Panel Chemia Środowiska

Pracownia Specjalizacyjna

Ćwiczenie 9

06.05.2016 (p.239, WCh ul. Ingardena 3)

Zastosowanie mikroskopii kąta Brewstera w badaniu

oddziaływań wybranych toksykantów z lipidowymi

monowarstwami na granicy faz roztwór wodny/powietrze.

dr Michał Flasiński

e-mail: flasinsk@chemia.uj.edu.pl

1. Zagadnienia teoretyczne

Monowarstwy Langmuira, klasyfikacja stanów monowarstw, surfaktanty - struktura

chemiczna i właściwości, podstawowe klasy lipidów błonowych, właściwości i funkcje lipidów

błon komórkowych, modelowe błony biologiczne, współczynnik załamania światła, kąt

Brewstera

2. Wstęp

Mikroskopia kąta Brewstera (BAM) stanowi obok mikroskopii fluorescencyjnej podstawową

technikę mikroskopową stosowaną w celu bezpośredniej wizualizacji monowarstw substancji

amfifilowych na granicy faz woda/powietrze. Historia techniki BAM sięga początku lat

dziewięćdziesiątych dwudziestego wieku, kiedy to pierwsze tego typu urządzenie zostało

skonstruowane w Laboratorium Fizyki Statystycznej Uniwersytetu w Paryżu (Rys. 1) [1].

Rys. 1. Pierwszy mikroskop kąta Brewstera. I - źródło światła (laser argonowy); Obj - układ

optyczny źródła światła, F - światłowód; C - kamera; Oc - okular; Mo - silnik; Trough - waga

Langmuira [1].

W przeciwieństwie do mikroskopii fluorescencyjnej obserwacja domen powierzchniowych

przy pomocy mikroskopu kąta Brewstera nie wymaga stosowania amfifilowych barwników

fluorescencyjnych, a tym samym ogranicza wpływ dodatkowej substancji na zachowanie

fazowe monowarstwy. Z tego względu technika BAM jest obecnie rutynowo stosowana w

celu uzupełnienia charakterystyki monowarstw Langmuira prowadzonej w oparciu o

rejestrowane izotermy ciśnienia powierzchniowego (π) w funkcji średniej powierzchni w

przeliczeniu na pojedynczą cząsteczkę w monowarstwie (A). Mikroskopia BAM dostarcza

informacji na temat przemian fazowych zachodzących w trakcie kompresji warstwy

powierzchniowej, a także podstawowych cech domen, takich jak wielkość, kształt oraz ich

gęstości powierzchniowej. Przy pomocy mikroskopii kąta Brewstera możliwa jest również

detekcja separacji fazowej oraz obserwowanie struktur trójwymiarowych związanych z

załamaniem (kolapsem) monowarstwy. Prowadząc analizę wewnętrznych tekstur domen

skondensowanych można również wnioskować na temat orientacji tworzących je cząsteczek

względem normalnej do granicy międzyfazowej.

Rys. 2. Nowoczesny mikroskop BAM firmy Accurion [2].

3. Podstawy metody

Mikroskopia kąta Brewstera jest jedną z podstawowych bezinwazyjnych technik

stosowanych w badaniu monowarstw utworzonych na powierzchni subfazy wodnej przez

nierozpuszczalne w wodzie substancje amfifilowe. Technika ta opiera się na zmianie

współczynnika załamania światła na granicy faz woda (roztwór wodny)/powietrze w wyniku

utworzenia na niej monowarstwy Langmuira.

a. Zasada działania mikroskopu BAM

Intensywność światła odbitego od oświetlanej powierzchni zależy od dwóch podstawowych

czynników: kąta padania światła oraz jego polaryzacji. W przypadku światła spolaryzowanego

w płaszczyźnie padania (polaryzacja p) istnieje kąt, zwany kątem Brewstera, dla którego

promieniowanie odbite od ostrej (tzw. fresnelowskiej) granicy międzyfazowej jest całkowicie

wygaszane (Rys. 3). Warto wspomnieć, że sytuacja ta odnosi się do idealnie ostrej,

pozbawionej szorstkości granicy pomiędzy dwoma przezroczystymi ośrodkami, pomiędzy

którymi współczynnik załamania światła zmienia się skokowo. Dla rzeczywistych granic

międzyfazowych, z uwagi na ich szorstkość, wywołaną przede wszystkim fluktuacjami

termicznymi, współczynnik załamania światła nie zmienia się skokowo, z tego względu

intensywność promieniowania odbitego nie jest wygaszona całkowicie, lecz osiąga minimum

(1,2·10-8) [1].

