Alternatywny splicingAlternatywny splicingWyjątek, który może być regułą?Wyjątek, który może być regułą?

Kamil LipińskiKamil Lipiński

Splicing jako potranskrypcyjna modyfikacja Splicing jako potranskrypcyjna modyfikacja mRNAmRNA

Schematy: „Genoms” T. A. Brown, 2001

Splicing konstytutywny (‘constitutive’)* Splicing alternatywny (‘alternative’)

*W ‘Molecular Biology of the Gene’ w ramach splicingu alternatywnego wyróżnia się alternatywny splicing regulacyjny oraz konstytutywny, co ma zupełnie inne znaczenie. W tej samej publikacji podzielono jednocześnie cały splicing na konstytutywny i alternatywny, analogicznie jak w powyższy schematach.

Izoformy

Sekwencja intronu a splicingSekwencja intronu a splicing

Ogólny schemat składania mRNA

„Genoms” T. A. Brown

Sekwencje konserwatywne w intronach kręgowcówConajmniej 15%, a być może nawet do 50% ludzkich chorób genetycznych powstaje na skutek mutacji albo w miejscach splicingowych albo w innych elementach warunkujących poprawnych splicing*

*Understanding alternative splicing: towards a cellular code, Nature reviews: 2005

Spliceosom - rola snRNPSpliceosom - rola snRNPRozpoznanie miejsc cięcia i składania zachodzi na zasadzie hybrydyzacji snRNA z sekwencjami konserwatywnymi w intronach. Motywy te mogą znajdować się wewnątrz eksonu czy intronu przypadkowo (miejsca kryptyczne). Musi zatem istnieć mechanizm zapewniający ich ignorowanie.

„Biochemia” Streyer, 2005

Mechanizm wyboru miejsc cięciaMechanizm wyboru miejsc cięcia i składaniai składania

Elementy ‘cis-acting’

Elementy ‘trans-acting’

Sekwencje posiłkowe (‘auxiliary elements’)

Sekwence konserwatywne w intronach

Miejsca donorowe

Miejsca akceptorowe

Miejsca rozgałęzienia

Trakt polipirymidynowy (PPT) Silencery

Enhancery

snRNP spliceosomu

Czynniki splicingowe

Represory splicingu

Aktywatory splicingu

Schemat: projekt własny, na podstawie danych z różnych pozycji w bibliografii

Mechanizm wyboru miejsc cięcia i składaniaMechanizm wyboru miejsc cięcia i składaniaRekrutacja białek regulacyjnych (czynników splicingowych) na pre-mRNA wpływa na

rozpoznawanie miejsc cięcia i składania mRNA przez snRNP spliceosomu.

„Protein Diversity from Alternative Splicing. A Challenge for Bioinformatics and Post-Genome Biology” Douglas L. Black, Cell 103:368, 2000

• ESE – ‘exonic splicing enhancer’

• ISE – ‘intronic splicing enhancer’

• ESS – ‘exonic splicing silencer’

• ISS – ‘intronic splicing silencer’

Sekwencje rozpoznawane przez czynniki splicingowe:

Rola czynników splicingowychRola czynników splicingowych

PTB / hnRNPI

Rekrutacja białek regulacyjnych (czynników splicingowych) na pre-mRNA wpływa na rozpoznawanie miejsc cięcia i składania mRNA przez snRNP spliceosomu.

*RRM – „RNA Recognition Motif”

RRM3 i 4 rozpoznaje CUCUCU*

Schemat: http://www.mimg.ucla.edu, http://www.library.csi.cuny.edu

Białka z rodziny SR i hnRNP

Mechanizmy aktywacji i represjiMechanizmy aktywacji i represji

Schemat: na podstawie „Understanding alternative splicing (…)”, Nature reviews, 2005

PTB wypętla ekson N1 w ssaczym genie src, co powoduje jego pominięcie

Z pre-mRNA genu tat wirusa HIV1 powstają dwa warianty mRNA. Proporcja zależy od względnej ilości/aktywności hnRNPA1 i SF2/ASF

PoziomyPoziomy zjawiskazjawiska

Poprzez alternatywny splicing z jednego pre-mRNA danego genu powstają różne warianty mRNA (zazwyczaj więc różne izoformy białek):

• w jednym rodzaju komórek:

- gen receptora DSCAM Drosophila

- antygeny t/T wirusa SV40

• w komórkach różnego rodzaju (tkanki):

- gen α-tropomiozyny szczura

- src ssaków

• w komórkach różnych osobników tego samego gatunku:

- sxl, tra, tra-2, dsx - determinacja płci u Drosophila melanogaster

KlasyfikacjaKlasyfikacja

• Pominięcie eksonu (‘exon skipping’)

- sxl, dsx Drosophila

- gen α-tropomiozyny szczura

- src ssaków

• Zatrzymanie intronu (‘intron retention’)

• Alternatywne 5’końcowe miejsce

• Alternatywne 3’końcowe miejsce

- tra Drosophila

- gen antygenu T/t SV40

• Wybór jednego z eksonów

- gen receptora DSCAM Drosophila

Schemat: http://www.stanford.edu

Splicing antygenu T/t wirusa SV40

Obie izoformy powstają w zakażonej komórce w określonej proporcji.

AS w genie antygenu T/t wirusa SV40AS w genie antygenu T/t wirusa SV40

Zidentyfikowany czynnik splicingowy, odpowiedzialny za wybór 5’ miejsca, nazwano ASF (‘alternative splicing factor’). Czynnik ten okazał się być tym samym, co SF2 - czynnikiem biorącym udział we wczesnym etapie asocjacji spliceosomu na wielu różnych pre-mRNA różnych genów. Przykład wyboru alternatywnego 5’

miejsca do wspólnego 3’ miejsca

ASF/SF2 jest białkiem z rodziny SR. Zwiększona koncentracja promuje wybór 5’ miejsca najbliższego do 3’ miejsca.

