Rozdzielanie kwasów perfluorokarboksylowych metodą elektroforezy kapilarnej z detekcją bezpośrednią UV

Electrophoresis, w druku

Lena Wójcik 1, Bogdan Szostek 2, Wioleta Maruszak 3, Marek Trojanowicz 1

1) Wydział Chemii Uniwersytetu Warszawskiego, 2) DuPont Haskell Laboratory for Health and Environmental Sciences, USA,3) Instytut Farmaceutyczny, Rydygiera 8, Warszawa

Opracowano warunki rozdzielania i oznaczania perfluorowanych kwasów karboksylowych (PFCAs) zawierających od 6 do 12 atomów węgla w cząsteczce metodą elektroforezy kapilarnej z detektorem diodowym. Optymalizowano warunki pomiarów przez dobór odpowiedniego rodzaju i stężenia elektrolitu podstawowego, jak również typu i zawartości procentowej modyfikatora organicznego. Za optymalne warunki rozdzielania badanych kwasów uznano 50 mM bufor fosforanowy o pH 9,3 zawierający 40% izopropanolu. Za optymalną długość fali detekcji uznano 190 nm. Dla detekcji pośredniej badano kilka chromoforów, a 5 mM kwas 3,5-dinitrobenzoesowy w 20 mM buforze fosforanowym uznano za optymalny eluent dla detekcji pośredniej przy 280 nm. Limit detekcji oznaczony dla detekcji bezpośredniej zawiera się w przedziale od 2 mg/mL dla C6-PFCA do 33 mg/mL dla C12-PFCA. Limit detekcji osiągnięty dla detekcji pośredniej był porównywalny do limitu detekcji dla detekcji bezpośredniej UV.

Elektroferogram standardowej mieszaniny kwasów perfluorokarboksylowych. Elektrolit: 50 mM Na2HPO4, 40% izopropanolu, pH 9.3, hydrostatyczne wstrzykiwanie próbki 0.5 p.s.i. 5s, napięcie +25 kV, λ = 190 nm, identyfikacja pików, 1 – C12PFCA, 2 – C11PFCA, 3 – C10PFCA, 4 – C9PDCA, 5 – C8PFCA, 6 – C7PFCA, 7 – C6PFCA, każdy analit o stężeniu 0.5 mM

Zastosowanie różnych technik zatężania on-line w oznaczeniach melatoniny i wybranych neuroprzekaźników

metodą elektroforezy kapilarnejElectrophoresis, przyjęte do druku

Jacek Musijowski, Ewa Poboży, Marek Trojanowicz

Melatonina (N-acetylo-5metoksytryptamina) jest hormonem wydzielanym przez szyszynkę. Spełnia ona wiele istotnych funkcji w organizmach. Najlepiej została poznana jej funkcja jako fizjologicznego regulatora dobowego cyklu snu. Opracowano metodę oznaczania i rozdzielania melatoniny (MT) i innych związków indolowych współwystępujących w próbkach naturalnych: 6-hydroksymelatoniny (6-HMT), kwasu 5-metoksyindolooctowego (5-MIAA), 5-metoksytryptaminy (5-MTRA), tryptofanu (TRP) i serotoniny (SER). Jako metodę rozdzielania zastosowano micelarną chromatografię elektrokinetyczną (MEKC) z dodecylosiarczanem sodu jako fazą pseudostacjonarną. Uzyskano dobre rozdzielenie wszystkich analitów.

Ponieważ melatonina występuje w płynach ustrojowych na poziomie pg/ml, konieczne jest przeprowadzenie wstępnego zatężania próbki. W tym celu sprawdzono możliwość zastosowania różnych wariantów technik zatężania on-line w kapilarze: spiętrzania (ang. stacking) oraz zmiatania (ang. sweeping). Uzyskane dla melatoniny współczynniki zatężania przedstawiono poniżej (EOF –przepływ elektroosmotyczny, LD – limit detekcji)

Technika Spiętrzanieprzy wysokim

EOF

Spiętrzanieprzy zatrzymanym

EOF

Zmiatanieprzy wysokim

EOF

Zmiatanieprzy zatrzymanym

EOFWspółczynnik

zatężania

LD [ng/ml]

52,8

40

8,6

30

41,8

59

11,9

36

Elektroforeogramy otrzymane po zastosowaniu techniki zmiatania z odwróconą migracją miceli i różnych czasach wstrzykiwania próbki 3, 30 i 50 sekund.