Rys. 3. Współczynnik odbicia (R) od ostrej granicy międzyfazowej w funkcji kąta padania dla

światła o polaryzacji p (w płaszczyźnie padania) oraz s (prostopadle do płaszczyzny padania)

[1]

Utworzenie monowarstwy surfaktantu na powierzchni wody powoduje wprowadzenie

dodatkowej cienkiej warstwy o współczynniku załamania światła innym niż dla powietrza i

wody, co powoduje zwiększenie intensywności promieniowania odbitego w wyniku

niewielkiej zmiany wartości kąta Brewstera. Na przykład utworzenie na granicy faz

woda/powietrze monowarstwy o grubości 10 Å i współczynniku załamania światła 1,4,

skutkuje około 35-krotnym zwiększeniem współczynnika odbicia. Intensywność

promieniowania odbitego jest zatem silnie zależna od właściwości granicy międzyfazowej. W

obecności monowarstwy zależy ona przede wszystkim od jej gęstości, grubości oraz

anizotropii, dlatego współistnienie na granicy międzyfazowej domen faz różniących się tymi

właściwościami może zostać zaobserwowane mikroskopem BAM. Dodatkowe użycie

analizatora umożliwia określenie polaryzacji promieniowania odbitego, dostarczając

informacji na temat anizotropii optycznej monowarstwy, a tym samym orientacji cząsteczek

względem normalnej do granicy międzyfazowej [3].

Rys. 4. Względna zmiana współczynnika odbicia w wyniku utworzenia monowarstwy na

granicy faz woda/powietrze [4].

Rys 4. przedstawia względną zmianę współczynnika odbicia związaną z utworzeniem

monowarstwy, w funkcji kąta padania światła. Na rysunku wykreślono wartość zmiany

współczynnika odbicia podzieloną przez wartość współczynnika odbicia dla granicy fazowej

niepokrytej monowarstwą (∆R/R).

Rys. 5. Schemat działania mikroskopu BAM.

Na Rys. 5 przedstawiono schemat obrazujący zasadę działania mikroskopu BAM wraz z

wyszczególnieniem podstawowych elementów optycznych urządzenia.

Wartość kąta Brewstera dla dwóch przezroczystych ośrodków o znanych współczynnikach

załamania światła n1 i n2 można obliczyć posługując się wzorem: 1

2

n

ntg B =θ . Dla granicy faz

powietrze (n1=1) / woda (n2=1,33) wartość kąta Brewstera wynosi w przybliżeniu 53°.

W przypadku granicy międzyfazowej pokrytej monowarstwą promieniowanie odbite

przechodzące przez analizator można zarejestrować posługując się czułą kamerą CCD. Jako

źródło światła w mikroskopie BAM stosowany jest laser (zazwyczaj światło czerwone lub w

starszych modelach zielone), zapewniający wysoką intensywność promieniowania

padającego, co w związku z niskim współczynnikiem odbicia powierzchni jest bardzo ważne.

b. Anizotropia optyczna w obrazach BAM

Obecność tekstur wewnętrznych przejawiających się niejednolitym kontrastem w obrazach

zarejestrowanych techniką BAM związane jest ze zjawiskiem anizotropii optycznej, które

występuje w przypadku domen odpowiadających fazom monowarstwy o relatywnie wysokiej

kondensacji (Rys. 6) [5]. W takim przypadku, w przeciwieństwie do światła padającego,

promieniowanie odbite nie jest już spolaryzowane w płaszczyźnie padania.

Rys. 6. Struktury wewnętrzne w obrębie domen fazy LC [6].

Najczęściej zjawisko to związane jest z niejednorodnym azymutem kąta odchylenia cząsteczki

od normalnej do granicy międzyfazowej (w przypadku faz utworzonych z cząsteczek

pochylonych, Rys. 7) lub z deformacją dwuwymiarowej sieci krystalicznej (w przypadku faz

złożonych z cząsteczek zorientowanych prostopadle do granicy międzyfazowej). Drugi z

powyższych przypadków, który odznacza się niższym kontrastem domen anizotropowych jest

często związany z obecnością na powierzchni faz typu 'harringbone', w których krótkie osie

prostopadle zorientowanych cząsteczek o konformacji all-trans hydrofobowego łańcucha

tworzą ten charakterystyczny wzór ułożenia na powierzchni (Rys. 8).

Rys. 7. Schemat odchylenia cząsteczki od normalnej do granicy międzyfazowej (t - kąt

odchylenia, ϕ - azymut odchylenia) oraz schemat rozmieszczenia cząsteczek różniących się

azymutem odchylenia w obrębie domeny [3].

