Uniwersytet Warszawski Wydział Biologii · Praca magisterska na ... Pani prof. dr hab. Wirginii...

Uniwersytet Warszawski

Wydzia Biologii

Izabela Chojnicka

Nr albumu 217280

Cytotoksyczne i proapoptotyczne dziaanie kwasu oleanolowego

oraz jego pochodnych wyizolowanych z buraka wikowego

na komrki nowotworowe jelita grubego linii DeTa

Praca magisterska na kierunku Biologia

w zakresie Biologia Komrki i Organizmu

Praca wykonana pod kierunkiem

Prof. dr hab. Wirginii Janiszowskiej

Wydzia Biologii Uniwersytetu Warszawskiego

Warszawa, czerwiec 2008

Owiadczenie kierujcego prac

Owiadczam, e niniejsza praca zostaa przygotowana pod moim kierunkiem i stwier-

dzam, e spenia ona warunki do przedstawienia jej w postpowaniu o nadanie tytuu

zawodowego.

Data Podpis kierujcego prac

Owiadczenie autora pracy

wiadom odpowiedzialnoci prawnej owiadczam, e niniejsza praca dyplomowa zo-

staa napisana przez mnie samodzielnie i nie zawiera treci uzyskanych w sposb niezgodny

z obowizujcymi przepisami.

Owiadczam rwnie, e przedstawiona praca nie bya wczeniej przedmiotem procedur

zwizanych z uzyskaniem tytuu zawodowego w wyszej uczelni.

Owiadczam ponadto, e niniejsza wersja pracy jest identyczna z zaczon wersj

elektroniczn.

Data Podpis autora pracy

Streszczenie

Z korzeni buraka wikowego Beta vulgaris var. esculenta, stosujc rne warunki eks-

trakcji i chromatografii (TLC, CC), wyizolowano mieszanin saponin triterpenowych oraz

wyodrbniono pojedynczy zwizek, ktry zidentyfikowano jako triglikozyd kwasu oleano-

lowego przy uyciu spektrometrii mas. Nastpnie zbadano ich dziaanie cytotoksyczne

i proapoptotyczne (cytometria przepywowa), a take monoglukozydu kwasu oleanolo-

wego, wolnego kwasu oleanolowego i wolnego kwasu ursolowego oraz mieszaniny tych

ostatnich na ludzkie komrki raka jelita grubego linii DeTa. Najsilniej dziaay w kolejno-

ci: monoglukozyd kwasu oleanolowego, triglikozyd kwasu oleanolowego i kwas ursolowy,

co wskazuje na zaleno badanych waciwoci od struktury zwizku.

Sowa kluczowe

Kwas oleanolowy, kwas ursolowy, saponiny, linia komrkowa DeTa, apoptoza, cytotok-

syczno

Dziedzina pracy (kody wg programu Socrates-Erasmus)

13.1. Biologia

Tytu pracy w jzyku angielskim

Cytotoxic and apoptogenic effect of oleanolic acid and its derivatives from beet root on

human colorectal adenocarcinoma cell line DeTa

Pani prof. dr hab. Wirginii Janiszowskiej za powicony czas, merytoryczn pomoc w

trakcie pisania pracy, a take za moliwo szczerej rozmowy, otrzymania rady

i wsparcia.

Pani mgr Agnieszce Mroczek za wykonanie analizy MS, jak rwnie za wszechstronn

pomoc i tworzenie niepowtarzalnej, koleeskiej atmosfery w czasie pracy.

Prac dedykuj mojej Mamie

Spis treci

Spis treci 1

1 Wstp 3

1.1 Rak jelita grubego . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

1.2 Chemoprewencja . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

1.3 Saponiny triterpenowe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

1.3.1 Budowa i waciwoci chemiczne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

1.3.2 Wystpowanie saponin oraz wolnego kwasu oleanolowego i kwasu

ursolowego w podkrlestwie rolin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

1.3.3 Aktywno przeciwnowotworowa saponin triterpenowych . . . . . . . 8

2 Zaoenia i cel pracy 12

3 Materiay i metody 13

3.1 Materia badawczy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

3.2 Odczynniki chemiczne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

3.3 Ekstrakcja . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

3.3.1 Przygotowanie materiau . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

3.3.2 Ekstrakcja eterem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

3.3.3 Ekstrakcja metanolem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

3.3.4 Ekstrakcja butanolem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

3.3.5 Ekstrakcja do fazy staej SPE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

3.4 Synteza monoglukozydu kwasu oleanolowego . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

1

SPIS TRECI 2

3.5 Metody chromatograficzne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

3.5.1 Chromatografia cienkowarstwowa TLC . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

3.5.2 Ukady chromatograficzne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

3.5.3 Chromatografia kolumnowa CC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

3.6 Spektrometria mas MS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

3.7 Metody hodowli komrek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

3.7.1 Pasa do butelek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

3.7.2 Pasa na szalki . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

3.8 Badanie ywotnoci komrek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

3.9 Badanie apoptozy metod cytometrii przepywowej . . . . . . . . . . . . . . 19

4 Wyniki 20

4.1 Analiza ekstraktw eterowych i butanolowych . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

4.2 Analiza MS mieszaniny saponin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

4.3 Pomiar ywotnoci komrek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

4.4 Analiza cytometryczna . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

5 Dyskusja 40

Bibliografia 47

Spis symboli i skrtw 55

Spis rysunkw 57

Spis tabel 59

Rozdzia 1

Wstp

1.1 Rak jelita grubego

W krajach rozwinitych, wraz ze wzrostem dugoci ycia obywateli, zwiksza si zapa-

dalno na schorzenia, a najbardziej powszechne pord nich s choroby nowotworowe (ok.

77% przypadkw po 55 roku ycia), charakteryzujce si niekontrolowanym namnaaniem

komrek, niezalenym od mechanizmw regulujcych podzia. W 2007 roku American

Cancer Society zanotowao ok. 1,5 mln nowych przypadkw zachorowa i ponad 0,5 mln

zgonw, czyli ponad 1500 osb kadego dnia [61].

Nowotwory dzielimy na agodne i zoliwe, z czego te ostatnie maj zdolno do meta-

stazy, czyli rozprzestrzeniania si po organizmie i kolonizowania tkanek. Do nowotworw

zoliwych nale: nowotwr anaplastyczny (typ nowotworu cakowicie niezrnicowa-

nego), misak (nowotwor zoliwy pochodzenia nienabonkowego), potworniak (nowotwr

wywodzcy si totipotencjalnych komrek zarodkowych) oraz rak (nowotwr zoliwy wy-

wodzcy si z tkanki nabonkowej).

Rak jelita grubego, obejmujcy zmiany nowotworowe w obrbie okrnicy, odbytnicy

oraz wyrostka robaczkowego, znajduje si na trzecim miejscu, po raku prostaty, puc

i oskrzeli, na licie nowotworw, na ktre zapada ludno krajw rozwinitych i na drugim

pod wzgldem miertelnoci wrd pacjentw, rwnie w Polsce. Kadego roku rak jelita

grubego jest przyczyn zgonu 655 000 ludzi na wiecie. Najwysza zapadalno wystpujeTylko na terenie USA

3

ROZDZIA 1. WSTP 4

w Europie Zachodniej, Stanach Zjednoczonych i Kanadzie, natomiast najnisza w krajach

Afryki i Azji [40].

Przyczyny zachorowa obejmuj zarwno czynniki genetyczne jak i rodowiskowe.

Wrd schorze dziedzicznych, zwizanych z rakiem jelita grubego, do najpowszechniej-

szych naley rodzinna polipowato gruczolakowata (FAP) czy zesp Lyncha (HNPCC),

t.j. dziedziczny rak jelita grubego niezwizany z polipowatoci. Zdecydowanie najwicej

zachorowa (65%85%) to tzw. sporadyczny rak jelita grubego, gdzie wystpuj naka-

dajce si mutacje genw supresorowych, kodujcych biaka takie jak APC, DCC czy

p53, ktrych powstanie moe by zwizane z diet ubog w warzywa i owoce, z przewag

misa czerwonego, paleniem papierosw, naduywaniem alkoholu czy brakiem wysiku

fizycznego. Nowotwr jelita moe si rwnie rozwin w wyniku wczeniej przebytych

chorb, takich jak wrzodziejce zapalenie jelita grubego czy pojedyncze polipy wystpu-

jce w jego obrbie.

1.2 Chemoprewencja

Leczenie raka jelita grubego obejmuje zabiegi chirurgiczne, a take radio- i chemiote-

rapi, ktre poza wysokim ryzykiem zgonu pacjenta, obciaj go dokuczliwymi i czsto

upoledzajcymi samodzielne funkcjonowanie skutkami ubocznymi. Dlatego niezwykle

wane jest zapobieganie powstawaniu choroby, a w przypadku jej wystpienia, wczesne

wykrycie i zahamowanie na pocztkowym etapie rozwoju, czyli tzw. prewencja [1, 15].

Chemoprewencja to stosowanie farmakologicznych lub naturalnych substancji w celu

zapobiegania, zahamowania lub odwrcenia procesu kancerogenezy [6]. Dotychczas opi-

sano wiele zwizkw wykazujcych zdolno zatrzymywania wczesnych etapw powstawa-

nia i rozwoju nowotworu, wrd ktrych wystpuj zarwno leki jak i zwizki pochodzenia

naturalnego. Do farmaceutykw obniajcych zapadalno i umieralno na raka jelita

grubego nale celeksyb, rofekoksyb czy niesteroidowe leki przeciwzapalne (np. sulindak).

Wszystkie one posiadaj wspln cech s inhibitorami cyklooksygenazy 2 (COX-2) .

Jednak pomimo korzystnego wpywu rofekoksybu na jelito jego przyjmowanie wizao

si z wystpieniem chorb ukadu krenia, gwnie zatorw i atakw serca. W efekcieNiesteroidowe leki zapalne hamuj obie izoformy enzymu COX: COX-1 i COX-2

ROZDZIA 1. WSTP 5

w 2004 roku lek wycofano z rynku, a w 2007r. firma Merck musiaa wypaci odszko-

dowanie w wysokoci 4,85 miliardw dolarw na terenie Stanw Zjednoczonych Ameryki

Pnocnej.

Zatem leczenie oparte na stosowaniu syntetycznych farmaceutykw moe wiza si

z wystpieniem wielu powika i skutkw ubocznych. Dlatego wielu badaczy skupio si

na poszukiwaniu naturalnych substancji, ktre mogyby by stosowane zarwno w chemo-

prewencji jak i wczesnej terapii nowotworowej [45]. Wykazano niewtpliwy wpyw diety

na raka jelita grubego w wielu badaniach in vivo zarwno na ludziach jak i zwierztach

laboratoryjnych [8, 22, 32, 36, 42, 48, 49, 54, 56]. Stwierdzono, e jadospis powinien za-

wiera produkty bogate w bonnik, takie jak warzywa, zboa i owoce. Ostatnio testuje

si wpyw ekstraktw z wielu rolin na komrki nowotworowe jelita grubego in vitro i in

vivo. Jednak nadal niewiele wiadomo, jaki jest dokadny skad podawanych ekstraktw,

ani nie znany jest mechanizm dziaania zawartych w nich substancji.

