Czy diagnostyka molekularna
zakażeń grzybiczych ma
znaczenie praktyczne?
Anita Hryncewicz-Gwóźdź
Diagnostyka mikologiczna
klasyczna
Badanie bezpośrednie
• Zeskrobiny ze zmian skórnych
• Zeskrobiny z materiału pod płytką paznokciową
Widoczne nici grzybni
• Włosy
Widoczne zarodniki o układzie endothrix lub
ectothrix.
• Fluorescencja w lampie Wood’a (UV 366nm)
Lampa Wooda (UV 366nm)
• M. canis zielona fluorescencja
• Możliwy nieprawidłowy odczyt: nie myć
głowy przed badaniem, prawidłowe
zaciemnienie pomieszczenia w którym
przeprowadza się badanie.
• Inne substancje mogą powodować
fluorescencję: dezodoranty, mydła, maści
z petrolum
• Obecność Malassezia żółta fluorescencja
Badanie bezpośrednie
Badanie bezpośrednie - włos
Układ zarodników ectothrix Układ zarodników endothrix
Hodowla
• Podłoże podstawowe-
Sabourauda (pepton, glukoza,
agar, chloramfenikol, aktidion)
obserwacja 14 do 28 dni.
• Podłoże DTM (dermatophyt test
medium)
1. Cechy makroskopowe
hodowli
2. Cechy mikroskopowe
3. Dodatkowe testy
umożliwiające różnicowanie
gatunków
.
Test ureazowy na
podłożu Chritensena
T mentagrophytes
zmienia barwę podłoża na czerwoną
T rubrum nie zmienia
barwy podłoża
(uwaga:
zanieczyszczenia –
bakterie zmieniają
barwę podłoża)
Test włosowy
T mentagrophyes - wynik dodatni
T rubrum – wynik ujemny
Podłoże płynne
Sabourauda
T. rubrum rośnie na dnie
T. mentagrophytes rośnie na
powierzchni
(zanieczyszczenie pleśniowe
rosną na powierzchni)
Podłoże ziemniaczane – intensywniejsze
zabarwienie podłoża przez T. rubrum
Czas niezbędny do wykonania
badania mikologicznego
metodą klasyczną
• Hodowla do 4 tygodni
• Testy dodatkowe ok. 1 tydzień
Długi okres oczekiwania na wynik badania
Możliwość kontaminacji przez grzyby środowiskowe w trakcie hodowli i wykonywania testów dodatkowych
Diagnostyka mikologiczna
molekularna
Krótki czas trwania badania - kilka godzin.
Wysoka specyficzność i czułość.
Metody molekularne
• Określanie gatunku grzyba uzyskanego w
hodowli na podłożach laboratoryjnych
• Wykrycie obecności grzyba w materiale
uzyskanym od pacjenta
• Typowanie genetyczne szczepów np.
T. rubrum w celach epidemiologicznych
Metody molekularne w diagnostyce
dermatofitów
• Sekwencjonowanie DNA ustalenie gatunku
grzyba z hodowli
• PCR – amplifikacja fragmentów DNA wykrycie obecności grzyba w materiale biologicznym,
ustalenie gatunku grzyba z hodowli
• Inne metody jak RFLP, RAPD typowanie
genetyczne szczepów w obrębie gatunku
Sekwencjonowanie DNA
• Umożliwia ustalenie gatunku grzyba z hodowli (w przypadku trudności identyfikacji gatunku metodami klasycznymi – brak charakterystycznych struktur grzybni, brak zarodników)
• Sekwencjonowanie fragmenu 28S rybosomalnego DNA
GenBank database
MicroSeq D2 Fungal database
PCR – amplifikacja fragmentów DNA
• Powielanie wybranego fragmentu łańcucha DNA przy użyciu specyficznych starterów.
• Możliwe jest wykrycie obecności w badanym materiale minimalnych ilości poszukiwanego odcinka
DNA.
Detekcja produktu amplifikacji: elektroforeza produktu amplifikacji w żelu agarozowym i określenie jego
wielkości na podstawie wysokości położenia prążka w żelu.
PCR
łańcuchowa reakcja polimerazy
Cel molekularny amplifikacji:
• Rybosomalne DNA
• Gen kodujący syntazę chityny
• Gen kodujący topoizmerazę II
• Sekwencje mikrosatelitarne
Real time PCR
PCR
łańcuchowa reakcja polimerazy
• Rybosomalne DNA
Brillowska-Dabrowska A, Saunte DM, Arendrup MC.
Five-hour diagnosis of dermatophyte nail infections with specific detection of Trichophyton rubrum.
J Clin Microbiol. 2007 Apr;45(4):1200-4.
Turenne CY, Sanche SE, Hoban DJ, Karlowsky JA, Kabani AM.
