DIAGNOSTYKA W MIKROBIOLOGII
ŻYWNOŚCI
PRZEWODNIK DO ĆWICZEŃ DLA STUDENTÓW II ROKU
KIERUNKU MIKROBIOLOGIA
(opracowanie: dr inż. Wioleta Chajęcka-Wierzchowska)
KATEDRA MIKROBIOLOGII PRZEMYSŁOWEJ I ŻYWNOŚCI
WYDZIAŁ NAUKI O ŻYWNOŚCI
OLSZTYN 2017
DIAGNOSTYKA W MIKROBIOLOGII ŻYWNOŚCI
KIERUNEK: MIKROBIOLOGIA ROK AKADEMICKI 2017/2018
ĆWICZENIE 1 31.10.2017r. wt. Zasady organizacji laboratorium mikrobiologicznego.
1. Zasady pracy w laboratorium mikrobiologicznym – fartuchy, obuwie, układ sali 2. Sylabus 3. Harmonogram ćwiczeń 4. Zakres kolokwium I:
Mikroflora mleka i przetworów mleczarskich (mleko surowe, mleko pasteryzowane, UHT, mleko w proszku, sery, masło, śmietana)
Rutynowe kierunki badan mikrobiologicznych mleka i produktów mlecznych
Mikroflora mięsa i przetworów mięsnych (mięso świeże, mięso mielone, przetwory: kiełbasy, w ty dojrzewające, wędliny, wyroby garmażeryjne)
Kierunki badań mikrobiologicznych mięsa i przetworów mięsnych.
Przetwory owocowe, warzywne i owocowo-warzywne (konserwy) – mikroflora, kierunki badań mikrobiologicznych
Piwo, słód, drożdże piekarskie – zanieczyszczenia mikrobiologiczne, metody badań.
5. Normy ISO, Rozporządzenie 2073
ĆWICZENIE 2 02.11.2017r. – czw. godziny rektorskie
Kryteria bezpieczeństwa żywności.
1. Pobieranie próbek do badań
Pierwszym etapem analizy mikrobiologicznej żywności jest pobranie i przygotowanie
próbki do badań. Niewłaściwe pobranie próbki może prowadzić do uzyskania wyników
fałszywie ujemnych bądź fałszywie dodatnich. Gdy mówimy o pobieraniu próbek, często
używa się terminu „próbka reprezentatywna”. Próbka powinna odzwierciedlać obraz
produktu, z którego pochodzi w sposób tak precyzyjny jak tylko jest to możliwe. Z produktów
płynnych np. mleka dość łatwo jest pobrać próbkę reprezentatywną, jeśli mleko zostało
wystarczająco wymieszane przed pobraniem próbki. Natomiast gdy jest badany produkt o
dużej lepkości, z powolnym przepływem lub o niejednorodnej strukturze wówczas
niezmiernie trudno jest ocenić jakość mikrobiologiczną całej partii (np. beczki lub ładunku
samochodu) przez zbadanie tylko jednej 25 gramowej próbki. Odpowiedź na pytanie
dotyczące wymaganej ilości próbek jednostkowych jest niezmiernie trudna. Z uwagi na
wysokie koszty badań mikrobiologicznych, liczba próbek z reguły jest ograniczona. Do
pobierania próbek w laboratorium mikrobiologicznym używa się sterylnych narzędzi np.
łyżeczek, skalpeli, noży, szpatułek, pipet. Produkty które są zamrożone najpierw należy
odmrozić w temperaturze poniżej 5°C ( nie dłużej niż 12 godzin). Jeśli próby są głęboko
mrożone do poboru stosuje się jałowe świdry.
Oznaczanie Salmonella sp. w produktach żywnościowych zawsze polega na wykryciu
obecności tych pałeczek w określonej ilości produktu (z reguły jest to 25g/ ml, bardzo rzadko
10g/ml), nie oznacza się natomiast liczby tych drobnoustrojów w żywności. Zarówno w
metodzie klasycznej jak i jej modyfikacjach pierwszym etapem oznaczenia jest etap
nieselektywnego namnażania. Jest on niezmiernie ważny ponieważ produkcja żywności wiąże
się z jej obróbką technologiczną np. ogrzewaniem co może spowodować śmierć większości
komórek lub ich subletalne uszkodzenie. Pominięcie etapu przednamnażania próbki i posiew
materiału bezpośrednio na podłoże stałe może dać wyniki fałszywie negatywne. Jeżeli w
badanym materiale jest bardzo mała liczba żywych komórek, bądź komórki zostały
subletalnie uszkodzone podczas procesów technologicznych, możemy nie otrzymać
widocznych makroskopowo koloni na podłożu stałym. W takim wypadku istnieje
niebezpieczeństwo dopuszczenia produktu do obrotu, mimo, że nie spełnia on kryteriów
bezpieczeństwa. Podczas przechowywania takiego produktu może nastąpić odbudowa
uszkodzonych komórek i namnożenie bakterii do poziomu niebezpiecznego dla konsumenta.
2. Klasyczna metoda oznaczania pałeczek Salmonella w żywności
Wykrywanie obecności pałeczek Salmonella zgodnie z Rozporządzeniem Komisji
Europejskiej 2073/2005 przeprowadza się zgodnie z normą ISO 6579 2003. Rozporządzenie
wskazuje, że wykrywanie obecności pałeczek Salmonella w żywności powinno być
przeprowadzane dla takich produktów jak: surowe mięso, produkty mięsne przeznaczone
do spożycia na surowo, żelatyna, sery, masło, śmietana, niepasteryzowane mleko, mleko
w proszku, jaja i produkty zawierające surowe jaja, skorupiaki, mięczaki, owoce i warzywa,
soki niepasteryzowane, preparaty w proszku dla niemowląt i żywność dietetyczna specjalnego
przeznaczenia medycznego. Norma ISO 6579 2003, obejmuje cztery etapy oznaczeń
i w zależności od konieczności potwierdzeń trwa od 5 do 7 dni:
1. Przednamnażania w nieselektywnej pożywce płynnej
2. Namnażanie selektywne w pożywkach płynnych
3. Różnicowanie na pożywkach stałych
4. Badania potwierdzające (biochemiczne i serologiczne)
Rys. 1 Schemat postępowania przy oznaczaniu pałeczek Salmonella w żywności wg ISO 6579.
