1 JAK WYZNACZA SIĘ PARAMETRY WALIDACYJNE

1

1

GCB – Rodzinnie, Zakopane, 24-26.10.2007

Katedra Chemii AnalitycznejWydział Chemiczny

Politechnika Gdańskaul. G. Narutowicza 11/12

80-952 GDAŃSKe-mail: [email protected]

Dr inż. Piotr KONIECZKA

JAK WYZNACZA SIĘPARAMETRY WALIDACYJNE

Granica wykrywalności i granica oznaczalności

2


Limit detekcji

Limit wykrywalności

Wykrywalność

Granica detekcji

GRANICA WYKRYWALNOŚCI

Nazewnictwo

2

3


GW

DL (detection limit)

MDL (method detection limit)

ML (minimum limit)

LD

DTC

RDL (reliable detection limit)

LOD

Symbole

4


Określenie minimalnej zawartości analitu, dla której wartości sygnału można przypisać obecność analitu – granica wykrywalności.

Określenie minimalnej zawartości analitu, dla której wartości sygnału można przypisać ilość analitu – granica oznaczalności.

LODsygnał/szum = 3

LOQsygnał/szum = 10

sygnał

szum

Definicje

3

5


Stosunek sygnału do szumu (ang. Signal to Noise Ratio –S/N): wielkość bezwymiarowa, która określa stosunek sygnałuanalitycznego do średniego poziomu szumów tła dla określonejpróbki.

• jego wartość może służyć do określania wpływu poziomu szumu na względny błąd pomiaru,

• najbardziej praktyczną metodą jego wyznaczenia jest stosunek średniej arytmetycznej serii pomiarów dla próbek ślepych (bądźzawierających analit na bardzo niskim poziomie) do wartości odchylenia standardowego uzyskanego dla tej serii pomiarów,

Definicje

6


Granica wykrywalności (ang. Limit of Detection - LOD)najmniejsza ilość lub najmniejsze stężenie substancji (pierwiastka, jonu, związku) możliwe do wykrycia za pomocądanej procedury czy też techniki analitycznej z określonym prawdopodobieństwem.

• związana ściśle z określoną procedurą analityczną (wartość zależy zarówno od poziomu zawartości oznaczanego składnika, jak i obecności innych składników występujących w analizowanej próbce),

• najmniejsze stężenie analitu, przy którym istnieje pewność jego obecności w próbce,

• jej wartość charakteryzuje się wymiarem zawartości czy stężenia (takim jak oznaczany analit czyli np. µg/dm3),

• ściśle związana z poziomem szumów stosowanego urządzenia pomiarowego (najczęściej to trzykrotność tego poziomu szumów),

Definicje

4

7


Granica oznaczalności (ang. Limit of Quantification - LOQ):najmniejsza ilość lub najmniejsze stężenie substancji, możliwe do ilościowego oznaczenia za pomocą danej proceduryanalitycznej z założoną dokładnością i precyzją.

• jej wartość jest zawsze wielokrotnością wyznaczonej wartości granicy wykrywalności – najczęściej: LOQ = 3 · LOD,

• chociaż znane są takie definicje granicy oznaczalności, w których jej wartość jest równa 2 · LOD czy też 6 · LOD,

Definicje

8


poza zakresem liniowym

wysoka pewność

niska niepewność

wysoka niepewność

szumy

MB

LOD

LOQ

-3

0

-2-1

123456789

101112

Zaw

artość

anal

itu

[wyr

ażon

a w

kro

tno ś

ci o

dch

ylen

ia s

tan

dard

oweg

o –

s]

Granica wykrywalności a niepewność

5

9


Sposób wyznaczania wartości granicy wykrywalności zależy od następujących czynników:

• natury procedury analitycznej – (procedura manualna bądź teżprocedura oparta na wykorzystaniu odpowiedniego przyrządu pomiarowego),

• charakterystyki procedury instrumentalnej,

• możliwości uzyskania (sporządzenia) tzw. ślepych próbek,

Metody wyznaczania wartości granicy wykrywalności

10


W przypadku metody klasycznej (nieinstrumentalnej), dla której nie jest możliwe wyznaczenie poziomu szumów stosowanego urządzenia pomiarowego, stosuje się metodę szacowania poziomu granicy wykrywalności w oparciu o własne doświadczenia.

W oparciu o wyniki analizy próbek o znanej zawartości analitu (roztwory wzorcowe) oszacowuje się ten poziom stężenia, przy którym możliwe jest jego wykrycie.

Sposób ten można także stosować w przypadku metod instrumentalnych.

Oszacowanie wzrokowe

6

11


Może być stosowana jedynie w przypadku, gdy istnieje możliwość uzyskania linii bazowej szumów – otrzymanej gdy oznaczeniu końcowemu jest poddawana tzw. ślepa próbka, bądź też próbka zerowa.