Próbka: 1) 5-MTRA, 2) SER, 3)L-TRP, 4) MT, 5) 5-MIAA, 6) 6-HMT, 1 mg/ml każdy; Elektrolit: 20 mM bufor fosforanowy pH 3,3 z 50 mM SDS; Napięcie: -20kV. Detekcja UV λ=214 nm.

Zastosowanie cyklodekstryn w rozdzielaniu kompleksów metaloporfirynowych metodą elektroforezy kapilarnej

Electrophoresis, wysłane do opublikowania

Krystyna Pyrzyńska, Krzysztof Kilian

Rozdzielanie i ilościowe oznaczanie porfiryn i ich kompleksów odgrywa istotną rolę w analizie klinicznej i farmaceutycznej. Niestety jakość uzyskanych elektroferogramów jest często obniżona przez silne rozmycie czołowe lub tyłowe sygnałów.

Cyklodekstryny są naturalnie występującymi cyklicznymi oligosacharydami, w których jednostki D-glukozy tworzą lukę, oddziałującą z cząsteczkami o odpowiednim kształcie i wielkości na zasadzie gość-gospodarz. Metaloporfiryny tworzą z cyklodekstrynami kompleksy inkluzyjne o stechiometrii 1:2, których charakterystyczną właściwością jest ograniczenie oddziaływań pomiędzy cząsteczkami metaloporfiryn w roztworze.

Zbadano możliwość zastosowania modyfikacji elektrolitu podstawowego -cyklodekstryną do poprawy rozdzielenia mieszaniny kompleksów Co, Cu, Cd, Ni i Zn z TCPP, o stężeniu 10-5 mol/dm3 . Zastosowano bufor boranowy o stężeniu 50 mmol/dm3 i pH=9.0 z dodatkiem 2 mmol/dm3 -cyklodekstryny. Zastosowanie dodatku -cyklodekstryny pozwoliło na rozdzielenie mieszaniny metaloporfiryn i uzyskanie sygnałów o poprawnych kształtach.

Elektroferogram mieszaniny kompleksów metaloporfirynowych po modyfikacji elektrolitu podstawowego 2 mmol/dm3 -cyklodekstryną (TCPP – 5,10,15,20-tetrakis (4-karboksyfenylo) porfiryna).

Wykorzystanie zintegrowanego systemu chromatografów jonowych do oznaczania chlorków, fosforanów

i siarczanów w roztworach stężonego kwasu azotowego

Journal of Chromatography A, 1026 (2004) 195-200

Magdalena Biesaga 1, Nicole Schmidt 2 and Andreas Seubert *,2

1) Wydział Chemii Uniwersytetu Warszawskiego2) Department of Chemistry, Philipps-University of Marburg, Niemcy

Wysokiej czystości kwas azotowy jest wykorzystywany w produkcji elementów elektronicznych. Oznaczanie śladowych zanieczyszczeń w roztworach o skomplikowanej matrycy jest szczególnie trudnym zagadnieniem.

Dwa połączone on-line systemy chromatografów jonowych zostały wykorzystane do oznaczanie zawartości chlorków, fosforanów i siarczanów w roztworze stężonego kwasu azotowego. Pierwszy system zawierał kolumnę anionową z kopolimerem divinylobenzenu i polistyrenu i unieruchomionymi grupami N-metylodietanolowymi o dużej pojemności, która umożliwiała oddzielenie anionowych zanieczyszczeń od wysokiego stężenia azotanów. Drugi system zawierający komercyjną kolumnę anionową był wykorzystywany do oznaczeń ilościowych. Oba systemy były połączone zaworem z kolumienką zatężającą. Calkowity czas analizy wynosił 30 minut. Granica wykrywalności dla Cl -, SO4

2-, PO43-

wynosiła odpowiednio 0,1; 1 i 5 mg/l w kwasie azotowym o stężeniu 69%.