Rys. 8. Schemat ułożenia typu 'herringbone' cząsteczek w monowarstwie [7].

W przypadku faz charakteryzujących się brakiem odchylenia cząsteczek od orientacji

prostopadłej oraz heksagonalną symetrią komórki elementarnej obserwowany obraz

przejawia jednolity kontrast. W takim przypadku swoboda rotacji cząsteczki wokół jej długiej

osi sprawia, że anizotropia nie jest obserwowana.

c. Przykłady zastosowania mikroskopii BAM

• Określanie stanu monowarstwy

Rys. 9. Struktury przypominające

monowarstwy w stanie ciekłym rozprężonym (lewe zdjęcie) oraz rozgałęzione struktury fazy

ciekłej skondensowanej (prawe zdjęcie).

• Obserwacja struktur trójwymiarowych

Rys. 10. Struktury fazy trójwymiarowej charakteryzujące się wysokim współczynnikiem

odbicia światła. Uwidaczniają się najczęściej w trakcie załamania (kolapsu) monowarstwy i w

zależności od jego mechanizmu przyjmują rozmaite struktury (np. białe pasy lub drobne,

• Detekcja przejść fazowych w obrębie monowarstwy oraz obserwacja zmian wielkości i

kształtu domen fazy skondensowanej

Przykłady zastosowania mikroskopii BAM

nie stanu monowarstwy

Struktury przypominające 'dwuwymiarową pianę', charakterystyczne dla

monowarstwy w stanie ciekłym rozprężonym (lewe zdjęcie) oraz rozgałęzione struktury fazy

ciekłej skondensowanej (prawe zdjęcie).

struktur trójwymiarowych - np. w trakcie kolapsu monowarstwy

Struktury fazy trójwymiarowej charakteryzujące się wysokim współczynnikiem

odbicia światła. Uwidaczniają się najczęściej w trakcie załamania (kolapsu) monowarstwy i w

zależności od jego mechanizmu przyjmują rozmaite struktury (np. białe pasy lub drobne,

jaskrawe punkty).

Detekcja przejść fazowych w obrębie monowarstwy oraz obserwacja zmian wielkości i

kształtu domen fazy skondensowanej

charakterystyczne dla

monowarstwy w stanie ciekłym rozprężonym (lewe zdjęcie) oraz rozgałęzione struktury fazy

np. w trakcie kolapsu monowarstwy

Struktury fazy trójwymiarowej charakteryzujące się wysokim współczynnikiem

odbicia światła. Uwidaczniają się najczęściej w trakcie załamania (kolapsu) monowarstwy i w

zależności od jego mechanizmu przyjmują rozmaite struktury (np. białe pasy lub drobne,

Detekcja przejść fazowych w obrębie monowarstwy oraz obserwacja zmian wielkości i

Rys. 11. Ewolucja kształtu, wielkości i gęstości powierzchniowej jasnych, nieregularnych domen

fazy ciekłej skondensowanej (LC) pozostającej w równowadze z ciemniejszą fazą rozrzedzoną

(np. fazą ciekłą rozprężoną, LE lub gazową, G).

przejścia fazowego LE -> LC.

• Badanie separacji fazowej

Rys. 12. Współistnienie fazy ciekłej skondensowanej (lewa strona zdjęcia) i trójwymiarowej fazy

krystalicznej (jaskrawe domeny z prawej strony). Obraz może świadczyć o separacji fazowej w

obrębie monowarstwy dwu- lub wieloskładnikowej o ograniczonej mieszalności komponentów.

Jeden ze składników wyodrębnia się w postaci

• Badanie organizacji cząsteczek w obrębie domen skondensowanych

kształtu, wielkości i gęstości powierzchniowej jasnych, nieregularnych domen

wanej (LC) pozostającej w równowadze z ciemniejszą fazą rozrzedzoną

(np. fazą ciekłą rozprężoną, LE lub gazową, G). Powyższa sekwencja struktur typowa dla

> LC. Fazę LC charakteryzuje duża różnorodność kształtu domen

eliptycznych, aż po dendrytyczne.

Badanie separacji fazowej

Współistnienie fazy ciekłej skondensowanej (lewa strona zdjęcia) i trójwymiarowej fazy

krystalicznej (jaskrawe domeny z prawej strony). Obraz może świadczyć o separacji fazowej w

lub wieloskładnikowej o ograniczonej mieszalności komponentów.

