMP-2,TIMP-3) jako czynników zwi¹zanych z ak-tywacj¹ enzymów proteolitycznych nale¿¹-cych do ¿elatynaz. Ponadto podjêto próbêopisania przebudowy pod�cieliska nowotwo-ru w trakcie jego powstawania i rozwoju, naprzyk³adzie raka p³askonab³onkowego krtanipoprzez ocenê lokalizacji i poziomu ekspresjitych parametrów w obszarze prawid³owejb³ony �luzowej i raku p³askonab³onkowymkrtani.

Materia³ i metodyGrupa badana:Badania wykonano na materiale pochodz¹cym od

31 mê¿czyzn oraz 6 kobiet, którym wykonano laryngek-tomiê w Katedrze i Klinice Otolaryngologii i OnkologiiLaryngologicznej CM UMK, Szpitala Klinicznego nr 1 im.dr. A. Jurasza w Bydgoszczy. Wiek pacjentów waha³ siêod 44 do 77 lat, tj. u mê¿czyzn od 44 do 77 lat (�redniawieku: 57 lat), a u kobiet od 50 do 69 lat (�rednia wieku:60 lat). Na badania otrzymano zgodê lokalnej KomisjiBioetycznej.

W zgromadzonym materiale rozpoznano raka p³a-skonab³onkowego krtani, co zosta³o zweryfikowane po-przez dwukrotn¹ ocenê materia³u tkankowego przepro-wadzon¹ przez dwóch lekarzy patologów. Ustalono stop-nieñ z³o�liwo�ci histologicznej. Stopieñ G3 zdiagnozo-wano u 2 pacjentów, G2 u 32, a G1 u 3 pacjentów.

Dokonano oceny klinicznego stopnia zaawansowa-nia procesu nowotworowego zgodnie z klasyfikacj¹ TNM(wg IUAC). Dwóch pacjentów zakwalifikowano do sta-dium T2, 24 pacjentów do T3, a 11 pacjentów do T4. Udwudziestu pacjentów nie stwierdzono przerzutów dowêz³ów ch³onnych. Przerzuty do okolicznych wêz³ówch³onnych zdiagnozowano u 17 chorych (jedenastu cho-rych z N1, trzech w N2, trzech w N3). W analizowanejgrupie nie stwierdzono przerzutów odleg³ych.

Wszyscy pacjenci z grupy badanej palili papierosy.Dwudziestu o�miu pali³o do 20 papierosów dziennie, adziewiêciu ponad 20 papierosów dziennie. Ponadto 29chorych nadu¿ywa³o alkoholi wysokoprocentowych.

Materia³ tkankowy podzielono na nastêpuj¹ce gru-py badawcze: 1. grupê badan¹ stanowi³y wycinki tkan-kowe z rakiem p³askonab³onkowym: 60 wycinków tkan-kowych. 2. grupê kontroln¹ stanowi³ obszar prawid³owejb³ony �luzowej: 18 wycinków tkankowych.

trami, w procesie inwazji nowotworowej, mo¿e przyczyniæsiê do rozwoju terapii opartej na dzia³aniu przeciwinwazyj-nym, a poznanie mechanizmów interakcji dzia³ania okre-�lonych metaloproteinaz oraz ich inhibitorów mo¿e mieæistotny wp³yw na strategie terapeutyczne.

of interaction between several metalloproteinases andtheir inhibitors may have a significant impact on thera-peutic strategies in the future.

680 Przegl¹d Lekarski 2011 / 68 / 10 M. Bodnar i wsp.

Badanie immunohistochemicznePrzeprowadzono badania immunohistochemiczne

postêpuj¹c wg standardowej procedury opisanej wewcze�niejszych publikacjach [1].

Wykorzystano pierwszorzêdowe przeciwcia³a skie-rowane przeciwko TIMP-1; Dako, Denmark, klon VT7,1:50; TIMP-2, Abcam, klon 3A4, 1:50; TIMP-3, Abcam,klon Loop1, 1:500. Ocenê poziomu ekspresji wykonanostosuj¹c zasady oceny morfometrycznej. Do oceny po-ziomu ekspresji oznaczanych czynników zastosowanozmodyfikowan¹ skalê (0-15) wg Remmele-Stegner [21](tabela I).

Zbadano zgodno�æ poszczególnych zmiennych zrozk³adem normalnym wykorzystuj¹c test Ko³mogorowa-Smirnowa z poprawk¹ istotno�ci Lillieforsa oraz testemShapiro-Wilka. Jednorodno�æ wariancji oceniono zapomoc¹ testu Levene'a.