W pierwszym etapie, w celu namnożenia i regeneracji komórek uszkodzonych
prowadzi się hodowlę na płynnej wodzie peptonowej w temperaturze 37°C przez 18±2godz.
Zbuforowana woda peptonowa stosowana jest w celu nieselektywnego namnażania
pałeczek Salmonella sp. Dla takich produktów jak kakao czy wyroby z czekolady stosuje się
wodę peptonową z dodatkiem kazeiny lub odtłuszczonego mleka oraz zieleni brylantowej
w celu zahamowania wzrostu bakterii Gram-dodatnich. Dla produktów żywnościowych
kwaśnych i ukwaszonych powinno się stosować wodę peptonowa o podwójnym stężeniu
składników, natomiast dla mięsa i żywności o wysokiej zawartości tłuszczów
przednamnażanie należy prowadzić w bulionie laktozowym z dodatkiem Triton X-100.
Z hodowli po etapie przednamnażania nieselektywnego pobiera się 0,1cm3 i posiewa
do 10cm3 pożywki selektywnej Rapaport-Vassiliadis z soją oraz do pożywki MKTTn w ilości
1 cm3. Pożywka Rappaport-Vassiliadis (RVS) jest płynna, silnie selektywna, zawiera
w swoim składzie zieleń malachitową i chlorek sodu (hamujące wzrost mikroflory
towarzyszącej). Pepton sojowy, pH 5,2 i podwyższona temperatura inkubacji (41,5°C)
sprzyjają wzrostowi szczepów Salmonella. sp Podłoże ma barwę ciemnoniebieską i jest
klarowne. Szczepy Salmonella sp. rosną na tym podłożu w postaci mlecznego osadu, barwa
samego podłoża nie ulega zmianie. Druga pożywka selektywna: Müllera-Kauffmana
(KKTTn), zawiera w swoim składzie tiosiarczan sodu i jodek potasu, które reagując tworzą
związek o nazwie tetrationian sodu hamujący wzrost pałeczek grupy coli. Pałeczki
Salmonella sp. mają zdolność do redukcji tego związku. W podłożu znajduje się także zieleń
brylantowa, która z kolei hamuje wzrost bakterii Gram-dodatnich.
Po inkubacji w temperaturze 37°C przez 48±3godz. hodowle posiewa się izolacyjnie
na dwie pożywki selektywne, w sposób umożliwiający otrzymanie pojedynczych kolonii.
Pierwszą z nich jest pożywka XLD (xylose lysine deoxycholate agar). Druga pozostaje do
wyboru przez laboratorium i może to być podłoże BGA (brillant green agar), Hektoen lub
Wilson-Blaira. Pożywka XLD (wg EN-ISO 6579 agar z ksylozą, lizyną i dezoksycholanem)
zawiera laktozę, ksylozę, sacharozę, L-lizynę, tiosiarczan sodu, deoksycholan sodu, cytrynian
amonowo-żelazowy (III), czerwień fenolową. Czynnikami różnicującymi pożywki są:
laktoza, sacharoza, ksyloza, lizyna oraz tiosiarczan sodu, z którego uwalniany jest
siarkowodór, tworzący w reakcji z solami żelaza (III) czarny osad siarczku żelaza w środku
kolonii. Wskaźnikiem pH jest czerwień fenolowa. Pożywka pozwala określić zdolność do
fermentacji cukrów. Inkubacja w temp. 37ºC przez 24±3 godz. Typowe kolonie mogą być
bezbarwne, bardzo jasne, lekko błyszczące i przezroczyste (kolor podłoża) z czarno
zabarwionym środkiem, otoczone jasnoczerwoną strefą i z żółtym brzegiem lub mieć
zabarwienie od różowego do czerwonego, z czarnym środkiem lub bez czarnego środka.
Szczepy Salmonella H2S-ujemne (np. S. Paratyphi A) są bezbarwne lub jasnoróżowe z
ciemniejszymi środkami. Szczepy Salmonella laktozo-dodatnie rosną na pożywce XLD w
postaci kolonii żółtych z charakterystycznym zaczernieniem lub bez takiego zaczernienia.
Podłoże BGA. Czynnikami różnicującymi podłoża są cukry: sacharoza i laktoza. Czynnikiem
selektywnym jest zieleń brylantowa Typowe kolonie są przezroczyste, bezbarwne lub lekko
różowe, a barwa wokół kolonii zmieniona z różowej na jasnoczerwoną.
Podłoże Hektoena. Czynnikiem selektywnym są sole żółci, hamujące wzrost bakterii Gram
(+). Czynnikami różnicującymi są trzy cukry: laktoza, sacharoza oraz salicyna. Podwyższona
zawartość laktozy nie pozwala na pominięcie bakterii fermentujących ten cukier z
opóźnieniem. Kolonie bakterii tworzących siarkowodór mają czarny środek wskutek reakcji
siarkowodoru z żelazem (III). Typowe kolonie pałeczek Salmonella sp. są barwy zielonej z
lub bez czarnego środka.
Podłoże Wilson-Blaira. Jest to podłoże silnie wybiórcze i różnicujące dla pałeczek
Salmonella, w tym S. Typhi izolowanych z żywności. Pałeczki Salmonella spp. w zależności
od szczepu rosną w postaci czarnych kolonii otoczonych strefą czarnego podłoża lub
ciemnobrązowych i brązowych bez strefy. Cechą charakterystyczną dla kolonii Salmonella
spp. jest metaliczna, połyskująca powierzchnia jako wynik produkcji siarkowodoru,
tworzącego metaliczno-czarny osad w reakcji z jonami żelaza. Wzrost bakterii Gram-
dodatnich i innych Enterobacteriaceae w tym Shigella spp. jest silnie hamowany przez
obecną w podłożu zieleń brylantową i siarczyn bizmutu.
Podłoże chromogenne Rambach-agar – z deoksycholanem sodu, glikolem propylenowym
i mieszanina chromogenną. Kolonie Salmonella sp. są barwy czerwonej w wyniku fermentacji
glikolu; bakterie laktozododatnie z grupy coli, dzięki działaniu galaktozydazy niszczą
wiązanie między składnikami mieszaniny chromogennej, a uwalniający się chromofor daje
niebiesko-fioletowe lub niebiesko-zielone zabarwienie ich kolonii. Salmonella Typhi i
Salmonella Paratyphi tworzą na tym podłoży kolonie bezbarwne lub żółtawe.
