Wybór systemu ekspresyjnego

Bakterie

Escherichia coli

Zalety:

wysoki poziom ekspresji (do 500 mg/l hodowli)

dobrze poznany system

proste technologie

niskie koszty

Wady:

brak modyfikacji potranslacyjnych

ograniczona wielkość klonowanego DNA

różnice w „codon usage”

Bacillus spp. - zalety

Organizm GRAS (generally regarded as safe)

Możliwość produkcji wielu białek do pożywki

Bakterie dobrze scharakteryzowane (znany genom B. subtilis

i B. licheniformis)

Rośnie na ubogich podłożach

Wysoki poziom ekspresji (10 mg/litr)

Bacillus spp. - ograniczenia

Preferowana ekspresja homologiczna:

Geny pochodzące z Bacillus sp. produkowane z dużą wydajnością (skala

produkcji białek gram/litr)

Niewydajna ekspresja białek eukariotycznych (skala produkcji białek

mg/litr)

Grzyby

Saccharomyces cerevisiae

ZALETY

Średni poziom ekspresji

Glikozylacja białek

Białka kierowane do

pożywki

Dobrze poznany proces

fermentacji

Łatwa liza komórek

WADY

Mała wydajność

transformacji

Ograniczona ilość wektorów

Pichia pastoris

Modyfikacje potranslacyjne białek

Poziom ekspresji genów heterogenicznych jest z reguły od 10- do 100- razy wyższy niż w drożdżachSaccharomyces cerevisiae

Pichia pastoris

Produkowane białka mogą być kierowane do: cytoplazmy

na zewnątrz komórki (mała ilość białek Pichii kierowanych na zewnątrz komórki)

Produkcję białek rekombinowanych w Pichia pastoris powinno prowadzić się w odpowiednich bioreaktorach (pełne wykorzystanie „potencjału ekspresyjnego P. pastoris)

Glikozylacja białek posiadających w swej sekwencji motyw Asn-X-Ser/Thr może prowadzić do utraty aktywności enzymatycznej lub antygenowych eksprymowanego białka heteregonicznego w Pichia pastoris

Kluyveromyces lactis

Wysoki poziom ekspresji

Możliwość zakupu gotowych kompetentnych komórek K.

lactis

Proste protokoły (dla osób bez doświadczenia w pracy z

drożdżami)

Możliwość wykorzystania systemów dla celów

komercyjnych (system sublicencjonowania)

Możliwość produkcji białek na zewnątrz lub wewnątrz

komórek

http://www.neb.com/nebecomm/products/productE1000.asp

Kluyveromyces lactis

Ekspresja w drożdżach zachodzi spod silnego promotora LAC4, który NIE umożliwia ekspresji w E. coli (geny kodujące białka toksyczne dla E. coli mogą być klonowane do plazmidu pKLAC1 w bakteriach przed ich ekspresją w systemach drożdżowych)

Białka produkowane w K. lactis ulegają modyfikacjom (glikozylacja)

Selekcja odbywa się bez użycia antybiotyków – acetamidaza (amdS) z pKLAC1 pozwala transformowanym komórkom na użycie acetamidu, jako źródła azotu

Hansenula polymorpha

Do 150 kopii klonowanego genu na komórkę

Możliwość koekspresjii do czterech różnych genów

Tanie pożywki

Wysoki poziom ekspresji do13.5 g/L

Stabilność białek - niewielka aktywność proteolityczna

http://www.artes-biotechnology.com/expres/hansenula/hansenula01.jsp

Trichoderma reesei

Wysoki poziom ekspresji

Glikozylacja białek

Możliwość ekspresji

zewnątrzkomórkowej

Mała wydajność

transformacji

Trudny proces fermentacji

Ograniczony wybór

wektorów

Specyficzny codon usage

Komórki owadzie

Baculovirus system, komórki owadzie Sf9

Glikozylacja

Proste zwiększanie skali

Trudne warunki hodowli

Powolny wzrost

www.invitrogen.com

Hodowle komórkowe

Komórki zwierzęce

Zalety Glikozylacja

Mogą być z nich wyprowadzane ciągłe linie komórkowe

Niektóre komórki rosną w zawiesinie (e.g., CHO cells)

Tempo wzrostu bardzo wysokie(e.g., HeLa cells)