(a) (b)Schemat układu (a) zatężanie próbki; (b) analizowanie próbki

Wpływ stężenia kwasu azotowego (system 1)

Chromatograam mieszaniny anionów po oddzieleniu matrycy-system 2

Opracowanie układu do chromatografii cieczowej z detekcją w podczerwieni i detekcją Ramana z

zastosowaniem mikrodyspensera przepływowego

Journal of Chromatography A, w druku

Izabella Surowiec 1, Josefa R. Baena 2, Johannes Frank 2, Thomas Laurell 3, Marek Trojanowicz 1, Bernhard Lendl 2

1) Wydział Chemii Uniwersytetu Warszawskiego, 2) Instytut Technologii Chemicznej i Analizy Politechniki Wiedeńskiej, Austria3) Wydział Pomiarów Elektrycznych, Instytut Technologii Uniwersytetu w Lund,

Szwecja

Mikrodyspenser (Rys.1) jest urządzeniem zbudowanym z dwóch struktur silikonowych z kanałem pomiędzy nimi, umożliwiającym jego podłączenie do pomiarowego systemu przepływowego (np. HPLC, Rys.2). Do kanału zamocowany jest poprzez płytkę z pleksi element piezoceramiczny. Przyłożenie napięcia do tego elementu powoduje jego zginanie a tym samym nacisk na kanał przepływowy i wypchnięcie kropli z małego otworu znajdującego się w nim. Zastosowanie mikrodyspensera umożliwia naniesienie wycieku z kolumny chromatograficznej na płytkę spektroskopową sterowaną komputerem i poruszającą się z określoną prędkością pod urządzeniem w postaci szeregu kropel o objętości pikolitrów. Odparowanie eluenta z tych kropel jest szybkie i umożliwia analizę otrzymanych suchych depozytów różnymi technikami mikroskopowymi.

Układ HPLC-mikrodyspenser został wykorzystany do oznaczania pięciu kwasów fenolowych występujących w próbkach win, po ich uprzednim chromatograficznym rozdzieleniu na kolumnie C-18 o średnicy 2.1 mm. Widma poszczególnych osadzonych związków zostały wykonane mikroskopią w podczerwieni oraz mikroskopią Ramana i wykazały dużą zgodność z widmami odniesienia wzorców, udowadniając tym samym przydatność powyższej techniki do analizy i charakterystyki związków metodą HPLC z detekcją w podczerwieni.

Rys. 1. Schemat mikrodyspensera

Rys. 2. Schemat układu HPLC-mikrodyspenser.

Porównanie różnych sorbentów stosowanych w ekstrakcji do fazy stałej (SPE) do zatężania herbicydów

fenoksykwasowych

Praca w przygotowaniu do opublikowania

Anna Jankowska, Magdalena Biesaga, Krystyna Pyrzyńska

Badano efektywność zatężania 6 herbicydów fenoksykwasowych: dikamby, MCPA, 2,4-D, MCPP, 2,4-DP i 2,4,5-T na różnych sorbentach: fenylowym, C18, Strata X, SAX, Oasis. Zatężone związki oznaczano za pomocą chromatografii cieczowej w układzie izokratycznym z detekcją UV przy długości fali 225 nm. Eluentem była acetonitrylu z 26,2 mM kwasem octowym o pH 2,5 o stosunku obj. (40/60, v/v).