Po 48godz. inkubacji w 37°C dokonuje się wstępnej identyfikacji na podstawie wyglądu
kolonii wyrosłych na podłożach selektywnych. Z każdej płytki wybiera się 5
charakterystycznych kolonii i posiewa izolacyjnie na podłoże agar odżywczy, a następnie
wykonuje się badania biochemiczne. W celu wykonania powyższych badań stosuje się testy
biochemiczne wykonywane na następujących podłożach:
Agar trójcukrowy z żelazem - podłoże TSI (Triple-sugar iron agar) z laktozą, sacharozą,
glukozą, siarczanem żelaza III i czerwienią fenolową (wskaźnik zmiany barwy), na
podłożu ocenia się zdolność do fermentacji cukrów (glukoza, laktoza, sacharoza) i
tworzenia H2S oraz gazu
Agar z mocznikiem wg Christiensena (wytwarzanie ureazy) – podłoże zawiera
ekstrakt drożdżowy, KH2PO4, Na2HPO4, mocznik, czerwień fenolową. Jeżeli po 24godz.
hodowli nastąpiła zmiana barwy na amarantowy świadczy to o rozkładzie mocznika
(obecność NH4OH)
podłoże z lizyną (dekarboksylacja lizyny) w pożywce znajduje się także ekstrakt
drożdżowy, glukoza i purpura bromokrezolową. Po zaszczepieniu podłoża, posiew należy
zalać parafiną, po czym wstawić do inkubacji. Zawsze wykonujemy próbę kontrolną.
Drobnoustroje podczas wzrostu zużywają glukozę, zakwaszając podłoże (zmiana barwy
na żółtą), następnie zachodzi rozkład aminokwasów powodujący wtórną alkalizację i
powrót do barwy fioletowej, podczas gdy próba kontrolna jest barwy żółtej.
podłoże Clarka (reakcja Vogues-Proskauera-VP ora MR) podłoże zawiera glukozę i
pepton. Celem wykonania próby VP i MR posiew wykonuje się do dwóch probówek z
podłożem Clarka. Probówki na próbę VP inkubuje się 48 h, a probówki na próbę
MR 72 h w temperaturze 37°C.
podłoże peptonowe z tryptofanem (wytwarzanie indolu) – zdolność do rozkładu
aminokwasu aromatycznego: tryptofanu- po zaszczepieniu i inkubacji należy zbadać
obecność indolu za pomocą odczynnika Kovacsa. Powstanie czerwonej obrączki świadczy
o obecności indolu.
wykrywanie β-galaktozydazy - służy do tego test krążkowy nasączony ONPG, który w
obecności ß-galaktozydazy ulega rozszczepieniu do związku o barwie żółtej. Test
wykonuje się w probówce zawierającej 0,1 cm3
sterylnej wody, którą zaszczepia się
odrobiną hodowli, a następnie umieszcza się tam krążek testowy i poddaje inkubacji. ß-
galaktozydaza jest enzymem odpowiedzialnym za rozkład laktozy do glukozy i galaktozy.
Interpretacja wyników biochemicznych:
TSI
słupek
- barwa żółta – fermentacja glukozy,
- barwa czerwona lub niezmieniona – brak fermentacji glukozy,
- barwa czarna – wytworzenie siarkowodoru (powstały w hodowli siarkowodór reaguje z
jonami Fe2+
dając siarczek żelaza, który zaczernia podłoże,
- pęcherzyki gazu lub rozerwanie słupka – wytworzenie gazu z glukozy.
skos
- barwa żółta – fermentacja laktozy i/lub sacharozy,
- barwa czerwona lub niezmieniona – brak fermentacji laktozy i/lub sacharozy
A B C D E Laktoza/sacharoza (-)
Glukoza (-)
H2S (-)
Gaz (-)
Kontrola Laktoza/sacharoza (-)
Glukoza (+)
H2S (-)
Gaz (-)
Laktoza/sacharoza (+)
Glukoza (+)
H2S (-)
Gaz (+)
Laktoza/sacharoza (-)
Glukoza (+)
H2S (+)
Gaz (-)
Posiewając na podłoże TSI nie należy wkłuwać igły do dna probówki, ponieważ
w przypadku reakcji dodatniej na siarkowodór (zaczernienie) utrudniony będzie odczyt
fermentacji laktozy i sacharozy.
Tabela. 1. Wyniki posiewów wybranych pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae
na podłoże TSI.
podłoże wg Christensena; zmiana barwy pożywki na różowoczerwony lub amarantowy
kolor świadczy o rozkładzie mocznika z uwolnieniem amoniaku,
podłoże z lizyną, zmętnienie i purpurowe zabarwienie pożywki świadczy
o dekarboksylacji lizyny – wynik dodatni,
podłoże Clarka:
próba VP, po inkubacji dodać do hodowli po 2 krople roztworu kreatyny i KOH oraz 3
krople etanolowego roztworu α-naftolu. Wytworzenie różowego lub jasnoczerwonego
zabarwienia pożywki w ciągu 15 min. w temp. pokojowej wskazuje wynik dodatni –
obecność acetoiny, która w środowisku alkalicznym, w obecności keratyny, przy dostępie
tlenu, utlenia się do diacetylu. Diacetyl w obecności α-naftolu reaguje z guanina zawarta
w peptonie , dając czerwone zabarwienie świadczące o próbie dodatniej VP.
próba MR, po inkubacji dodać kroplę czerwieni metylowej. Czerwone zabarwienie na
powierzchni świadczy o wyniku dodatnim
podłoże z tryptofanem, po inkubacji dodać 1 cm3 odczynnika Kovacsa; powstanie
czerwonej obrączki świadczy o obecności indolu,
3. Testy API 20E
Do określenia cech biochemicznych pałeczek Salmonella można także zastosować
gotowe testy biochemiczne API 20E (Biomerieux) służące do identyfikacji bakterii z rodziny
Enterobacteriaceae.
Rys. 1. Wynik testu API 20E pozytywnego dla pałeczek Salmonella.
Paski API 20 E składają się z 20 mikroprobówek zawierających odwodnione substraty.