Ekspresja zewnątrzkomórkowa

Wady Niektóre komórki rosną

przytwierdzone do podłoża

Skomplikowana hodowla

Wolny wzrost niektórych linii komórkowych (15-25h)

Bardzo wrażliwe na kontaminację

Bardzo wrażliwe na wstrząsy

Hodowla komórek roślinnych

Zalety

Hodowla w zawiesinie

Małe wymagania

napowietrzania

Białka w wakuolach

Wady

Mała ilość systemów

Agrobacterium

Specyficzne wirusy

Powolny wzrost

Wrażliwe na wstrząsy

Inne systemy

Zwierzęta

Transformacja zarodków

Użycie tkankowo-specyficznych promotorów (np. produkcja

w mleku)

ESCHERICHIA COLI

Plazmid - definicja

Plazmidy – autonomiczne, pozachromosomalne elementy genetyczne występujące (zwykle w postaci kolistych, lub rzadziej w postaci liniowych cząsteczek DNA) w bardzo wielu organizmach prokariotycznych (i niektórych eukariotycznych)

Plazmidy - charakterystyczne cechy

Zdolność do trwałego utrzymywania się w komórce

Zdolność replikowania się w komórce w kontrolowany sposób

Plazmidy nie kodują funkcji, które byłyby niezbędne do życia komórki (w „normalnych” warunkach)

Wybór systemów ekspresyjnych w E. coli

Zalety:wysoki poziom ekspresji (do 500 mg/l hodowli)dobrze poznany systemproste technologieniskie koszty

Wady:brak modyfikacji posttranslacyjnychograniczona wielkość klonowanego DNAróżnice w „codon usage”

Wektory prokariotyczne

Zawierają tzw. markery selekcyjne, nadające komórkom gospodarza łatwy

do testowania fenotyp (np. oporność na antybiotyk)

Posiadają unikalne miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne w

obrębie rejonów, w które można wprowadzić obcy DNA, bez naruszania

zdolności wektora do replikacji i możliwości selekcji zrekombinowanych

cząstek

Są niezdolne do przeżycia poza komórką gospodarza, namnażają się w

niewielu szczepach i nie posiadają zdolności koniugacyjnych

Wektory prokariotyczne - podział

Wektory autonomiczne – autonomicznie replikują się w

komórkach gospodarza

Wektory integracyjne – włączają się do genomu gospodarza

(duża stabilność, mała liczba kopii)

Wektory ekspresyjne - podział

Wektory ekspresyjne z silnym promotorem - jeżeli klonowany

gen nie posiada efektywnego promotora, ale zawiera własny

rejon RBS to włączany jest do wektora tuż za silnym

promotorem (fuzja genowa transkrypcyjna)

Wektory ekspresyjne

Wektory ekspresyjne z sygnałami translacyjnymi – konieczność

modyfikacji sekwencji genu w miejscu kodonu inicjatorowego

translacji (ATG) (fuzja genowa translacyjna)

Wektory ekspresyjne

Wektory ekspresyjne umożliwiające produkcję białek

hybrydowych – białka hybrydowe z dodatkowymi

aminokwasami w części N-terminalnej (fuzje proksymalne) lub

w części C-terminalnej (fuzje dystalne) (fuzja translacyjnie

złożona)

Wybór systemu

Wybór odpowiedniego systemu

stopień tolerancji komórek gospodarza na obecność obcego białka

zasada: siła promotora determinuje możliwy do osiągnięcia stan jego

represji (słabszy promotor jest ściślej kontrolowany, natomiast silny

promotor jest gorzej regulowany)

Wybór odpowiedniego wektora:

ilość kopii wektora na komórkę

promotory bakteriofagowe (PR i PL z faga λ oraz Φ10 z faga T7), promotory

bakteryjne (PLAC) oraz eukariotyczne (PCMV)

Składniki systemu ekspresyjnego

DNA kodujace białko docelowe mRNA

cDNA

genomowe DNA

Wektor (plazmid) pET

pQE

pGEX

Szczep ekspresyjny (E. coli ) BL21(DE3)

Rosetta(DE3) plus pRARE

Tuner(DE3)