Przed zatężaniem próbki były zakwaszane do pH 2,5 kwasem octowym i wymywane 1 ml metanolu. Inną procedurę stosowano przy zatężaniu próbki na silnym wymieniaczu anionowym SAX, próbek nie zakwaszano, i wymywano anality 1 ml acetonitrylu z buforem octanowym o pH 6,9 (40/60, v/v). Porównywano odzysk uzyskany na każdym sorbencie. Chromatogramy przestawiają zatężone próbki wody oligoceńskiej i z Kanału Żerańskiego z dodatkiem wzorców o stężeniu 5 µg/L. Najlepsze rezultaty uzyskano na sorbentach polimerycznych: Strata X i Oasis oraz na sorbencie fenylowym, rzędu 90% dla MCPA, 2,4-D, MCPP i 2,4-DP, ponad 80% dla 2,4,5-T, najgorszy odzysk na wszystkich sorbentach otrzymano dla dikamby, która w odróżnieniu od pozostałych herbicydów jest pochodną kwasu benzoesowego.

Enzymatyczne oznaczanie mikrocystyn z wykorzystaniem bioczujników amperometrycznych

Biosensors and Bioelectron 20 (2005) 1520-1530

M. Campas2, Dorota Szydlowska1, Marek Trojanowicz1, J.-L. Marty2

1) Wydział Chemii Uniwersytetu Warszawskiego, 2) Centrum Fitofarmacji Uniwersytetu w Perpignan, Francja

Celem badań było opracowanie bioczujników przeznaczonych do szybkiego monitoringu środowiskowego szkodliwych produktów metabolizmu cyjanobakterii (sinic) występujących w zbiornikach słodko- i słonowodnych. Bioczujniki te będą przeznaczone do detekcji jednej z najobszerniejszych klas toksyn cyjanobakteryjnych, mikrocystyn, wywołujących silne efekty chorobotwórcze.

Toksyczność mikrocystyn jest wynikiem ich silnego wiązania do kluczowych enzymów komórkowych nazywanych fosfatazami proteinowymi. Mikrocystyny powodują inhibicję enzymów odpowiedzialnych za defosforylację wewnątrzkomórkowych fosfoprotein. Wielkość inhibicji enzymu może być użyta jako miara zawartości mikrocystyn w badanych próbkach. Inhibitowane enzymy należą do klasy fosfataz serynowo/treoninowych (PP).

W pracy badawczej wykorzystano węglowe elektrody sitodrukowane służące jako podłoże do unieruchomienia fosfatazy proteinowej typu 2A (PP2A). Enzym unieruchomiono na zasadzie pułapkowania cząsteczek białka w matrycy polimerowej alkoholu poliwinylowego sprzężonego z grupami styrylopirydynowymi. (PVA-SbQ). Oznaczanie mikrocystyn opiera się na inhibicji unieruchomionego na powierzchni bioczujnika enzymu, oraz możliwości amperometrycznej detekcji powstającego w reakcji enzymatycznej elektroaktywnego produktu. Uzyskane wyniki wskazują, że stężenie przy którym inhibicja osiąga wartość 50 % wynosi IC50 = 0,867µg/L

Zastosowanie elektrod sitodrukowanych modyfikowanych nanorurkami węglowymi do konstrukcji czujników

chemicznych i bioczujników

Analytical Letters, 37 (2004) 3185-3204

Marek Trojanowicz 1, Ashok Mulchandani 2, Marco Mascini 3

1) Wydział Chemii Uniwersytetu Warszawskiego2) Wydział Inżynierii Chemicznej i Środowiskowej Uniwersytetu Kalifronijskiego w

Riverside, USA3) Laboratorium Bioczujników Wydziału Chemii Uniwersytetu we Florencji,

Włochy

Do modyfikowania powierzchni grafitowych elektrod pracujących trójelektrodowych sitodrukowanych czujników elektrochemicznych zastosowano wielościenne nanorurki węglowe (CNT) otrzymane metodą CVD przez sublimację ferrocenu. Modyfikowanie prowadzono przez odparowanie na powierzchni elektrod grafitowych zawiesin nanorurek w dimetyloformamidzie. Wykazano wpływ zmodyfikowania na odwracalność procesów elektrodowych. Efekt ten wykorzystano do poprawy czułości detekcji i poziomu wykrywalności pestycydu paraoksonu w pomiarach z bioczujnikiem zawierającym unieruchomiony enzym hydrolazę organofosforową OPH (Rys.1). Pozytywny efekt modyfikacji nanorurkami uzyskano również w elektrokatalitycznym pomiarze metanolu w obecności jonów kobaltu(II) w roztworze (Rys.2).

