Konstrukcja genetycznie

modyfikowanych roślin

Kroki milowe w badaniach molekularnych

i bioinżynierii roślin

• 1953 - Odkrycie struktury DNA

• 1958 - Wyizolowanie polimerazy DNA z E. coli

(można syntetyzować DNA in vitro) - Kornberg

• 1963 - Odkrycie kodu genetycznego (poznanie

zasad trójkowego kodowania informacji

genetycznej) – Crick

Kroki milowe w badaniach molekularnych

i bioinżynierii roślin

• 1967 - Wyizolowanie ligazy DNA (możliwość

łączenia między sobą fragmentów DNA) -

Olivera & Lehman

• 1970 - Izolacja nowego rodzaju enzymów-

enzymów restrykcyjnych (można ciąć fragmenty

DNA w miejscach rozpoznawanych przez dany

enzym) - Smith & Wilcox

Kroki milowe w badaniach molekularnych

i bioinżynierii roślin

• 1972 - Otrzymanie pierwszego rekombinowanego

DNA - połączono między sobą fragmenty DNA po

ich przecięciu przez ER - Jackson i zespół

• 1973 - Wprowadzenie obcego DNA do komórek E.

coli przez zrekombinowany plazmid (możliwość

namnażania biologicznego zrekombinowanego DNA

w kom. bakterii) - Cohen i zespół

• 1975 - Praktyczna metoda sekwencjonowania

fragmentów DNA (rozpoczął się szybki rozwój

metod sekwencjonowania DNA) - Sanger

Kroki milowe w badaniach molekularnych

i bioinżynierii roślin

• 1984 - Otrzymanie pierwszej transgenicznej

petunii z wykorzystaniem agroinekcji do jej

transformacji (pracowanie powszechnie

obecnie używanej metody transformacji roślin

dwuliściennych) - De Block i in., Horsch i in.

• 1984 - Otrzymanie transgenicznego tytoniu

metodą PEG (opracowanie metody

transformacji poprzez bezpośrednie

wprowadzenie DNA do protoplastów) -

Paszkowski i in.

Kroki milowe w badaniach molekularnych

i bioinżynierii roślin

• 1986 - Odkrycie łańcuchowej reakcji polimerazy

(PCR)

• 1990 - Otrzymanie kukurydzy transgenicznej z

zastosowaniem strzelby genowej (opracowanie

metody transformacji roślin jednoliściennych) -

Gordon- Kamm i in.

• 1994 - Pomidor transgeniczny Flavr- Savr na

rynku USA (pierwsza roślina transgeniczna w

uprawie) - Monsanto

Zakres, cel i przykłady modyfikacji

genetycznej roślin uprawnych

• Pożądane zmiany w wegetatywnych

częściach roślin bez znaczących zmian

składu chemicznego generatywnych części

– zwiększenie tolerancji na działanie

herbicydów, choroby wirusowe i grzybowe

– zmiany architektury roślin oraz terminu

kwitnienia i dojrzewania

– zwiększenie tolerancji na stres środowiskowy

Zakres, cel i przykłady modyfikacji

genetycznej roślin uprawnych

• Zmiany w składzie chemicznym i wartości

użytkowej jadalnych części roślin

- zwiększenie zawartości niedoborowych

aminokwasów

- „projektowanie olejów roślinnych”

- poprawa cech sensorycznych produktu

Zakres, cel i przykłady modyfikacji

genetycznej roślin uprawnych

• Synteza specyficznych, zazwyczaj gatunkowo

obcych, substancji chemicznych

–produkcja farmaceutyków i szczepionek roślinnych

–zmiany kompleksu celulozowo-ligninowego oraz

właściwości skrobi przydatnych w produkcji naturalnych

biodegradowalnych opakowań

– zwiększenie zdolności wybranych roślin

do kumulowania w glebie składników

niepożądanych

Produkcja białek

SYSTEMY ROŚLINNE

• Powstanie biomasy wymaga jedynie

– energii słonecznej

– podłoża mineralnego

Transformacja organizmów

wielokomórkowych

• Transformacja wszystkich

komórek dorosłej rośliny nie

jest możliwa.