Jedn z wielu jarzyn powszechnie spoywanych nie tylko w kulturze sowiaskiej,

ale na wszystkich kontynentach, jest burak zwyczajny Beta vulgaris, rolina dwuletnia

z rodziny komosowatych Chenopodiaceae. Najpopularniejsze odmiany hodowlane to tzw.

bowina, czyli burak liciowy (Beta vulgaris ssp. vulgaris convar. vulgaris var. cicla)

i burak korzeniowy (Beta vulgaris ssp. vulgaris convar. crassa), w przypadku ktrego

wyrniamy buraka wikowego (Beta vulgaris ssp. vulgaris convar. crassa var. esculenta),

cukrowego (Beta vulgaris ssp. vulgaris convar. crassa var. altissima) oraz pastewnego

(Beta vulgaris ssp. vulgaris convar. crassa var. rapacea) [64].

Burak wikowy to bogate rdo witamin (A, C, E, witaminy z grupy B tiamina, ry-

boflawina, niacyna, pirydoksyna i kwas foliowy), mineraw i pierwiastkw ladowych. Za

fioletowo-czerwon barw odpowiedzialne s betaniny, uywane w przemyle spoywczym

jako barwnik E162. Do tej pory ukazaa si jedna praca, dokumentujca wystpowa-

nie saponin triterpenowych w buraku wikowym [12], rolinnych metabolitw wtrnych,

budzcych obecnie due zainteresowanie ze wzgldu na wykazywany przez nie szereg ak-

tywnoci farmakologicznych. Brakuje jednak informacji na temat ich skadu jakociowego

i wykazywanego dziaania.

ROZDZIA 1. WSTP 6

Rysunek 1: Burak wikowy [58]

1.3 Saponiny triterpenowe

1.3.1 Budowa i waciwoci chemiczne

Saponiny s to glikozydy wystpujce u wielu gatunkw rolin i kilku organizmw mor-

skich [51]. Nazwa pochodzi od charakterystycznej zdolnoci tych zwizkw doobniania

napicia powierzchniowego roztworw wodnych z wytworzeniem piany [34], std roliny

bogate w saponiny uywane byy dawniej jako substytut myda, jak na przykad mydlnica

lekarska Saponaria officinalis czy mydlany korze Chlorogalum pomeridianum [25].

Saponiny s zbudowane z aglikonu zwanego te sapogenin poczonej wizaniem

O-glikozydowym lub estrowo-glikozydowym z czci cukrow, czyli glikonem. Ze wzgldu

na budow wyrniamy aglikony sterydowe i aglikony triterpenowe. Sapogeniny sterydowe

wystpuj najczciej w formie furostanolowej albo spirostanolowej, natomiast triterpe-

nowe w formie oleananu, ursanu albo lupanu.

Sapogeniny triterpenowe to trzydziestowglowe triterpenoidy pentacykliczne, posiada-

jce w swojej czsteczce pi piercieni skondensowanych, przy czym cztery piercienie s

ROZDZIA 1. WSTP 7

szecioczonowe, a ostatni szecio- lub picioczonowy. Ich prekursorem jest skwalen zbu-

dowany z szeciu jednostek izoprenoidowych [34]. Z pord triterpenoidw pentacyklicz-

nych najliczniej u rolin wystpuj kwas oleanolowy (kwas 3-hydroksy-olea-12-en-28-owy)

i kwas ursolowy (kwas 3-hydroksy-urs-12-en-28-owy), rnice si pooeniem grup me-

tylowych przy wglach C-19 i C-20 (Rys. 2). Oba posiadaj grup hydroksylow przy

wglu w pozycji 3 i grup karboksylow przy wglu w pozycji 17.

Cz cukrowa zbudowana jest z pojedynczej czsteczki cukru bd liniowego lub roz-

gazionego acucha cukrowego, w ktrego skad mog wchodzi zarwno heksozy jak

i pentozy, gwnie: D-glukoza, D-galaktoza, D-ksyloza, L-arabinoza, L-fukoza, D-chinowoza,

kwas D-glukuronowy czy kwas D-galaktouronowy [34, 51]. W zalenoci od liczby do -

czonych reszt cukrowych mamy mono-, di- i tridesmozydy [34, 71]. Obecno cukru

w czsteczce zwiksza polarno zwizku, a wic jego rozpuszczalno w wodzie i alkoholu.

(a) Kwas oleanolowy (OA)

(b) Kwas ursolowy (UA)

Rysunek 2: Kwas oleanolowy i kwas ursolowy

1.3.2 Wystpowanie saponin oraz wolnego kwasu oleanolowego i kwasu ursolowego

w podkrlestwie rolin

Kwas oleanolowy wyizolowano po raz pierwszy w roku 1931 z lici oliwki europejskiej

Olea eurepaea [52]. Zarwno wolny kwas jak i jego glikozydowe pochodne znajduj

si we wszystkich czciach rolin, to jest w korzeniach, odydze, liciach, kwiatach,

owocach i nasionach, jednak ich zawarto i proporcje w rnych organach rni si

ROZDZIA 1. WSTP 8

u rnych gatunkw [7, 29, 30, 31, 55, 68]. Zwizki te wystpuj powszechnie w klasie

dwuliciennych Magnoliopsida, z czego w dwch spord omiu podklas, w podklasach

Ranunculidae i Asteridae we wszystkich nadrzdach. Nie wystpuj natomiast wrd

przedstawicieli podklas Magnoliidae i Hamamelididae. Z kolei kwas ursolowy wyizolowano

po raz pierwszy w roku 1923 z lici mcznicy lekarskiej Arctostaphylos uva-ursi [52].

On i jego pochodne rwnie wystpuj powszechnie w klasie Magnoliopsida, gwnie

w podklasach: Hamamelididae, Asteridae, Lamiidae, Rosidae, Dilleniidae. Kwas ursolowy,

w przeciwiestwie do kwasu oleanolowego, wystpuje u rolin najczciej w postaci wolnej.

1.3.3 Aktywno przeciwnowotworowa saponin triterpenowych

Proces powstania i rozwoju nowotworu, czyli kancerogeneza obejmuje trzy etapy

faz inicjacji, promocji oraz progresji. W fazie inicjacji zdrowa komrka w wyniku mutacji

staje si komrk rakow, dzielc si niezalenie od mechanizmw regulujcych podzia.

Dochodzi do hiperplazji, czyli rozrostu tkanki, bd dysplazji, czyli nieprawidowoci

w jej strukturze. W fazie promocji namnaajce si komrki charakteryzuje zwikszona

ruchliwo, utrata penionej funkcji i cznoci z ssiednimi komrkami. W ostatniej

fazie progresji nastpuje proces angiogenezy, a zmienione komrki wydzielaj autokrynne

czynniki wzrostowe. Dochodzi do licznych aberracji DNA. Komrki przenikaj do naczy

krwiononych i limfatycznych, kolonizuj nowe tkanki, tworzc przerzuty [2, 28, 70].

Terapia moe obejmowa oddziaywanie na kadym z tych etapw.

Dziaanie przeciwoksydacyjne i przeciwmutagenne

Z procesem powstawania nowotworu wie si generowanie wolnych rodnikw, ktre

wywouj nieodwracalne zmiany w komrkach ogranizmu poprzez peroksydacj lipidw

i destrukcj biaek, co moe zapocztkowa proces kancerogenezy. Znane s m.in. dwie

grupy enzymw zwizane z ich genereowaniem w organizmie: cyklooksygenazy (COX)

i lipooksygenazy (LOX). Uczestnicz one w przemianach dwudziestowglowych, wielo-

nienasyconych kwasw tuszczowych (gwnie kwasu arachidonowego) do eikozanoidw,

fizjologicznie i farmakologicznie czynnych zwizkw, do ktrych nale prostaglandyny,

tromboksany, leukotrieny i lipoksyny [46]. Niektre z nich to hormony parakrynne, mo-

ROZDZIA 1. WSTP 9

gce hamowa reakcje odpornociowe organizmu, aktywowa namnaanie komrek oraz

indukowa angiogenez, jak to ma miejsce w przypadku raka jelita grubego [35].

W organizmie czowieka wystpuj dwie izoformy enzymu COX, posiadajce odmienne

funkcje biologiczne. Stale syntetyzowane biako COX-1 bierze udzia w utrzymywaniu

homeostazy. Z kolei enzym COX-2, ktrego ekspresja wystpuje w komrkach transfor-

mowanych nowotworowo, w wielu postaciach raka i w procesach zapalnych, pobudza

migracj komrek rdbonka, angiogenez a take zapobiega apoptozie [35]. Poniewa

regulacja ekspresji cox-2 oraz hamowanie aktywnoci COX-2 jest obiecujcym krokiem

w zapobieganiu i leczeniu nowotworw, to chemoprewencyjne Syntetyczne zwizki, b-

dce skutecznymi inhibitorami cyklooksygenazy 2, w praktyce jako leki wywoyway liczne

skutki uboczne [15]. Dlatego wydaje si, e naturalne zwizki hamujce aktywno COX-2

mog by potencjalnymi rodkami chemoprewencyjnymi w terapii przeciwnowotworowej.

Kwas ursolowy, kwas oleanolowy oraz jego glikozydowe pochodne wykazuj zdolno

do hamowania tranksrypcji genu cox-2 i aktywnoci enzymu COX-2 [63, 65], a take

enzymu lipoksygenazy [47, 59, 60] oraz wzrostu wytwarzania peroksydazy glutationowej

(GPx) i dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) [62], to jest enzymw rozkadajcych reak-

tywne formy tlenu [46].

Ponadto kwas oleanolowy poprzez hamowanie kinazy biakowej C (PKC), wpywa

na obnienie trankskrypcji protoonkogenw, midzy innymi c-fos, c-myc i c-jun, jak

rwnie aktywnoci enzymw takich jak metalotioneina i dekarboksylaza ornitynowa,

ktre s charakterystyczne dla pocztkowych etapw rozwoju nowotworu [50, 65].

Dziaanie cytotoksyczne

Jeli chemoprewencyjne strategie zawiodz, naley zatrzyma transformacj nowotwo-

row tkanki poprzez zahamowanie proliferacji, bd zaindukowanie apoptozy w zmie-

nionych komrkach. Wiele bada wskazuje na cytotoksyczne waciwoci kwasu ole-

anolowego i ursolowego, jednak mechanizm ich dziaania nie jest dokadnie poznany

[9, 11, 13, 18, 26, 33]. Z drugiej strony brakuje prac opisujcych dziaanie pojedynczych

saponin ze wzgldu na trudn procedur oczyszczenia i rodzielania zwizkw triterpeno-Wykazano, e nadekspresja COX-2 zwizana jest z procesem nowotworzenia w obrbie bony luzowej jelita

grubego [69].

ROZDZIA 1. WSTP 10

wych. Na og komrkom podawane s ekstrakty, bdce mieszanin bardzo wielu rnych,

czsto niezidentyfikowanych substancji, przez co trudno stwierdzi, ktra z nich ma wpyw

na wywoany efekt.