Rozk³ad uzyskanych wyników odbiega³ od rozk³a-du normalnego, dlatego analizê statystyczn¹ przepro-wadzono za pomoc¹ testów nieparametrycznych. Dooceny ró¿nic istotnych statystycznie, miêdzy dwoma gru-pami (uwzglêdniaj¹c lokalizacjê tj. w komórkach prawi-d³owego nab³onka versus komórkach nowotworu orazpod�cielisku [zrêbie] w prawid³owej b³onie �luzowej orazw utkaniu nowotworu), wykorzystano test nieparame-tryczny U Manna-Whitneya. Ocenê ekspresji oznacza-nych parametrów wzglêdem lokalizacji i obecno�ci lubnie, przerzutów do wêz³ów ch³onnych (cecha N) wyko-nano za pomoc¹ testu Kruskala-Wallisa. W celu porów-nañ statystycznych analizowanych zmiennych w niniej-szej pracy wykorzystano modu³ budowy i analizy drzewklasyfikacyjnych, z zastosowaniem testu zgodno�ci Chikwadrat. Za ró¿nicê istotn¹ statystycznie przyjêto war-to�ci p<0,05.

WynikiStwierdzono spadek przeciêtnych war-

to�ci ekspresji dla TIMP-1 oraz TIMP-2 za-równo w zrêbie jak i nowotworze u pacjen-tów pal¹cych powy¿ej 20 papierosów dzien-nie w porównaniu z grupa osób pal¹cychdo 20 papierosów dziennie. Natomiast prze-ciêtne warto�ci ekspresji TIMP-3 w obu gru-pach znajdowa³y siê na zbli¿onym poziomie.Najwy¿sze warto�ci ekspresji stwierdzonodla TIMP-3, natomiast najni¿sz¹ ekspresjêodnotowano dla TIMP-2 w obu analizowa-nych grupach. Jednak¿e ze wzglêdu na zbytdu¿¹ ró¿nicê w liczebno�ci poszczególnychgrup (uwzglêdniaj¹c liczbê wypalanychdziennie papierosów) nie przeprowadzonoanalizy statystycznej. W niniejszej pracyzwrócili�my uwagê na ocenê ekspresji ozna-czanych parametrów podczas procesu bio-logicznego, zw³aszcza interakcji pomiêdzynowotworem a pod�cieliskiem w raku krta-ni - nowotworze, którego patogeneza �ci-�le zwi¹zana jest z ekspozycj¹ na dym ty-toniowy.

Stwierdzono cytoplazmatyczn¹ ekspre-sjê oznaczanych parametrów (TIMP-1,TIMP-2, TIMP-3) w prawid³owym nab³onkuoraz otaczaj¹cym je utkaniu ³¹cznotkanko-wym (ekspresja obecna w komórkach na-cieku zapalnego). Stwierdzono cytoplazma-tyczn¹ ekspresjê oznaczanych bia³ek, od-powiednio w 91% (71/78) dla TIMP-1, 22%(17/78) TIMP-2, 100% (78/78) TIMP-3 przy-padków raka p³askonab³onkowego krtani.Zaobserwowano wy¿sz¹ ekspresjê ozna-czanych inhibitorów tkankowych w utkaniunowotworu, w porównaniu z pod�cieliskiem.Najwy¿sz¹ ekspresjê zarówno w nowotwo-rze jak i zrêbie stwierdzono dla TIMP-3 (od-powiednio: 8 i 6). Natomiast najni¿sz¹ eks-presjê stwierdzono w badaniu TIMP-2, wkomórkach nowotworu 0,5 i 0 w zrêbie no-wotworu (tabela II).

rtemarapynazcanzOanlortnokapurG anadabapurG æ�ontotsI

PanzcytsytatsajcazilakoL anaideM ajcazilakoL anaideM

1-PMITkeno³ban 01 rówtowon 4 *000,0

b¹rz 4 b¹rz 4 597,0

2-PMITkeno³ban 5 rówtowon 5,0 *000,0

b¹rz 0 b¹rz 0 *000,0

3-PMITkeno³ban 21 rówtowon 8 *000,0

b¹rz 9 b¹rz 6 *000,0

Tabela IIPorównanie poziomów ekspresji badanych antygenów pomiêdzy grup¹ kontroln¹ a badan¹ w nab³onku,nowotworze i zrêbie.Comparison of the expression levels of studied antigens between the control group and epithelium, tumor cells and

tumor stroma.

* ró¿nica istotna statystycznie

RÓWTOWON B¥RZ

0N 1N 2N 3Næ�ontotsI

:anzcytsytats3+N.sv0N

0N 1N 2N 3Næ�ontotsI

:anzcytsytats3+N.sv0N

1-PMIT 6 4 6 1 sn 6 4 5,1 1 50,0<p

2-PMIT 1 5,0 0 1 sn 0 0 0 1 sn

3-PMIT 8 8 7 01 sn 8 8 7 01 50,0<p

Tabela IIIWyniki analiz statystycznych ekspresji oznaczanych parametrów z uwzglêdnieniem obecno�ci lub brakuprzerzutów do wêz³ów ch³onnych za pomoc¹ testu Kruskala-Wallisa.The results of statistical analysis of expression of determined parameters including lymph node involvement using

Kruskal-Wallis test.