• Transformacji ulegają

pojedyncze komórki, z

których roślina jest

regenerowana

SYSTEMY ROŚLINNE

• Z 1 ha można otrzymać do 20 kg czystego

białka

• W przypadkach, gdy preparat białkowy

dostarczany jest drogą pokarmową – brak

konieczności oczyszczania białka

METODY WYTWARZANIA OBCYCH BIAŁEK

W KOMÓRKACH ROŚLINNYCH

• Ekspresja przejściowa – wymaga

wprowadzenia genu do ukształtowanego

organizmu

• Ekspresja konstytutywna – transformacja

komórek roślinnych

Ekspresja przejściowa – problemy do

rozwiązania

• Jak równocześnie dostarczyć obcy gen do

wielu komórek czy tkanek?

– Wirusy roślinne

Wirusy roślinne

• 99% wszystkich wirusowych patogenów

roślinnych stanowią wirusy RNA

• niewielki genom (zwykle 6-10 tysięcy

nukleotydów) występuje najczęściej w formie

pojedynczej nici (u niektórych wirusów składa

się z dwóch, trzech lub nawet czterech

jednoniciowych RNA)

Wirusy roślinne - zalety

• Najprostsze wirusy kodują zaledwie kilka

białek:

– niezbędną do replikacji genomu zależną od

RNA polimerazę RNA (RdRp – ang. RNA-

dependent RNA polymerase),

– białko umożliwiające systemiczną infekcję

(MP – ang. movement protein)

– strukturalne białko

płaszcza (CP - ang.

Coat protein)

Wirusy roślinne

• Dotychczasowe badania sugerują, że najlepszym

materiałem do konstrukcji wektorów są wirusy o

jednoniciowym genomie

• Wysoki poziom ich akumulacji w zainfekowanej

tkance (do 8,6 mg wirionu / g świeżej masy)

• Naturalna zdolność do rozprzestrzeniania się i

przełączania metabolizmu rośliny na wydajną

syntezę (synteza miligramowych ilości białka/ g

tkanki roślinnej)

• Synteza produktu w ilości 0.4-2% rozpuszczalnych

białek rośliny

Wirusy roślinne – zalety ułatwiające

konstrukcję układów

• Możliwość manipulowania klonami cDNA

genomów wirusowych

• Niewielkie wymiary wirusów

The structure of cowpea chlorotic mottle virus, a plant virus,

in its open and closed forms, with a section of the capsid

removed from the closed form to illustrate the interior cavity.

This virus serves as a biotemplate for viral-based

nanomaterials applications.

Wirusy roślinne – zalety

• Możliwość wyboru momentu infekcji

(podczas dowolnego etapu rozwoju

rośliny) – znaczenie przy produkcji białek

toksycznych dla gospodarza

• Możliwość produkcji białek w roślinach

jedno- i dwuliściennych

Wektory wirusowe (np. wius mozaiki

stokłosy BMV)

Genom wirusa mozaiki stokłosy BMV składa się z

trzech jednoniciowych cząsteczek RNA (zwanych

RNA1, RNA2 i RNA3) o polarności mRNA.

Wektory wirusowe (np. wirus mozaiki

stokłosy BMV)

• RNA1 i RNA2 kodują białka replikazowe

odpowiedzialne za namnażanie

genomowych RNA

• odpowiednie modyfikacje umożliwiające

ekspresję obcych genów wprowadzone

zostały w RNA3

Brome mosaic virus

Wektory wirusowe

Wektory wirusowe

Photo credit: Ping Xu

Drought-stressed rice plants after six days without water.

The plant on the right is infected with Brome mosaic virus;

the one on the left is "healthy" (i.e., virus free).

Ekspresja stała obcych genów

w komórkach roślinnych

Ekspresja stała obcych genów

w komórkach roślinnych

• Najbardziej rozpowszechniony sposób

wytwarzania białek heterologicznych w

roślinach

Ekspresja stała obcych genów w komórkach

roślinnych

• sklonowany wcześniej gen wprowadzony

zostaje do specjalnego plazmidu

posiadającego zdolność do rekombinacji z

genomem roślinnym (Ti-plazmid – ang.

Tumor inducing plasmid).