Apoptoza, czyli programowana mier komrkowa, to zachodzcy w zdrowych tkan-

kach proces zapobiegajcy nadmiernemu rozrostowi tkanki, eliminujcy nadliczbowe bd

uszkodzone komrki, hamujcy nieprawidow proliferacj oraz bdcy narzdziem walki

komrek ukadu immunologicznego z patogenami. Moe by zaindukowany poprzez dwie

oddzielne cieki sygnaowe, zewntrz- i wewntrzkomrkow.

cieka wewntrzkomrkowa, wywoywana poprzez sygnay uszkodzenia DNA lub

aktywowane onkogeny, generuje wzrost przepuszczalnoci bon mitochondrialnych i ak-

tywacj kaskady kaspaz. Natomiast cieka zewntrzkomrkowa inicjowana jest przez

receptory mierci na powierzchni plazmalemmy. Receptory te s aktywowane przez li-

gandy cytokin i biaka powierzchniowe komrek NK oraz cytotoksycznych limfocytw T.

Znajdujce si po cytozolowej stronie bony domeny aktywowanych receptorw mierci

poczone s z biakami adaptorowymi FADD w kompleksie zwanym DISC, ktry akty-

wuje kaskad kaspaz samodzielnie lub z wspudziaem cieki wewntrzkomrkowej.

Do najwaniejszych regulatorw apoptozy nale inhibitory apoptozy IAP, inaktywu-

jce kaspazy oraz biaka z rodziny BCL2, w ktrej znanych jest ok. 20 biaek znajdujcych

si w bonie mitochondrialnej, z ktrych niektre s induktorami apoptozy (gwne biaka

BAX i BAK), a inne maj dziaanie antyapoptotyczne. Biaka BAX i BAK poredni-

cz w indukowaniu zmian w strukturze i funkcji mitochondriw. Nastpuje translokacja

ADP + Pi i ATP w wewntrznej bonie mitochondrialnej, a czsteczki razem z jo-

nami Ca 2+ uwalniane s do cytoplazmy przez powstae w zewntrznej bonie pory, co

prowadzi do zaniku potencjau bonowego. Nastpuje uwolnienie m.in. cytochromu c,

biaka SMAC/Diablo oraz indukujcej apoptoz flawoproteiny AIF. Osiem czsteczek

cytochromu c asocjuje z t sam liczb czsteczek biaka APAF-1, formujc struktur o

ksztacie koa, zwan apoptosomem lub koem mierci. Apoptosom aktywuje kaspaz 9,

ktra aktywuje kolejne kaspazy, m.in. egzekutorow kaspaz 3, inicjujc zalen od ATP,

autokatalityczn proteoliz [2, 14, 39, 57].

Liczne prace omawiaj dziaanie cytotoksyczne i indukowanie apoptozy w komrkach

ROZDZIA 1. WSTP 11

wielu linii nowotworowych przez wolny kwas oleanolowy [3, 4, 27] i ursolowy [5, 10, 15, 37],

a take ich glikozydowe pochodne, takie jak -D-glukozyd OA i metylglukuronozyd OA

z Viguiera decurrens [41] czy kwas 3-[(-L-arabinopiranozylo)-oksy]-23-hydroksyolean

-12-en-28-owy z Sanguisorba officinalis L. [43]. Kwas oleanolowy i kwas 2-hydroksy-oleanolowy

oraz kwas ursolowy i kwas 2-hydroksy-ursolowy hamoway aktywno polimeraz DNA

i oraz topoizomerazy II [44]. Ponadto OA i UA indukoway apoptoz poprzez za-

trzymnie komrek w fazie G0/G1 [16, 17, 65], uruchomienie kaskady kaspaz i zaburzenie

metabolizmu mitrochondrialnego [5, 10, 23, 27, 37], jednak dokadny mechanizm dziaania

tych zwizkw nie jest poznany.

Zbadane zostay rwnie wyizolowane z Silene fortunei saponiny triterpenowe, ktre

nie wykazuj waciwoci cytotoksycznych, lecz wpywaj na zwikszenie akumulacji

w organizmie cis-platyny, leku stosowanego w terapii raka okrnicy, potgujc jego

dziaanie [63].

Rozdzia 2

Zaoenia i cel pracy

Rak jelita grubego jest trzecim co do czstoci wystpowania i drugim pod wzgldem

miertelnoci typem nowotworu w krajach rozwinitych, a rozwj choroby jest niezwykle

uciliwy i nieprzyjemny dla pacjenta. Dlatego te cigle poszukuje si naturalnie wy-

stpujcych w rolinach substancji, ktre mogyby by zastosowane w prewencji choroby,

gdy wpyw diety na rozwj raka jelita grubego zosta szeroko udokumentowany.

Wydaje si, e takimi zwizkami mogyby by saponiny treiterpenowe, wykazujce

liczne waciwoci farmakologiczne, takie jak dziaanie przeciwbakteryjne, przeciwwiru-

sowe oraz przeciwgrzybicze, pierwotniakobjcze, przeciwzapalne, przeciwnowotworowe jak

rwnie oddziaywanie na ukad i mmunologiczny i krwionony [11, 13, 20, 38].

Ostatnio wykazano, e w korzeniu buraka wikowego wystpuj ladowe iloci wolnego

kwasu oleanolowego oraz jego glikozydowych pochodnych, przy czym stosunek zawartoci

aglikonu do jego formy zwizanej wynosi jak 1:600 [12].

Celem niniejszej pracy byo:

1. Wyizolowanie mieszaniny saponin triterpenowych z korzenia buraka wikowego Beta

vulgaris var. esculenta.

2. Zbadanie dziaania cytotoksycznego i proapoptotycznego wyizolowanych saponin oraz

wolnego kwasu oleanolowego i jego izomeru kwasu ursolowego na komrki nowotwo-

rowe jelita grubego linii DeTa.

12

Rozdzia 3

Materiay i metody

3.1 Materia badawczy

Materia badawczy stanowiy:

1. Korzenie buraka wikowego Beta vulgaris var. esculenta (Rys. 3), zebrane z pola

na terenie powiatu ochowskiego w wojewdztwie mazowieckim w padzierniku 2006

roku.

2. Ludzkie komrki nowotworowe jelita grubego linii DeTa, otrzymane z warszawskiego

Centrum Onkologii Instytutu im. Marii Skodowskiej-Curie, a oryginalnie pochodzce

z wiedeskiego The Cancer Research Institute [53].

Rysunek 3: Korzenie buraka wikowego

13

ROZDZIA 3. MATERIAY I METODY 14

3.2 Odczynniki chemiczne

Skadniki medium, w ktrym hodowano komrki:

kwas 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowy HEPES (firmy GIBCO) penicylina (firmy SigmaAldrich) podowa surowica cielca FCS (firmy GIBCO) RPMI (firmy SigmaAldrich) streptomycyna (firmy SigmaAldrich)

Inne odczynniki:

acetylobromoglukoza (firmy Fluka Chemie GmbH) alkohol butylowy (firmy Chempur, Piekary lskie) alkohol etylowy (firmy Chempur, Piekary lskie) alkohol metylowy (firmy Chempur, Piekary lskie) bkit trypanu (firmy Sigma Aldrich) chloroform (firmy Chempur, Piekary lskie) eter dietylowy (firmy Chempur, Piekary lskie) kwas siarkowy (firmy POCh, Warszawa) toluen (firmy Chempur, Piekary lskie) trypsyna (firmy Sigma Aldrich) wglan kadmu (firmy POCh, Warszawa) zestaw Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I, zawierajcy aneksyn sprzonz fluorescein, jodek propidyny i bufor do aneksyny (firmy BD Biosciences, NJ USA)

Wzorce:

kwas oleanolowy (otrzymany w Zakadzie Biochemii Rolin) 3-O-monoglukozyd kwasu oleanolowego (otrzymany w Zakadzie Biochemii Rolin) kwas ursolowy (otrzymany w Zakadzie Biochemii Rolin)


3.3 Ekstrakcja

3.3.1 Przygotowanie materiau

Pokrojone korzenie suszono w temperaturze 50oC, a nastpnie mielono w mynku do

kawy (firmy Moulinex, typ A505).

3.3.2 Ekstrakcja eterem

Rozdrobniony materia (pkt 3.1) umieszczono w gilzie i ekstrahowano eterem etylowym

w aparacie Soxhleta w cigu szesnastu godzin. Otrzymane ekstrakty zatano do sucha.

3.3.3 Ekstrakcja metanolem

Pozostay materia po ekstrakcji eterowej (pkt 3.3.2) zalewano w zlewce metanolem

i umieszczano w ultrasonifikatorze (firmy POLSONIC, typ Sonic 2, moc 250W) w tem-

peraturze 30oC na 20 minut. Powstay osad odsczano na lejku Buchnera i ekstrahowano

w tych samych warunkach szeciokrotnie. Do ekstraktu metanolowego dodawano rwn

objeto wody, a nastepnie oddestylowano metanol na wyparce obrotowej (firmy Heidel),

pozostawiajc frakcj wodn.

3.3.4 Ekstrakcja butanolem

Frakcj wodn (pkt 3.3.3) ekstrahowano szeciokrotnie n-butanolem. Poczone eks-

trakty odparowywano do sucha pod zmniejszonym cinieniem na wyparce obrotowej.

3.3.5 Ekstrakcja do fazy staej SPE

25 g elu krzemionkowego RP-18 (LiChroprep RP-18, o wielkoci ziaren 40-60 m,

firmy Merck) zawieszano w metanolu i wlewano do lejka Schotta o rednicy 6 cm i wy-

sokoci 10 cm. Lejek by umieszczony w kolbie ssawkowej poczonej z pompk (Rys. 4),

wytwarzajc podcinienie. Zoe kondycjonowano, przepuszczajc przez nie nastpujce

roztwory metanolu w wodzie w objtoci 300 ml:

75% metanolu 50% metanolu


20% metanolu 10% metanolu woda

Rysunek 4: Schemat aparatury uytej do SPE

Ekstrakt butanolowy (800 mg) (pkt 3.3.4) rozpuszczono w najmniejszej objtoci wody,

naniesiono na zoe i przemywano kolejnymi roztworami (300 ml) metanolu w wodzie:

I 100% H2O

II 10% metanolu

III 40a% metanolu

IV 40b% metanolu

V 60% metanolu

VI 80% metanolu

VII 100% metanol

Zebrane frakcje zatano do sucha na wyparce obrotowej.

3.4 Synteza monoglukozydu kwasu oleanolowego

W kolbie trjszyjnej z wkraplaczem, termometrem oraz chodnic Lebiega umiesz-

czono bezwodny toluen (24 ml) z rozpuszczonym kwasem oleanolowym (60 mg) i katali-

zatorem wglanem kadmu (120 mg) i ogrzewano do wrzenia. W czasie oddestylowywania


toluenu wkraplano powoli najpierw roztwr rozpuszczonej w 36 ml toluenu acetylobro-

moglukozy (240 mg), a nastpnie toluen, w celu utrzymania staej objtoci mieszaniny.

Syntez prowadzono przez 4 godziny. Nastpnie na sczku karbowanym odsczano kata-

lizator, a przescz zatano do sucha na wyparce obrotowej.

3.5 Metody chromatograficzne

3.5.1 Chromatografia cienkowarstwowa TLC

Do analitycznej chromatografii cienkowarstwowej stosowano pytki Kieselgel firmy

Merck o gruboci warstwy elu 0,2 mm i wymiarach 20 x 20 cm.

