BADANIA GENETYCZNE

W DYSTROFIACH MIOTONICZNYCH

Anna Sułek

Pracownia Molekularnych Podstaw

Chorób Neurodegeneracyjnych

Zakład Genetyki, IPiN

Kurs Neurogenetyki

DYSTROPHIES NON-DYSTROPHIC

MYOTONIA MYOTONIC

DYSTROPHY

OBRAZ KLINICZNY DYSTROFII MIOTONICZNEJ – WIELE TWARZY

Choroba wieloukładowa, klinicznie heterogenna, miopatia miotoniczna

DM1 – 4 podtypy: łagodny, klasyczny, młodzieńczy i wrodzony

Typ 1: zaćma, łysienie, w późnym wieku może rozwinąć się miotonia

Typ 2: 2-3 dekada życia, osłabienie siły mięśni dystalnych, zaburzenia przewodzenia,

miotonia, objawy ze strony układu pokarmowego, apatia

Typ3: przypomina typ 2, zaburzenia poznawcze, zaburzenia zachowania

Typ4: słabe ruchy płodu, wielowodzie, dziecko wiotkie, zaburzenia oddychania

Antycypacja w dziedziczeniu

dystrofii miotonicznej

zjawisko obserwowane w dziedziczeniu niektórych chorób genetycznie

uwarunkowanych, charakteryzujące się wcześniejszym występowaniem

objawów choroby i cięższym (ostrzejszym) jej przebiegiem w kolejnych

pokoleniach.

ANTYCYPACJA

PATOGENEZA MOLEKULARNA

Poziom DNA – niestabilność powtórzeń mikrosatelitarnych Poziom RNA – toxic gain of function Poziom białka – czy bierze udział w patomechanizmie?

DYSTROFIA MIOTONICZNA TYPU 1

mutacja dynamiczna w genie DMPK (19q13)

ekspansja powtórzeń CTG w regionie nie ulegającym

translacji genu DMPK

5 - 37 CTG norma

38 - 49 CTG premutacja

> 50 CTG pełna mutacja

Produktem genu jest serynowo-treoninowa kinaza białkowa

związana z przewodnictwem i przekazywaniem sygnału wewnątrz

komórki. Aktywna w komórkach mięśnia sercowego i mięśni

szkieletowych

Sąsiedztwo genu DMPK i lokalizacja powtórzeń

SIX5 – czynnik transkrypcyjny zawierający homeodomenę,

pełniący funkcję w organogenezie

DMWD – dystrophia miotonica-containing WD repeat motif

Patogeneza na poziomie DNA

CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG

CTG CTG CTG CTG CTG CTG

CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG

mutacja dynamiczna de novo

CTG CTG CTG CTG CTG CTG

CAG mutacja dynamiczna –

zwielokrotnienie powtórzeń

mutacja dynamiczna

przypadek sporadyczny - 1%

choroba dziedziczna

Antycypacja

forma młodzieńcza – 10%

Niestabilność powtórzeń CTG/CCTG

Tworzenie struktur: pętle, potrójne helisy, kwadrupleksy i in.

Niestabilność somatyczna (większa w DM2)

DM1 (płód) – największe ekspansje w sercu a najmniejsze w wątrobie (40-400)

DM1 (dorosły) – największe ekspansje w sercu i korze mózgowej, najmniejsze

w móżdżku (5770 CTG)

Białka zaangażowane w procesy naprawcze DNA

Patogeneza na poziomie DNA

Frequency of DMPK alleles (DM1)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

5 8 10 11 12 13 14 15 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 28 29 30 31

allele (CTGn)

freq

ue

ncy %

Prawidłowy zakres liczby CTG a częstość występowania DM1

Proponowany mechanizm patologiczny w DM1 (gain of function)

• im więcej powtórzeń, tym bardziej zaburzony splicing

• poziom białka CUG BP jest podwyższony w mięśniach pacjentów z DM1

• CIC - białko kanału chlorkowego, specyficznego dla komórek

mięśniowych

CUG

mRNA białka CUG

BP

wzrost

alternatywnego

splicingu

różnych białek

IR (insulinooporność)

CIC-1 (miotonia)

DYSTROFIA MIOTONICZNA TYPU 1

Patogeneza DM

Mbnl1 CUG BP Mbnl1

CUG BP

Prawidłowy stan DM1

Elementy trans (spliceopathy)