Agrobacterium tumefaciens – naturalna

transformacja roślin

Metoda z wykorzystaniem wektora

plazmidowego

• Wykorzystanie do wprowadzenia materiału genetycznego do komórek roślinnych bakterii z rodzaju Rhizobium: Agrobacterium tumefaciens i Agrobacterium rhizogenes, które posiadają naturalną zdolność do wprowadzania swojego DNA do roślin.

Agrobacterium tumefaciens

Metoda z wykorzystaniem wektora

plazmidowego

• Mikroorganizmy posiadają w swojej

komórce plazmid, który zawiera

zakodowaną informację o białkach

niezbędnych do zaatakowania rośliny. To

właśnie on wnika do komórki roślinnej, a

jeden z jego fragmentów, nazwany

odcinkiem T (T-DNA), integruje się z

materiałem genetycznym komórki

gospodarza.

Metoda z wykorzystaniem

wektora plazmidowego

Metoda z wykorzystaniem

wektora plazmidowego

• Usuwając geny znajdujące się wewnątrz

fragmentu T, można na ich miejsce

wstawić dowolny inny fragment DNA, który

może zawierać geny pochodzące z innego

organizmu. Obecnie do transformacji

roślin używa się plazmidów pochodzących

z Agrobacterium tumefaciens.

Agrobacterium tumefaciens

• Plazmid Ti

• 120 kB

Plazmidy pochodne plazmidu Ti

Agrobacterium tumefaciens

Struktura odcinka T-DNA

Transfer T-DNA do komórek

roślinnych

Proces przekazywania T-DNA jest aktywowany, kiedy dochodzi do kontaktu A.

tumefaciens z uszkodzoną tkanką roślinną

T-DNA jest nacinane w miejscu RB, zachodzi replikacja jednoniciowego DNA

do miejsca RB, a następnie powstałe fragmenty wnikają do komórek rośliny

(vir)

Transfer T-DNA do komórek

roślinnych

Transfer T-DNA do komórek

roślinnych

• T-DNA integruje z genomem w

przypadkowych miejscach

• Komórki, które uległy transformacji

zaczynają dzielić się tworząc guzy

Comparison of A. tumefaciens-induced

crown galls on wild-type tomato (A and C)

and the Never ripe (ethylene insensitive)

mutant (B and D) stems.

Agrobacterium tumefaciens

Geny vir i T-DNA mogą być dostarczane w dwóch

oddzielnych plazmidach

Agrobacterium tumefaciens

• Zainfekowane komóki umieszcza się na

pożywce zawierającej antybiotyk lub

herbicyd

• Następnie z pojedynczych

transformowanych komórek odtworzone

zostają cale rośliny w procesie zwanym

regeneracją

Badania roślin

• Czy gen ulega wydajnej ekspresji?

• Czy obecność genu/białka nie wpływa

negatywnie na funkcjonowanie roślin (np.

Uniemozliwi kwitnienie roślin czy

owocowanie?

Transformacja roślin

• T-DNA integruje się w każdej komórce w

innym miejscu genomu

• Insercja zachodzi w obrębie tylko jednej

części chromosomu (insercja nie jest

letalna – rośliny - organizmy diploidalne)

W laboratorium Instytutu Chemii Bioorganicznej

PAN w Poznaniu:• Otrzymano szereg roślin transgenicznych, w

których syntetyzowane są

– białka wirusowe (białko powierzchniowe wirusa

zapalenia wątroby typu B (HBV)

– białko otoczki wirusa klasycznego pomoru świń

(CSFV)

– białka pasożytnicze (proteinaza kodowana przez

motylicę wątrobową)

W laboratorium Instytutu Chemii Bioorganicznej

PAN w Poznaniu:

• Wykazano, iż spożycie rośliny transgenicznej

zawierającej antygen powierzchniowy HBV

indukuje specyficzną odpowiedź

immunologiczną mogącą chronić ludzi przed

zakażeniem wirusowym.

• Obecnie prowadzone są analogiczne

eksperymenty dotyczące immunogenności

białka pochodzącego z CSFV i z motylicy.

Transformacja roślin

• Metoda ta ma poważne ograniczenie -

można ja stosować wyłącznie do roślin

dwuliściennych, ponieważ tylko one

ulegają zarażeniu przez Agrobacterium.

