Katarzyna Guz

Instytut Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie

Nieinwazyjne badania molekularne

antygenów komórek krwi

Dlaczego są ważne?

Dzięki czemu są możliwe?

Jakimi metodami prowadzimy je w Polsce i na świecie?

Dlaczego nie są proste?

Jakie są nasze wyniki i wyniki innych laboratoriów?

Co wymaga ulepszenia?

Dlaczego są ważne?

Antygeny komórek krwi mogą być immunogenne:

erytrocyty: najważniejsze RhD, ale też K, Rhc, RhE i inne

płytki: najważniejsze HPA-1a, ale też HPA-5b i inne HPA

Matczyne alloprzeciwciała

mogą powodować chorobę hemolityczną (ChHPN) lub

alloimmunologiczną małopłytkowość (AIMP/N) płodu/noworodka, gdy

dany antygen jest obecny na komórkach płodu

nie są groźne, gdy płód nie ma antygenu do którego są przeciwciała

nie trzeba monitorować ciąży metodami inwazyjnymi (kordocenteza,

amniopunkacja - ryzyko utraty płodu 1%, pogłębienia alloimmunizacji

Immunoprofilaktyka konfliktu RhD – nie potrzebna jak płód Rh-

Konflikt RhD

przed immunoprofilaktyką

~20% immunizacja

immunoprofilaktyka po porodzie, poronieniu

1,6% immunizacja (Lenkiewicz 2000), 0,49% w latach 2006-2007

(Żupańska 2009) ~1000 rocznie w Polsce

90% skuteczność (zaniedbania podania immunoglobuliny anty-D, za mała dawka, przeciek i alloimmunizacja już w trakcie ciąży, u 1% ciężarnych w pierwszej ciąży, błędy w oznaczeniu RhD dziecka)

immunoprofilaktyka w 28 lub 34 tyg ciąży (rutynowo

stosowana w wielu krajach)

Obniżenie ryzyka immunizacji do 0,3% (van der Schoot 2009)

wysokie koszty, a nie jest potrzebna gdy płód RhD ujemny (40%)

w Wielkiej Brytanii 40 000 kobiet na 700 000 porodów rocznie

niepotrzebnie dostanie immunoglobulinę anty-D (Wright 2009)

Konflikty inne niż RhD

brak immunoprofilaktyki

obowiązek skriningu przeciwciał czerwonokrwinkowych u

wszystkich ciężarnych w 12 i 28 tyg ciąży od roku 1996

zagwarantowany ustawowo:

ocena stosowania tego prawa w latach 2006-2007 (Żupańska

2009):

niespełna 48% ciężarnych objęto badaniami skriningowymi

(prawie 100% w Holandii)

jedynie 50% z nich to ciężarne RhD dodatnie (ich liczba powinna

być 5-krotnie wyższa)

przeciwciała nie anty-D u 0,37% ciężarnych RhD+ (anty-E, -K, -

c, -Jka,-Jkb, -Fya, -C, MNS, anty-Coa)

szacunkowo ~2000 przypadków rocznie w Polsce – aż 4/5

niedodiagnozowane

Klinicznie istotne przeciwciała nie

anty-D Anty-K:

ciężka ChHP/N

Anty-c:

ciężka ChHPN nawet przy niskim mianie przeciwciał

przeciwciała mogą wytworzyć się w późniejszym etapie ciąży

Anty-E:

często wykrywane u ciężarnych

na ogół nie reagują one w pośrednim teście antyglobulinowym (PTA)

albo miano ich jest bardzo niskie

rzadko są przyczyną choroby hemolitycznej płodów/noworodków

(ChHP/N)

zdarzają się przypadki ChHP/N o bardzo ciężkim przebiegu

Dzięki czemu są możliwe?