Sposób obliczania:

• wyznaczyć wartość stosunku sygnału do szumu dla próbki ślepej (jeśli to jest możliwe) lub dla próbki o bardzo niskiej zawartości analitu,

• zastosować wprost definicję granicy wykrywalności.

Obliczanie na podstawie wartości stosunku sygnał/szum (S/N)

12


W przypadku np. metod chromatograficznych można wartośćLOD wyznaczyć na podstawie uzyskanego chromatogramu dla próbki ślepej.

W tym celu określa się poziom szumów – mierząc na chromatogramie zakres zmiany sygnału w pobliżu czasu retencji dla analitu (można przyjąć np. wartość zakresu czasu retencji jako tRanalitu ± 0,5 minuty).

Następnie tę wielkość mnoży się przez 3 i przelicza uzyskanąwartość sygnału na wartość stężenia.

Obliczanie na podstawie wartości stosunku sygnał/szum (S/N)

7

13


Sposób postępowania:

• przeprowadzić 10 niezależnych pomiarów dla 10 niezależnie przygotowanych ślepych próbek,

• obliczyć dla tak uzyskanych 10-ciu wyników wartośćśrednią oraz wartość odchylenia standardowego,

• wyznaczyć wartość granicy wykrywalności w oparciu o zależność:

Metoda bardziej pracochłonna jednak i zarazem metrologicznie bardziej poprawna.

sxLOD śr ⋅+= 3

Obliczanie na podstawie wyników oznaczeń dla próbek ślepych

14


Uzyskanie wartości liczbowej dla wartości średniej w praktyce jest rzadko możliwe - paradoksalnym wydaje się uzyskanie wyniku dla wartości, która z definicji powinna być poniżej wartości granicy oznaczalności.

Zastosowanie powyższego sposobu jest możliwe jedynie w przypadku, gdy poziom stężenia analitu jest mierzalny dla próby ślepej (poziom zawartości analitu w ślepej próbce jest co najmniej równy wartości granicy oznaczalności).


8

15


• wykonać 10 niezależnych oznaczeń dla próbek, w których poziom zawartości analitu jest bliski spodziewanej granicy wykrywalności (oczywiście próbki takie sporządzane sąpoprzez dodanie do próbek ślepych mierzalnych ilości analitu),

• obliczyć dla tak uzyskanych 10-ciu wyników wartośćśrednią oraz wartość odchylenia standardowego,

• wyznaczyć wartość granicy wykrywalności w oparciu o zależność:

sLOD ⋅+= 30


W przeciwnym przypadku stosować można modyfikację opisanej metody:

16


Kolejną modyfikacją tej metody jest opisany poniżej sposób:• sporządzić serię n próbek o zawartości analitu na poziomie

zbliżonym do spodziewanej wartości granicy wykrywalności (najdogodniej wzorce, w których matryca odpowiada swoim składem matrycy próbek rzeczywistych),

• wykonać analizę tak przygotowanych próbek otrzymując serię n wyników,

• obliczyć dla nich wartość średnią i wartość odchyleniastandardowego,

• wartość granicy wykrywalności obliczyć wg zależności:

sftLOD ⋅= ),(αgdzie: t – parametr testu t-Studenta,

f – liczba stopni swobody f = n -1,n – liczba niezależnych próbek,α – przyjęty poziom istotności,


9

17


Jeżeli przygotowane roztwory wzorcowe poddawane są przed oznaczeniem końcowym całej procedurze analitycznej tak wyznaczona wartość granicy wykrywalności stanowi granicęwykrywalności procedury analitycznej – MDL (methoddetection limit).

Jeżeli natomiast oznaczenia wykonywane są bezpośrednio w przygotowanych roztworach wzorcowych to w ten sposób wyznaczana jest wartość granicy wykrywalności urządzenia pomiarowego – IDL (instrument detection limit).


18


Polega na wykonaniu oznaczeń dla 3 poziomów stężeń analitu (bliskim spodziewanej wartości granicy wykrywalności).

Dla każdego poziomu zawartości analitu należy wykonać po co najmniej 6 oznaczeń, a następnie dla każdej z tak uzyskanych serii pomiarów obliczyć wartości odchyleń standardowych.

Z kolei wyznacza się zależność liniową wiążącą obliczone wartości odchylenia standardowego z wartościami stężeń:

wyraz wolny tej zależności to wartość so a wyznaczona na tej podstawie wartość granicy wykrywalności obliczana jest zgodnie ze wzorem:

)(cfs =

osLOD ⋅= 3

Obliczanie w oparciu o metodę graficzną

10

19


stężenie sygnał0,2 140,2 120,2 120,2 110,2 130,2 120,3 150,3 160,3 150,3 170,3 160,3 180,4 230,4 240,4 220,4 250,4 230,4 24

20


11

21


22


12

23


24


Najczęściej jednak, wykorzystywana procedura analityczna oparta jest, na etapie oznaczenia końcowego, o zasadę pomiaru pośredniego, czyli takiego dla którego wymagany jest dodatkowy etap procedury analitycznej – kalibracja.