Integralną częścią testu API 20 E jest też test na oksydazę. Substraty zostają uwodnione
poprzez dodanie zawiesiny bakterii. Uwodnione substraty stanowią również podłoża do
hodowli bakterii. Procesy metaboliczne zachodzące podczas inkubacji powodują zmiany
koloru, które są albo spontaniczne, albo wywołane przez dodanie odczynników. Lista testów
znajdujących się na paskach API 20 E:
ONPG – test na zdolność rozkładu laktozy. Proces rozkładu laktozy wymaga kilku
enzymów, w tym β-galaktozydazy. W teście ONPG używa się molekularnego wskaźnika:
orto-nitrofenylo-β-D-Galaktopiranozydu, który w przypadku obecności β-galaktozydazy
spowoduje pojawienie się żółtego zabarwienia.
ADH, LCD, ODC - testy badające zdolność do dekarboksylacji aminokwasów (lizyny,
ornityny, argininy) w warunkach beztlenowych z wytworzeniem amin biogennych.
Bakterie hoduje się na pożywkach zawierających badany aminokwas jako substrat, oraz
barwnik wskazujący zmiany pH pożywki. Podczas hodowli drobnoustroje wykorzystują
najpierw glukozę – bardziej przyswajalne źródło węgla, a po jej zużytkowaniu, jeżeli
wytwarzają odpowiednią dekarboksylazę, rozkładają aminokwasy. Wykorzystanie
glukozy powoduje zakwaszenie hodowli i podłoże przyjmuje zabarwienie żółte, zaś
wtórna alkalizacja środowiska w wyniku dekarboksylacji aminokwasu powoduje zmianę
barwy na pomarańczowo-czerwoną. Podobny mechanizm zachodzi w przypadku testu na
dihydrolazę argininy (ADH).
CIT – test na wykorzystanie cytrynianu. Na podłożu z cytrynianem trisodowym, wyrastają
bakterie zdolne do wykorzystania tego związku jako jedynego źródła węgla oraz jako
źródła azotu – jonu amonowego. Źródłem tego jonu w podłożu jest fosforan amonowy.
Drobnoustroje poprzez uwalnianie amoniaku z fosforanu amonowego alkalizują
środowisko, co w obecności wskaźnika – błękitu btomotymolowego prowadzi do zmiany
barwy podłoża na niebieską.
H2S – wytwarzanie siarkowodoru. H2S powstaje w wyniku rozkładu aminokwasów
siarkowych. Enzym, który warunkuje ten proces – sulfhydraza, hydrolizuje wiązania
chemiczne pomiędzy grupą sulfhydrolową (- SH) a resztą aminokwasu. Uwolniona grupa
–SH zostaje zredukowana do H2S środowisku wzrostu bakterii. Wydzielany H2S
wykrywa się poprzez jego reakcję z octanem ołowiu, podczas której wydziela się siarczek
ołowiu o czarnym zabarwieniu.
URE – hydroliza mocznika. Mocznik jest rozkładany przez bakterie syntetyzujące ureazę.
Produktami końcowymi tego rozkładu są NH3 i CO2. Właściwości te u bakterii badamy
na podłożu zawierającym mocznik jako jedyne źródło azotu oraz indykator – czerwień
krezolową.
TDA – wytwarzanie amoniaku. Amoniak powstaje podczas deaminacji aminokwasów.
Amoniak wykrywa się poprzez reakcję barwną z indykatorem dodanym do pożywki np. z
odczynnikiem Nesslera (odczynnik jodowo-rtęciowy) tworzy on brunatne zabarwienie.
IND – rozkład tryptofanu – próba na indol. Bakterie syntetyzujące enzym tryptofanazę
rozkładają tryptofan z wytworzeniem indolu. Obecność indolu sprawdzamy traktując
kulturę specjalnym odczynnikiem wywołującym reakcję barwną.
VP – próba Voges-Proskauera, służy do identyfikacji bakterii z rodziny
Enterobacteriaceae, które prowadzą rozkład glukozy z wytwarzaniem wielu produktów
pośrednich i końcowych: kwasów organicznych, etanolu, gazów CO2 i H2, a także
acetoiny (produkt kondensacji dwóch cząsteczek kwasu pirogronowego) oraz 2,3
butandiolu. Produkty te są wytwarzane w różnych zestawieniach jakościowych i
ilościowych u różnych gatunków bakterii (np. u E. coli kwasy organiczne są głównymi
produktami a 2,3 butandiol wytwarzany jest w niewielkiej ilości. Obecność acetoiny
(prekursor 2,3 butandiolu) w próbce decyduje o pozytywnej reakcji VP. Acetoinę
wykrywa się poprzez dodanie alkoholowego roztworu α-naftolu, stężonego KOH i
kreatyny, co w efekcie daje czerwone zabarwienie.
GEL – upłynnianie żelatyny. Bakterie wytwarzające enzym żelatynazę hydrolizują
żelatynę z wytworzeniem rozpuszczalnych w wodzie peptydów. Upłynniona żelatyna nie
krzepnie w temperaturze pokojowej.
GLU, MAN, INO, SOR, RHA, SAC, MEL, AMY, ARA – testy do badania zdolności
drobnoustrojów do rozkładania węglowodorów (glukozy, mannozy, inozytolu, sorbitolu,
ramnozy, sacharozy, melibiozy, amigdaliny, arabinozy). W podłoży stosuje się
dodatkowe wskaźniki powodujące zmianę zabarwienia pod wpływem produktów
rozkładu węglowodorów.
OX – test na oksydazę. Oksydaza cytochromowa jest enzymem końcowym układu
oddechowego bakterii tlenowych i przenosi elektrony na tlen atmosferyczny z
wytwarzaniem H2O. Test ten pozwala na różnicowanie bakterii na tlenowe i beztlenowe.
Obecność oksydazy w bakteriach wykrywamy za pomocą odczynnika ‘NADI’
(chlorowodorek dimetylo-p-fenylodoaminy i α-naftolu). Powstanie fioletowego
zabarwienia świadczy o dodatniej próbie.
Testy przeprowadza się na organizmach wyizolowanych bezpośrednio z badanych prób.