Inwazyjna

badania

antygenów

na komórkach pobranych w trakcie kordocentezy

DNA

z amniocytów

zbyt mało materiału u około 2% kobiet; ryzyko utraty płodu 1% (Mujezinovic, 2007)

z kosmków łożyska

zbyt mało materiału u około 8%;

ryzyko utraty płodu u około 1% (Mujezinovic, 2007)

W Wielkiej Brytanii rocznie ~20 000 amniocentez i 5 000 CVS - około przypadków 250 utraty płodu

Nieinwazyjna

badania

komórek płodu we krwi matki

zarzucona bo komórki te mogą przetrwać >20 lat

wolnokrążącego DNA płodu (cell free fetal - cff-DNA) w osoczu kobiety ciężarnej

Diagnostyka prenatalna

Izolacja

DNA

cff-DNA w osoczu ciężarnych (Lo 1997)

cff-DNA

DNA matki

Z wykładu „ Non – invasive Prenatal Diagnosis

Technical Challenges and Advances, Helen White, PhD, 2009

Charakterystyka cff-DNA możliwe do wykrycia już w 5/7 tygodniu ciąży

stężenie początkowo bardzo niskie, wzrasta z wiekiem

ciąży, ale zawsze konieczne czułe metody by je

wykryć

stanowi tylko 3-6% DNA w osoczu – reszta to DNA

matki

ulega degradacji w kilka godzin po porodzie (źródłem

cff-DNA komórki trofoblastu)

Kierunki intensywnych badań

cff-DNA w osoczu

Choroby uwarunkowane genetycznie

sprzężone z płcią

jednogenowe

aneuploidia

Konflikty serologiczne (od 10 lat w IHiT):

RhD, Rhc, RhE

K w standaryzacji

Jakimi metodami badamy cff-DNA?

Efektywna metoda izolowania DNA:

z dużych objętości (1 ml)

odczynnikami dedykowanymi do izolowania kwasów

nukleinowych wirusów

Bardzo czuła i specyficzna detekcja DNA:

real-time PCR

spektrometria mas MALDI-TOF

digital PCR

Ograniczenie ryzyka kontaminacji na etapie

przedanalitycznym i analitycznym

Dlaczego nie jest to proste?

śladowa ilość cff-DNA w osoczu wobec wysokiej proporcji

DNA matki

tylko połowa genów w cff-DNA pochodzi od ojca

różna skala trudności badania w zależności jakie jest podłoże

genetyczne determinujące antygen, którego szukamy u płodu

ryzyko kontaminacji próbki DNA w fazie przedanalitycznej

genem powszechnym w populacji

konieczność udowodnienia, że badamy DNA płodu, a nie tylko

DNA matki - trudności w opracowaniu taniej, uniwersalnej

kontroli cff-DNA > niedopuszczalny wynik fałszywie ujemny!

Skale trudności nieinwazyjnych

badań prenatalnych Najłatwiej szukać genu, którego nie ma u matki

SRY - nie ma go u kobiet

RHD – nie ma go u kobiet RhD-, a jest u osób

RhD+

ale skomplikowane i różnorodne podłoże fenotypów RhD+ i

RhD– stwarza dodatkowe trudności

Podłoża genetyczne fenotypu RhD(-)

Delecja (brak) genu RHD (99% w rasie białej*)

pseudogen RHD ψ (67% w rasie negroidalnej)

RHD-CE(3-9)-D (4-6% w rasie żółtej)

RHDel (20-30% w rasie żółtej)

inne nieznane dotąd mutacje

* u 1% osób RhD- rasy kaukaskiej gen RHD jest obecny,

różne warianty RHD niemego

Warianty białka RhD o zmienionej

ekspresji lub/i zmienionych epitopach Słabe D - mała ilość antygenu D na krwinkach