Do preparatywnej chromatografii cienkowarstwowej stosowano pytki Kieselgel 60 F254

firmy Merck o gruboci warstwy elu 2 mm i wymiarach 10 x 20 cm.

3.5.2 Ukady chromatograficzne

Pytki TLC rozwijano w szczelnych, wysyconych parami rozpuszczalnikw kamerach

szklanych w ukadach rozpuszczalnikw:

I chloroform : metanol (98 : 2, v/v)

II chloroform : metanol (85 : 15, v/v)

III chloroform : metanol (60 : 40, v/v)

IV chloroform : metanol : woda (60 : 40 : 10, v/v)

V chloroform : metanol : woda (50 : 50 : 10, v/v)

Do wywoywania pytek stosowano:

A) 50% kwas siarkowy i ogrzewano w temperaturze 120oC (chromatografia analityczna).

B) wod (chromatografia preparatywna).

3.5.3 Chromatografia kolumnowa CC

15 g elu krzemionkowego zawieszano w ukadzie IV (pkt 3.5.2) i wlewano do szklanej

kolumny o rednicy 1,5 cm i wysokoci 21 cm. Po ustabilizowaniu si zoa pozostawiano


0,3 cm mieszaniny rozpuszczalnikw nad jego powierzchni. Frakcj rozpuszczano w nie-

wielkiej objtoci stosowanego ukadu i nanoszono na kolumn. Kolumn rozwijano t

sam mieszanin rozpuszczalnikw w przepywie 2,5 ml/ min zbierajc ok. 10 ml frakcje.

3.6 Spektrometria mas MS

Spektroskopia mas zostaa przeprowadzona w Zakadzie Biochemii Instytutu Uprawy,

Nawoenia i Gleboznawstwa w Puawach na spektrometrze masowym Thermo Finnigan

LCQ Adventage Max.

3.7 Metody hodowli komrek

Komrki hodowano w sterylnych butelkach zamykanych korkiem z filtrem na podou

RPMI (pkt 3.2) z dodatkiem 5% FCS, 1% Hepes oraz antybiotykami penicylin i strep-

tomycyn z zawartoci CO2 5%, w temperaturze 37oC. Co trzeci dzie zbierano zuyte

medium znad hodowli i uzupeniano butelki wieym medium (15 ml).

3.7.1 Pasa do butelek

Raz w tygodniu przeprowadzano pasa komrek. Zlewano medium, dodawano 1 ml

trypsyny, po czym trypsyn zbierano razem z resztkami medium. Pozostae w butelce

komrki inkubowano z 3 ml trypsyny w cigu 5-10 min, po czym dodawano 12 ml medium.

Pobierano 3 ml otrzymanej zawiesiny komrek, przenoszono do nowej, sterylnej butelki

i dopeniano 12 ml medium.

3.7.2 Pasa na szalki

Otrzyman zawiesin komrek (pkt 3.7.1) rozlewano na szeciodokowe szalki. W ka-

dym doku umieszczano 0,5 ml zawiesiny i dopeniano 4,5 ml medium. Po trzech dniach

hodowli do dokw dodawano jeden z badanych zwizkw (Tab. 1) w odpowiednim st-

eniu albo 100M etanolu (kontrola z etanolem) albo niczego nie dodawano (kontrola).

Dowiadczenie wykonano w dwch powtrzeniach. Komrki inkubowano 24h.


Tabela 1: Zwizki podawane komrkom

Zwizek lub mieszanina zwizkw Stenie ( M)rozpuszczonych w etanolu

OA 25, 50, 100, 150UA 10, 50, 100

UA + OA UA10 + OA10UA10 + OA25UA10 + OA50

monoglukozyd OA 10, 25, 50, 100, 150, 200triglikozyd OA 50, 100, 150mieszanina saponin 29, 57, 86, 143, 200

3.8 Badanie ywotnoci komrek

Po inkubacji ze zwizkami (pkt 3.7.2) do zawiesiny komrek (30 l) dodawano bkit

trypanu (30 l) i umieszczano kilka kropel w komorze Burkera przykrytej szkiekiem

nakrywkowym. Pod mikroskopem wietlnym liczono ywe i martwe komrki, a nastpnie

wyliczano procent ywych komrek w preparacie.

3.9 Badanie apoptozy metod cytometrii przepywowej

Po zebraniu medium znad hodowli (pkt 3.7.2), dodawano trypsyn (100 l) i usuwano

resztki medium. Nastpnie ponownie dodawano trypsyn (500 l) i inkubowano komrki

5-10 min. Gdy komrki odkleiy si od dna szalki, dodawano medium (2,5 ml), wirowano

zawiesin (1200 rpm, 8 min., 20oC) i zlewano supernatant. Komrki zawieszano w buforze

do aneksyny, tak by otrzyma stenie ok. 10 mln komrek/1 ml (komrki liczono w ko-

morze Burkera). Nastpnie 100 l zawiesiny komrek umieszczano w probwce, dodawano

jodek propidyny (10 l) oraz aneksyn (5 l). Komrki inkubowano w ciemnoci w cigu

15 min i przeprowadzano pomiar w cytometrze przepywowym (FACSCalibur firmy BD

Biosciences, NJ USA) maksymalnie w przecigu 60 min od zakoczenia inkubacji komrek

z jodkiem propidyny i aneksyn.

Rozdzia 4

Wyniki

4.1 Analiza ekstraktw eterowych i butanolowych

Z wysuszonych korzeni uzyskano ekstrakt eterowy (pkt 3.3.2) i butanolowy (pkt 3.3.4)

wedug schematu przedstawionego na rysunku 5. ! "#$%&'()*)' +, ! -./ 0 / 00 / 000 / 01 / 1 / 10 / 10022222234567 89 : ; %TLCRysunek 5: Schemat izolowania saponin triterpenowych z korzenia buraka wikowego

20

ROZDZIA 4. WYNIKI 21

Frakcja eterowa zawieraa wolny kwas oleanolowy, natomiast frakcja butanolowa jego

glikozydowe pochodne.

Wstpn analiz ekstraktu butanolowego przeprowadzono technik chromatografii

TLC (pkt 3.5.1) w ukadzie III wobec wzorca 3-O-monoglukozydu kwasu oleanolowego.

Wykazaa ona obecno zwizkw mogcych by glikozydowymi lub glikozydoestrowymi

pochodnymi kwasw triterpenowych lub steroli, widocznych na pytce po wywoaniu (pkt

3.5.2) w postaci pasm o charakterystycznym, fioletowo-rowym zabarwieniu.

Ekstrakty butanolowe poddano ekstrakcji SPE (pkt 3.3.5). Otrzymane frakcje poddano

wstpnej analizie TLC (pkt 3.5.1) w ukadzie IV wobec wzorca 3-O-monoglkozydu OA.

Uzyskany chromatogram przedstawiono na rysunku 6, gdzie pasma o zabarwieniu fioleto-

wym, fioletowo-rowym i fioletowo-niebieskim zostay zaklasyfikowane jako potencjalne

saponiny. Frakcja nr III, frakcje nr IV + V oraz VI + VII (pkt 3.3.5) zostay poddane

w celu oczyszczenia chromatografii kolumnowej (pkt 3.5.3), a nastpnie chromatografii

cienkowarstwowej (pkt 3.5.1).

Rysunek 6: Wstpna analiza TLC frakcji po ekstrakcji SPE

W wyniku chromatofrafii kolumnowej dla prby nr III zebrano 27 frakcji, dla prb

nr IV + V 36 frakcji oraz dla prb nr VI + VII 30 frakcji. Wszystkie frakcje otrzymane


w wyniku chromatografii kolumnowej wstpnie analizowano technik TLC w ukadzie

IV. Frakcje zawierajce saponiny, oczyszczano nastpnie technik TLC w ukadzie V.

Zeskrobane do szklanych kolumienek pasma elu z saponinami eluowano dziesiciokrotn

objtoci metanolu, po czym powtrnie wykonywano chromatografi TLC w ukadzie IV.

Ca procedur powtrzono, uzyskujc z frakcji nr III pojedynczy zwizek, widoczny na

rysunku 6 jako najniej umiejscowione pasmo w prbie a po ekstrakcji 40% metanolem.

Oczyszczone saponiny pochodzce z frakcji nr IV + V oraz VI + VII, poczono.

4.2 Analiza MS mieszaniny saponin

W celu zidentyfikowania zwizkw wystpujcych w oczyszczonej mieszaninie saponin

poddano je analizie metod spektrometrii masowej (pkt 3.6). W wyniku bezporedniego

nastrzyku mieszaniny saponin usyskano widmo MS szeregu jonw molekularnych o masach

molowych od 763 do 1117 gmol(Rys. 7).

Rysunek 7: Widmo MS mieszaniny saponin

W oczyszczonym esktrakcie z B. vulgaris var. esculenta stwierdzono obecno dzie-

wiciu rnych saponin w siedmiu spord nich aglikon stanowi kwas oleanolowy, a

w dwch hydroksy-oleanolowy. Natomiast nie stwierdzono obecnoci glikozydw kwasu

ursolowego. Czci cukrowe wyizolowanych saponin zawieraj od dwch do czterech reszt


Rysunek 8: Widmo MS oczyszczonego triglikozydu kwasu oleanolowego

cukrowych, wrd ktrych wystpuj pentozy, heksozy oraz kwas glukuronowy w rnej

liczbie i kombinacjach.

Przeprowadzono fragmentacj do minujcego ilociowo w mieszaninie jonu o masie

955,5 gmol(Rys. 8). Analiza wykazaa, e zwizek ten jest triglikozydem kwasu oleanolowego

(Rys. 8) zawierajcym dwie heksozy i kwas glukuronowy.

4.3 Pomiar ywotnoci komrek

W celu zbadania waciwoci cytotoksycznych zwizkw triterpenowych, to jest kwasu

oleanolowego, 3-O-monoglukozydu OA oraz triglikozydu OA, podawano je osobno do ho-

dowli komrek nowotworowych linii DeTa. Po 24-godzinnej inkubacji dodawano bkit

trypanu (pkt 3.8), ktry wnika do martwych komrek, barwic je na fioletowo-niebieski

kolor. Obliczono procent ywych komrek (Tab. 2, 3, 4).

Wpyw kwas oleanolowego

Wyniki badania ywotnoci komrek DeTa hodowanych w obecnoci kwasu oleanolo-

wego w rnych steniach przedstawiono w tabeli 2 i na rysunku 9.


Tabela 2: Zawarto procentowa ywych komrek hodowanych z kwasem oleanolowym

Kontrola EtOH100 M

OA25M

OA50M

OA100M

OA150M

95% 94% 92% 96% 89% 87%

Nie zaobserwowano wpywu etanolu na ywotno komrek, ani znaczcych rnic

ywotnoci w prbach z kwasem oleanolowym o wzrastajcym steniu. Przy najwyszych

steniach 100 i 150 M liczba martwych komrek jest wiksza zaledwie o ok. 5% w

porwnaniu do pozostaych prb.

Rysunek 9: Zawarto procentowa ywych komrek hodowanych z kwasem oleanolowym

K kontrola, EtOH etanol 100 M

Wpyw 3-O-monoglukozydu kwasu oleanolowego

Wyniki badania ywotnoci komrek DeTa hodowanych w obecnoci 3-O-monoglukozydu

kwasu oleanolowego w rnych steniach przedstawiono w tabeli 3 i na rysunku 10.