ADA494(DE3)trxB mutant

Origami(DE3) trxB and gor mutations

System nadprodukcji białek bakteriofaga T7

(Tabor-Studier)

genom E.coli Komórka gospodarza

pET

gen kodujący lizozym

lizozym T7

pLysS

Inaktywacja

polimeraza RNA T7

DE3

gen T7

lac Opromotor lac

represor lacI

gen kodujący represor

lacI

polimeraza RNA E.coli

Indukcja IPTG

represor lacI

gen kodujący represor

lacI

lac Opromotor T7

polimeraza RNA T7

Indukcja IPTG

gen docelowy

http://www.pg.gda.pl/chem/Katedry/Mikrobiologia/inzgen.html

System pET (Novagen)

Możliwość klonowania genów, które chcemy eksprymować w E. coli, pod silny promotor bakeriofaga T7, który nie jest rozpoznawany przez polimerazę RNA E. coli

Brak ekspresji genów spod promotora T7 w komórkach E. colidopóki nie pojawi się w nich polimeraza RNA faga T7

System pET –części składowe

Plazmidowy wektor serii pET umożliwiający ekspresjęwklonowanego do niego genu pod kontrolą silnychsygnałów transkrypcyjnych (promotor) i translacyjnych(RBS) pochodzących z bakteriofaga T7

Szczep E. coli pozwalający na indukcję na ściślekontrolowanym poziomie polimerazy RNA bakteriofaga T7spod wybranego promotora E. coli np. pLacUV5

Induktor IPTG regulujący poziom ekspresji genu z plazmidupET w komórkach E. coli

Wektory ekspresyjne serii pET (Novagen)

Wektory ekspresyjne serii pET - wektory

transkrypcyjne

Dostępne trzy wektory transkrypcyjne: pET21(+), pET23(+) ipET24(+) umożliwiają silną transkrypcję mRNA wklonowanegogenu z promotora T7

Brak sekwencji RBS w obrębie transkryptu powstającego spodpromotora T7

W celu uzyskania białka z genu wklonowanego do tychwektorów należy klonować go z własną sekwencją RBSumożliwiającą translację w E. coli

Wektory ekspresyjne serii pET - wektory

translacyjne

Umożliwiają silną transkrypcję mRNA wklonowanego genu zpromotora T7

Posiadają sekwencje RBS w obrębie transkryptu powstającegospod promotora T7 zapewniającą wydajną translacje

Większość zawiera miejsca restrykcyjne pozwalająceklonować w jedną z trzech możliwych ramek odczytu spodRBS znajdującego się na wektorze

Wektory ekspresyjne rodziny pET

Większość wektorów serii pET poza typowym ori replikacyjnym zawiera również sekwencję origin replikacji faga f1 umożliwiającą uzyskanie jednoniciowej formy DNA tych plazmidów np. w celu przeprowadzenia mutagenezy ukierunkowanej w obrębie ich sekwencji

Wszystkie wektory z origin f1 zawierają w nazwie sufix (+)

pET System – trzy podstawowe kryteria

wyboru wektora ekspresyjnego

1. Ilość białka, którą chcemy wyprodukować:

„małe” ilości białka (techniki badania aktywności białek,

badania oddziaływania uzyskanego białka z wybranymi

ligandami, uzyskiwanie przeciwciał przeciwko tym białkom)

„duże” ilości białka (uzyskanie stężonych lub wysoce

aktywnych preparatów – badania strukturalne, zastosowania

przemysłowe)

pET System – 3 podstawowe kryteria

wyboru wektora ekspresyjnego

2. Możliwość lub konieczność uzyskania białka w postaci fuzji z wybranymi domenami fuzyjnymi mającemu na celu np.:

• ułatwienie procedury oczyszczania eksprymowanego białka

• zwiększenie rozpuszczalności uzyskanego białka w cytozolu E. coli

• transport eksprymowanego białka do przestrzeni periplazmatycznej E. coli

pET System – 3 podstawowe kryteria

wyboru wektora ekspresyjnego

3. Strategia klonowania czyli wybór wektora pod

względem miejsc restrykcyjnych obecnych w MCS

oraz pod względem wyboru jednej z trzech

możliwych ramek odczytu

pET System – trzy podstawowe kryteria

wyboru wektora ekspresyjnego

Jeżeli możliwość klonowania do wektorów

ekspresyjnych jest ograniczona można zastosować

„klonowanie bez ligazy” (wektory LIC serii pET np.

pET30LIC)