mutacje punktowe w regionach przezbłonowych lub

wewnątrzkomórkowych białka RhD i niektóre hybrydy

RHD-CE-D

Częściowy D - utrata jakiegoś epitopu D

hybrydy RHD-CE-D lub mutacje punktowe w

zewnątrzkomórkowych fragmentach białka RhD

DEL - szczególnie słaby D możliwe do wykrycia

serologicznie tylko techniką adsorpcji elucji

mutacje nonsensowne lub delecja eksonu 9 lub 8 RHD

Konsekwencje skomplikowanego podłoża

genetycznego antygenu RhD dla

nieinwazyjnej diagnostyki

Niektóre osoby RhD-mają gen RHD lub jego

fragmenty

Jeśli kobieta Rh ujemna ma niemy gen RHD nie można u niej wykonać nieinwazyjnej diagnostyki RHD płodu

Analiza poziomu genu RHD względem genu kontrolnego na poziomie ilości DNA matczynego a nie cff-DNA

Niektóre osoby RhD+ mogą

nie mieć pewnych

fragmentów genu RHD

RhD dodatni płód może nie mieć

wszystkich eksonów/intronów genu

RHD

Konieczne badanie więcej niż jednego

fragmentu RHD

Ilościowe wyniki wykrywania RHD pozwalają

odróżnić czy to gen płodu czy matki

flu

ore

scen

cja

Sygnał tła (fluorescencja z pierwszych 15 cykli)

RhD dodatnia

kobieta

Ct=28

Osoba

RhD

ujemna

Ct=40

RhD ujemna kobieta

z RhD dodatnim

płodem

Ct=35

Przypadki w których niemożliwe było

nieinwazyjne ustalenie czy płód jest RhD+

4 matki z RHD słabe

1 matka z wariantem RHDel (IVS3 +1G>A)

6 RHD 1 RHDel (IVS3 + 1 G>A)

RHD częściowe (3 DVI typ 2, 1 DVI typ 1; 1 DV typ 4)

3 RHD słabe (typ 1, 11, 17)

IHiT,

Warszawa

5/353

Amsterdam

16/2380

Jeśli w osoczu kobiety ciężarnej Rh-

nie wykryto genu RHDnajprawdopodobniej płód jest RHD ujemny

lecz

trzeba potwierdzić, że w próbce było:

wystarczająco dużo DNA płodu

„dobra” jakość DNA płodu

Badamy geny kontrolne odziedziczone po ojcu, a nie obecne u matki dla chłopców : gen SRY

dla dziewczynek: polimorfizmy typu delecja genu: GSTM1, GSTT1, S03, S06 , S 15 lub bialleliczne polimorfizmy typu insercja/delecja w obrębie genu: S01a/b, S04a/b, S05a/b, S07a/b, S08a/b, S09a/b, S10a/b, S11a/b, S14a/b, S 18a/b RHCE, ACEdel/ins

Transfusion, 2005, 45, 9

Gin.Pol, 2004, 75, 12

Gin.Pol, 2004, 75, 1

TRUDNE, ŻMUDNE, DROGIE…

Wykrywanie genu kodującego RhD

w osoczu RhD ujemnej ciężarnej

Gen RHD-

Gen SRY+

RhD (-)chłopiec

GEN RHD+/-

POWTÓRZYĆ

BADANIE

Gen RHD-

Gen SRY-

prawdopodobnieRHD (-)

dziewczynka

ALE trzeba potwierdzić obecność DNA płodu

wykryciem polimorfizmu ins/del odziedziczonego

po ojcu

WYNIKI POWTARZALNE > dla 3 reakcji real-

time PCR (3 fragmentów genu RHD) WYNIKI ROZBIEŻNE

Gen RHD +

RhD (+) dziecko z drugiej

probówki

Przykład wyniku

Zakład Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologicznej

Instytut Hematologii i Transfuzjologii

00-957 Warszawa, ul. Chocimska 5 Warszawa dn. 17.02.2005

Wynik

Metodą real-time PCR w osoczu pani XY (RhD-) z 16 tygodnia

ciąży nie wykryto genu RHD pochodzącego od płodu. Osocze

zawierało DNA płodu, co potwierdzono wykrywając w nim

polimorfizmy S08a i ACEdel, nieobecne u matki, a obecne u ojca

(pana Z Y).