3-O-monoglukozyd OA hamuje ywotno komrek o 60-80%, jednak nie ma liniowej

zalenoci liczby martwych komrek od podanego stenia monoglukozydu. Najwicej

martwych komrek wystpio przy steniu 100 i 200 M, najmniej przy steeniu 150

M.


Tabela 3: Zawarto procentowa ywych komrek hodowanych z 3-O-monoglukozydem kwasuoleanolowego

Kontrola EtOH 100M

Mono 50M

Mono 100M

Mono 150M

Mono 200M

95% 0,02 94% 0,06 25% 0,01 17% 0,06 38% 0,06 18% 0,01

Rysunek 10: Zawarto procentowa ywych komrek hodowanych z 3-O-monoglukozydem kwasuoleanolowego

Wpyw triglikozydu kwasu oleanolowego

Wyniki badania ywotnoci komrek DeTa hodowanych w obecnoci triglikozydu

kwasu oleanolowego w rnych steniach przedstawiono w tabeli 4 i na rysnunku 11.

Tabela 4: Zawarto procentowa ywych komrek hodowanych z triglikozydem kwasu oleanolo-wego

Kontrola EtOH 100 M Tri 50 M Tri 100 M Tri 150 M99% 0,03 91% 0,04 79% 0,02 69% 0,03 77% 0,01

Liczba martwych komrek jest wiksza o ok. 10-20% w przypadku prb z triglikozydem

OA ni w kontroli i kontroli z etanolem. Nie obserwuje si jednak liniowej zalenoci

liczby martwych komrek od stenia triglikozydu, poniewa najwicej martwych komrek

wystpio przy steniu 100 M, natomiast przy steniu 50 i 150 M uzyskane wyniki

s praktycznie identyczne.


Rysunek 11: Zawarto procentowa ywych komrek hodowanych z triglikozydem kwasu oleano-lowego

4.4 Analiza cytometryczna

Metoda badania ywotnoci komrek z zastosowaniem bkitu trypanu, w ktrej

komrki s liczone pod mikroskopem wietlnym przez czowieka, jest metod niedokadn.

Dlatego postanowiono zastosowa bardziej precyzyjn cytometri przepywow, w ktrej

jednorazowej analizie zostao poddanych trzydzieci tysicy komrek. Co wicej, analiza

cytometryczna pozwala rozrni komrki martwe na komrki apoptotyczne i na komrki

nekrotyczne.

Jest to moliwe dziki wykorzystaniu faktu, e we wczesnym stadium apoptozy na-

stpuje przeniesienie umiejscowionej w bonie fosfatydyloseryny ze strony cytozolowej

na zewntrz komrki. Do fosfatydyloseryny docza si sprzona z fluorescein aneksyna.

Do prb dodaje si rwnie barwicy DNA jodek propidyny, ktry wnika przez

polunion bon martwych komrek. Rwnoczesne podanie jodku propidyny i anek-

syny pozwala na rozrnienie zdrowych komrek, komrek nekrotycznych oraz wczesno i

pno-apoptotycznych, co przedstawiono schematycznie na rysunku 12).

W lewym dolnym kwadracie lokuj si zdrowe komrki, do ktrych nie wnika jodek

propidyny ani nie przycza si aneksyna. W lewym grnym kwadracie znajduj si ab-


Rysunek 12: Schemat analizy cytometrycznej

sorbujce jodek propidyny komrki nekrotyczne, ktre posiadaj fosfatydyloseryn po

cytozolowej stronie bony, w zwizku z czym nie wi aneksyny. Prawy dolny kwadrat

zawiera komrki znajdujce si we wczesnej apoptozie wice aneksyn, ktrych plazma-

lemma jest szczelna i nie przepuszcza do wntrza jodku. W prawym grnym kwadracie

znajduj si komrki z rozszczelnion bon w rodkowym i pnym stadium apoptozy,

ktre wi aneksyn i absorbuj jodek propidyny.

Wpyw kwasu oleanolowego

Wyniki analizy cytometrycznej komrek DeTa hodowanych w obecnoci kwasu ole-

anolowego w rnych steniach zestawiono w tabeli 5.

Tabela 5: Analiza cytometryczna komrek hodowanych z kwasem oleanolowym

kontrola EtOH 100 M OA 25M

OA 50M

OA100M

OA 150 M

ywe 90,35% 0,68 87,00% 3,44 88,20% 90,00% 86,89% 79,90% 1,03nekroza 2,34% 0,16 3,55% 0,24 3,42% 1,53% 3,30% 5,50% 3,41apoptoza 7,32% 0,5 9,46% 3,2 8,37% 8,48% 9,81% 14,61% 4,44

Najwysz warto procentow komrek ywych (Rys. 13) obserwowano w kontroli

(90,35%) oraz w hodowli z kwasem oleanolowym w steniu 50 M (90%), Nastnie liczba


Rysunek 13: Analiza cytometryczna komrek hodowanych z kwasem oleanolowym

Rysunek 14: Zawarto procentowa komrek apoptotycznych i nekrotycznych po analizie cyto-metrycznej hodowanych z kwasem oleanolowym

ywych komrek stopniowo malaa przy wzrastajcych steniach, osigajc 79,9% pzy

steniu 150 M.

Niejednoznaczne s wyniki dla nekrozy (Rys. 14). Najwicej komrek nekrotycznych

zaobserwowano w prbie z OA 150 M (5,5%) (bardzo wysoka warto odchylenia standar-


dowego), a najmniej w prbie OA 50 M (1,53%). Ponadto liczba komrek nekrotycznych

nie rosa wraz z steniem podanego kwasu warto dla stenia 25 M kwasu oleano-

lowego bya zbliona do wartoci dla stenia 100 M i kontroli z etanolem i wysza ni

dla stenia 50 M. Przy wzrocie stenia od 50 M do 100 M ronie liczba martwych

komrek, najwysza dla stenia 150 M.

Liczba komrek apoptotycznych (Rys. 14) w obecnoci kwasu oleanolowego w steniu

25 M i 50 M jest praktycznie identyczna, natomiast ronie przy wyszych steniach

OA, osigajc najwysz warto przy steniu 150 M (14,61%). Najmniej komrek

apoptotycznych znajduje si w prbie kontrolnej (7,63%). Wystpiy rnice w przypadku

kontroli i kontroli z etanolem 100 M warto dla prby z etanolem (9,46%) jest zbliona

do prby z OA 100 M (9,81%) i wysza ni dla prb z 25 i 50 M.

Nie zaobserwowano znaczcego wpywu etanolu na liczb komrek ywych i komrek

martwych ani na proporcje midzy komrkami nekrotycznymi i apoptotycznymi.

Wpyw kwasu ursolowego

Wyniki analizy cytometrycznej dla komrek DETA hodowanych w obecnoci kwasu

ursolowego w rnych steniach zestawiono w tabeli 6.

Tabela 6: Analiza cytometryczna komrek hodowanych z kwasem ursolowym

kontrola EtOH100 M

UA 10 M UA 50 M UA 100 M

ywe 90,76% 0,86 89,62% 0,95 86,42% 1,57 66,11% 2,4 60,72% 18,72nekroza 1,85% 0,66 1,29% 0,32 1,31% 0,23 7,43% 0,82 16,66% 20,35apoptoza 7,40% 0,2 9,05% 1,2 12,28% 1,33 26,46% 3,22 22,63% 1,63


Rysunek 15: Analiza cytometryczna komrek hodowanych z kwasem ursolowym

! " # " " # Rysunek 16: Zawarto procentowa komrek apoptotycznych i nekrotycznych po analizie cyto-metrycznej hodowanych z kwasem uroslowym


Najwysz warto procentow komrek ywych obserwowano w obu prbach kon-

trolnych (kontrola 90,76%, kontrola z etanolem 100 M 89,62%), tym samym etanol

nie wywiera wpywu cytotoksycznego na komrki. Najnisz warto procentow ko-

mrek ywych zaobserwowano w hodowli komrek z najwyszym steniem UA 100 M

(60,72%), co stanowi znaczc rnic 30% (Rys. 15) w porwnaniu z kontrol. Ponadto

liczba ywych komrek maleje wraz ze wzrostem stenia UA od 10 do 100 M.

Liczba komrek nekrotycznych (Rys. 16) podobna i nie przekraczajca 2% dla kontroli,

kontroli z etanolem i UA 10 M, znaczco wzrastaa przy wyszym steniu kwasu

ursolowego (7,43%, UA 50 M). Ze wzgldu na bardzo wysokie odchylenie standardowe

dla prby z UA 100 M wynik nie jest analizowany.

W przypadku kwasu ursolowego liczba komrek apoptotycznych (Rys. 16) bya zna-

czco wysza ni komrek nekrotycznych i komrek kontrolnych i rosa wraz ze wzrostem

stenia UA, osigajc najwysz warto (26,46%) przy steniu 50 M.

Wpyw mieszaniny kwas ursolowego i kwasu oleanolowego

Wyniki analizy cytometrycznej dla komrek DeTa hodowanych w obecnoci miesza-

niny kwasu ursolowego i oleanolowego w rnych steniach zestawiono w tabeli 7. Dla

porwnania w tabeli umieszczono rwnie wyniki otrzymane dla komrek hodowanych z

wolnym kwasem ursolowym w steniu 10 M oraz z kwasem oleanolowym w steniu 25

i 50 M.

Tabela 7: Analiza cytometryczna komrek hodowanych z kwasem ursolowym i oleanolowym

Kontrola EtOH100M

UA10MOA10M

UA10MOA25M

UA10MOA50M

UA10M

OA25M

OA50M

ywe 92,96%1,29

92,17%0,94

94,08%0,91

92,82%0,5

93,73%1,23

86,42%1,57

88,20% 90,00%

nekroza 3,59%0,4

2,77%0,48

3,03%0,46

5,03%0,99

2,84%0,03

1,29%0,23

3,42% 1,53%

apoptoza 3,47%0,88

5,07%0,47

2,89%0,59

2,15%1,51

3,43%1,27

12,28%1,33

8,37% 8,48%


Rysunek 17: Analiza cytometryczna komrek hodowanych z kwasem ursolowym i oleanolowym

! " ! ! "

Rysunek 18: Zawarto procentowa komrek apoptotycznych i nekrotycznych po analizie cyto-metrycznej hodowanych z kwasem uroslowym i oleanolowym

Liczba ywych komrek (Rys. 17) jest taka sama w poszczeglnych prbach (ok.

9294%). Najwicej komrek ywych wystpuje w prbie z UA 10 M + OA 10 M

(94,08%), najmniej w kontroli z etanolem 100 M (92,17%).

Rwnie liczba komrek apoptotycznych i nekrotycznych (Rys. 18) utrzymuje si


na podobnie niskim poziomie we wszystkich prbach. Nie zaobserwowano te zalenoci

midzy liczb komrek martwych a wzrastajcym steniem kwasu oleanolowego w mie-

szaninie.