Jeden ze składników wyodrębnia się w postaci jaskrawych struktur trójwymiarowych.

Badanie organizacji cząsteczek w obrębie domen skondensowanych

kształtu, wielkości i gęstości powierzchniowej jasnych, nieregularnych domen

wanej (LC) pozostającej w równowadze z ciemniejszą fazą rozrzedzoną

Powyższa sekwencja struktur typowa dla

Fazę LC charakteryzuje duża różnorodność kształtu domen - od

Współistnienie fazy ciekłej skondensowanej (lewa strona zdjęcia) i trójwymiarowej fazy

krystalicznej (jaskrawe domeny z prawej strony). Obraz może świadczyć o separacji fazowej w

lub wieloskładnikowej o ograniczonej mieszalności komponentów.

struktur trójwymiarowych.

Rys. 13. Anizotropowe domeny fazy skondensowanej.

4. Literatura

1. Meunier, J. Why a Brewster angle microscope?

2. Dostępne na: www.accurion.com

3. Henon, S.; Meunier, J.

mesophases. J. Chem. Phys.

4. Feder, A. Optical Studies of Monolayers at the Air/Water Interface

1997, Harvard University

5. Roldán-Carmona, C.; Giner

Camacho, L. Revisiting the Brewster Angle Microscopy: The relevance of the polar

headgroup. Adv. Colloid Interfac.

6. Albalat, R.; Claret, J.; Ignés

Pinazo, A. Langmuir Monolayers of Diacyl Glycerol Amino Acid

Effect of the Substitution Pattern of the Glycerol Backbone.

10878-10884.

7. Kaganer, V. M.; Möhwald, H.; Dutta

monolayers. Rev. Mod. Phys.

5. Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest przeprowadzenie bezpośredniej wizualizacji monowarstw lipidowych

utworzonych na granicy faz roztwór wodny/powietrze przy

Brewstera. Obserwacja domen powierzchniowych utworzonych na powierzchni wodnych

Anizotropowe domeny fazy skondensowanej.

Meunier, J. Why a Brewster angle microscope? Colloids Surf. A 2000

Dostępne na: www.accurion.com

Henon, S.; Meunier, J. Phase transitions in Gibbs films: Star textural defects in tilted

J. Chem. Phys. 1993, 98, 9148 - 9154.

Feder, A. Optical Studies of Monolayers at the Air/Water Interface

Harvard University.

Giner-Casares, J. J.; Pérez-Morales, M.; Martín

Camacho, L. Revisiting the Brewster Angle Microscopy: The relevance of the polar

Adv. Colloid Interfac. 2012, 173, 12-22.

Albalat, R.; Claret, J.; Ignés-Mullol, J.; Sagués, F.; Morán, C.; Pérez, L.; Clapés, P.;

Langmuir Monolayers of Diacyl Glycerol Amino Acid-

Effect of the Substitution Pattern of the Glycerol Backbone. Langmuir

Kaganer, V. M.; Möhwald, H.; Dutta, P. Structure and phase transitions in Langmuir

Rev. Mod. Phys. 1999, 71, 779-819.

przeprowadzenie bezpośredniej wizualizacji monowarstw lipidowych

utworzonych na granicy faz roztwór wodny/powietrze przy zastosowaniu mikroskopu kąta

Obserwacja domen powierzchniowych utworzonych na powierzchni wodnych

Anizotropowe domeny fazy skondensowanej.

2000, 171, 33-40.

Phase transitions in Gibbs films: Star textural defects in tilted

Feder, A. Optical Studies of Monolayers at the Air/Water Interface. Doctoral Thesis

Morales, M.; Martín-Romero, M. T.;

Camacho, L. Revisiting the Brewster Angle Microscopy: The relevance of the polar

n, C.; Pérez, L.; Clapés, P.;

-Based Surfactants.

Langmuir 2003, 19,

, P. Structure and phase transitions in Langmuir

przeprowadzenie bezpośredniej wizualizacji monowarstw lipidowych

zastosowaniu mikroskopu kąta

Obserwacja domen powierzchniowych utworzonych na powierzchni wodnych

roztworów wybranych toksykantów oraz dla porównania na powierzchni ultraczystej wody

ma na celu analizę wpływu czynników zanieczyszczających środowisko na morfologię

monowarstw badanych lipidów błonowych.

6. Aparatura i stosowane odczynniki

• Waga Langmuira: KSV (Helsinki, Finlandia) model 2000, dwubarierkowa o całkowitej

powierzchni 700 cm2. Jako sensor ciśnienia powierzchniowego zastosowano płytkę

Wilhelmy'ego wykonaną z bibuły filtracyjnej.

