Post on 08-Sep-2019
1
Elektroforeza kapilarna
Wykład 216 marca 2009
Elektroforeza kapilarna
• Ruchliwość elektroforetyczna
• Sprzęt
• Wybór metody
• Bufory
• CZE i techniki specjalne
• przykłady zastosowań
2
Ruchliwość elektroforetyczna
Aparatura - Agilent
3
Beckman MDQ
Detektory - UV
• czułość
• droga optyczna
• stęŜenie
• szybkość ruchu substancji
4
Detektory - UV
• czułość
• droga optyczna
• stęŜenie
• szybkość ruchu substancji
Detektory - UV
5
Detektory - MS
• uziemienie
• przepływ cieczy
• postać jonowa
• skład buforu
• ciecz osłonowa
(sheath, make-up liquid)
Detektory - MS
6
Detektory - MS
Detektory - MS
7
8
Detektory - MS
DetektoryDetekcja Wymagania Selektywność Uniwersalność Identyfikacja LOD (mol)
UV/VIS chromofory, TAK NIE TAK/NIE 10-5 – 10-7
absorpcja (DAD)pow. 190 nm
LIF fluorofory TAK NIE NIE 10-13 – 10-16
derywatyzacja
MS ładunek TAK TAK TAK 10-8 – 10-10
Amperometria brak* TAK NIE NIE 10-7 – 10-10
Konduktometria ładunek NIE TAK NIE 10-7 – 10-9
9
Opracowanie metody
Opracowanie metody
10
CZE
Ion intrinsic mobility Ion net mobility Anion Cation
Injection end Detection end
EOF
negatively charged silica wall
Kapilara
Kapilara długości 57 cm
Średnica powierzchnia pojemność pow/obj20 35,81 0,179 20050 98,53 1,119 8075 134,3 2,518 53100 179,1 4,477 40200 258,1 17,907 20
śel (14x11,5x0,15 cm) 32 200 24 150 1,3
11
Kapilary powlekane
Kapilary powlekane
12
Kapilary powlekane
Sodium phosphate pH 2.5, normal capillary +30kV
Sodium phosphate pH 2.5,coated capillary -30kV
Powlekane kapilary
POWLEKANE WEWNĘTRZNIE KAPILARY – brak EOF*alkohol poliwinylowy poliakrylamidpolimery węglowodorowe
13
Bufory
14
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
190 210 230 250 270 290 310
Wavelength (nm)
Ab
sorb
ance
25mM Phosphoric Acid pH 2.1
25mM Glycine pH 2.4
25mM Citric Acid pH 3
25mM Formic Acid pH 3.8
25mM Citric Acid pH 4.7
25mM Citric Acid pH 5.4
25mM Phosphoric Acid pH 7.2
25mM TRIS pH 8.1
25mM Boric Acid pH 9.2
25mM Glycine pH 9.8
25mM HEPES pH 7.6
25mM Phosphoric Acid pH 12.4
15
Czynniki, wpływające na jakośćrozdziału
16
17
Elektroforeza kapilarna –
metody specjalne
18
Elektroforeza kapilarna –metody specjalne
• CE elektroforeza kapilarna
• CZE zone = strefowa
• CGE gel = Ŝelowa
• CEC elektrochromatografia
• MEKC micellar = micelarna
• MEEKC mikroemulsyjna
• ACE affinity = powinowactwa
MEKC
19
Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography
Neutralne anality*
faza pseudostacjonarna
Metoda łatwamniej selektywna
Rozdziały chiralne
MEKC
EOF
t
EOF
t
MEOF
t
M
20
MEKC
Separation of different analytes is a result of their differential association with the micelles. The apparent partition coefficient for that analyte is a measure of its interaction with the micelle and can be calculated as follows:
teo is the elution time of a neutral marker that doesn’t interact with micelle and tmc is the elution time of micelle itself.
k’app = [(t – teo)/ (teo(1- t/tmc))]
MEKC
21
22
MEKC
E O F
M ic e l le s v e lo c it y
+
+
+ v e- v e
+
+
++ +
+ +
+
-+
+ ++ +
+ +
+
-+
+
++ +
+ +
+
-+
+
+ S u r fa c ta n t
+
+
+
+
+
++
+
+
+
+
+ +
+
+
+
+
++
+
+
+
+
+ +
+
+
+
+
++
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
++
+
+
+
+
+ +
+
+
+
+
++
+
+
+
+
+ +
+
+
+
+
++
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Cationic surfactant MEKC requires negative polarity voltage as EOF is reversed
Rozdziały chiralne
23
Rozdziały chiralne
Rozdziały chiralne
Ad+ Ad+
Ad+
Ad+
Al+
Ad+
Ad+Ad+
Ad+
Al+ Al+
Al+
Al+
Al+
Al+
24
Rozdziały chiralne
O
O
O
O
O
O
RN
H
H H+
Rozdziały chiralne
25
Mikroemulsje - MEEKC
SO3-
SO3-
SO3-
OH OH
OH OH
Na+
Na+
Oil droplet
WATER WATER
MEEKC
EOF
-
-
- -
--- -
Microemulsion velocity-
-
- -
--- -
-
--
-
--
--- -
- -
Droplet - SDS surfactant
-ve+ve
Rozdział w wysokim pH
26
Ruchliwość w MEEKC vs LogP
Valko 5 (7,1)
20
40
60
80
100
120
Res
pons
e
4 5 6 7 8 9Retention time
Phe
nace
tine
Ace
tani
lide
Ace
toph
enon
e
Pro
piop
heno
ne
But
yrop
heno
ne
Val
erop
heno
ne
Hex
anop
heno
ne
Hep
tano
phen
one
9.83
logP vs migration time
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
0 2 4 6 8 10
migration time
log
P
Altria KD, J.Chromatogr.A 892 (2000) 171-186