Rys. 1. Zależność wielkości prądu anodowego od stężenia paraoksonu dla bioczujnika z powierzchnią niemodyfikowaną CNT () oraz modyfikowaną 5 mg () i 20 mg () CNT. Pomiar w 50 ml próbki umieszczonej na powierzchni bioczujnika.

Rys. 2. Zależność wielkości prądu od stężenia metanolu mierzona czujnikami niezmodyfikowanymi CNT (,) oraz zmodyfikowanymi 20 g CNT (,). Pomiar w obecności 50 M Co(II) przy +0.8 V (,) oraz +0.9 V vs. Ag/AgCl (,).

Paraoxon concentration, mM0 10 20 30 40 50 60

Cur

rent

, nA

0

100

200

300

400

500

600

700

Methanol concentration, mM

0 100 200 300 400 500 600 700

Cur

rent

, uA

0

10

20

30

40

Enancjoselektywne czujniki ze unieruchomioną oksydazą D-aminokwasową

Praca w przygotowaniu do publikacji

Marzena Wcisło1, Dario Compagnone2, Marek Trojanowicz1

1) Wydział Chemii Uniwersytetu Warszawskiego, 2) Wydział Chemii Żywności Uniwersytetu w Teramo, Włochy

Celem pracy było stworzenie i zoptymalizowanie bioczujnika z unieruchomioną oksydazą D-aminokwasową. Jest to enzym niespecyficzny gdyż utlenia więcej niż jeden aminokwas o konfiguracji względnej D, wyróżnia się natomiast wysoką enancjoselektywnością w stosunku do aminokwasów D.

Jako analit wybrana została alanina, gdyż zawartość jej enancjomeru D w naturalnych próbkach żywności może być wskaźnikiem czystości bakteriologicznej. Stosunek enancjomerów związków będących składnikami żywności jest istotnym wskaźnikiem jakości, postępu procesów technologicznych, zanieczyszczenia, podrabiania, bądź starzenia się produktu. Konstrukcja bioczujnika oparta były na elektrodzie “screen-printed” pokrytej warstwą Błękitu Pruskiego, który stanowił mediator czuły na zmiany stężenia nadtlenku wodoru, wprost proporcjonalne do zmian stężenia aminokwasów o konformacji D.

Optymalizacja bioczujnika polegała na wyborze odpowiedniego buforu, ustaleniu najlepszego pH, dobraniu odpowiednich proporcji składników warstwy z unieruchomionym enzymem, sposobu jej przygotowania i przechowywania gotowego czujnika. Sprawdzana była czułość bioczujnika, czas jego życia i enancjoselektywność.

Unieruchomienie DAAOx możliwe było po dializie enzymu, który, handlowo dostępny zawiera sole TRIS, które utrudniały immobilizację enzymu. Otrzymany bioczujnik jest enancjoselektywny. Może być stosowany do oznaczania całkowitej ilości D aminokwasów przy obecności L aminokwasów. Otrzymano liniową odpowiedź dla D alaniny w zakresie stężeń 10-250 mmol/l. Czas życia bioczujnika wynosił 10 dni.

Porównanie odpowiedzi elektrody wobec enancjomerów D i L alaniny. Pomiary w buforze fosforanowym 0,05 mol/l z dodatkiem KCl 0,1 mol/l i FAD 10 mmol/l.

y = 0,246x + 2,3165R2 = 0,9944

y = -0,0027x + 0,5636R2 = 0,5237

-100

10203040506070

0 50 100 150 200 250 300

DAlanine

LAlanine

I [nA]

Stężenie D- lub L-alaniny [mmol/l]