Komentarz: Wyniki badania wskazują, że płód jest Rh ujemny.

Konsekwencje kliniczne fałszywych

wyników Fałszywie dodatni =

wykrywamy antygen,

którego płód nie ma

Płód jest traktowany jako mogący zimmunizować matkę i zagrożony ChHPN niepotrzebnie

zastosowana immunoprofilaktyka anty-D (dotyczy tylko konfliktu Rh)

monitorowanie hemolizy u płodu

co byłoby i tak stosowane gdyby badania cff-DNA nie wykonać

Fałszywie ujemny =nie wykrywamy antygenu,

który jest „groźny”

Płód jest traktowany jako

nie zagrożony, a:

matka powinna dostać immunoglobuliną anty-D (dotyczy

tylko konfliktu Rh)

płód powinien być monitorowany i ewentualnie leczony

Potencjalne źródła wyniku fałszywie

dodatniego, sposoby przeciwdziałania

Kontaminacja próbki materiałem zawierającym DNA od osoby RhD dodatniej >> odpowiedni sposób pobierania, przesyłania

materiału, izolacji DNA, wykonania badania

Obecność „niemego genu RHD u płodu” w populacji kaukaskiej ryzyko około 0,2-1%

jeśli ojciec innej rasy niż kaukaska ryzyko większe konieczność analizy wykrywania różnych fragmentów RHD należy podać na skierowaniu pochodzenie etniczne (rasa

czarna, żółta)

Potencjalne źródła wyniku fałszywie

ujemnego, sposoby przeciwdziałania

Brak lub zbyt mała koncentracja DNA płodowego w próbce

Konieczne udowodnienie obecności cff-DNA:

dla płodów płci męskiej – wykrycie genów z chromosomu Y

dla płodów płci żeńskiej – wykrycie genu/polimorfizmu ins/del odziedziczonego po ojcu, a nie obecnego u matki (wieloetapowe i skomplikowane badania)

Powtórzenie badania w późniejszym etapie ciąży

Dalsze badania nad sposobami udowodnienia „dobrej jakości” cff-DNA w próbce

badanej analiza metylacji DNA

Skala trudności diagnostyki nieinwazyjnej

w konfliktach innych niż RhD

znacznie trudniejsza, bo podłożem różnicy

antygenów u matki i płodu są tzw. SNP

wysoki poziom niespecyficznej amplifikacji, powstający z

przeważającej ilości DNA matczynego

zadawalające wyniki jedynie dla badania:

alleli RHCE*c, RHCE*E genu RHCE ze względu na to że,

użyte startery zawierają dodatkowe polimorfizmy SNP,

prócz tych warunkujących antygeny Rhc czy RhE

allelu KEL*1 ze względu na modyfikację startera -

wstawienie tzw. LNA (z ang. locked nucleic acids) przed

specyficznym nukleotydem na końcu 3

Czułość i swoistość kliniczna wykrywania genów płodu

w cff-DNA według publikowanych danychWykry

wany

gen

Publikacja/ Liczba

przypadków

Czułość %

(przedział

ufności dla 95%)

Swoistość

(przedział

ufności 95%)

SRY Metaanaliza 57 publikacji

/ 7 000

99.9

(99.7 – 100%)

94.9%

(93.5 – 96.4)

RHD Wielka Brytania/ 1997 99.8 99.2

Francja / 300+ 283 100 97.5 - 100

Belgia / 563 100 99.5

Polska / 230 100 99.6*

* u jednej ciężarnej z płodem RhD- nie wykryliśmy genu RHD, ale nie potwierdziliśmy

obecności cff-DNA, gdyż nie znaleźliśmy markera obecnego u ojca, a nieobecnego u matki

Jakie są wyniki nasze i innych laboratoriów?

