Mikroskopia fluorescencyjna

Mikroskop fluorescencyjny

to mikroskop świetlny, wykorzystujący zjawisko fluorescencji

większość z nich to mikroskopy tzw. epi-fluorescencyjne

zjawisko fotoluminescencji: fluorescencja i fosforescencja

BARWNIKI

Struktura, którą chcemy uwidocznić

Źródło wzbudzające

Emitują głównie światło widzialne

Barwa emitowanego światła zależy od substancji fluoryzującej

Fluoresceina

Rodamina

DAPI (4’,6- diamydino-2-fenyloindol)

Oranż akrydynowy

+ przeciwciała fluoryzujące

Budowa mikroskopu fluorescencyjnego

Rys. 1. Schemat mikroskopu fluorescencyjnego źródło: http://bioinfo.mol.uj.edu.pl/articles/Kaluzny05

Rys. 2. Mikroskop fluorescencyjny Źródło: http://www.e-biotechnologia.pl/Artykuly/Fluorescencyjna-hybrydyzacja-in-situ/

Źródło: http://www2.chemia.uj.edu.pl/chemia_konserwatorska/materialy/Techniki%20mikroskopowe1.pdf

Elementy mikroskopu fluorescencyjnego • Źródło światła – żarówka emitująca promieniowanie UV

• Zestaw filtrów:

o Filtr wzbudzenia – przepuszcza światło o pożądanej długości fali

o Filtr barierowy (supresyjny) – przepuszcza jedynie widzialną część widma, pochłania ultrafiolet

• Lusterko dichroiczne – rozdziela ścieżki wzbudzenia i emisji

• Obiektyw – skupia światło wzbudzające na preparacie, wysoka apertura numeryczna

Zasada działania mikroskopu fluorescencyjnego

• Zjawisko fluorescencji – powstawanie światła widzialnego w wyniku naświetlania obiektu promieniami ultrafioletowymi, niebieskimi lub zielonymi

• Próbka może wykazywać zdolność do naturalnej fluorescencji lub może być wyznakowana barwnikami fluorescencyjnymi

• Uzyskiwany obraz jest negatywem obrazu z typowego mikroskopu świetlnego: na ciemnym tle uwidaczniają się świecące struktury.

Źródło: http://pl.wikipedia.org/w/index.php?title=Plik:Yeast_membrane_proteins.jpg&filetimestamp=20090113144047

Źródło: http://micro.magnet.fsu.edu/primer/lightandcolor/fluorointroduction.html

Oświetlenie w mikroskopii fluorescencyjnej

W mikroskopach fluorescencyjnych można stosować dwa sposoby oświetlania preparatu: • system diailuminacji - odpowiada przebiegowi wiązki oświetlającej w normalnym mikroskopie optycznym, • system epiiluminacji - standardowy w nowoczesnych mikroskopach, w których promienie przechodzą przez obiektyw i padają na preparat z góry, światło emitowane przez preparat przechodzi z powrotem przez ten sam obiektyw. W tym przypadku wiązka wzbudzająca po przejściu przez preparat ulega rozproszeniu i poza nielicznymi promieniami odbitymi nie wpada do obiektywu, a obraz tworzony jest wyłącznie przez promienie widzialnego zakresu widma emitowane na drodze fluorescencji. Taki sposób oświetlenia preparatu polepsza jakość obrazu i zmniejsza narażenie żywych komórek na kontakt ze szkodliwym ultrafioletem.

Stosując odpowiedni zestaw filtrów można uzyskać efekt ciemnego pola. We współczesnych mikroskopach fluorescencyjnych najczęściej światło wzbudzające kierowane jest na preparat poprzez obiektyw. Światło emitowane z preparatu zbierane jest przez obiektyw i po przejściu przez zestaw filtrów kierowane jest do okularu. W starszych konstrukcjach stosowano układ optyczny podobny do układu wywołującego efekt ciemnego pola w mikroskopach świetlnych. Obecnie stosowany system wzbudzenia (obiektyw skupia światło wzbudzające na preparacie) pozwala uzyskać duże lokalne natężenia światła wzbudzającego przy niewielkiej mocy źródła.

Źródło: http://www.pg.gda.pl/chem/Katedry/Leki_Biochemia/dydaktyka/biofizyka/cz4.pdf

Mikroskopia fluorescencyjna całkowitego wewnętrznego odbicia

Powstała jako modyfikacja klasycznej mikroskopii fluorescencyjnej i stała się szczególnie użyteczna w badaniu zjawisk zachodzących bezpośrednio pod i na powierzchni komórek.