Rapid identification of fungi by using the ITS2 genetic region and an automated fluorescent capillary electrophoresis system.
J Clin Microbiol. 1999 Jun;37(6):1846-51.
Trichophyton rubrum
PCR
łańcuchowa reakcja polimerazy
• Gen kodujący syntazę chityny
Brillowska-Dabrowska A, Saunte DM, Arendrup MC.
Five-hour diagnosis of dermatophyte nail infections with specific detection of
Trichophyton rubrum.
J Clin Microbiol. 2007 Apr;45(4):1200-4.
Kano R, Hirai A, Muramatsu M, Watari T, Hasegawa A.
Direct detection of dermatophytes in skin samples based on sequences of the
chitin synthase 1 (CHS1) gene.
J Vet Med Sci. 2003 Feb;65(2):267-70.
Dermatofity
PCR
łańcuchowa reakcja polimerazy
• Gen kodujący topoizmerazę II
Kanbe T, Suzuki Y, Kamiya A, Mochizuki T, Fujihiro M, Kikuchi A.
PCR-based identification of common dermatophyte species using primer sets
specific for the DNA topoisomerase II genes.
J Dermatol Sci. 2003 Aug;32(2):151-61.
PCR
łańcuchowa reakcja polimerazy • Sekwencje mikrosatelitarne (tandemowe
powtórzenia składające się z dwu-, trzy- lub czteronukleotydowych sekwencji zwanych motywami)
Kardjeva V, Summerbell R, Kantardjiev T, Devliotou-Panagiotidou D, Sotiriou E, Gräser Y.
Forty-eight-hour diagnosis of onychomycosis with subtyping of Trichophyton rubrum strains.
J Clin Microbiol. 2006 Apr;44(4):1419-27.
Brasch J, Beck-Jendroschek V, Gläser R.
Fast and sensitive detection of Trichophyton rubrum in superficial tinea and onychomycosis by use of a direct polymerase chain reaction assay.
Mycoses. 2011 Sep;54(5):e313-7.
Opracowanie metody wykrywania
dermatofitów w materiale od pacjenta,
dla rutynowej diagnostyki labolatoryjnej
• Mała ilość etapów procedury – ograniczenia ryzyka kontaminacji
• Prostota wykonania – możliwość
wdrożenia do laboratorium
Dostępne zestawy do wykrywania
grzybów w materiale klinicznym
Statens Serum Institut (Dania)
Biotype Diagnostic GmbH (Niemcy)
Zestaw zawiera odczynniki wystarczające na
przeprowadzenie 100 multipleksowych reakcji PCR.
Statens
Serum
Institut
Wykrywa:
• Dermatofity (pan-dermatophytes)
• Trichophyton rubrum.
Przeznaczony do badania zakażenia
paznokci stóp
Duplex PCR
Zastosowanie testu umożliwia wykrycie w
materiale biologicznym DNA dermatofitów
i Trichophyton rubrum w ciągu 5 godzin.
Brillowska-Dabrowska A, Saunte DM, Arendrup MC.
Five-hour diagnosis of dermatophyte nail infections with specific detection of
Trichophyton rubrum.
J Clin Microbiol. 2007 Apr;45(4):1200-4.
Mieszanina starterów zawiera dwie pary starterów które zapoczątkowują amplifikację genów:
• syntetazy 1 chityny w celu wykrycia obecności dermatofitów
• ITS1 (internal transcribed spacer) w celu wykrycia T. rubrum
Wewnętrzna kontrola(~660 bp)
Pan-dermatophytes (366 bp)
T. rubrum (203 bp)
studzienka 1: Marker molekularny DNA100 bp
2: DNA genomowe dermatofitów (Kontrola 1)
3: DNA genomowe dla T. rubrum (Kontrola 2)
4: materiał z paznokcia dodatni w kierunku dermatofitów
5: materiał z paznokcia dodatni w kierunku dermatofitów
6: materiał z paznokcia dodatni w kierunku T. rubrum
7: materiał z paznokcia ujemny.
1 2 3 4 5 6 7
Badana próbka paznokcia
pozytywna w kierunku
T. rubrum daje najczęściej
silny sygnał na wysokości 203
par zasad i słabszy (bądź
zerowy) sygnał na wysokości
366 par zasad z powodu
wysokiej liczby kopii regionu
ITS1 w porównaniu z
regionem chs1.
• Reakcji multipleks-PCR, w skład której wchodzi
mieszanina starterów zaprojektowanych dla genów
specyficznych dla różnych gatunków lub rodzajów
grzybów.
• Dermatofity, drożdże i grzyby pleśniowe
• Epidermophyton floccosum
• Microsporum canis
• Microsporum gypseum
• T. rubrum
• T. interdigitale
• T. spp.