Rutynowo przeprowadzana diagnostyka

nieinwazyjna w konfliktach serologicznych w IHiTRhD

u 348/348 kobiet prawidłowo oznaczono RhD płodu:

– u 260 płód RHD(+)

– u 88 płód RHD(-): u 51 gen SRY (chłopcy), u 36 marker ins/del po

ojcu, w 1 przypadku brak markera od ojca (87/88 wydano wynik)

Rhc

u 22/22 kobiet prawidłowo oznaczono Rhc płodu:

– u 16 płód RHCE*c (+)

– u 6 płód RHCE*c (-)

RhE

u 21/21 kobiet prawidłowo oznaczono RhE płodu:

– u 14 płód RHCE*E (+)

– u 7 płód RHCE*E (-)

Badania nieinwazyjne allelu KEL*1

minimalizacja ryzyka fałszywej amplifikacji przez stosowanie zmodyfikowanych starterów o podwyższonej swoistości, tzw. LNA (locked nucleic acids)

Finning i wsp. 2008: prawidłowe wyniki u 43 kobiet, które urodziły dzieci K-

1/27 wynik fałszywie ujemny u kobiet z przeciwciałami anty-K, które urodziły dziecko K+

IHiT pilotażowe badania DNA z osocza 11ciężarnych K-

u 5 potwierdzone prawidłowe wyniki: u 3 urodziły się K+ dzieci, u 2 K-

poziom wykrywanego allelu KEL*1 o 3-4- krotnie niższy od genu RHD

Projekt masowych badań RHD płodu

do kwalifikacji do podania anty-D

Przy masowych badaniach

automatyzacja

zmniejszenie kosztów

Koszty immunoprofilaktyki w czasie ciąży i ich

organiczenie po wprowadzeniu oznaczania RHD

płodu w Holandii

Obecnie stosowany schemat:

Ig dla kobiet Rh ujemnych,

które nie maja dzieci(14 000 )

koszt 3.1mln Euro

Wprowadzenie badań RHD w

ciąży i podawanie Ig

tylko gdy płód jest Rh+

koszt razem z badaniami

3 mln Euro

Objęcie wszystkich kobiet

podawaniem Ig w ciąży

(34 000)

koszt 6.6 mln Euro

Po włączeniu

nieinwazyjnych badań

RHD płodu

3.9 mln Euro

Van der Schoot, 2009

Co wymaga ulepszenia?Potencjalne metody udoskonalenia nieinwazyjnych

badań prenatalnych

Rozdzielenie cff-DNA od DNA matki na podstawie:

wielkości

cff-DNA <300bp

DNA matczyne >500bp

różnic w budowie białek histonowych (cff-DNA z H3.1,

DNA matczyne z H3.3)

Opracowanie uniwersalnej kontroli cff-DNA

różnice w metyzacji cff-DNA

PodziękowaniaWszystkim lekarzom i diagnostom laboratoryjnym, którzy

współpracują z IHiT dla udoskonalania nieinwazyjnej diagnostyki płodu

i

kobietom ciężarnym, które wyrażają zgodę na pobranie krwi i udostępniają dane o grupie krwi urodzonego noworodka

składa

zespół Pracowni Biologii Molekularnej Zakładu Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologicznej w składzie:

dr Katarzyna Guz, dr Agnieszka Orzińska, mgr Justyna Smolarczyk-Wodzyńska, mgr Magdalena Łakomy,

prof. Ewa Brojer, prof. Barbara Żupańska

Tylko z Państwa pomocą możemy kontynuować badania!

Zakład Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologicznej IHiT

Kierownik: Prof. dr hab. Ewa Brojerebrojer@ihit.waw.pl tel. (22)34 96 611

Pracownia Biologii Molekularnej:

dr Katarzyna Guz kguz@ihit.waw.pl

dr Agnieszka Orzińska orzińska@ihit.waw.pl

tel. 022 34 96 600 wew. 144, 154