Poszczególne etapy obejmują:
1. Przygotowanie komory inkubacyjnej (pokrywki i podstawki) - na podstawkę nanieść
ok. 5 ml wody destylowanej, w celu zapewnienia odpowiedniej wilgotności podczas
inkubacji
2. Wyjąć pasek z opakowania i umieścić w komorze inkubacyjnej
3. Przygotować jednorodną zawiesinę bakterii poprzez pobranie pipetą pojedynczej
kolonii i dodanie jej do probówki zawierającej 5 ml soli fizjologicznej
4. Przy pomocy tej samej pipety napełnić zawiesiną bakteryjną probówki na pasku
(unikając tworzenia się pęcherzyków przy podstawie probówki, przechylając nieco
pasek i umieszczając końcówkę pipety naprzeciw zagłębienia)dla testów CIT, VP i
GEL napełnić zarówno probówkę jak i wgłębienie mikroprobówkidla innych testów
napełnić jedynie probówkę (bez wgłębień)
5. Dla testów ADH, LCD, ODC, H2S i URE wytworzyć warunki beztlenowe poprzez
naniesienie oleju mineralnego
6. Zamknąć komorę i inkubować w 36oC przez 18-24 h
Jeśli 3 lub więcej testów (test GLU + lub -) jest pozytywnych zanotować wyniki
wszystkich reakcji spontanicznych na karcie wyników a następnie odczytać testy wymagające
dodania odczynników.
W przypadku niektórych testów wymagane jest dodanie przed odczytem odpowiednich
odczynników:
TDA: dodać 1 kroplę odczynnika TDA (chlorek żelaza). Czerwono-brązowy kolor wskazuje
na reakcję pozytywną co należy wpisać do karty wyników
VP: dodać po 1 kropli z każdego odczynnika VP1 (α-naftol) i VP2 (KOH). Odczekać
przynajmniej 10 min; różowy lub czerwony kolor wskazuje na reakcję pozytywną; jeśli po 10
min pojawi się blado różowy kolor, reakcję należy uznać za negatywną
IND: dodać 1 kroplę odczynnika JAMES; różowy kolor powstający w całej probówce
wskazuje na reakcję pozytywną
Test INDOL należy wykonać na końcu, ponieważ w trakcie jego wykonania dochodzi do
wytwarzania produktów gazowych, które wpływają na interpretację innych wyników na
pasku. Plastikowa pokrywka inkubacyjna nie powinna być podnoszona po dodaniu
odczynnika.
W celu wykonania testu na oxydazę (OX) kroplę odczynnika (oksydazy) zakroplić
bezpośrednio na kolonię na płytce Petriego; w przypadku pozytywnej reakcji nastąpi zmiana
koloru na różowy w ciągu 1 minuty, następnie na niebieski i czarny; w przypadku reakcji
negatywnej nie nastąpi zmiana zabarwienia kolonii.
Identyfikację bakterii uzyskuje się używając bazy danych z Książki Kodowej, poprzez
odszukanie właściwego profilu numerycznego, lub przy pomocy oprogramowania
komputerowego apiwebTM
.
Rys. 2. Negatywne wyniki testów API 20E
Rys. 3. Pozytywne wyniki testów API 20E
TEST Aktywne składniki Stężenie
mg
/probówk
a
Reakcje/Enzymy Wynik negatywny Wynik pozytywny
ONPG 2-nitrofenylo-βD-
galaktopiranozyd
0,223 β-galaktozydaza (orto nitrofenylo βD-
Galaktopiranozyd)
bezbarwny żółty (1)
ADH L-arginina 1,9 dihydrolaza argininy żółty czerwony / pomarańczowy (2)
LDC L-lizyna 1,9 dekarboksylaza lizyny żółty czerwono /pomarańczowy (2)
ODC L-ornityna 1,9 dekarboksylaza ornityny żółty czerwono-pomarańczowy (2)
CIT cytrynian trisodowy 0,756 wykorzystanie cytrynianu jasno szary /żółty niebiesko-zielony/niebieski (3)
H2S Tiosiarczan sodowy 0,075 wytwarzanie H2S bezbarwny / szarawy czarny osad/ rozpłynięta linia
URE Mocznik 0,76 ureaza żółty czerwono-pomarańczowy (2)
TDA L-tryptofan 0,38 dezaminaza tryptofanu TDA/żółty natychmiast,czerwono-brązowy
IND L-tryptofan 0,19 wytwarzanie indolu JAMES/bezbarwny
jasno zielony/ żółty
natychmiast, różowy
VP pirogronian sodu 1,9 wytwarzanie acetoniny (VP) VP1 + VP2/bezbarwny 10 minut różowy/czerwony (5)
GEL Żelatyna (wołowa) 0,6 żelatynaza brak dyfuzji dyfuzja czarnego pigmentu
GLU D-glukoza 1,9 fermentacja/utlenianie (glukoza) (4) niebieski/niebiesku-zielony żółty/szaro-żółty
MAN D-mannitol 1,9 fermentacja/utlenianie (mannitol) (4) niebieski/niebiesku-zielony żółty
INO Inozytol 1,9 fermentacja/utlenianie (inoytol) (4) niebieski/niebiesku-zielony żółty
SOR D-sorbitol 1,9 fermentacja/utlenianie (sorbitol) (4) niebieski/niebiesku-zielony żółty
RHA L-ramnoza 1,9 fermentacja/utlenianie (ramnoza) (4) niebieski/niebiesku-zielony żółty
SAC D sacharoza 1,9 fermentacja/utlenianie (sacharoza) (4) niebieski/niebiesku-zielony żółty
MEL D-melibioza 1,9 fermentacja/utlenianie (melibioza) (4) niebieski/niebiesku-zielony żółty
AMY Amigdalina 0,57 fermentacja/utlenianie (amigdalina) (4) niebieski/niebiesku-zielony żółty
ARA L-arabinoza 1,9 fermentacja/utlenianie (arabinoza) (4) niebieski/niebiesku-zielony żółty
OX Oksydaza oksydaza bezbarwny/żółty fioletowy
(1) Nawet bardzo blady żółty kolor należy uznać za reakcję pozytywną. (2) Pomarańczowy kolor po 36-48 h inkubacji należy uznać za negatywny. (3) Odczytu dokonać we
wgłębieniu (warunki tlenowe). (4) Fermentacja zachodzi w najniższej części probówki, utlenianie we wgłębnej. (5) Słabo różowy kolor po 10 minutach należy uznać za
negatywny.