Rycina 1Ekspresja tkankowych inhibitorów metaloproteinaz w poszczególnych stopniach zajêcia wêz³ów ch³onnychw nowotworze.Expression of tissue inhibitors of matrix metalloproteinases in various degrees of lymph nodes involvement in the

tumor cells.

Porównuj¹c poziom ekspresji oznacza-nych antygenów w komórkach nab³onka gru-py kontrolnej i badanej, w analizie statystycz-nej stwierdzono istotne statystycznie ró¿ni-ce dla oznaczanych parametrów: TIMP-1,TIMP-2, TIMP-3. Oceniaj¹c poziom ekspre-sji badanych antygenów w zrêbie stwierdzo-no ró¿nice istotne statystycznie pomiêdzyekspresj¹ TIMP-2 i TIMP-3 pomiêdzy grup¹

kontroln¹ a grup¹ badan¹. Nie stwierdzonoró¿nic istotnych statystycznie w przypadkuporównania poziomów ekspresji TIMP-1 wzrêbie oraz kontroli grupy badanej. Ponad-to wykorzystuj¹c test nieparametryczny UManna-Whitneya stwierdzono ró¿nicê istot-n¹ statystycznie pomiêdzy ekspresj¹ TIMP-1, TIMP-2 oraz TIMP-3 w komórkach no-wotworu a pod�cieliskiem (p<0,05).

681Przegl¹d Lekarski 2011 / 68 / 10

Uwzglêdniaj¹c stopieñ zajêcia wêz³ówch³onnych, pacjentów podzielono na nastê-puj¹ce grupy: bez przerzutów do wêz³ówch³onnych (N0), z przerzutami do wêz³ówch³onnych (odpowiednio: N1, N2, N3) i prze-prowadzono analizê ró¿nic ekspresji bada-nych parametrów. Wykazano ró¿nice istot-ne statystycznie (test Kruskala-Wallisa) wpoziomach ekspresji TIMP-1 i TIMP-3 w zrê-bie zmiany pierwotnej porównuj¹c materia³od pacjentów z przerzutami lub bez prze-rzutów do wêz³ów ch³onnych. Natomiast dlapoziomów ekspresji TIMP-1, TIMP-2 TIMP-3 w nowotworze nie stwierdzono ró¿nic istot-nych statystycznie pomiêdzy pacjentami zN+ (³¹cznie N1-N3) lub bez przerzutów dowêz³ów ch³onnych

W wyniku analizy ekspresji oznacza-nych parametrów uwzglêdniaj¹cej stopieñzajêcia wêz³ów ch³onnych zaobserwowanow obrêbie pierwotnego nowotworu spadekekspresji TIMP-1 oraz TIMP-2 wraz ze wzro-stem stopnia zajêcia wêz³ów ch³onnych.Warto�ci TIMP-1 w nowotworze dla po-szczególnych grup wynosi³y odpowiednioN0 - 6, N1 - 4 i N3 - 1. Dla TIMP-2 w nowo-tworze wynosi³y: N0 - 1,0, N1 - 0,5 oraz N2- 0. Natomiast w przypadku ekspresji TIMP-3 stwierdzono wzrost warto�ci ekspresjioznaczanego parametru, porównuj¹c pa-cjentów bez przerzutów do wêz³ów ch³on-nych N0 - 8 i pacjentów w stopniu N3 - 10(rycina 1).

Ponadto w zrêbie nowotworu zaobser-wowano spadek ekspresji TIMP-1 u pacjen-tów, u których stwierdzono przerzuty dowêz³ów ch³onnych (N1 - 4, N2 - 1,5, N3 - 1)w porównaniu z ekspresj¹ oznaczanegoenzymu w stadium N0 - 6. Podobn¹ tenden-cjê stwierdzono analizuj¹c poziom ekspre-sji TIMP-3. U pacjentów, u których niestwierdzono przerzutów do wêz³ów ch³on-nych, przeciêtne warto�ci ekspresji TIMP-3by³y wy¿sze (N0 - 6) w porównaniu z eks-

presj¹ tego antygenu u pacjentów z przerzu-tami do wêz³ów ch³onnych (N2 - 4, N3 - 4)(rycina 2).

