双视角光片荧光显微镜的介绍李玥

倒 置 光 片 荧 光 显 微 镜 （ inverted Selective Plane Illumination

Microscopy，iSPIM）作为倒置排列装置的一种，最初由美国国立卫生研究院

（National Institutes of Health，NIH）的 Shroff实验室最先提出，该显微

镜在普通的倒置显微镜上改装而成，生物样本不需要经过特殊的处理，便可以

直接加载在普通的载玻片上。而后该装置又进一步发展为双视角倒置光片荧光

显微镜（dual-view inverted Selective Plane Illumination Microscopy,

diSPIM）。diSPIM 主要通过两只物镜交替地激发荧光和成像采集，在样品固

定的情况下，实现了双视角成像，并且对两个视角的图像进行融合，重建出一

幅空间分辨率各向均匀的图像。下面简单介绍其总体装置、激发光路和数据采

集过程。一、 总体装置

diSPIM系统的整体装置如图 1所示，是以倒置的荧光显微镜为基座改装而

成。系统采用两个 NA均为 0.8的水浸物镜（分别对应于 A视角和 B视角），

两个物镜相互垂直并且与水平平面成 45°夹角。两个物镜分别和机械臂相连，

整个机械臂挂载在 z升降平台上。激发光从后端进入机械臂并经双色镜反射，

经过物镜之后激发样品，激发的荧光被另一只物镜采集并成像到该侧的

sCMOS相机上。整个机械臂可以通过升降平台精密移动，以调节物镜和样品

的距离。底端的倒置显微镜，可以对样品的初步观察，方便样品准备和仪器操

作。

图 1 diSPIM整体装置图

二、 激发光路该系统通过扫描高斯激光光束产生扫描式的光片，整个激发光路如图 2所

示。488 nm 和 561 nm 的光束通过双色镜相汇合，通过声光调制器

（AOTF）之后分别通过透镜对组成的 4f系统（L1和 L2，L3和 L4，L5/L6和

OBJ A/OBJ B）。扫描振镜GALVO1和物平面共轭，通过扫描光束，可以使光

束绕物平面旋转，以消除条纹影响。扫描振镜 GALVO2和物镜的后焦面共轭，

通过扫描光束，可以生成虚拟的光片。扫描振镜 GALVO3同样和物镜后焦面共

轭，但是其扫描作用使光片沿成像物镜的光轴平移，从而实现三维体积的荧光

激发和成像。

图 2 diSPIM的激发光路图三、 数据采集在一个数据采集周期内（图 3），假定先用 A视角进行成像，则此时 B视

角将产生光片，激发荧光被 A视角物镜采集。采集完一个平面后，光片沿着 A

视角光轴移动一个脚步（一层切片的厚度）；同时 OBJA也有压电陶瓷控制，

同步移动，保证光片始终在 OBJA的焦平面上。在 A视角采集完一个 3D数据

之后，切换成 A视角激发荧光，B视角采集数据，同样采集完一个 3D数据。

如此完成了双视角的一次采集。对两个 3D数据进行配准和联合去卷积之后，

就可以得到 diSPIM 各向分辨率均匀的图像。

图 3 双视角采集流程

四、 非对称双视角倒置光片荧光显微系统diSPIM显微镜由于样品准备简单，并且不需旋转样品就可以获得空间各向

均匀的分辨率，开始在活体生物样品的长时间三维成像中获得越来越广泛的应

用。然而该系统采用相同数值孔径（NA）的两个物镜，难以使用更大的数值孔

径，限制了两个视角横向分辨率的进一步提高。因而采用非对称设计的双视角

光片荧光显微系统，以进一步提高显微镜的横向分辨率。根据阿贝准则，光学显微镜的分辨率定义为用显微镜可以分辨出来的两个

同等亮度的点光源之间的最小距离，而此分辨率的极限是由光的衍射特性所决

定的．无论是宽场显微镜还是共聚焦显微镜，其在阿贝准则下的横向分辨率极

限与光波的波长 及物镜的数值孔径 有如下关系：

（1）

这也成为显微镜分辨率的衍射极限，是理想状态下显微镜所能达到的最大

分辨能力。虽然 diSPIM通过联合去卷积之后的图像可以达到各向同性的分辨率，但

是由于其两个视角采用相同的配置，同时由于两个视角光轴的遵循 90°夹角，

加上物镜的外壳带来的限制，目前能用上的水浸物镜的最大 NA只能达到

0.8。这也意味着其横向极限分辨率只能达到 313nm（对于 =500nm）。而

如果采用不对称的两个视角，通过稍微牺牲一只物镜的 NA来提高另一只物镜

的 NA，这样至少会在大 NA 的视角上获得更高的横向分辨率。例如采用

1.1NA物镜和 0.7NA物镜的组合。这样对于 1.1NA的物镜，其横向分辨率极

限可以达到 227nm，而对于 0.7NA物镜的横向分辨率则降低到了 357nm。这样的非对称物镜组合，在应用到倒置显微镜中时，由于两个物镜的张角

不一样，则不能像原来的装置一样与水平面 45°角摆放，而必须倾斜摆放，才

可以避免 1.1NA的物镜碰触载玻片，如图 4所示。这导致物镜的整个机械臂一

起倾置，如图 5所示。由于系统架构的非对称性，这种系统称为非对称双视角

倒置光片荧光显微镜（asymmetrical dual-view inverted Selective Plane

Illumination Microscopy, adiSPIM）。

图 4 不同物镜组合的位置摆放

图 5 机械结构的倾置

通过实验证明，由于采用非对称的、数值孔径高低搭配的物镜组合，与

diSPIM系统相比（各向均匀的分辨率：0.33 μm），adiSPIM以牺牲少量轴

向分辨率的代价，将横向分辨率提高到了 0.26 μm。