Polega ona na oświetleniu próbki światłem wzbudzającym, jednak pod takim kątem (kąt graniczny), aby padające światło uległo całkowitemu wewnętrznemu odbiciu przed wejściem do próbki: • w szkiełku nakrywającym próbkę (typu epi-), • w kwarcowym pryzmacie (typu trans-).

Zjawisku całkowitego wewnętrznego odbicia towarzyszy powstanie fali zanikającej (wiąże się to z różnicą między współczynnikiem załamania światła szkła, czyli kwarcu i wody, czyli próbki – współczynnik ten dla szkła (kwarcu) jest większy), która nie ulega odbiciu, ale penetruje środowisko (próbkę) po drugiej stronie szkiełka lub pryzmatu. Czyni to jednak tylko na pewną określoną głębokość (fala ta zanika wykładniczo wraz z odległością), co w praktyce oznacza zwykle około 100-250 nm. W tym obszarze głębokości próbki, fala ta może wzbudzić obecne w próbce fluorofory, a one zaczną emitować światło (co ważne, fala zanikająca ma tę samą długość co fala która uległa odbiciu). To emitowane światło jest następnie odbierane przez obiektyw, przepuszczane przez odpowiednie filtry i przetwarzane jak w klasycznym mikroskopie fluorescencyjnym. W ten sposób w TIRFM następuje bardzo selektywna wizualizacja obszarów położonych zaraz pod szkiełkiem lub pryzmatem, ponieważ obszar wzbudzenia powstaje tylko w zasięgu fali zanikającej, co znacznie ogranicza wpływ tła (wnętrza komórki), zwiększając rozdzielczość uzyskanych obrazów.

Rys. 2. Schemat zasady TIRFM w systemie epi- (światło pada i odbierane jest z tej samej strony próbki). Źródło:http://encyklopedia.eduteka.pl/wiki/Mikroskopia_fluorescencyjna_ca%C5%82kowitego_wewn%C4%99trznego_odbicia

1. Próbka 2. Zasięg fali zanikającej 3. Szkiełko nakrywkowe 4. Olejek immersyjny 5. Obiektyw 6. Promień emitowany (sygnał) 7. Promień wzbudzający

1. Obiektyw 2. Promień emitowany 3. Olejek immersyjny 4. Szkiełko nakrywkowe 5. Próbka 6. Zasięg fali zanikającej 7. Promień wzbudzający 8. Pryzmat kwarcowy

Rys. 3. Schemat zasady TIRFM w systemie trans- (światło pada i odbierane jest z różnych stron próbki). Źródło:http://encyklopedia.eduteka.pl/wiki/Mikroskopia_fluorescencyjna_ca%C5%82kowitego_wewn%C4%99trznego_odbicia

Zastosowania mikroskopii

fluorescencyjnej

Rys.3. Fibroblasty komórek naskórka jelenia

Nauki biologiczne

Rys.1. Trzy markery fluorescencyjne

Rys.2. Odmienne stężenie jonów wapnia w komórce Purkynie’go w móżdżku świnki morskiej

Rys.5. Oddziaływanie białko –białko ulegające apoptozie, badanie metodą FRET

Rys.4. Immunofluorescencja. Mikrotubule w komórkach nerki myszy

Diagnostyka chorób • Choroby genetyczne

• Diagnozowanie nowotworów

• Obrazowanie i identyfikacja komórek rakowych w badanym preparacie

Rys.6 i 7. Dyspersja światła przechodzącego przez zarażone tkanki. Rys.8. Potrójne barwienie w komórkach ludzkich.

Komórki nowotworu czerniaka

Kryształy antybiotyku ciprofloksacyny Mikrokapsułki alginianowe zawierające liposomy z ciprofloksacyną

Streptomyces coelicolor produkujący podjednostkę polimerazy DNA

Rys. Komórki śródbłonka tętnicy

Rys.6. Autofluorescencja chlorofilu

Rys.5. Móżdżek transgenicznej myszy

Rys.7. Neurony

Mikroskopy fluorescencyjne stały się ważnym narzędziem w biologii, stając się podstawą do rozwoju bardziej zaawansowanych technik mikroskopii fluorescencyjnej, takich jak: • TIRFM, • mikroskopia konfokalna, • mikroskopia dwufotonowa, • FLIC (Mikroskopia fluorescencyjna kontrastu interferencyjnego).

Dziękujemy za uwagę