DyskusjaTransformacja nowotworowa jest proce-

sem z³o¿onym i wieloetapowym.Z biologicznego punktu widzenia �natu-

ralna historia nowotworu� rozpoczyna siêpojawieniem pierwotnego ogniska guza.Nastêpnie obserwujemy miejscowy wzrostguza. Natomiast kluczowym etapem w pro-cesie dalszego rozwoju jest uwolnienie ko-mórek nowotworowych z pierwotnego utka-nia guza. Rozwój tego stadium uzale¿nionyjest od nabycia przez komórki nowotworo-we tzw. �fenotypu inwazyjnego�. Zjawisko tow konsekwencji determinuje zdolno�æ ko-mórek nowotworowych do naciekania ota-czaj¹cych tkanek i ostatecznie daje mo¿li-wo�æ tworzenia przerzutów. Inwazja komó-rek nowotworowych do pod�cieliska stajesiê mo¿liwa dziêki zdolno�ci do degradacjib³on podstawnych, które stanowi¹ podsta-wow¹ barierê chroni¹c¹ przed ekspansj¹ ko-mórek guza. Powstawanie przerzutów od-leg³ych w ró¿nych narz¹dach jest wynikiemzró¿nicowanych interakcji pomiêdzy komór-kami nowotworowymi a nowym mikro�rodo-wiskiem [9].

Proces inwazji nowotworowej zwi¹zanyjest g³ównie z degradacj¹ macierzy zewn¹-trzkomórkowej (ECM) otaczaj¹cej nowotwór[13]. Doniesienia licznych autorów wskazu-j¹ na ekspresjê MMPs w ró¿nych typachnowotworów z³o�liwych, w tym tak¿e w ra-kach p³askonab³onkowych obszaru g³owy iszyi [5]. W niniejszej pracy dokonano szcze-gó³owej oceny ekspresji poszczególnychparametrów zarówno w komórkach raka p³a-skonab³onkowego krtani, jak i w pod�cieli-sku nowotworu. Zrozumienie oraz poznaniewielostronnych interakcji zachodz¹cych po-miêdzy utkaniem guza a jego pod�cieliskiem

oraz wskazanie dominuj¹cych zale¿no�cipomiêdzy guzem a pod�cieliskiem umo¿li-wi³oby lepsze poznanie biologii nowotworu.

Do jednych z g³ównych enzymów prote-olitycznych zaanga¿owanych w proces de-gradacji pod�cieliska nowotworu, a przedewszystkim proteolizy sk³adników b³on pod-stawnych (kolagenu typu IV), nale¿¹ meta-loproteinazy zaliczane do grupy ¿elatynaz:¿elatynaza-A (MMP-2) oraz ¿elatynaza-B(MMP-9) [15]. Wydzielane s¹ w postaci nie-aktywnych form, tzw. zymogenów, a ich ak-tywacja regulowana jest na kilku poziomach,tj. zarówno na poziomie transkrypcji, jak ina poziomie posttranslacyjnym. Na pozio-mie posttranslacyjnym aktywno�æ wyszcze-gólnionych enzymów proteolitycznych kon-trolowana jest w macierzy zewn¹trzkomór-kowej, poprzez koordynowanie aktywacji iwydzielania proenzymów oraz interakcji ak-tywnych form enzymów proteolitycznych zich inhibitorami [8,15]. Do najwa¿niejszychnale¿¹ TIMP-1 oraz TIMP-2. £¹cz¹ siê onew stosunku stechiometrycznym (1:1). Po-nadto ¿elatynazy (zarówno MMP-2, jak iMMP-9) s¹ jedynymi enzymami proteolitycz-nymi w�ród wszystkich MMPs, które wyka-zuj¹ zdolno�æ do interakcji z odpowiednimidla nich inhibitorami zarówno w formie ak-tywnej, jak i w postaci zymogenów [5,15].

W warunkach fizjologicznych aktywno�æi ilo�æ MMPs regulowana jest poprzez en-dogenne inhibitory metaloproteinaz (TIMP).Dotychczas znane s¹ cztery TIMP, odpo-wiednio: TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3, TIMP-4.Tkankowe inhibitory metaloproteinaz tak¿es¹ zaanga¿owane w degradacjê macierzyzewn¹trzkomórkowej poprzez zdolno�æ doeliminacji MMPs oraz zdolno�æ do hamo-wania aktywacji tych enzymów. Tworz¹ wi¹-zania zarówno z formami aktywnymi jak ilatentnymi MMPs powoduj¹c zablokowaniemo¿liwo�ci od³¹czenia koñca N-terminalne-go okre�lonych metaloproteinaz, co unie-mo¿liwia ich aktywacjê. Biologiczna funkcjatkankowych inhibitorów metaloproteinaz jestró¿norodna.