Tabela 2. Tabela odczytu testu API 20 E (w oparciu o ulotkę informacyjną API 20E)
W przypadkach wątpliwych prowadzi się testy dodatkowe:
Redukcja azotanów do azotynów (NO2) i gazowego azotu (N2): dodać po 1 kropli z
każdego odczynnika NIT 1 i NIT 2 do probówki GLU. Odczekać 2-5 minut. Czerwony
kolor wskazuje na reakcję pozytywną (NO2); reakcja negatywna (żółty) może być
spowodowana redukcją do azotu (co czasami jest uwidaczniane przez pęcherzyki gazu); w
celu weryfikacji należy dodać 2-3 mg odczynnika Zn do probówki GLU; po 5 min jeśli
probówka pozostaje żółta wskazuje to na reakcję pozytywną (N2), co należy zanotować w
karcie wyników; jeżeli pojawia się kolor pomarańczowo-czerwony jest to wynik
negatywny: azotany nadal występujące w probówce zostały zredukowane przez cynk.
Serotypowanie Salmonella
Dla szczepów bakterii, które na podstawie cech biochemicznych zostały
zakwalifikowane do rodzaju Salmonella przeprowadza się testy serologiczne w celu wykrycia
obecności antygenów somatycznych O, otoczkowych Vi i rzęskowych H. Badania wykonuje
się metoda aglutynacji szkiełkowej na podstawie schematu antygenowego Kauffmanna-
White’a. Do oznaczania antygenów somatycznych powinno się stosować surowice
poliwalentne i monowalentne, natomiast do wykrywania obecności antygenu Vi i H –
surowice anty-Vi i anty – H. Oznaczenie antygenów rzęskowych umożliwia określenie typu
serologicznego badanych bakterii.
Alternatywne metody oznaczania obecności Salmonella w żywności
PCR – łańcuchowa reakcja polimerazy (polimerase chain reaction) – to enzymatyczna
reakcja powielania cząsteczki DNA. Warunkiem krytycznym przebiegu PCR jest obecność
enzymu, termostabilnej polimerazy DNA. Substratami reakcji są deoksyrybonukleotydy
(cegiełki budujące nowo syntetyzowane cząsteczki DNA) oraz oligonukleotydy (startery),
które komplementarnie przyłączają się do powielanej nici DNA. Reakcja łańcuchowa
polimerazy jest procesem termicznym, z cyklicznie zmieniającymi się temperaturami. Na
jeden cykl prowadzący do syntezy jednej kopii DNA z jednej cząsteczki matrycowej składają
się etapy: denaturacji DNA (90-95°C), przyłączenia starterów (tzw. annealingu, 50-65°C) i
wydłużania nici. Reakcja w warunkach laboratoryjnych przeprowadzana jest w urządzaniu
zwanym termocyklerem. Zazwyczaj w jednej reakcji PCR przeprowadza się 35-40 cykli,
których rezultatem jest powstanie kilku miliardów kopii pojedynczej cząsteczki DNA (w
każdym cyklu ilość produktu przyrasta logarytmicznie).
REAL-TIME PCR Ulepszeniem klasycznej metody PCR jest real-time PCR, czyli reakcja
PCR obserwowana w czasie rzeczywistym. Termocykler realtime PCR posiada system
optyczny, który cykl po cyklu zbiera informacje o przebiegu reakcji. Dodatkowym
składnikiem reakcji real-time PCR są sondy TaqMan® wyznakowane barwnikami
fluorescencyjnymi. Sonda to oligonukleotyd zaprojektowany tak, aby wiązał się wysoce
specyficznie z powielanym fragmentem DNA, a więc – w przypadku omawianego
zastosowania w mikrobiologii żywności – „wykrywał” charakterystyczną dla szukanego
patogenu sekwencję. Sonda powinna wiązać się specyficznie i silnie, co mogą zapewnić jej
specjalne cząsteczki białkowe (cząsteczka MGB w sondach TaqMan® Applied Biosystems).
Polimeraza, syntetyzując nową nić, przesuwa się po matrycy, napotykając na swojej drodze
sondę. Dzięki aktywności egzonukleolitycznej enzym zaczyna „odlepiać” sondę od matrycy,
a następnie ją niszczyć, uwalniając barwnik fluorescencyjny. System optyczny termocyklera
wzbudza, a następnie odbiera świecenie barwnika, które z każdym cyklem staje się coraz
intensywniejsze (logarytmiczny przyrost ilości produktu oznacza logarytmiczny przyrost
stężenia uwalnianego barwnika). W efekcie jesteśmy w stanie w czasie rzeczywistym
monitorować, czy mamy produkt reakcji.
Czterdziestocyklowa reakcja real-time PCR trwa około 1,5 godziny, po dodaniu do tego czasu
potrzebnego na wyizolowanie DNA z analizowanej próbki (do 30 minut) całość oznaczenia
obecności bądź braku patogenu trwa 2 godziny (przy użyciu systemu Applied Biosystems
TaqMan® Pathogen Detection System). Próby do oznaczenia pobiera się z hodowli
przednamnażających na zbuforowanej wodzie peptonowej po 18 godzinach inkubacji w temp.
37°C, tak więc sumarycznie czas od pobrania próbki do gotowego wyniku zamyka się w 24
godzinach.
Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ FISH
Technika FISH polega na hybrydyzacji sekwencji rRNA unieruchomionych komórek
sondą oligonukleotydową 16S rRNA znakowaną fluorescencyjnie. Sondy oligonukleotydowe
SA krotkimi fragmentami kwasu deoksyrybonukleinowego, które hybrydyzuja, czy paruja się
z komplementarnymi sekwencjami DNA lub RNA ekstrahowanymi z badanych
drobnoustrojow. Paruja się one w ten sam sposób, jak formy dwuniciowego DNA (adenina z
tymina i guanina z cytozyna). Jeżeli sekwencja zasad w sondzie DNA jest komplementarna
do sekwencji charakterystycznej dla oznaczanego mikroorganizmu, sonda wiąże się jedynie z
DNA identyfikowanego mikroorganizmu. Sondy najczęściej znakowane są na jednym bądź
na obu końcach znacznikiem fluorescencyjnym. Sondy molekularne specyficznie wiążą się z
rRNA w rybosomach komórek docelowych, identyfikując je na różnych poziomach
taksonomicznych. Rozwiązanie takie znacznie zwiększa czułość oznaczenia, gdyż rRNA jest
integralną częścią bakteryjnego rybosomu, wiec występuje w komórce w dużej liczbie kopii
(od 1000 do 10000). Inną zaleta tego rozwiązania jest dostępność obszernej informacji
odnośnie sekwencji rRNA pochodzących od różnych często bardzo blisko genetycznie
spokrewnionych mikroorganizmów, dzięki czemu możliwe jest otrzymywanie sond o bardzo
wysokiej specyficzności. Ze względu na zakres specyficzności sondy wyróżnia się: sondy
uniwersalne np. EUB338 (GCTGCCTCCCGTAGGAGT), nonsensowne, np. NON388
(CGACGGAGGGCATCCTCA) do wykrywania niespecyficznego wiązania sondy oraz sondy
specyficzne, np. Sal3 (5’-AATCACTTCACCTACGTG-3’)dla Salmonella sp..