Rośliny jednoliścienne, do których należą

zboża, nie mogą być transformowane tym

sposobem.

Metody bez wykorzystania

wektora

Metody bez wykorzystania wektora

1. Są to metody polegające na bezpośrednim

wprowadzeniu DNA do komórek

roślinnych. Niezbędnym etapem jest

poddanie komórek roślinnych działaniu

enzymu usuwającego ścianę komórkową.

2. Otrzymuje się w ten sposób tzw. protoplast,

którego błona komórkowa stanowi koleją

barierę dla transgenu, wprowadzanego do

komórek z wykorzystaniem jednej z metod,

ogólnie podzielonych na fizyczne i

chemiczne.

Metody wprowadzania DNA do

protoplastów komórek roślinnych• Elektroporacja, fizyczna -

polega na wykorzystaniu serii impulsów elektrycznych, które naruszają strukturę błony, powodując powstanie w niej porów, przez które DNA może przeniknąć do wnętrza komórki. Podejście to może być stosowane też przy wprowadzaniu genów do innych komórek - zwierzęcych, bakteryjnych.

Metody wprowadzania DNA do

protoplastów komórek roślinnych• Mikrowstrzeliwanie, fizyczna -

wykorzystuje mikroskopijne kulki z złota lub wolframu o średnicy 0,5 -5 mikrometra (0,0000005-0,000005 metra). Fragmenty DNA które pragnie się wprowadzić do komórek są opłaszczane na tych kulkach, a następnie wstrzeliwane do komórek roślinnych. Używana jest do tego tzw. "armatka genowa" (ang. particle gun). Wadą metody jest niska wydajność oraz mogące wystąpić uszkodzenia komórek. Zaletą jest to iż komórki nie muszą być pozbawiane ściany komórkowej, można wprowadzać do np. do fragmentu liścia, jak i DNA może zostać wprowadzona także do chloroplastów i mitochondriów.

http://www.biotechnolog.pll

Metody wprowadzania DNA do

protoplastów komórek roślinnych

Metody wprowadzania DNA do

protoplastów komórek roślinnych• Fuzja liposomów - tworzone są liposomy, wewnątrz których są

cząsteczki DNA. Tworzy się je poprzez utworzenie podwójnej błony lipidowej na roztworze z cząsteczkami DNA i wstrząsanie nie - powstają wtedy "kuleczki" błonowe z DNA w środku. Liposomy łączą się z protoplastami komórek wprowadzając do środka DNA

• Z użyciem PEG, chemiczna - polega na wykorzystaniu glikolu polietylenowego (PEG od ang. polyethylene glycol), który powoduje zwiększenie przepuszczalności błony komórkowej, poprzez prowadzenia do niej chwilowej, odwracalnej dezorganizacji. To pozwala na wniknięcie transgenu do komórek, wraz z DNA nośnikowym

• Mikroiniekcja - polega na wprowadzeniu DNA za pomocą igły mikromanipulatora, doświadczenie wykonywanie jest przez ręcznie człowieka. Metoda praco- i czasochłonna.

http://www.biotechnolog.pll

WPROWADZANIE OBCEGO DNA

DO CHLOROPLASTÓW

icongenetics.com/html/download.php?ityp=3&id=5913

Informacja genetyczna w roślinach

• Jądro komórkowe N

• Mitochondria M

• Plastydy (w zielonych częściach roślin –

chloroplasty) P

Genom chloroplastów• Koduje ok. 120 genów

• 10000 kopii genomów chloroplastów

(komórki liścia – 100 chloroplastów, każdy

zawiera 100 kopii)

Zalety produkcji białek w

plastydach

• Nie zachodzi zjawisko wyciszania obcych

genów

• Możliwość ekspresji kilku białek poprzez

konstrukcję sztucznych operonów

• Brak możliwości niekontrolowanego

przekazywania wprowadzonych genów

przez pyłek

Transformacja chloroplastowego DNA

użyciem systemu Genegun

Transformation of the chloroplast genome by bombarding tobacco leaves with

microprojectiles coated with DNA. Following bombardment, leaf discs are placed

onto antibiotic-containing medium (panel A). Transgenic plants are regenerated from

the transformed tissue that is able to develop green chloroplasts (panel B)

Czy r-białka otrzymywane w

roślinach są bezpieczne?