Z jednej strony odpowiedzialne s¹ zazahamowanie syntezy oraz aktywno�ci en-zymów proteolitycznych, natomiast z drugiejstrony wykazuj¹ w³a�ciwo�ci antyapopto-tyczne oraz proproliferacyjne [30]. G³ówn¹funkcj¹ TIMPs, oprócz zdolno�ci do hamo-wania aktywno�ci MMPs, jest tak¿e zdol-no�æ do stymulowania wzrostu nowotworów.Stwierdzono, ¿e TIMPs bior¹ udzia³ zarów-no w procesach degradacji, jak i syntezymacierzy pozakomórkowej reguluj¹c oba teprocesy.W wyniku nadmiernego wydziela-nia MMPs, m.in. przez komórki nowotworo-we, dochodzi do zwiêkszonego wydzielaniaTIMP. Ponadto w przebiegu procesu nowo-tworowego wzrost syntezy MMPs, zarównow komórkach guza jak i pod�cielisku nowo-tworu, zwi¹zany jest ze zwiêkszon¹ syntez¹inhibitorów metaloproteinaz. Nadmierna syn-teza MMPs, w porównaniu do syntezy inhibi-torów tkankowych, powoduje nasilenie pro-cesów degradacyjnych, co z kolei powodujezwiêkszon¹ migracjê komórek guza [30].

Wed³ug niektórych autorów TIMP-1 wy-dzielany jest g³ównie przez komórki zrêbu,natomiast TIMP-2 zarówno przez pod�cie-lisko jak i komórki nowotworowe [17,27,29].Ponadto w badaniach innych autorów, opie-

Rycina 2Ekspresja tkankowych inhibitorów metaloproteinaz w poszczególnych stopniach zajêcia wêz³ów ch³onnychw zrêbie.Expression of tissue inhibitors of matrix metalloproteinases in various degrees of lymph nodes involvement in tumor

stroma.

682 Przegl¹d Lekarski 2011 / 68 / 10 M. Bodnar i wsp.

raj¹c siê na badaniach immunohistoche-micznych, wykazano, ¿e ekspresja tych pa-rametrów by³a wy¿sza w porównaniu z eks-presj¹ ¿elatynaz, co mo¿e sugerowaæ ichaktywno�æ hamujac¹ w stosunku do enzy-mów proteolitycznych [5].

W niniejszej pracy wykazano niewielkieró¿nice w ekspresji MMP-2 i MMP-9 a od-powiadaj¹cym im inhibitorom w utkaniu guza(dane niepublikowane). Zaobserwowanonatomiast znacznie wy¿sze warto�ci ekspre-sji MMP-2 w zrêbie nowotworu w porówna-niu z ekspresj¹ TIMP-2 w tej samej lokali-zacji. Ponadto wykazano zale¿no�æ pomiê-dzy ekspresj¹ MMP-9 a TIMP-1 (dane nie-publikowane).

Ocena lokalizacji tkankowych inhibito-rów metaloproteinaz pozostaje wci¹¿ nieroz-strzygniêta. Istniej¹ doniesienia stwierdza-j¹ce, ¿e ekspresja TIMP-1, TIMP-2 zacho-dzi wy³¹cznie na powierzchni komórek no-wotworowych [18]. Natomiast wyniki badañSutinena i wsp. [27] oraz innych autorów [29]wskazuj¹ na ekspresjê TIMP-2 w zlokalizo-wanych bezpo�rednio przy utkaniu guzakomórkach zrêbu. W wyniku badañ przed-stawionych w niniejszej pracy wykazanoekspresjê oznaczanych parametrów zarów-no w komórkach nowotworowych jak i wpod�cielisku nowotworu. Warto podkre�liæ,i¿ zaobserwowano wy¿sz¹ ekspresjê ozna-czanych inhibitorów tkankowych w utkaniunowotworu w porównaniu z otaczaj¹cym dopod�cieliskiem. W niniejszej pracy wykaza-no ekspresjê TIMP-1 w 91% przypadkówSCC i TIMP-2 w 22% przypadkach SCC,natomiast TIMP-3 w 100% badanych prób.Ponadto dla TIMP-3 odnotowano najwy¿sz¹ekspresjê zarówno w nowotworze jak i zrê-bie. Natomiast najni¿sze poziomy ekspresjistwierdzono w przypadku TIMP-2. Analizu-j¹c ekspresjê badanych czynników w pod-�cielisku, zaobserwowano zmniejszon¹ eks-presjê bezpo�rednio przy froncie nacieka-nia nowotworu (w fibroblastach), natomiastsiln¹ ekspresjê stwierdzono w nacieku za-palnym. Ponadto nie zaobserwowano eks-presji inhibitorów w pod�cielisku znajduj¹-cym siê wewn¹trz utkania nowotworu. W�wietle dostêpnych danych literaturowychjest to nowe stwierdzenie, które mo¿e czê-�ciowo t³umaczyæ zjawisko promocji nowo-tworu przez naciek zapalny. Dotychczasnaciek zapalny by³ traktowany jako silne �ró-d³o czynników wzrostowych wzmagaj¹cychproliferacjê komórek nowotworu. W �wietlewyników niniejszej pracy naciek zapalnywokó³ nowotworu, poprzez wydzielanie in-hibitorów enzymów degraduj¹cych pod�cie-lisko, jest tak¿e czynnikiem hamuj¹cym po-wstanie przerzutów. W aspekcie obrony or-ganizmu przed nowotworem (tumor-hostinteraction) w wiêkszo�ci dostêpnego pi-�miennictwa naciek zapalny jest opisywanyjako wyk³adnik immunologicznego �zwalcza-nia� komórek nowotworowych. Wyniki niniej-szych badañ wskazuj¹ na mo¿liwo�æ istnie-nia tak¿e innych mechanizmów obronnychprzed progresj¹ nowotworow¹. Christopo-ulos i wsp. [5] wykazali prawie dwukrotniewy¿sz¹ ekspresjê oznaczanych parametrów(TIMP) w tkance nowotworowej ni¿ w mate-riale kontrolnym. Zjawisko to wskazuje napewn¹ zale¿no�æ sugeruj¹c¹, i¿ wy¿sze stê-¿enia tkankowych inhibitorów w utkaniu