Klonowanie bez użycia ligazy

Domeny fuzyjne- różnorodność wektorów

plazmidowych pET

Domeny fuzyjne („tag”) umożliwiają ekspresję tego samego genu w postaci białek fuzyjnych różniących się właściwościami wynikającymi z ich sekwencji

Domeny fuzyjne mogą składać się z kilku reszt aminokwasowych np. 6 reszt aminokwasowych His-Tag lub mogą być to sekwencje reszt aminokwasowych białek np. 495 reszt aa. białka NusA z Nus-Tag

Domeny fuzyjne - różnorodność

wektorów plazmidowych pET

Domeny fuzyjne umożliwiające łatwą detekcję białek fuzyjnych za pomocą techniki Western blotting:

S•Tag, T7•Tag, GST•Tag, His•Tag, Nus•Tag, HSV•Tag

Domeny fuzyjne umożliwiające „proste” oszacowanie poziomu ekspresji białka nawet w surowych ekstraktach komórkowych:

S•Tag, GST•Tag

Domeny fuzyjne - różnorodność

wektorów plazmidowych pET

Domeny fuzyjne umożliwiające łatwe oczyszczanie

białek fuzyjnych za pomocą różnego typu

chromatografii powinowactwa:

His•Tag, GST•Tag, S•Tag, T7•Tag

Domeny fuzyjne umożliwiające transport

eksprymowanego białka do przestrzeni

periplazmatycznej E. coli np.

sekwencja sygnalna ompT/pelB w wektorach pET12a-c

Domeny fuzyjne - różnorodność

wektorów plazmidowych pET

Sekwencje rozpoznania dla wybranych enzymów

proteolitycznych umożliwiające łatwe odcięcie

domeny fuzyjnej po wykorzystaniu ich w oczyszczaniu

docelowego białka typu dzikiego za pomocą wybranej

metody chromatografii powinowactwa:

LeuValProArg*GlySer – trombina

AspAspAspAspLys* - enterokinaza

IleGluGlyArg* - czynnik X

* - miejsce cięcia

Domeny fuzyjne - różnorodność

wektorów plazmidowych pET

Domeny fuzyjne zwiększające rozpuszczalność białek

fuzyjnych i ułatwiające powstawanie właściwych

mostków disiarczkowych:

W cytoplazmie szczepów E. coli mutantów trxB- - Nus•Tag,

Trx•Tag i GST•Tag

W przestrzeni periplazmatycznej E. coli oraz wspomagające

„folding” białek fuzyjnych

DsbA•Tag

DsbC•Tag

Domeny fuzyjne - różnorodność

wektorów plazmidowych pET

Domena fuzyjna zmniejszająca rozpuszczalność białek fuzyjnych

i ułatwiające powstawanie ciał inkluzyjnych tzw „kamień

białkowy”:

KSI-Tag

silnie eksprymowana silnie hydrofobowa domena fuzyjna zbudowana

ze 125 aa

użyteczna także przy ekspresji małych białek a nawet peptydów

zabezpieczająca je przed proteolizą w cytoplazmie

His•Tag

Sekwencja domeny fuzyjnej

Ligand wiążący domenę

fuzyjną:

Elutant:

• Zbuforowane roztwory imidazolu (pH=7,9)

• Poprzez powolne obniżanie pH

Np. HisHisHisHisHisHisMetXXXX

His•Tag

Zalety Możliwość oczyszczania

białkaMożliwość oczyszczania

białka w warunkach denaturujących (6M Gu-HCl lub 6M mocznik)

Wady Należy unikać buforów

zawierających związki: redukujące takie jak: -merkaptoetanol, ditiotreitol oraz chelatujące tj. EDTA

www.invitrogen.com

Plazmidy serii pETBlue

Powodem skonstruowania plazmidów serii pETBlue była

chęć połączenia zalet plazmidów serii pET tj.

wysokokopijność i ekspresja wklonowanych genów spod

silnego promotora T7 z prostą selekcją

rekombinantowych klonów E. coli opartą o znany z

plazmidów pUC18/19 system selekcji białe/niebieskie

kolonie na podłożach z X-Gal i IPTG

Plazmidy serii pETBlue oraz pET

Plazmidy serii pET

Plazmidy serii pETBlue

Plazmidy serii pETBlue – selecja

„białe/niebieskie”

Ekspresja -peptydu -galaktozydazy LacZ E. coli odbywa się spod „słabego” promotora ptet E. coli