Transgeniczny ryż

Transgeniczny bawełna

http://129.186.108.103/2005CONF/Conference/ui.pdf

Rośliny transgeniczne, GMO -

przykłady modyfikacji • Modyfikowana sałata

produkująca szczepionkę na zapalenie wątroby typu B –została opracowana przez naukowców z Instytutu Chemii Bioorganicznej PAN w Poznaniu pod kierownictwem prof. Legockiego - jest to przykład wykorzystania rośliny jako bioreaktora. W ten sposób można uzyskiwać także inne białka, enzymy, antybiotyki.

Aprotinin• Inhibitor proteaz “bovine pancreatic

trypsin inhibitor”

• Zastosowanie: redukcja ryzyka utraty krwi podczas operacji chirurgicznych

• Sposób podania: dożylnie

AproliZeanTM – (ProdiGene – maize);

ApronexinTM – (produced by Large Scale Biology Corp. for Sigma Aldrich)

http://129.186.108.103/2005CONF/Conference/ui.pdf

E.coli Heat-labile Enterotoxin B

Subunit (LT-B)

• Enterotoxigenic E. coli (ETEC)

• B podjednostka (LT-B) nie jest toksyczna. Wywołuje odpowiedź immunologiczną (szczepionka)

• LT-B produkowane w kukurydzy ma takie same cechy, jak oczyszczane z E. coli

– eksperymenty na zwierzętach – szczepionka LT-B wydajna i bezpieczna

– badania kliniczne – dobrze tolerowana

http://129.186.108.103/2005CONF/Conference/ui.pdf

Charakterystyka potencjalnej

możliwości wywoływania alergii

http://129.186.108.103/2005CONF/Conference/ui.pdf

Laktoferryna

• wiąże żelazo, pierwiastek niezbędny do

przetrwania dla wielu bakterii

• antyutleniacz

• aktywność anty-nowotworowa• Ventria Bioscience – ExpressTecTM production system for human

LF (using crops of rice and barley);

• Meristem® Therapeutics – LF production from maize

Tatura from New Zealand construct a new

Lactoferrin plant for the manufacture of

15 000 0000 tons Lactoferrin per annum.

Trypsyna

• produkcja insuliny

• hodowla tkankowa

TrypZeanTM – bovine trypsin from transgenic maize (ProdiGene)

Ocena ewentualnych skutków

ubocznych• Układ krwionośny

• Układ oddechowy

• Układ trawienny

• Układ moczowy

• Układ nerwowy

• Wątroba

• Immunotoksyczność (w tym alergie)

• Kancerogenność i mutagenność

• Toksyczność dla poszczególnych organów

• Skóra

• Wpływ na zdolności rozrodcze

Rośliny transgeniczne –przykłady

Soja •Odporność na wirusy, herbicydy, szkodniki

•Obniżenie zawartości kw. palmitynowego

Rzepak •Odporność na herbicydy,

•Zmniejszona zawartość nienasyconych kw.

tłuszczowych

•Większa zawartość kw. laurynowego

Kukurydza •Odporność na owady

•„źródło żelaza”

Pomidory •Spowolnienie dojrzewania, większa trwałość

•Większa zawartość suchej masy,

•Intensywniejsza barwa, cieńsza skórka

Ziemniaki •Wzrost zawartości skrobi

•Odporność na wirusy, herbicydy, stonkę

ziemniaczaną

•Odporność na ciemnienie pouderzeniowe, większa

trwałość

Rośliny transgeniczne –przykładyTruskawki • Wyższa słodkość owoców,

• Spowolnienie dojrzewania

• Odporność na mróz

Buraki cukrowe • Odporność na herbicydy, szkodniki

• Dłuższy okres przechowywania bez strat w

zawartości cukru

Ryż • Zwiększona produkcja β-karotenu

Sałata • Produkująca szczepionkę na zapalenie wątroby

typu B

Pszenica • Zwiększenie zawartości glutenu

Dynia • Odporność na grzyby

Banany • Odporność na wirusy i grzyby

Winogrona • Odmiany bezpestkowe

Seler, marchew •Zachowanie kruchości