guza maj¹ za zadanie �przygotowaæ� tkan-kê do inwazji nowotworowej. Autorzy wska-zuj¹ na zdolno�æ syntezy TIMP-2 nie tylkoprzez komórki pod�cieliska, ale tak¿e przezkomórki nowotworowe, zw³aszcza w pó�-nych etapach rozwoju nowotworu [5].

Cytoplazmatyczn¹ ekspresjê tkankowe-go inhibitora-1 stwierdzono w wielu typachnowotworów m.in. w raku piersi [33], p³uc[34], ¿o³¹dka [25], a tak¿e w raku p³askona-b³onkowym krtani [8]. Badania Görötha i wsp.[8] wskazuj¹ na supresorowe w³a�ciwo�citkankowych inhibitorów metaloproteinaz(TIMP-1, TIMP-2) w stosunku do inwazji orazwzrostu nowotworu. Badania autorów wyka-za³y tak¿e, ¿e zwiêkszenie ekspresji na po-ziomie transkrypcyjnym inhibitorów TIMP-1i TIMP-2 w konsekwencji prowadzi dozmniejszenia aktywno�ci enzymatycznejMMPs, podlegaj¹cych regulacji okre�lonyminhibitorom. Ponadto badania Sato i wsp.[22-24] wykaza³y, ¿e w wyniku aktywacjiMMPs, dochodzi jednocze�nie do syntezytkankowych inhibitorów metaloproteinazprzez komórki zrêbu. Immunohistochemicz-na analiza ekspresji TIMP-3, przeprowadzo-na przez Miyazaki i wsp. wykaza³a ekspre-sjê oznaczanego parametru w utkaniu no-wotworu, zaznaczaj¹c jej brak przy �froncienaciekania� guza. Ci sami autorzy stwierdziliobni¿on¹ ekspresjê w centralnej czê�ci,wskazuj¹c na wzrost ekspresji TIMP-3 wzewnêtrznej czê�ci utkania nowotworu [14].Znamienn¹ korelacjê spadku ekspresjiTIMP-3 z nasileniem stopnia inwazji orazobecno�ci¹ przerzutów do wêz³ów ch³on-nych, potwierdzaj¹ nasze obserwacje. Ana-liza ekspresji TIMP-3 wykaza³a spadek �red-nich warto�ci TIMP-3 w pod�cielisku oraz wkomórkach nowotworowych w stadium N2w stosunku do N0. Natomiast w N3 odnoto-wano wzrost ekspresji tego inhibitora. Po-nadto liczni autorzy podkre�lili znaczenieprognostyczne TIMP-3, wskazuj¹c, i¿ pa-cjenci, u których obserwowano spadek eks-presji tkankowego inhibitora-3 charakteryzo-wali siê krótszym czasem prze¿ycia, w po-równaniu z pacjentami z wy¿sz¹ ekspre-sj¹ TIMP-3. Badania te sugeruj¹ znaczenieTIMP-3 jako czynnika wykazuj¹cego w³a�ci-wo�ci supresorowe w stosunku do wzrostunowotworów oraz procesu angiogenezy[20,26].