W takim przypadku także i ten etap będzie miał wpływ na wartość granicy wykrywalności.

Obliczenie granicy wykrywalności oparte jest w tym przypadku o następującą zależność:

bsLOD ⋅

=3,3

gdzie: s – wartość odchylenia standardowego,b – współczynnik kierunkowy prostej kalibracyjnej,

Obliczanie na podstawie wartości odchylenia standardowego zbioru sygnałów i kąta nachylenia krzywej kalibracyjnej

13

25


Wartość odchylenia standardowego można w tym przypadku wyznaczyć w trojaki sposób:

1. odchylenie standardowe wyników uzyskanych dla serii próbek ślepych,

2. resztkowe odchylenie standardowe krzywej kalibracyjnej,

3. odchylenie standardowe wyrazu wolnego uzyskanej krzywej kalibracyjnej.


26


Ważnym jest fakt odpowiedniego doboru stężeń roztworów wzorcowych w celu wyznaczenia krzywej kalibracyjnej (wiadomo jest, że krzywa kalibracyjna ma zakres prostoliniowy w ściśle określonym przedziale stężeń i z całąpewnością jej przebieg ma inną charakterystykę dla poziomu zawartości w pobliżu granicy wykrywalności).


14

27


stężenie sygnał0,25 1100,25 1050,25 1040,25 1060,25 1080,35 1250,35 1280,35 1320,35 1300,35 1330,45 1520,45 1560,45 1570,45 1590,45 1600,55 1890,55 1900,55 1920,55 1970,55 1920,65 2150,65 2200,65 2170,65 2300,65 229

28


15

29


30


16

31


Sposób postępowania:• wykonać pomiary dla roztworów wzorcowych (wzorce

matrycowe) na co najmniej 5 poziomach stężeń,• wykonać po 6 równoległych pomiarów dla każdego z

roztworów wzorcowych,• dla każdego z poziomu stężeń obliczyć wartość

współczynnika zmienności – CV,• wykreślić wykres zależności: CV = f(c),• określić wartość wymaganej precyzji dla granicy

oznaczalności (zwykle CV = 10%) i dla tej wartości odczytać z wykresu wartość stężenia równego granicy oznaczalności,

• granicę wykrywalności obliczyć jako:

3LOQLOD=

Obliczanie na podstawie wartości granicy oznaczalności

32


c [np.: mg/dm3]

założona wartośćprecyzji

np.: CV =10%

CV [%]

odczytana wartość LOQ


17

33


stężenie sygnał0,25 450,25 510,25 530,25 420,25 440,5 870,5 820,5 920,5 950,5 98

0,85 1240,85 1340,85 1260,85 1270,85 1301,25 1891,25 1901,25 1921,25 1971,25 1922,1 3132,1 3242,1 3232,1 3202,1 317

34


18

35


36


19

37


• metoda szybka,• stosowana jedynie w

przypadku pomiarów instrumentalnych – istnieje możliwość wyznaczenia stosunku sygnał/szum,

próbka o znanej zawartości analitu (roztwór wzorcowy lub wzorzec matrycowy),

Obliczanie na podstawie stosunku sygnał/szum

• metoda szybka,• metoda szacunkowa,• stosowana przeważnie w

przypadku klasycznych (nieistrumentalnych) metod analitycznych,

• wymagane doświadczenie analityczne,

próbka o znanej zawartości analitu (roztwór wzorcowy lub wzorzec matrycowy),

Oszacowanie wzrokowe

Wady/zaletyWymaganiaMetoda obliczania wartości granicy wykrywalności

Metody obliczania granicy wykrywalności –wymagania, wady i zalety

38


• metoda dość szybka,• uwzględnia się wpływ etapu

kalibracji na wartość LOD,

seria próbek wzorcowych –3 poziomy stężeń,wykonanie po co najmniej 6 pomiarów dla każdej z próbek wzorcowych,

Obliczanie w oparciu o metodę graficzną

• metoda praco- i czasochłonna,• nie uwzględnia wpływu

kalibracji na wartość LOD,• wykorzystuje się parametr

prawdopodobieństwa w wyznaczeniu LOD,

seria próbek ślepych lub o znanej zawartości analitu (roztwór wzorcowy lub wzorzec matrycowy),




20

39


• metoda praco- i czasochłonna,

• uwzględnia się wpływ etapu kalibracji na wartość LOD,

• „umotywowana”metrologicznie,

seria próbek ślepych lub o znanej zawartości analitu (roztwór wzorcowy lub wzorzec matrycowy),roztwory wzorcowe do sporządzenia krzywej kalibracyjnej,