Sondy oligonukleotydowe 16S (23S) specyficzne dla Salmonella sp. m.in. można
wyszukać w bazie danych probeBase (www.microbial-ecology.de/probebase/index.html) i
literaturze. Wysoko specyficzne sondy można zaprojektować samodzielnie wykorzystując
oprogramowanie ARB (www.arb-home.de), oraz bazy danych: Ribosomal Database Project
II (www.rdp.cme.msu.edu) oraz probeBase (www.microbial
ecology.de/probebase/index.html). Specyficzność wybranych sekwencji względem gatunków
bakterii z rodzaju Salmonella można sprawdzić in silico przy użyciu PROBE MATCH
(www.rdp.cme.msu.edu) lub probeCheck (www.microbial-ecology.de/probebase/index.html).
Metodą FISH z zastosowaniem fluorescencyjnie znakowanych sond oligonukleotydowych
16S rRNA oznacza się liczbę tylko fizjologicznie aktywnych komórek, ponieważ okres
półtrwania rRNA jest krótszy niż DNA, co czyni rRNA potencjalnie lepszym wskaźnikiem
ich aktywności. W rybosomach szybko rosnących komórek znajduje się liczba kopii rRNA,
zwykle ponad 1000 co wystarcza do indukcji sygnału świetlnego po związaniu wyznakowanej
sondy. Po śmierci komórki następuje rozpad rRNA, a jego szybkość zależy, między innymi,
od koncentracji enzymów - RNAz, a także od ciągłości błony cytoplazmatycznej. Komórki
wolno rosnące lub metabolicznie nieaktywne, zawierające niewielką liczbę kopii rybosomów,
emitują światło o słabym natężeniu. Nowe czulsze modyfikacje techniki FISH powodują
amplifikację sygnału (TSA-FISH znany również jako CARD-FISH) stając się użytecznym
narzędziem w rękach współczesnej mikrobiologii. Sondy oligonukleotydowe 16S rRNA
znakowane fluoroforami o zróżnicowanej masie cząsteczkowej (np. peroksydazą chrzanową –
44 kDa, fluoresceiną – 330 kDa) pozwalają na wizualną ocenę stopnia permeabilizacji ściany
komórkowej na zasadzie różnicy w przenikaniu barwników do wnętrza komórki. Niezmiernie
dużą zaletą techniki FISH jest możliwość wykrycia komórek VBNC (viable but not
culturable), które nie dają wzrostu na podłożach stałych co powoduje, że metoda ta jest
czulsza od metod płytkowych.
Standardowa metodyka FISH obejmuje przygotowanie i permeabilizację komórek,
hybrydyzację, wymywanie nadmiaru niezwiązanej sondy oraz detekcję sygnału z
zastosowaniem mikroskopii fluorescencyjnej.
Doniesienia na temat zastosowania techniki fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w
badaniach żywności informują o możliwości jej aplikacji w tej dziedzinie i wskazują na tę
metodę jako bardzo czułą, szybką i tanią. Jednak wnioski płynące z badań wskazują na
konieczność ciągłego doskonalenia metodyki i doboru i/lub projektowania bardziej
specyficznych sond. Związane to jest z różnorodnym składem chemicznym i
mikrobiologicznym żywności (tzw. matrycą), który może prowadzić do błędów w odczycie.
Dlatego dla stosunkowo szybkiej oceny jakości i bezpieczeństwa żywności potrzebny jest
dobór nie tylko sond dla poszczególnych gatunków drobnoustrojów ale przede wszystkim
zoptymalizowanie przygotowania prób żywności do badań w zależności od matrycy. Poprzez
przygotowanie prób rozumie się odpowiednią filtrację i wirowanie przy różnych parametrach
celem wyeliminowania dużych cząstek, a także dobór optymalnych warunków trawienia lub
permeabilizacji ściany komórkowej drobnoustrojów (np. lizozymem, proteinazą K,
achromopeptydazą, paraformaldehydem, etanolem itp.) występujących w badanej żywności.
Właściwe przygotowanie próby i komórek uniemożliwia niespecyficzną absorpcję sondy do
elementów komórkowych, oraz łatwiejszą penetrację cytoplazmy komórek.
ĆWICZENIE 3 07.11.2017r. - wt. Projektowanie analizy produktu z uwzględnieniem obowiązujących wymagań. Studium przypadków. Cz. I.