• Arthroderma benhamiae
• Candida spp. C. albicans C. tropicalis C. glabrata C. krusei C. guilliermondii C. parapsilosis
• Trichosporon cutaneum
• Scopulariopsis brevicaulis
• Aspergillus spp. A. fumigatus A. flavus A. niger A. Versicolor
Mieszanina wielu par starterów
Porównanie metod klasycznej i
molekularnej
Porównanie PCR
i metody klasycznej
Pan-dermatophytes T. rubrum
KOH
hodowla
38.1 %
22.9 %
PCR 42.4 % 41.5 %
Wzrost
wykrywalności
4.3 % 18.6 %
Brillowska-Dabrowska A, Saunte DM, Arendrup MC.
Five-hour diagnosis of dermatophyte nail infections with specific detection of
Trichophyton rubrum.
J Clin Microbiol. 2007 Apr;45(4):1200-4.
118 pacjentów z onychomykozą Duplex PCR
Porównanie PCR
i metody klasycznej
107 próbek z
paznokci
Kliniczne
podejrzenie
grzybicy
PCR + Hodowla +
77 (72%) 63 T.rubrum
14 pan-dermatophytes
57 (53%) 38 (35%) dermatofity
19 niedermatofity
Wzrost wykrywalności dermatofitów w PCR w porównaniu z hodowlą wynosi 37%
Chandran NS, Pan JY, Pramono ZA, Tan HH, Seow CS.
Complementary role of a polymerase chain reaction test in the diagnosis of onychomycosis.
Australas J Dermatol. 2013 May;54(2):105-8.
Duplex PCR
Singapore
Porównanie PCR
i metody klasycznej
177 próbek z
paznokci
Kliniczne podejrzenie
grzybicy
Hodowla PCR
59
(34%)
78
(44%)
Wzrost wykrywalności dermatofitów w PCR w porównaniu z hodowlą wynosi 10%
Duplex PCR
Kondori N, Abrahamsson AL, Ataollahy N, Wennerås C.
Comparison of a new commercial test, Dermatophyte-PCR kit, with conventional methods
for rapid detection and identification of Trichophyton rubrum in nail specimens.
Med Mycol. 2010 Nov;48(7):1005-8. Göteborg,Sweden
Porównanie PCR
i metody klasycznej
120 próbek
z paznokci
Kliniczne
podejrzenie
grzybicy
KOH Hodowla PCR
35
(29,2%)
12
(10%)
48
(40%)
PCR pan-dermatophyt
Gen topoizomerazy II
Luk NM, Hui M, Cheng TS, Tang LS, Ho KM.
Evaluation of PCR for the diagnosis of dermatophytes in nail specimens from
patients with suspected onychomycosis.
Clin Exp Dermatol. 2012 Apr;37(3):230-4.
Wzrost wykrywalności dermatofitów w PCR w porównaniu z hodowlą wynosi 30%
Hong Kong
Porównanie PCR
i metody klasycznej
Nested PCR
Sekwencjonowanie fragmentu 28S rDNA
Hodowla+ Hodowla +
PCR+
Hodowla –
PCR+
Hodowla-
Głowa 23 14 12 18
Skóra 10 6 3 5
Paznokcie 23 20 4 9
W 7 przypadkach przy pomocy PCR zweryfikowano błedne rozpoznanie gatunku
ocenianego na podstawie hodowli
Verrier J, Krähenbühl L, Bontems O, Fratti M, Salamin K, Monod M.
Dermatophyte identification in skin and hair samples using a simple and reliable nested polymerase
chain reaction assay.
Br J Dermatol. 2013 Feb;168(2):295-301. Lausanne, Switzerland
Porównanie PCR
i metody klasycznej
PCR pan-dermatophyt
PCR gatunek
KOH Hodowla PCR
Pan-
dermatophyt
PCR
gatunek
Multiplex
PCR
Pan-
dermatophyt
Multiplex
PCR
gatunek
42 28 45 45 45 41
Przebadano 107 próbek ze skóry gładkiej, głowy, paznokci z podejrzeniem
grzybicy
Wrocław Praca doktorska
Katarzyna Kalinowska
Multiplex PCR
Możliwości diagnostyczne z użyciem dostępnych
komercyjnie testów PCR
Materiał biologiczny
• dermatofity. Dermatophyte PCR KIT, MycoDermQS PCR Amplification KIT
• T. rubrum Dermatophyte PCR KIT. Wysoka przydatność w rozpoznaniu grzybicy paznokci stóp (T. rubrum jest najczęstszym patogenem), MycoDermQS PCR Amplification KIT
• E. floccosum, M. canis M. gypseum T. rubrum,
T. interdigitale, Trichophyton spp. MycoDermQS PCR Amplification KIT.
Znaczna ilość gatunków dermatofitów – brak możliwość detekcji przy zastosowaniu dostępnych komercyjnie testów opartych na metodzie PCR
Opracowywanie dalszych testów
PCR
Brillowska-Dabrowska A, Swierkowska A, Lindhardt Saunte DM, Arendrup MC.
