Funkcjonalne współzależności szlaków sygnałowych zależnych od czynników transkrypcyjnych

TP53 i NFkB.

Katarzyna Szołtysek

Mechanizm regulacji NFkB, współzależności z TP53

www.brc.riken.jp/.../201p53_network.html

TP53 jako czynnik transkrypcyjny

http://p53.free.fr/index.html

Regulacja aktywacji TP53

MDM2 negatywny regulator p53:• wiąże się z domeną TA p53• eksport p53 z jądra komórkowego• funkcja ligazy ubikwityny

PTEN pozytywny regulator p53:• defosforyluje PIP3 (Pi3-4-5P)• blokada aktywacji Akt/PKB

Cel pracy

zidentyfikowanie i scharakteryzowanie funkcjonalnych współzależności pomiędzy szlakami sygnałowymi zależnymi od czynników transkrypcyjnych NFkB i TP53

analiza wpływu aktywacji szlaku zależnego od NFkB na przeżycie komórek nowotworowych eksponowanych na czynniki genotoksyczne (promieniowanie

UV i promieniowanie jonizujące)

analiza profilu ekspresji wybranych genów regulowanych przez czynniki transkrypcyjne NFkB i TP53, w warunkach kontrolnych i w komórkach eksponowanych na czynniki stresu komórkowego

identyfikacja genów, na których aktywność mają wpływ oba czynniki transkrypcyjne

i opracowanie modelu funkcjonalnych współzależności obu szlaków sygnałowych

HCT116 (rak jelita grubego) p53+/+ (wt) p53-/- (bi-allelic knock-out)

STATUS p53:

A – RT-PCR B – Western blot

A B

HCT116

Model doświadczalny

Analiza poziomu ekspresji genów oraz białek TP53 zależnych

Linia komórkowa: HCT116 (wt, p53-/-)

Analiza (WB, qRT-PCR):

regulacja p53

blokada cyklu komórkowego

indukcja apoptozy

Analiza poziomu ekspresji genów oraz białek TP53 zależnych

Analiza aktywacji badanych ścieżek sygnałowych

Indukcja białka p53:

A – Western blot

Indukcja ścieżki NFkB:

B – Western blot

C – RT-PCR

A

B C

Analiza poziomu ekspresji genów TP53 zależnych

Schemat ścieżki sygnałowej TP53

HCT116 HCT116 p53-/-

Analiza ekspresji genów regulatorowych, zależnych od TP53 – MDM2

Analiza ekspresji genów regulatorowych, zależnych od TP53 – PTEN

HCT116 HCT116 p53-/-

Analiza ekspresji genów zależnych od TP53 – p21

HCT116 HCT116 p53-/-

Analiza ekspresji genów zależnych od TP53 – Noxa

HCT116 HCT116 p53-/-

Wnioski:

stymulacja komórek TNFa wpływa na aktywację genów zależnych od p53, wywołaną promieniowaniem UV

poziom ekspresji MDM2 i PTEN ulega podwyższeniu w obu stosowanych schematach

poziom ekspresji p21/WAF1 i Noxa ulega początkowemu obniżeniu, a następnie podwyższeniu w obu stosowanych schematach aktywacji analizowanych ścieżek sygnałowych

Analiza poziomu ekspresji genów NFkB zależnych

Linia komórkowa: HCT116 (wt, p53-/-)

Analiza: qRT-PCR

PCR Array (SABioscience -NFkB dependent genes)

Analiza ekspresji genów zależnych od NFkB

Linia komórkowa: HCT116 (wt, p53-/-)

Analiza: cDNA 1h

Analiza ekspresji genów zależnych od NFkB

Linia komórkowa: HCT116 (wt, p53-/-)

Analiza: cDNA 1h

Analiza ekspresji genów zależnych od NFkB

Analiza qRT-PCR: BCL3, NFKBIA, REL,

IL1A, IL8,

TNF, TNFAIP3