• Mikroskop kąta Brewstera: ultraBAM, Accurion (Getynga, Niemcy). W urządzeniu

zastosowano laser o mocy 50 mW emitujący światło o polaryzacji równoległej (p) i

długości fali 658 nm.

• Mikrostrzykawki: firmy Hamilton o pojemności 250 µl

• Badane lipidy: kwas stearynowy, kardiolipina, DPPC

• Wybrane toksykanty: jony Cd(II), wybrany regulator wzrostu roślin stosowany jako

herbicyd (np. kwas indolilo-3-octowy, kwas 2,4-dichlorofenoksyoctowy)

• Stosowane rozpuszczalniki: chloroform o czystości spektroskopowej 99,9% stabilizowany

etanolem (Sigma-Aldrich), metanol czda. o czystości 99% (Avantor), chloroform czda. o

czystości 99% (Avantor), ultraczysta woda o oporności ≥18,2 MΩ·cm produkowana przez

system Milli-Q.

7. Wykonanie ćwiczenia

• Przygotowanie wagi Langmuira do pomiaru - dokładne wyczyszczenie teflonowych

powierzchni wanienki oraz ruchomych barierek przy pomocy wacików nasączonych

chloroformem, a następnie dwukrotne przemycie wodą ultraczystą.

• Wypełnienie wagi Langmuira subfazą na którą zostanie naniesiona monowarstwa (w

zależności od pomiaru: wodą ultraczystą lub uprzednio sporządzonym wodnym

roztworem toksykanta o znanym stężeniu).

• Kalibracja mikroskopu względem oczyszczonej powierzchni subfazy - dostosowanie

parametrów ekspozycji i wzmocnienia obrazu.

• Utworzenie monowarstwy badanego lipidu na powierzchni subfazy wodnej. W tym celu,

na powierzchnię subfazy nanosi się za pomocą mikrostrzykawki roztwór lipidu

sporządzony w lotnym, niemieszającym się z wodą rozpuszczalniku organicznym (w

praktyce najczęściej stosuje się mieszaninę chloroform/metanol 9/1). Przed

rozpoczęciem pomiaru konieczne jest odczekanie 5 minut, celem odparowania

rozpuszczalnika.

• Pomiar rozpoczyna włączenie symetrycznej kompresji monowarstwy na powierzchni

subfazy wodnej, w trakcie której rejestruje się izotermę ciśnienia powierzchniowego (π)

w funkcji średniej powierzchni przypadającej na cząsteczkę w monowarstwie (A).

Obserwację ewolucji struktur powierzchniowych w czasie pomiaru prowadzi się na

monitorze komputera za pomocą sterującego mikroskopem oprogramowania. Program

umożliwia zarejestrowanie obrazów morfologii warstwy powierzchniowej na dowolnym

etapie pomiaru. Rejestrując zdjęcie należy pamiętać o zanotowaniu parametrów

odpowiadających etapowi kompresji monowarstwy, tj. powierzchni i/lub ciśnienia

powierzchniowego. W trakcie pomiaru należy pamiętać o regulacji ostrości obrazu oraz

o zastosowaniu korekty tła.

8. Sposób opracowania wyników

• Izotermy ciśnienia powierzchniowego (π) w funkcji średniej powierzchni (A)

przypadającej na cząsteczkę w monowarstwie. Używając programy do obróbki danych

umożliwiającego import plików ASCI (np. Origin lub Excel) należy opracować wykresy

izoterm π - A dla badanych monowarstw lipidowych.

• Moduły ściśliwości monowarstw. Na podstawie zarejestrowanych izoterm π - A

przeprowadzić obliczenia modułów ściśliwości według wzoru: Cs-1 =-A(dπ/dA), a wyniki

obliczeń wykreślić w funkcji ciśnienia powierzchniowego. Na podstawie maksymalnych

wartości Cs-1(π) dokonać klasyfikacji stanu monowarstwy w oparciu o poniższą tabelę.

Wartość modułu ściśliwości [mN/m] Stan monowarstwy 0 - 12,5 Gazowy (G)

>12,5 - 100 Ciekły rozprężony (LE) >100 - 250 Ciekły skondensowany (LC)

≥250 Stały (S)

• Obrazy BAM. Pomniejszone i w razie konieczności przycięte zdjęcia zestawić wraz z

informacją o ciśnieniu powierzchniowym i powierzchni/cząsteczkę, przy jakiej zostały

zarejestrowane obrazy.