Studium przypadków: 1. Mięso mielone, w toku produkcji
Pałeczki Salmonella nieobecne w 25g (kryterium higieny)
E. coli 3,2x102jtk/g (wytyczne branżowe)
Liczba bakterii tlenowych mezofilnych: 6,7x107jtk/g (wymagane – przekroczony parametr)
Proteus sp. 1,7x104jtk/g (wytyczne branżowe)
Gronkowce koagulazo-dodatnie: 4,3x107jtk/g (trzeba zrobić enterotoksynę)
Liczba grzybów: 2,3x102jtk/g (zbędne oznaczenie)
2. Mięso mielone, pakowane próżniowo:
Pałeczki Salmonella nieobecne w 10g (błąd, powinno być w 25g)
E. coli 5,4x102jtk/g (zbędne oznaczenie)
Liczba bakterii tlenowych mezofilnych: 5,7x106jtk/g (zbędne)
Proteus sp. 2,7x104jtk/g (wytyczne branżowe)
Gronkowce koagulazo-dodatnie: 4,9x103jtk/g
Liczba grzybów: 2,3x102jtk/g (Brak Listeria monocytogenes)
3. Mleko w proszku dla niemowląt na końcu procesu produkcyjnego
Pałeczki Salmonella nieobecne w 10g (błąd, powinno być w 25g)
E. Coli 5,2x102jtk/g (zbędne oznaczenie)
Rodzina Enterobacteriaeae 5,2x102jtk/g (wyróżnik higieny)
Liczba bakterii tlenowych mezofilnych: 3,7x105jtk/g (niewymagane)
Gronkowce koagulazo-dodatnie: 1,3x103jtk/g (niewymagane)
Liczba grzybów: 1,3x103jtk/g (brak Cronobacter sakazakii)
4. Ser z mleka niepasteryzowanego gotowy do spożycia
Pałeczki Salmonella nieobecne w 25g (kryterium higieny)
E. coli 1,2x102jtk/g (zbędne oznaczenie, wyróżnik higieny)
Rodzina Enterobacteriaceae 3,2x102jtk/g (zbędne oznaczenie)
Liczba bakterii tlenowych mezofilnych: 6,8x105jtk/g (niewymagane)
Gronkowce koagulazo-dodatnie: 6,3x106jtk/g (powinna być oznaczona enterotoksyna)
Liczba grzybów: 7,1x103jtk/g (wymagania branżowe)
Listeria monocytogenes nieobecna w 10g (błąd, powinno być w 25g)
5. Ser z mleka niepasteryzowanego
Pałeczki Salmonella nieobecne w 25g (kryterium bezpieczeństwa)
E. coli 1,2x102jtk/g (wyróżnik higieny)
Rodzina Enterobacteriaceae 3,2x102jtk/g (zbędne oznaczenie)
Liczba bakterii tlenowych mezofilnych: 4,7x106jtk/g (niewymagane)
Gronkowce koagulazo-dodatnie: 6,3x106jtk/g (powinna być oznaczona enterotoksyna, nie spełnia kryterium higieny)
Liczba grzybów: 7,1x103jtk/g (wymagania branżowe)
Listeria monocytogenes nieobecna w 25g (niewymagane)
6. Lody w toku produkcji
Pałeczki Salmonella nieobecne w 10g (niewymagane)
Rodzina Enterobacteriaceae 5,8x103jtk/g (wyróżnik higieny – nie spełnia wymogów)
Liczba bakterii tlenowych mezofilnych: 6,2x105jtk/g
Gronkowce koagulazo-dodatnie: 2,1x103jtk/g
Listeria monocytogenes nieobecna w 25g (niewymagane)
7. Owoce morza, żywe
Pałeczki Salmonella nieobecne w 10g (błąd, powinno być w 25g)
E. coli 2,2x102jtk/g (kryterium bezpieczeństwa)
Rodzina Enterobacteriaceae 3,5x102jtk/g (niewymagane)
Liczba bakterii tlenowych mezofilnych: 3,2x105jtk/g (niewymagane)
Gronkowce koagulazo-dodatnie: 3,8x103jtk/g Student ma za zadanie:
Określić czy odpowiednio dobrane są analizy mikrobiologiczne
Czy poprawnie uwzględniono kryteria higieny lub/i kryteria bezpieczeństwa
Czy nie brakuje jakichś analiz lub któreś są zbędne
Czy produkt spełnia wymagania ustalone w Rozporządzeniu 2073 Przypadki do podziału dla zespołów 2 – osobowych na kolejnych zajęciach głoszą seminarium)
1. Ser dojrzewający - wzdęty z białym nalotem (możliwe kierunki badań: Clostridia sacharolityczne, grupa coli - wzdęcie, pleśnie, drożdże - nalot)
2. Sałatka warzywna z majonezem w opakowaniu plastikowym – wypukłe wieczko (możliwe kierunki badań: heterofermentatywne mlekowe, grupa coli, Clostridia sacharolityczne)
3. Mleko skondensowane, niesłodzone, UHT – słodki skrzep (możliwe kierunki badań: Bacillus)
4. Masło - zjełczałe z czarnymi plamami (możliwe kierunki badań: Clostridia sacharolityczne pleśnie)
5. Wędlina pakowana próżniowo - kwaśny posmak i lekko wzdęte opakowanie (możliwe kierunki badań: mlekowe heterofermentatywne)
6. Sok jabłkowy pasteryzowany - zmętnienie, medyczny dezynfekcyjny zapach (możliwe kierunki badań: Alicyclobacillus)
7. Pieczywo - ciągliwość miękiszu, nitki śluzu o nieprzyjemnym zapachu (możliwe kierunki badań: Bacillus )
Student ma za zadanie:
- rozpatrzyć przyczyny powstałych wad z uwzględnieniem poszczególnych etapów produkcji na których mogło dojść do powstania wad
- wymienić grupy drobnoustrojów, które zamierza oznaczyć celem stwierdzenia przyczyny wad
- podczas odczytu wyników muszą zwrócić uwagę na fakt, że może zachodzić potrzeba wykonania schematycznego drzewka decyzyjnego (np. barwienie metodą grama, test na katalazę, oksydazę itd.)
- zaprojektować tok przebiegu analizy z uwzględnieniem poboru prób, użytych podłoży, warunków inkubacji, sposobu odczytu i ewentualnych posiewów potwierdzających
ĆWICZENIE 4 09.11.2017r. – czw. Projektowanie analizy produktu z uwzględnieniem obowiązujących wymagań. Studium przypadków. Cz. II – seminarium. ĆWICZENIE 5 14.11.2017r. - wt. Analiza mikrobiologiczna przetworów owocowych, warzywnych i warzywno-mięsnych. Cz. I Kolokwium I. ĆWICZENIE 6 16.11.2017r. – czw. Analiza mikrobiologiczna przetworów owocowych, warzywnych i warzywno-mięsnych. Cz. II – odczyt wyników i posiewy potwierdzające. Poprawa kolokwium I. ĆWICZENIE 7 21.11.2017r. - wt. Analiza mikrobiologiczna mięsa i przetworów mięsnych. Cz. I. Kolokwium II. ĆWICZENIE 8 23.11.2017r. – czw. Analiza mikrobiologiczna mięsa i przetworów mięsnych. Cz. II – odczyt wyników i posiewy potwierdzające. Poprawa kolokwium II. ĆWICZENIE 9 28.11.2017r. - wt. Analiza mikrobiologiczna mleka i produktów mlecznych. Cz. I. ĆWICZENIE 10 30.11.2017r. – czw. Analiza mikrobiologiczna mleka i produktów mlecznych. Cz. II – odczyt wyników i posiewy potwierdzające ĆWICZENIE 10 28.11.2017r. - wt. Raport końcowy z wyników badań. Zaliczenie końcowe.
Top Related