Diagnostic PCR tests for Microsporum audouinii, M. canis and Trichophyton infections.
Med Mycol. 2010 May;48(3):486-90.
Brillowska-Dabrowska A, Michałek E, Saunte DM, Nielsen SS, Arendrup MC.
PCR test for Microsporum canis identification.
Med Mycol. 2013 Aug;51(6):576-9.
Diagnostyka grzybicy skóry owłosionej głowy – większa
wrażliwość Trichophyton niż Microsporum na terbinafinę.
Schemat diagnostyki mikologicznej z wykorzystaniem metod klasycznych i
molekularnych opracowany przez Brillowską-Dabrowską A.
Znaczenie metod molekularnych
• Metody molekularne łącznie z metodami klasycznymi powinny być wykorzystywane w laboratoriach mikologicznych
• Wykorzystanie metod molekularnych może prowadzić do zmniejszenia ilości próbek badanych metodami klasycznymi.
• W przyszłości laboratorium mikologiczne które będzie wykonywało badania bezpośrednie, hodowle i będzie korzystało z metod molekularnych umożliwi szybką i poprawną identyfikacje gatunkową.
Przypadki kliniczne, w których
dla oznaczenia gatunku
dermatofita zastosowano
metodę molekularną
Grzybica głowy z towarzyszącymi
rozsianymi zmianami grudkowo-krostkowymi
Przypadek kliniczny
5 letnia dziwczynka
W krótkim czasie rozwinął się
kerion Celsi w okolicy
ciemieniowo skroniowej
W wywiadzie nie podawano
kontaktu z dziećmi lub
zwierzętami z zakażeniem
grzybiczym
Grzybica głowy z towarzyszącymi
rozsianymi zmianami grudkowo krostkowymi
Po miesiącu
utrzymywania się zmian
na skórze owłosionej
głowy pojawiły się
wykwity rumieniowe,
grudkowe i krostkowe na
twarzy
Przypadek kliniczny
Grzybica głowy z towarzyszącymi
rozsianymi zmianami grudkowo krostkowymi Przypadek kliniczny
następnie na tułowiu i kończynach
Grzybica głowy z towarzyszącymi
rozsianymi zmianami grudkowo krostkowymi
• Badanie mikologiczne ze
zmiany w skórze owłosionej
głowy – dodatnie
• Bezpośrednie: zarodniki o
układzie endothrix
• T. tonsurans (hodowla, metoda
PCR)
• Dermatofit antropofilny
• Wywołuje grzybicę głowy
(najczęstszy czynnik etiologiczny grzybicy głowy w
USA i Wielkiej Brytanii)
• Leczenie Terbinafina 125
mg/dobę przez 12 tygodni
Przypadek kliniczny
PCR for T. tonsurans (173 bp) J. Brasch
Tinea incognito
23 letni pacjent
Skierowany do Kliniki Dermatologicznej z podejrzeniem Erythema gyratum repens
Trenował zapasy
Pierwsze zmiany rumieniowo złuszczające w okolicy skroniowej pojawiły się rok
wcześniej . Leczone miejscowo preparatami przeciwgrzybiczymi (bez diagnostyki
mikologicznej). Nawrót zmian zlokalizowanych na skórze owłosionej głowy i
ramionach.
Przypadek – Tinea Gladiatorum
Tinea incognito
Podejrzewano podłoże alergiczne zmian
skórnych.
Pacjentowi ordynowano leczenia
kortykosteroidam miejscowe i ogólne.
Stopniowo zmiany uległy dalszemu
rozsiewowi, zajmowały tułów, twarz i
kończyny.
Przypadek
Tinea incognito
Badanie mikologiczne: dodatnie
T. tonsurans.
Dermatofit antropofilny
Wywołuje zakażenie skóry owłosionej
głowy (najczęstszy czynnik etiologiczny
grzybicy głowy w USA i Wielkiej
Brytanii)
W Polsce stanowi 4,6% dermatofitów (w
Europie 1%)
Zakażenia wśród sportowców
trenujących zapasy.
Terapia: terbinafina 4 tygodni, miejscowo preparaty azolowe.
Przypadek
PCR dla T. tonsurans (173 bp)
Podsumowanie
• Zastosowanie procedur wykorzystujących metody klasyczne i molekularne w laboratoriach mikologiczych skrócą czas oczekiwania na wynik badania i zwiększą ich czułość.
• Metody molekularne są pomocne w oznaczeniu gatunku grzyba uzyskanego w hodowli (w przypadkach wątpliwych - pleomorfizm).
• Typowanie genetyczne szczepów dermatofitów umożliwi prowadzenie dokładniejszych badan epidemiologicznych.
Top Related