Apoptoza w adnym ze stosowanych ste zwizkw nie jest wiksza ni w kontroli,

najwysz warto osigajc w kontroli z etanolem 100 M (5,07%), a najnisz dla

mieszaniny UA 10 M + OA 25 M (2,15%). Z kolei w tej prbie nekroza osigna

warto najwysz (5,03%), za najnisz w prbie z etanolem (2,77%).

Porwnujc wyniki otrzymane dla komrek DeTa hodowanych z mieszanin kwasu

oleanolowego i ursolowego z wynikami otrzymanymi dla hodowli z pojedynczymi kwasami,

nie zaobserwowano istotnych rnic w liczbie komrek ywych i komrek nekrotycznych.

Jedynie liczba komrek apoptotycznych jest wysza o ok. 10% dla prby z UA 10 M i o

ok. 5% dla OA 25 M i 50 M od prby z mieszanin obu kwasw.

Wpyw 3-O-monoglukozydu kwasu oleanolowego

Wyniki analizy cytometrycznej dla komrek DeTa hodowanych w obecnoci 3-O-monoglukozydu

kwasu oleanolowego w rnych steniach zestawiono w tabeli 8.

Tabela 8: Analiza cytometryczna komrek hodowanych z monoglukozydem kwasu oleanolowego

kontrola EtOH100 M

Mono10 M

Mono25 M

Mono50 M

Mono100 M

Mono150 M

Mono200 M

ywe 90,35%0,68

87%3,44

93,65%0,15

91,28%0,18

15,04%4,35

2,70%0,12

6,78%0,53

6,57%0,23

nekroza 2,34%0,16

3,55%0,24

2,77%0,31

3,16%0,03

79,68%6,59

89,89%0,47

81,26%1,31

80,13%4,48

apoptoza 7,32%0,51

9,46%3,2

3,58%0,45

5,56%0,22

13,42%2,23

7,42%0,59

11,42%1,57

13,30%4,22

Podobnie wysokie wartoci liczby komrek ywych wystpuj w obu kontrolach (87%

i 90%) i w obecnoci monoglukozydu OA przy steniach 10 M i 25 M (Rys. 19).

Poczwszy od monoglukozydu OA w steniu 50 M liczba komrek ywych gwatownie

maleje, osigajc najnisz warto dla stenia 100 M (2,7%). Dla obu najwyszych

ste 150 i 200 M liczba komrek ywych jest podobna i wynosi ok. 6,5%.

Wraz ze spadkiem liczby komrek ywych wzrasta liczba komrek martwych nie-

wielka liczba komrek nekrotycznych wystpuje w przypadku obu kontroli i stenia 10


Rysunek 19: Analiza cytometryczna komrek hodowanych z monoglukozydem kwasu oleanolo-wego

M i 25 M monoglukozydu OA, nieprzekraczajc 3,55%. Liczba komrek nekrotycznych

(Rys. 20) gwatownie wzrasta od stenia 50 M monoglukozydu i jest najwysza dla

stenia 100 M (89,89%).

W przypadku komrek apoptotycznych wida, e ich liczba jest zdecydowanie nisza

ni nekrotycznych (Rys. 20). Ponadto liczba komrek apoptotycznych w kontrolach (r-

nica ok. 2%) i prbie z monoglukozydem w steniu 100 M jest wysza ni dla ste

10, 25. Najwicej komrek apoptotycznych wystpuje w obecnoci monoglukozydu OA

w steniu 50 M i 200 M (ok. 13 %). Od stenia 100 M do 200 M liczba komrek

apoptotycznych wzrasta. W obu kontrolach i w prbach z monoglukozydem w steniach

10 M i 25 M komrek apoptotycznych jest wicej ni nekrotycznych, natomiast przy

wyszych steniach monoglukozydu OA odwrotnie.

Wpyw triglikozydu kwasu oleanolowego

Wyniki analizy cytometrycznej dla komrek DeTa hodowanych w obecnoci trigliko-

zydu kwasu oleanolowego w rnych steniach zestawiono w tabeli 9.

Najwicej komrek ywych (Rys. 21) znajduje si w kontroli (89,07%) i kontroli z

etanolem (79,52%). Natomiast we wszystkich prbach z triglikozydem OA liczba ywych


! " " Rysunek 20: Zawarto procentowa komrek apoptotycznych i nekrotycznych po analizie cyto-metrycznej hodowanych z monoglukozydem kwasu oleanolowego

Tabela 9: Analiza cytometryczna komrek hodowanych z triglikozydem kwasu oleanolowego

kontrola EtOH 100 M Tri 50 M Tri 100 M Tri 150 Mywe 89,07% 2,04 79,52% 2,62 54,59% 3,68 52,46% 2,12 54,36% 1,7nekroza 5,08% 1,6 8,26% 1,42 30,18% 0,93 28,49% 0,3 31,86% 2,35apoptoza 5,85% 2,2 12,26% 4,04 15,24% 2,74 19,06% 1,82 13,79% 0,65

komrek jest podobna i wynosi rednio 54%.


Rysunek 21: Analiza cytometryczna komrek hodowanych z triglikozydem kwasu oleanolowego

Rysunek 22: Zawarto procentowa komrek apoptotycznych i nekrotycznych po analizie cyto-metrycznej hodowanych z triglikozydem kwasu oleanolowego


Podobnie we wszystkich prbach z triglikozydem OA liczba komrek nekrotycznych

wynosi ok. 30% (Rys. 22) bez wzgldu na stenie.

Najmniej komrek apoptotycznych znajduje si w kontroli (5,85%), najwicej w prbie

z triglikozydem o steniu 100 M (Rys. 22). Liczba komrek apoptotycznych wynosia

mniej wicej poow liczby komrek nekrotycznych we wszystkich prbach z triglikozydem

kwasu oleanolowego.

Wpyw mieszaniny saponin

Wyniki analizy cytometrycznej dla komrek DeTa hodowanych w obecnoci mieszaniny

saponin w rnych steniach zestawiono w tabeli 10.

Tabela 10: Analiza cytometryczna komrek hodowanych z mieszanin saponin

kontrola EtOH100 M

Sapo 29M

Sapo 57M

Sapo 86M

Sapo143 M

Sapo200 M

ywe 92,96%1,29

92,17%0,95

91,64%0,2

92.30%1,46

93,43%0,35

92,46%0,88

91,86%0,71

nekroza 3,56%0,4

2,77%0,48

3,13%0,78

3,33%0,33

3,24%0,11

4,13%0,98

3,57%0,67

apoptoza 3,47%0,88

4,41%0,45

5,07%0,47

5,52%0,16

5,20%0,62

4,97%0,3

4,38%1,14

Nie obserwuje si znaczcych rnic midzy liczb ywych komrek przy wzrastajcych

dawkach saponin (Rys. 23). Najnisze wartoci procentowe ywych komrek wystpiy

w przypadku podania saponin w steniu 29 M (91,64%) i 200 M (91,86%), a najwysze

(93,43%) przy steniu 86 M.


!"#$"$$% &' '

Rysunek 23: Analiza cytometryczna komrek hodowanych z mieszanin saponin

!" "

Rysunek 24: Zawarto procentowa komrek apoptotycznych i nekrotycznych po analizie cyto-metrycznej hodowanych z mieszanin saponin


We wszystkich przypadkach zarwno nekroza jak i apoptoza (Rys. 24) utrzymuje si

na niskim poziomie, przy czym liczba komrek nekrotycznych we wszystkich prbach

ma podobn warto ok. 3,5%, a komrek apoptotycznych nieco wysz w przypadku

prb z saponinami (ok. 5%). Najnisza warto nekrozy wystpia u komrek kontrolnych

z etanolem (2,77%), a najwysza u komrek z saponinami w steniu 143 M (4,13%).

Najmniej komrek apoptotycznych znajdowao si w kontroli (3,47%). Natomiast

najwicej w przypadku saponin w steniach 29, 57, 86 M, z czego najwiksz warto

osigno dla komrek ze steniem saponin 57 M (5,52%).

Rozdzia 5

Dyskusja

Badanie waciwoci cytotoksycznych i proapoptotycznych

Do medium, w ktrym hodowano komrki linii DeTa dodawano zwizki wystpujce

w korzeniu B. vulgaris, czyli kwas oleanolowy, triglikozyd kwasu oleanolowego oraz mie-

szanin pozostaych omiu saponin. W celu zbadania, jak zmiany budowy czsteczki natu-

ralnych triterpenoidw wpywaj na ich waciwoci cytotoksyczne i proapoptotyczne, po-

dawano rwnie zwizki, ktrych obecno w buraku wikowym nie zostaa wykryta [12],

t.j. kwas ursolowy oraz jego mieszanin z kwasem oleanolowym, a take syntetyzowany

3-O-monoglukozyd kwasu oleanolowego. Monoglukozyd kwasu oleanolowego, zawierajcy

pojedyncz glukoz poczon wizaniem glikozydowym z grup 3-hydroksylow kwasu

oleanolowego, zosta wybrany jako zwizek poredni midzy wolnym kwasem oleanolo-

wym a jego triglikozydow pochodn wyizolowan z korzenia B. vulgaris. Z kolei kwas

ursolowy jest izomerem kwasu oleanolowego, rnicym si pooeniem grup metylowych

przy wglach C-19 i C-20 i czsto wykazujcym silniejsze waciwoci farmakologiczne.

Stenia podawanych zwizkw ustalono, analizujc przegld literatury. Istniej donie-

sienia o oddziaywaniu kwasu ursolowego i niektrych saponin na linie komrkowe ju przy

steniach rzdu kilku M [17, 47, 50, 66] lub kilkudziesiciu M [19, 72]. W przypadku

linii komrkowej HepG2, ludzkiego wtrobiaka zarodkowego, kwas ursolowy obnia y-

wotno komrek przy steniu poniej 30 M, natomiast powyej tej wartoci indukowa

apoptoz, wywoujc fragmentacj DNA, powstanie komrek subdiploidalnych, uwolnie-

40

ROZDZIA 5. DYSKUSJA 41

nie cytochromu c oraz zalenej od niego kaspazy 3 [33].

Na tej podstawie ustalono rozpito ste dla kwasu oleanolowego od 25 do 150 M

i dla kwasu ursolowego od 10 do 100 M, dostosowujc do tych wartoci ilo pozostaych

zwizkw.

Inkubacj komrek ze zwizkami prowadzono 24 godziny, poniewa po tym czasie skad

medium ulega zmianom, ktre mogyby mie wpyw na przeywalno komrek.

W celu sprawdzenia, czy wyniki otrzymane dla wszystkich badanych zwizkw s po-

rwnywalne, w tabelach 11, 12 i na rysunkach 25, 26 przedstawiono rezultaty pomiarw

cytometrycznych dla wszystkich kontroli oraz kontroli z etanolem w steniu 100 M.