Schemat: na podstawie „Genes VIII”, Benjamin Levin, 2004

AS AS αα--tropomiozyny szczura tropomiozyny szczura

Izoforma białka powstającego w wyniku ekspresji genu zależy od rodzaju komórki, a więc w różnych tkankach powstają różne warianty mRNA. Oznacza to, że mechanizm regulujący alternatywny splicing tego genu jest tkankowo specyficzny.

Schemat: http://www.oregonstate.edu

Izoformy tropomiozyny powstają w wyniku pomijania eksonów (‘exon skipping’)

AS genu DSCAM AS genu DSCAM DrosophilaDrosophila

„Protein Diversity from Alternative Splicing. A Challenge for Bioinformatics and Post-Genome Biology” Douglas L. Black, Cell 103:368, 2000

Każdy mRNA będzie zawierał jedną z:

• 12 możliwych alternatyw dla eksonu 4 (czerwony)

• 48 możliwych alternatyw dla eksonu 8 (niebieski)

• 33 możliwych alternatyw dla eksonu 9 (zielony)

• 2 możliwych alternatyw dla eksonu 17 (żółty)

W efekcie daje to możliwości powstania 38,016 różnych mRNA i białek

AS w determinacji płci somatycznej AS w determinacji płci somatycznej DrosophilaDrosophilaSpecyficzne dla płci alternatywne wycinanie intronów z pre-mRNA sxl Gen podlega samoregulacji: wczesne białko SXL powoduje pominięcie eksonu 3 w mRNA późnego białka SXL (prowadzi do represji splicingu)

Schemat: projekt własny, na podstawie danych z różnych pozycji w bibliografii

sxl – (‘sex lethal’) nadzędny gen regulatorowy somatycznej determinacji płci

AS w determinacji płci somatycznej AS w determinacji płci somatycznej DrosophilaDrosophila

Schemat: projekt własny, na podstawie danych z różnych pozycji w bibliografii

SXL promuje wybór kryptycznego 3’ miejsca splicingu wewnątrz eksonu 2. TRA powoduje pominięcie eksonu 4 w mRNA dsx, zawierającego kodon stop. Zarówno krótsza jak i dłuższa izoforma DSX jest funkcjonalna.

DSX(F) i DSX(M) są regulatorami transkrypcji genów wykonawczych

BibliografiaBibliografia

• „„Genetyka molekularna” , Genetyka molekularna” , praca zbiorowa pod redakcją Piotra Węgleńskiego, praca zbiorowa pod redakcją Piotra Węgleńskiego, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2006Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2006

• „„Genomy”,Genomy”, T. A. Brown, przekład pod redakcją Piotra Węgleńskiego, Wydawnictwo T. A. Brown, przekład pod redakcją Piotra Węgleńskiego, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2001Naukowe PWN, Warszawa 2001

• „„Protein Diversity from Alternative Splicing. A Challenge for Bioinformatics and Post-Protein Diversity from Alternative Splicing. A Challenge for Bioinformatics and Post-Genome Biology”, Genome Biology”, Douglas L. Black, Douglas L. Black, CellCell 103:368, 2000 103:368, 2000

• „„Molecular Biology of the Gene, fifth edition”,Molecular Biology of the Gene, fifth edition”, James D. Watson et al.., 2004 James D. Watson et al.., 2004

• „„Genes VIII”,Genes VIII”, Benjamin Lewin, 2004 Benjamin Lewin, 2004

• Understanding alternative splicing: towards a cellular code”,Understanding alternative splicing: towards a cellular code”, Arianne J. Martiln, Arianne J. Martiln, Francis Clark, Christopher W. J. Smith, Francis Clark, Christopher W. J. Smith, Nature reviews:Nature reviews: 2005 2005

• „„Splicing in action: assessing disease causing sequence changesSplicing in action: assessing disease causing sequence changes”, D. Baralle, M. ”, D. Baralle, M. Baralle, JMG Online, 2005Baralle, JMG Online, 2005

• „„Function of alternative splicing”,Function of alternative splicing”, Stefan Stamm et al.., Science Direct, 2005 Stefan Stamm et al.., Science Direct, 2005

• „„Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing”,Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing”, Douglas L. Black, Annual Douglas L. Black, Annual Review of Biochemistry, 2003 Review of Biochemistry, 2003

ELASTYCZNE i SELEKTYWNE ‘ŁĄCZENIE’ SEKWENCJI

NONSENSE-MEDIATED DECAY

BIAŁKA ‘KOMBINOWANE’ (IZOFORMY)

REGULACJA EKSPRESJI

ALTERNATYWNY SPLICING

GENEROWANIE ZŁOŻONYCH PROTEOMÓW

„CELLULAR CODE”

TKANKOWO SPECYFICZNA REGULACJA EKSPRESJI

SEKWENCJA ORF

INNE MODYFIKACJE

ZMIANY O CHARAKTERZE REGULACYJNYM

RUST

miejsce akceptorowe

5’-AG-3’

ekson 1 ekson 2intron

5’ 3’

Pre-mRNA

miejsce donorowe

5’-GU-3’

trakt pirymidyn

5’-YYYYYY-3’

miejsce rozgałęzienia

5’-A-3’

ekson 1 ekson 2Intron 1

5’ 3’ekson 3Intron 2

ekson 1 ekson 2 ekson 3

ekson 1 ekson 3

mRNA 1

mRNA 2

Negatywny czynnik splicingowy (represor splicingu) np. Sxl, PTB

Pozytywny czynnik splicingowy (aktywator splicingu) np. białka SR

snRNP spliceosomu np. U1 snRNP