W obecności mutRNA białko CUG-BP wiąże się z kompleksem

rybonukleinowym, co opóźnia jego szybki katabolizm i prowadzi do

akumulacji i „nadaktywności” w jądrze

Dwa czynniki splicingowe: białko Mbnl1 i CUG BP

Patogeneza DM – poziom RNA

Dwa czynniki splicingowe: białko Mbnl1 i CUG BP

Elementy cis

Transkrypty z ekspansją powtórzeń zostają w jądrze komórkowym

Tworzą struktury drugo-, trzecio- i czwartorzędowe

Brak białka DMPK – haploinsufficiency

Zaburzenia transkrypcji genów flankujących – SIX5 i DMAHP

Alternatywne składanie genów w DM1

Patogeneza – DM – poziom białka

Geny:

ClC1

IR

Troponina T (TNNT2,3)

Białko tau (MAPT), APP,

NMDAR1

Miotubularyna,

MTMR1 – myotubularin related 1 gene

SERCA1, 2, RγR,

Dystrofina (ex 71, 78)

?

?

Objawy:

Miotonia

Cukrzyca

Zaburzenia kardiologiczne

CNS

Miopatia

Zróżnicowanie mięśni

Zaćma

Inne

Geny, których alternatywny splicing może powodować objawy kliniczne DM

(CTG)n

(CCTG)n

Cytoplazma

zaburzona regulacja

alternatywnego splicingu genów:

TNNT2, TNNT3, CLCN1, IR, MAPT, MTMR1

NMDAR1, APP, SERCA1, SERCA2, RγR,

-dystrobrevin

Jądro komórkowe

zaburzona regulacja

transkrypcji genów:

NKX2-5, Sp1, CLCN1,

Connexin 40, 43

toksyczne RNA

Patogeneza DM – poziom białka

DMPK – kinaza białkowa serynowo/treoninowa związana z dynamiką aktyny

i homeostazą jonową

Ulega alternatywnemu splicingowi

Lokalizacja: DMPK A, B, C, D – białka błonowe ER i mitochondrium

DMPK E – białko w cytozolu

ZNF9 – „palce cynkowe” wiążące się do DNA

Prawidłowy poziom białka u pacjentów ?

DYSTROFIA MIOTONICZNA TYPU 1

Diagnostyka molekularna w DM1

badania diagnostyczne

badania przedobjawowe

badania prenatalne

DYSTROFIA MIOTONICZNA TYPU 1

Diagnostyka molekularna

wg Best Practice Guidelines for Molecular Analysis

of Myotonic Dystrophy EMQN

1. PCR

• dwa allele o prawidłowej liczbie CTG - jednoznaczne

wykluczenie DM1

• jeden allel - wynik nieinformatywny

hybrydyzacja, XL PCR

2. Southern blot (hybrydyzacja)

dokładne ustalenie liczby powtórzeń nie jest możliwe

powtórzenia CTG są niestabilne podczas mitoz

DYSTROFIA MIOTONICZNA TYPU 1

PCR z użyciem starterów znakowanych fluorescencyjnie

Diagnostyka dystrofii miotonicznej typu 1 z wykorzystaniem TP-PCR

NP

NP

NP

NP

DYSTROFIA MIOTONICZNA TYPU 2 (Richer syndrome,

PROMM)

• choroba wieloukładowa,

• autosomalny dominujący sposób dziedziczenia

• częstość występowania: głównie Europa

• antycypacja ? brak wyraźnej korelacji pomiędzy zakresem

mutacji a ciężkością objawów

DYSTROFIA MIOTONICZNA TYPU 2

mutacja dynamiczna w intronie 1 genu ZNF9 (3q13.3-q24)

ekspansja powtórzeń CCTG w niekodującym regionie

• 71 - 11.000 CCTG - mutacja

(TG)n(TCTG)n(CCTG)n

• motyw + sekwencje przerywające

• patologia na poziomie RNA

DYSTROFIA MIOTONICZNA TYPU 2

Diagnostyka molekularna

• rodzaje badań

• metody molekularne

• interpretacja wyników

DYSTROFIA MIOTONICZNA TYPU 1 i 2

epidemiologia

wiek zachorowania

antycypacja

forma wrodzona

sposób dziedziczenia

lokalizacja genu

gen

typ mutacji

rodzaj powtórzeń

liczba powtórzeń

rozpowszechniona

0 do wieku dorosłego

+

+

autosomalny dominujący

19q13.3

DMPK

dynamiczna

CTG

100 - 4.000

Europa

8 - 60 l.

nieznaczna

brak

autosomalny dominujący

3q21

ZNF9

dynamiczna

CCTG

średnio 5.000

DM1 DM2

Perspektywy terapeutyczne

STRATEGIE:

• redukcja aktywności białka Msh1 – zapobieganie ekspansji powtórzeń

• zwiększenie stężenia białka Mbnl1

• spowodowanie poprawności alternatywnego splicingu poszczególnych

transkryptów

• usuwanie toksycznych transkryptów zawierających powtórzenia - siRNA