Tabela 11: Porwnanie analiz cytometrycznych prb kontrolnych

OA UA UA+OA Mono Tri Sapo redniaywe 90,35%

0,6890,76%0,86

92,96%1,29

90,35%0,68

89,07%1,42

92,96%1,29

91,07

nekroza 2,34%0,16

1,85%0,66

3,59%0,40

2,34%0,16

5,08%1,34

3,59%0,40

3,13

apoptoza 7,32%0,51

7,40%0,21

3,47%0,88

7,32%0,51

5,85%1,30

3,47%0,88

5,80

Tabela 12: Porwnanie analiz cytometrycznych prb kontrolnych z etanolem 100 M

OA UA UA+OA Mono Tri Sapo redniaywe 87,00%

3,4489,62%0,95

92,17%0,95

87,00%3,44

76,52%2,62

92,17%0,95

87,41

nekroza 3,55%0,24

1,29%0,32

2,77%0,48

3,55%0,24

8,26%1,42

2,77%0,48

3,70

apoptoza 9,46%3,20

9,05%1,20

5,0%0,47

9,46%3,20

12,23%4,04

4,41%0,45

8,28

Wyniki otrzymane dla kontroli s podobne, rnice wynosz maksymalnie ok. 4%.

Wiksze rnice wystpiy w zestawieniu kontroli z etanolem (7-15%).

Porwnanie rednich wartoci wszystkich kontroli i kontroli z etanolem pokazuj nie-

wielkie rnice (ok. 3-4%) midzy wartociami procentowymi komrek ywych i apopto-

tycznych oraz brak rnic dla komrek nekrotycznych.

Podsumowujc, niewielkie rnice midzy prbami kontrolnymi pozwalaj porwny-

wa ze sob aktywnoci badanych zwizkw, co wicej obecno etanolu, w ktrym byy


!"!#$

"%%&"'()('(*+,-"%. )(%

Rysunek 25: Porwnanie analiz cytometrycznych prb kontrolnych

! "#$% & ' (

$))*$+,-,+,./01$)2 -,)

Rysunek 26: Porwnanie analiz cytometrycznych prb kontrolnych z etanolem 100 M

rozpuszczone podawane triterpenoidy, praktycznie nie wpywaa na przeywalno kom-

rek.

Aktywno cytotoksyczn mierzono dwiema metodami jedn z zastosowaniem barw-

nika bkitu trypanu (pkt 3.8) i bardziej dokadn, rnicujc komrki martwe na ne-


krotyczne i apoptotyczne, metod cytometrii przepywowej (pkt 3.9). Otrzymane obiema

metodami wyniki dla hodowli z 3-O-monoglukozydem OA oraz triglikozydem OA znacznie

rni si midzy sob.

Wyniki analizy cytometrycznej pokazuj radykaln aktywno cytotoksyczn 3-O-mono-

glukozydu kwasu oleanolowego na komrki DeTa, ktry obnia liczb ywych komrek

w prbie nawet o 97%. Z kolei przy zastosowaniu bkitu trypanu stwierdzono obnienie

liczby ywych komrek o 83%. Poniewa cytometria przepywowa jest metod znacznie

bardziej precyzyjn ni liczenie komrek pod mikroskopem wietlnym, wyniki uzyskane

t metod s bardziej wiarygodne.

Analizujc proporcje komrek apoptotycznych i komrek nekrotycznych okazao si,

e aktywuje on gwnie mier na drodze nekrozy, w mniejszym stopniu indukujc pro-

gramowan mier komrkow. Aktywno proapoptotyczna wystpia na podobnym

poziomie, jak w hodowli w obecnoci OA w steniu 150 M oraz UA w steniu 10

M.

Wyniki uzyskane obiema metodami dla triglikozydu kwasu oleanolowego rwnie r-

ni si midzy sob. W pomiarze z uyciem bkitu trypanu zaobserwowano sabsz

aktywno cytotoksyczn (ok. 70-80% ywych komrek) ni w pomiarze cytometrycznym

(ok. 54%). Wrd komrek martwych komrki nekrotyczne do apoptotycznych wystpo-

way w stosunku 2:1. Stosujc obie metody, wykazano e dziaanie cytotoksyczne trigli-

kozydu kwasu oleanolowego byo silniejsze ni wolnego kwasu oleanolowego, ale sabsze

od 3-O-monoglukozydu OA. Interesujcym jest, e w pomiarze cytometrycznym nie za-

obserwowano zmian aktywnoci triglikozydu w zalenoci od stenia. Wydaje si wic,

e wynik uzyskany w metodzie z uyciem bkitu trypanu dla triglikozydu OA o steniu

100 M, ktry odbiega od dwch pozostaych wynikw dla ste 50 M i 150 M, jest

najprawdopodobniej zwizany z niedoskonaoci zastosowanej metody.

Kwas oleanolowy nie wykazywa znaczcego dziaania cytotoksycznego bez wzgldu na

zastosowan metod. Rnice dotyczce liczby ywych komrek wyniosy kilka procent.

Wraz ze wzrostem stenia tylko nieznacznie rosa liczba komrek znajdujcych si

w apoptozie, dlatego mona powiedzie, e kwas oleanolowy w podanych steniach

wykazywa jedynie bardzo sabe waciwoci proapoptotyczne na komrki linii DeTa.


Uzyskane wyniki wyranie wskazuj na zaleno dziaania cytotoksycznego od struk-

tury triterpenoidu. Kwas oleanolowy z woln grup hydroksylow przy wglu C-3 i woln

grup karboksylow przy wglu C-17 praktycznie nie wykazywa badanych aktywnoci,

natomiast zablokowanie grupy hydroksylowej przez czsteczk glukozy radykalnie zmie-

niao waciwoci zwizku. 3-O-monoglukozyd OA zabija niemal wszystkie komrki w

prbie. Obecno dodatkowej heksozy oraz kwasu glukuronowego w triglikozydzie OA

obniaa aktywno cytotoksyczn prawie o poow. Jednak nieznajc dokadnej budowy

reszt cukrowych triglikozydu kwasu oleanolowego wyizolowanego z B. vulgaris, ani miejsca

ich przyczenia do aglikonu, nie mona wykluczy, e to nie liczba reszt cukrowych, a ich

rodzaj i miejsce wystpowania w czsteczce saponiny decyduj o aktywnoci biologicz-

nej caego zwizku. Z drugiej strony mieszanina omiu saponin triterpenowych z buraka

wikowego w podanych steniach nie wykazaa ani wybirczo waciwoci proapopto-

tycznych ani waciwoci cytotoksycznych. W mieszaninie tej wystpuj zarwno di-, tri-

jak i tetra-glikozydy kwasu oleanolowego (6 zwizkw) oraz kwasu hydroksy-oleanolowego

(2 zwizki) o nieznanych proporcjach ilociowych. Jako e dominujcy ilociowo wrd sa-

ponin triterpenowych wystpujcych w korzeniu buraka wikowego, triglikozyd kwasu

oleanolowego wykazywa dziaanie cytotoksyczne, a mieszanina pozostaych omiu zwiz-

kw nie wykazywaa tej aktywnoci, to wydaje si e zarwno liczba reszt cukrowych, ich

rodzaj i miejsce przyczenia maj istotny wpyw na aktywno biologiczn zwizku. Nie

mona wykluczy, i w tej mieszaninie wystpuj glikozydy o aktywnoci cytotoksycznej,

ale by moe wystpuj one w bardzo maych ilociach i/lub znosz wzajemnie swoje

dziaanie.

Podobnie Gurfinkel i Rao [21] stwierdzili brak waciwoci cytotoksycznych saponin

triterpenowych wyizolowanych z soi na komrki nowotworowe jelita grubego linii HT-29.

Nastpnie przeprowadzili fermentacj glikozydowych pochodnych przez bakterie nalece

do mikroflory jelitowej, otrzymujc aktywne aglikony.

Zatem glikozydowe pochodne mog potencjalnie dziaa przeciwnowotworowo in vivo,

nie wykazujc takiego dziaania in vitro, poniewa w wyniku hydrolizy w organizmie

chorego mog dostarcza aktywnych, czy to aglikonw czy zwizkw z mniejsz iloci

reszt cukrowych, np. monoglikozydw.


W nienijszej pracy wykazano rwnie, i na waciwoci cytotoksyczne i proapop-

totyczne triterpenoidw mia wpyw nie tylko doczony do aglikonu cukier, ale take

zmiana pooenia jednej grupy metylowej w piercieniu E. Ot kwas ursolowy, w przeci-

wiestwie do kwasu oleanolowego, obnia liczb ywych komrek linii DeTa o ok.24-30%,

przy czym wicej byo komrek apoptotycznych ni komrek nekrotycznych, co wskazuje

na waciwoci proapoptotyczne kwasu ursolowego.

Wyniki dziaania cytotoksycznego i proapoptotycznego kwasu oleanolowego oraz

kwasu ursolowego na komrki linii DeTa odbiegaj od danych literaturowych dotyczcych

innych linii komrek nowotworowych. Harmand i wsppracownicy, badajc indukowanie

apoptozy w komrkach linii HaCat przez kwasu ursolowy, otrzymali IC50 dla stenia

12.5 M [24]. Inni badacze, analizujc waciwoci cytotoksyczne UA na komrki linii

B16, otrzymali IC50 przy steniu 10 M [17] za na komrki HepG2 przy 30 M [33].

Z kolei w badaniach dziaania cytotoksycznego kwasu oleanolowego IC50 wynosio poniej

10 g/ml dla trzech linii komrkowych HO-8910, Hela oraz HL60 [67].

Nie zaobserwowano synergistycznego dziaania kwasu oleanolowego i kwasu ursolowego

przy zastosowaniu mieszaniny obu kwasw w najniszych steniach, przy ktrych aden

z nich z osobna nie wykazywa badanych aktywnoci. Oznacza to, e przy zastosowanych

steniach oba izomery nie wpywaj wzajemnie na swoje dziaanie.

Podsumowanie

Z korzenia Beta vulgaris var. esculenta przy zastosowaniu rnych warunkw ekstrakcji

i chromatografii wyizolowano mieszanin dziewiciu saponin triterpenowych, z ktrej

wyodrbniono triglikozyd kwasu oleanolowego. Analiza MS wykazaa obecno siedmiu

glikozydw kwasu oleanolowego oraz dwch glikozydw kwasu hydroksy-oleanolowego.

Dominujcy ilociowo w mieszaninie saponin triglikozyd OA zawiera w swojej czsteczce

dwie heksozy i kwas glukuronowy.


Nastpnie zbadano waciwoci cytotoksyczne i proapoptotyczne zwizkw wyizolowa-

nych z B. vulgaris oraz wolnych kwasw triterpenowych oleanolowego i ursolowego, a take

3-O-monoglukozydu OA za pomoc dwch metod jednej z zastosowaniem bkitu try-

panu i drugiej cytometrii przepywowej. Wyniki otrzymane po analizie cytometrycznej

s znacznie bardziej precyzyjne.

Wykazano zaleno aktywnoci cytotoksycznej i proapoptotycznej od struktury triter-

penoidu. Wolny kwas oleanolowy nie wykazywa dziaania cytotoksycznego ani znaczcego

dziaania proapoptotycznego. Zmiana pooenia jednej z dwch grup metylowych wyst-

pujcych w kwasie oleanolowym przy wglu C-20 w pozycj C-19 w kwasie ursolowym

powodowaa wzrost waciwoci proapototycznych kwasu ursolowego o ok. 18% i cytotok-

sycznych o ok. 24%.

W badanych steniach nie stwierdzono synergistycznego dziaania kwasu oleanolo-

wego i kwasu ursolowego na komrki linii DeTa.