Dzięki umiejscowieniu MCS w obrębie fragmentu genu lacZ kodującego -peptyd -galaktozydazy LacZ E. coli możliwa jest prosta selekcja klonów rekombinantowych na podłożach z X-gal i IPTG

- Białe kolonie rekombinantowe

- Niebieskie kolonie niosące nierekombinowane plazmidy serii pETBlue

Plazmidy serii pETBlue – selecja

„białe/niebieskie”

Selekcja „białe/niebieskie” dla plazmidów pETBlue jest możliwa do przeprowadzenia tylko w szczepach E. coli, które nie produkują natywnej beta-galaktozydazy E. coli

Plazmidy serii pETBlue – selekcja

„białe/niebieskie”

Plazmidy serii pETBlue – ekspresja spod

promotora T7

W plazmidach serii pETBlue

znajdują się dwie sekwencje

operatorowe lacO (miejsca

wiązania dla represora lacI)

Plazmidy serii pETBlue – ekspresja spod promotora T7

Plazmidy serii pETBlue

nie niosą własnej kopii

genu lacI represora (w

przeciwieństwie do

plazmidów serii pET)

Plazmidy serii pETBlue – ekspresja spod

promotora T7

Plazmidy serii pETBlue są wykorzystywane do ekspresji białek w warunkach ściślejszej kontroli represorem lacI niż ma to miejsce w przypadku plazmidów serii pET

Szczepy ekspresyjne E. coli dla plazmidów

pETBlue

www.novagen.com

Szczepy ekspresyjne E. coli dla plazmidów

pETBlue

www.novagen.com

Szczepy ekspresyjne E. coli dla plazmidów

pETBlue

Istniej możliwość prowadzenia ekspresji w komórkach E.

coli NovaBlue transformowanych plazmidem serii pETBlue

po ich zakażeniu fagiem CE6

Plazmidy serii pETBlue

www.novagen.com

Koekspresja dwóch i więcej genów w

systemie pET

Koekspresja dwóch (lub więcej genów) w E. coli może

mieć na celu np.:

Wyprodukowanie dużej liczby multimerycznych kompleksów

białek enzymatycznych

Produkcję określonych białek wraz ze specyficznymi dla nich

białkami opiekuńczymi

Koekspresja dwóch i więcej genów w

systemie pET

Produkcja multi-podjednostowych kompleksów białek służy:

Badaniu oddziaływań pomiędzy poszczególnymi podjednostkami

kompleksu

Badaniu właściwości enzymatycznych multimerycznego kompleksu

enzymatycznego

Koekspresja z białkiem opiekuńczym jest często jedyną drogą

otrzymania niektórych białek w postaci natywnej z

zachowaniem ich „pierwotnej” funkcji

Koekspresja dwóch i więcej genów w

systemie pET

Koekspresja dwóch i więcej genów w E. coli może być

osiągnięta:

Poprzez wklonowanie dwóch lub więcej genów do

jednego wektora plazmidowego

Poprzez transformację komórek E. coli dwoma lub więcej

plazmidami posiadającymi kompatybilne ori replikacji oraz

niosącymi różne geny oporności na antybiotyki

Koekspresja dwóch i więcej genów w

systemie pET

Koekspresja dwóch i więcej genów w systemie

pET

Koekspresja dwóch i więcej genów w

systemie pET

Istotny jest odpowiedni wybór wektora i szczepu ze

względu na kompatybilność ori replikacji i genów

oporności na antybiotyki wektorów (oporność „własna”

szczepów ekspresyjnych na antybiotyki)

Koekspresja dwóch i więcej genów w

systemie pET

DuetSystem System składa się z czterech wektorów plazmidowych

umożliwiających jednoczesną ekspresję nawet ośmiu różnych białek w E. coli

Każdy z tych wektorów pozwala na jednoczesną ekspresję do dwóch różnych genów spod niezależnych promotorów T7lac

Wektory te umożliwiają ekspresję wklonowanych białek w postaci natywnej lub fuzji z His-Tag lub S-Tag w celu detekcji i łatwego oczyszczania powstałych białek fuzyjnych

Koekspresja dwóch i więcej genów w

systemie pET

Duet System

System ten pozwala na stosowanie innych wektorów serii

pET, pETBlue, pETcoco wymiennie z poszczególnymi

wektorami Duet System