Na podstawie przedstawionej powy¿ejdyskusji mo¿na wysun¹æ hipotezê, ¿e w ró¿-nych typach raków p³askonab³onkowychobszaru g³owy i szyi, istniej¹ zró¿nicowanemechanizmy zwi¹zane z procesem transfor-macji nowotworowej uzale¿nione od MMPsi ich inhibitorów.

Utrzymanie równowagi miêdzy aktywno-�ci¹ enzymów proteolitycznych i ich inhibi-torów odgrywa istotn¹ rolê w utrzymaniu pra-wid³owej struktury tkanek oraz zapobiegadegradacji sk³adników macierzy zewn¹trzko-mórkowej. Nadmierna ekspresja enzymówproteolitycznych oraz brak aktywno�ci odpo-wiednich inhibitorów prowadzi do destabili-zacji równowagi pomiêdzy okre�lonymi bia³-kami, co w konsekwencji u³atwia migracjêkomórek nowotworowych. Natomiast nade-kspresja tkankowych inhibitorów metalopro-teinaz w stosunku do enzymów proteolitycz-nych prowadzi do zahamowania migracjikomórek oraz tworzenia przerzutów odle-

g³ych [15]. Rozwój wiedzy dotycz¹cej rolimetaloproteinaz oraz ich inhibitorów, pod-kre�la znaczenie szlaków aktywacji MMP-2 i MMP-9 [3,6,28]. Ponadto ocena wza-jemnych interakcji pomiêdzy wyszczegól-nionymi parametrami, w procesie inwazjinowotworowej, mo¿e przyczyniæ siê do roz-woju terapii opartej na dzia³aniu przeciwin-wazyjnym, a poznanie mechanizmów inte-rakcji dzia³ania okre�lonych metaloprote-inaz oraz ich inhibitorów mo¿e mieæ istotnywp³yw na strategie terapeutyczne.

Pi�miennictwo1. Bodnar M, Rekwirowicz H, Burduk P. i wsp.: Im-

pact of tobacco smoking on biologic background oflaryngeal squamous cell carcinoma. Przegl. Lek.2009, 66, 598.

2. Bieñ S., Kamiñski B., ¯y³ka S. i wsp.: Ewolucjaobrazu epidemiologicznego i klinicznego raka krtanii krtaniowej czê�ci gard³a w Polsce w latach 1991-2001. Otolaryngol. Pol. 2005, 59, 169.

3. Birkedal-Hansen B., Pavelic Z.P., Gluckman J.L.et al.: MMP and TIMP gene expression in head andneck squamous cell carcinomas and adjacent tis-sues. Oral Dis. 2000, 6, 376.

4. Blavier L., Henriet P., Imren S. et al.: Tissue inhibi-tors of matrix metalloproteinases in cancer. Ann. NY Acad. Sci. 1999, 878, 108.

5. Christopoulos T.A., Papageorgakopoulou N.,Ravazoula P. et al.: Expression of metallo-proteinases and their tissue inhibitors in squamouscell laryngeal carcinoma. Oncol. Rep. 2007, 18, 855.

6. Clark I.M., Swingler T.E., Young D.A.: Acetylationin the regulation of metalloproteinase and tissue in-hibitor of metalloproteinases gene expression. FrontBiosci. 2007, 12, 528.

7. Egeblad M., Werb Z.: New functions for the matrixmetalloproteinases in cancer progression. Nat. Rev.Cancer. 2002, 2, 161.

8. Göröth T., Beier U.H., Bäumken J. et al.: Metallo-proteinases and their inhibitors: influence on tumorinvasiveness and metastasis formation in head andneck squamous cell carcinomas. Head Neck. 2006,28, 31.

9. Gupta G.P., Massagué J.: Cancer metastasis: build-ing a framework. Cell. 2006, 127, 679.

10. Hunter K.W.: Host genetics and tumor metasta-sis. Br. J. Cancer 2004, 90, 752.

11. Jodele S., Blavier L., Yoon J.M. et al.: Modifyingthe soil to affect the seed: role of stromal-derivedmatrix metalloproteinases in cancer progression.Cancer Metastasis Rev. 2006, 25, 35.

12. Kalluri R., Zeisberg M.: Fibroblasts in cancer. Nat.Rev. Cancer 2006, 6, 392.

13. McAllister S.S., Wienberg R.A.: Tumor-host inter-actions: a far-reaching relationship. J. Clin. Oncol.2010, 28, 4022.

14. Miyazaki T., Kato H., Nakajima M. et al.: An immu-nohistochemical study of TIMP-3 expression inoesophageal cell carcinoma. Br. J. Cancer. 2004,91, 1556.

15. Murphy G., Nagase H.: Progress in matrixmetalloproteinase research. Mol. Aspects Med.2008, 29, 290.

16. Nakopoulou L., Tsirmpa I., Alexandrou P. et al.:MMP-2 protein in invasive breast cancer and theimpact of MMP-2/TIMP-2 phenotype on overall sur-vival. Breast Cancer Res. Treat. 2003, 77, 145.