Obliczanie na podstawie wartości odchylenia standardowego sygnałów i kąta nachylenia krzywej kalibracyjnej

• metoda pośrednia – LODobliczone na podstawie wyznaczonej LOQ,

• wartość LOD (LOQ) powiązana z założonąprecyzją pomiarów,

seria roztworów wzorcowych,założona wartośćwspółczynnika zmienności dla granicy oznaczalności,




40


Do obliczania wartości granicy wykrywalności stosuje się roztwory wzorcowe. Powinny one charakteryzować się, w przypadku obliczania granicy wykrywalności dla procedury analitycznej (MDL), dwiema podstawowymi cechami:• jak najbardziej zbliżony skład matrycy do składu matrycy dla

próbek rzeczywistych,

• stężenie analitu na poziomie zbliżonym do spodziewanej wartości granicy wykrywalności,

Wartość odchylenia standardowego ściśle zależy od poziomu zawartości oznaczanego składnika.

Może się zdarzyć, iż stosowane stężenia dla próbek wzorcowych znacznie przewyższają obliczoną wartość granicy wykrywalności.

Sposoby sprawdzania poprawności wyznaczonej wartości granicy wykrywalności

21

41


W celu sprawdzenia poprawności wyliczonej wartości granicy wykrywalności należy sprawdzić następujące zależności:

10 · MDL > cmin

MDL < cmin

gdzie: cmin – stężenie analitu w próbkach roztworu wzorcowego o najniższym stężeniu,

Nie spełnienie pierwszej z zależności oznacza, iż stężenie w przygotowanych roztworach wzorcowych jest za wysokie i należy przeprowadzić obliczenia wartości granicy wykrywalności dla nowo przygotowanych roztworów wzorcowych o niższym stężeniu.

Odwrotnie, nie spełnienie drugiej zależności oznacza, że stężenie analitu w przygotowanych roztworach wzorcowych jest za niskie, należy przeprowadzić ponowne pomiary i obliczenia stosując roztwory wzorcowe o wyższej zawartości analitu.


42


Sprawdzenie poprawności wartości stężenia w oparciu, o które wyznaczano wartość granicy wykrywalności można także przeprowadzić szacując wartość stosunku sygnału do szumu na podstawie zależności:

sx

NS śr=

Zgodnie z definicją granicy wykrywalności wartość tego stosunku powinna mieścić się w przedziale 3 do 10.

W przypadku gdy obliczona wartość jest wyższa, wartośćstężenia roztworu wzorcowego jest zbyt wysoka i należałoby przeprowadzić ponowne pomiary dla niższych stężeńzawartości analitu w próbkach roztworów wzorcowych.


22

43


Należy również zwrócić uwagę, w trakcie pomiarów dla roztworów wzorcowych, na wartość tzw. odzysku metody analitycznej.

Obliczyć ją można na podstawie zależności:

% 100⋅=cxR śr

Zbyt niska wartość tego parametru wpływa na niedoszacowanie obliczonej wartości granicy wykrywalności.

R powinno zawierać się w przedziale 80-120%


44


Opisane metody sprawdzania poprawności wyliczonej wartości granicy wykrywalności mogą być stosowane jedynie w przypadku, gdy pomiary są wykonywane z wykorzystaniem sporządzonych roztworów wzorcowych.


23

45


Podstawowym kryterium sprawdzającym wartośćwyznaczonej granicy wykrywalności jest spełnienie wymogów stawianych danej procedurze analitycznej.


46


Wartość stężeniax ≥ LOQWykryto, nie oznaczonoLOD ≤ x < LOQNie wykrytox < LOD

Zapisanie wynikuWartość wynikux

Poprawne podawanie wartości wyników pomiarów w pobliżu granicy wykrywalności i oznaczalności

24

47


Wybór odpowiedniej metody wyznaczania granicy wykrywalności zależy od celu jakiemu ma ona służyć jak i wymogów danej procedury analitycznej. W przypadku walidacji procedury analitycznej zalecanym jest wykorzystanie metody, która w swych założeniach opiera się o metrologię chemiczną – wartość wyznaczonej granicy wykrywalności jest związana z parametrami statystycznymi takimi jak poziom prawdopodobieństwa, liczba stopni swobody. W przypadku pomiarów jednostkowych, gdy wymagane jest jedynie oszacowanie wartości LOD wskazanym jest stosowanie metod mniej czasochłonnych.

PODSUMOWANIE

48


Przy podawaniu wartości LOD należy podać również opis i parametry metody jaka została wykorzystana przy jej obliczaniu.

PODSUMOWANIE

25

49


1 JAK WYZNACZA SIĘ PARAMETRY WALIDACYJNE

Documents

Transcript of 1 JAK WYZNACZA SIĘ PARAMETRY WALIDACYJNE