17. Oberg A., Höyhtyä M., Tavelin B. et al.: Limitedvalue of preoperative serum analyses of matrixmetalloproteinases (MMP-2, MMP-9) and tissue in-hibitors of matrix metalloproteinases (TIMP-1, TIMP-2) in colorectal cancer. Anticancer Res. 2000, 20,1085.

18. Ohashi K., Nemoto T., Nakamura K. et al.: In-creased expression of matrix metalloproteinase-7,and -9 and membrane type matrix metalloproteinasein esophageal squamous cell carcinoma. Cancer.2000, 88, 2201.

19. Oppenheimer S.B.: Cellular basis of cancer me-tastasis: A review of fundamentals and new ad-vances. Acta Histochem. 2006, 108, 327.

20. Qi J.H., Ebrahem Q., Moore N. et al.: A novel func-tion for tissue inhibitor of metalloproteinases-3(TIMP-3): inhibition of angiogenesis by blockage of

683Przegl¹d Lekarski 2011 / 68 / 10

VEGF binding to VEGF receptor-2. Nat. Med. 2003,9, 407.

21. Remmele W., Stegner H.E.: Vorschlag zureinheitlichen Definition eines immunoreactiven Score(IRS) für den Immunohistochemischen Ostrogen-rezeptor - Nachwies (ER-ICA) im Mammakar-zinomgewebe. Pathologe. 1987, 8, 138.

22. Sato H., Kida Y., Mai M. et al.: Expression of genesencoding type IV collagen-degrading metallo-proteinases and tissue inhibitors of metallo-proteinases in various human tumor cells. Oncogene1992, 7, 77.

23. Sato H., Takino T., Kinoshita T. et al.: Cell surfacebinding and activation of gelatynase A induced byexpression of membranr-type-1- matrix metallo-pro-teinase (MT1-MMP). FEBS Lett. 1996, 385, 238.

24. Sato H., Takino T., Okada Y. et al.: A matrixmetalloproteinase expressed on the surface of inva-sive tumor cells. Nature. 1994, 370, 61.

25. Shim K.N., Jung S.A., Joo Y.H. et al.: Clinical sig-

nificance of tissue levels of matrix metalloproteinasesand tissue inhibitors of metalloproteinases in gastriccancer. J. Gastroenterol. 2007, 42, 120.

26. Spurbeck W.W., Ng C.Y., Strom T.S. et al.: Enforcedexpression of tissue inhibitor of matrix metallo-pro-teinase-3 affects functional capillary morphogenesisand inhibits tumor growth in a murine tumor model.Blood. 2002, 100, 3361.

27. Sutinen M. Kainulainen T., Hurskainen T. et al.:Expression of matrix metalloproteinase (MMP-1 and-2) and their inhibitors (TIMP-1, -2, and -3) in orallichen planus, dysplasia, squamous cell carcinomaand lymph node metastasis. Br. J. Cancer. 1998, 77,2239.

28. Vihinen P., Käkäri V.M.: Matrix metalloproteinasesin cancer: prognostic markers and therapeutic tar-gets. Int. J. Cancer 2002, 99, 157.

29. Visscher W., Höyhtyä M., Ottosen S.K. et al.: En-hanced expression of tissue inhibitor of metalo-pro-teinase-2 (TIMP-2) in the stroma of breast carcinoma

correlates with tumor recurrence. Int. J. Cancer 1994,59, 339.

30. Visse R., Nagase H.: Matrix metalloproteinases andtissue inhibitors of metalloproteinases: structure,function, and biochemistry. Circ. Res. 2003, 92, 827.

31. Wang W., Goswami S., Sahai E. et al.: Tumor cellscaught in the act of invading: their strategy for en-hanced cell motility. Trends Cell Biol. 2005, 15, 138.

32. Wierzbicka M., Szyfter W., Bieñ S. i wsp.: Zaleceniadiagnostyczno-terapeutyczne dla wybranychnowotworów g³owy i szyi. Rak krtani. Wspó³cz. Onkol.2006, 5, 195.

33. Wu Z.S., Wu Q., Yang J.H. et al.: Prognostic signifi-cance of MMP-9 and TIMP-1 serum and tissue expres-sion in breast cancer. Int. J. Cancer. 2008, 122, 2050.

34. Ylisirnio S., Hoyhtya M., Turpeenniemi-HujanenT.: Serum matrix metalloproteinase-2, -9 and tissueinhibitors of metalloproteinase-1, -2 in lung cancer-TIMP-1 as prognostic marker. Anticancer Res. 2000,20, 1311.