Zdecydowany wpyw na badane waciwoci miao doczenie czsteczki glukozy do

wolnego kwasu oleanolowego. Przy steniu 100 M 3-O-monoglukozyd OA praktycz-

nie zabija wszystkie komrki. Z kolei obecno trzech reszt cukrowych, skadajcych si

z dwch heksoz i kwasu glukuronowego, obniaa aktywno cytotoksyczn zwizku o po-

ow. Obie pochodne glikozydowe w wikszym stopniu indukoway mier nekrotyczn ni

apoptotyczn, co nie jest korzystne z punktu widzenia potencjalnego zastosowania w tera-

pii, w ktrej powinny by stosowane zwizki wybirczo eliminujce komrki nowotworowe

i nie niszczce zdrowej tkanki.

Mieszanina omiu saponin triterpenowych bez triglikozydu kwasu oleanolowego nie wy-

kazywaa istotnego wpywu na komrki linii DeTa. By moe aden spord zwizkw

w mieszaninie nie wykazuje aktywnoci cytotoksycznej i proapoptotycznej lub te sub-

stancje aktywne mog wystpowa w niewielkich ilociach, a pozostae saponiny nie wy-

kazywa badanych waciwoci i/lub znosi wzajemnie swoje dziaanie.

Bibliografia

[1] BB Aggarwal and S Shishodia. Molecular targets of dietary agents for prevention and

therapy of cancer. Biochemical Pharmacology, (71):1397 1421, 2006. [cytowanie na str. 4]

[2] B Alberts. Molecular Biology of The Cell. New York, 2002. [cytowanie na str. 8, 10]

[3] H Assefa, A Nimrod, L Walkerb, and R Sindelara. Synthesis and evaluation of

potential complement inhibitory semisynthetis analogs of oleanolic acid. Bioorganic

and Medicinal Chemistry Letters, (9):18891894, 1999. [cytowanie na str. 11]

[4] H Assefa, A Nimrod, L Walkerb, and R Sindelara. Synthesis and evaluation of

potential complement inhibitory semisynthetis analogs of oleanolic acid enantiose-

lective synthesis and complement inhibitory assay of a/b-ring partial analogues of

oleanolic acid. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, (11):16191623, 2001.

[cytowanie na str. 11]

[5] JH Baek, YS Lee, CM Kang, JA Kim, KC Kwon, HC Son, and KWKim. Intracellular

ca2+ release mediates ursolic acid-induced apoptosis in human leucemic hl-60 cells.

International Journal of Cancer, (73):725728, 1997. [cytowanie na str. 11]

[6] W BaerDubkowska. Chemoprewencja - profilaktyka i terapia wspomagana rakw

gowy i szyji. Postpy w Chirurgii Gowy i Szyi, (2):314, 2003. [cytowanie na str. 4]

[7] E Bedir, H Krmzpekmez, O Stitcher, and D Cal. Triterpene saponins from the fruits

of hedera helix. Phytochemistry, (53):905, 2000. [cytowanie na str. 8]

[8] SA Beresford, KC Johnson, C Ritenbaugh, NL Lasser, LG Snetselaar, HR Black,

GL Anderson, AR Assaf, T Bassford, D Bowen, RL Brunner, RG Brzyski, B Caan,

RT Chlebowski, M Gass, RC Harrigan, J Hays, D Heber, G Heiss, SL Hendrix,

47

BIBLIOGRAFIA 48

Howard BV, J Hsia, FA Hubbell, RD Jackson, JM Kotchen, LH Kuller, AZ LaCroix,

DS Lane, RD Langer, CE Lewis, JE Manson, KL Margolis, Y Mossavar-Rahmani,

JK Ockene, LM Parker, MG Perri, L Phillips, RL Prentice, J Robbins, JE Rossouw,

GE Sarto, ML Stefanick, L Van Horn, MZ Vitolins, J Wactawski-Wende, RBWallace,

and Whitlock E. Low-fat dietary pattern and risk of colorectal cancer: the womens

health initiative randomized controlled dietary modification trial. The Journal of the

American Medical Association, 6(295):643654, 2006. [cytowanie na str. 5]

[9] CY Choi, HJ You, and HG Jeong. Nitric oxide and tumor necrosis factor- production

by oleanolic acid via nuclear factor-b activation in macrophages. Biochemical and

Biophysical Research Communications, (288):4955, 2001. [cytowanie na str. 9]

[10] YH Choi, JH Baek, MA Yoo, HY Chung, ND Kim, and KW Kim. Induction of

apoptosis by ursolic acid through activation of caspases and down-regulation of c-iaps

in human prostate epithelial cells. International Journal of Oncology, (17):565571,

2000. [cytowanie na str. 11]

[11] I Chojnicka and W Janiszowska. Przeciwnowotworowe dziaanie rolinnych triter-

penoidw: kwasu oleanolowego i kwasu ursolowego oraz ich pochodnych. Kosmos,

(3-4):335341, 2007. [cytowanie na str. 9, 12]

[12] A Chouj, I Chojnicka, and W Janiszowska. Preliminary glc and ms analysis of

aglycone moiety of saponins from beetroot (Beta vulgaris var. esculenta). Lublin,

(71), 2006. [cytowanie na str. 5, 12, 40]

[13] A Chouj and W Janiszowska. Pochodne kwasu oleanolowego i ich dziaanie farma-

kologiczne. Herba Polonica, (51):6675, 2005. [cytowanie na str. 9, 12]

[14] J Crocker and PG Murray. Molecular Biology in Cellular Pathology. Chichester,


[15] M Degowska and G Rydzewska. Chemoprewencja raka jelita grubego. Przewodnik

Lekarski, (10):4641, 2005. [cytowanie na str. 4, 9, 11]

[16] D Es-saady, A Simon, C Jayat-Vignoles, AJ Chulia, and C Delage. Mcf-7 cell

cycle arrested at g1 through ursolic acid andincreased reduction of tetrazolium salts.

Anticancer Research, (16):481486, 1996. [cytowanie na str. 11]

BIBLIOGRAFIA 49

[17] D Es-saady, A Simon, M Ollier, JC Maurizis, AJ Chulia, and C Delage. Inhibitory

effect of ursolic acid on b16 proliferation through cell cycle arrest. Cancer Letters,

(106):193197, 1996. [cytowanie na str. 11, 40, 45]

[18] J Fernandes, RO Castilho, M Rangel da Costa, K Wagner-Souza, MA Coelho Kaplan,

and CR Gattass. Pentacyclic triterpenes from chrysobalanaceae species: cytoto-

xicity on multidrug resistant and sensitive leukemia cell lines. Cancer Letters,

(190):165169, 2003. [cytowanie na str. 9]

[19] J Fernandesa, RO Castilhob, MR da Costaa, K Wagner-Souzac, MA Kaplanb, and

CR Gattass. Pentacyclic triterpenes from chrysobalanaceae species: cytotoxicity on

multidrug resistant and sensitive leukemia cell lines. Cancer Letters, (190):165169,


[20] O Guclu-Ustundag and G Mazza. Saponins: Properties, applications and processing.

Critical Reviews in Food Science and Nutrition, (47):231258, 2007. [cytowanie na str. 12]

[21] RAO AV Gurfinkel, DM and. Soyasaponins: The relationship between chemical

structure and colon anticarcinogenic activity. Nutrition and Cancer, (47):2433, 2003.


[22] R Hakkak, S Korourian, MJ Ronis, JM Johnston, and TM Badger. Soy protein

isolate consumption protects against azoxymethane-induced colon tumors in male

rats. Cancer Letters, 1(166):2732, 2001. [cytowanie na str. 5]

[23] PO Harmand, R Duval, C Delage, and A Simon. Ursolic acid induces apoptosis thro-

ugh mitochondrial intrinsic pathway and caspase-3 activation in m4beu melanoma

cells. International Journal of Oncology, (10):111, 2005. [cytowanie na str. 11]

[24] PO Harmand, R Duval, B Liagre, C Jayat-Vignoles, JL Beneytout, C Delage, and

A Simon. Ursolic acid induces apoptosis through caspase-3 activation and cell

cycle arrest in hacat cells. International Journal of Oncology, (23):105112, 2003.


[25] K Hostettmann and A Marston. Saponins. Cambridge University Press, 1995.


BIBLIOGRAFIA 50

[26] Y Hsu, JJ Yang, and CC Lin. Effects of oleanolic acid and ursolic acid on inhibiting

tumor growth and enhancing the recovery of hematopoietic system postirradiation

in mice. Cancer Letters, (111):713, 1997. [cytowanie na str. 9]

[27] Sun HX, YP Ye, and YJ Pan. Cytotoxic oleanane triterpenoids from the rhizomes

of Astilbe chinensis (maxim.) franch. et savat. Journal of Ethnopharmacology,

(90):261265, 2004. [cytowanie na str. 11]

[28] M Jakbisiak and W Lasek. Immunologia. Warszawa, 2002. [cytowanie na str. 8]

[29] Z Kasprzyk and Z Wojciechowski. The structure of triterpenic glycosides from flowers

of Calendula officinalis l. Phytochemistry, (6):69, 1967. [cytowanie na str. 8]

[30] Z Kasprzyk, Z Wojciechowski, and W Janiszowska. Incorporation of 1-14c-acetate

into glycosides of oleanolic acid in Calendula officinalis. Phytochemistry, (19):561,


[31] Z Kasprzyk, Z Wojciechowski, and A Kuczewska-Jankowska. The glycosides of

triterpenic acid from Helianthus annus l. flowers. Bulletin LAcademie Polonaise

des Science, (14):747, 1966. [cytowanie na str. 8]

[32] K Kawabata, T Tanaka, T Murakami, T Okada, H Murai, T Yamamoto, A Hara,

M Shimizu, Y Yamada, K Matsunaga, T Kuno, N Yoshimi, S Sugie, and H Mori.

Dietary prevention of azoxymethane-induced colon carcinogenesis with rice-germ in

f344 rats. Carcinogenesis, 11(20):21092115, 1999. [cytowanie na str. 5]

[33] DK Kim, JH Baek, CM Kang, MA Yoo, JW Sung, HY Chung, ND Kim, YH Choi,

SH Lee, and KW Kim. Apoptotic activity of ursolic acid may correlate with

the inhibition of initiation of dna replication. International Journal of Cancer,

(87):629636, 2000. [cytowanie na str. 9, 41, 45]

[34] S Kohlmunzer. Farmakognozja. Number 277. Wydawnictwo Lekarskie PZWL,

Warszawa, 1998. [cytowanie na str. 6, 7]

[35] J Kotynia and E Maecka-Panas. Uwarunkowania rodowiskowe i chemoprewencja

raka jelita grubego. Gastroenterologia Polska, (10):7583, 2003. [cytowanie na str. 9]

[36] D Kritchevsky and DM Klurfeld. Interaction of fiber and energy registration in

experimental colon carcinogens. Cancer Letters, 1(114):5152, 1997. [cytowanie na str. 5]

BIBLIOGRAFIA 51

[37] F Lauthier, L Taillet, P Trouillas, C Delage, and A Simon. Ursolic acid triggers

calcium-dependent apoptosis in human daudi cells. Anticancer Drugs, (11):737745,


[38] J Liu. Oleanolic acid and ursolic acid: Research perspectives. Journal of Ethnophar-

macology, (100):9294, 2005. [cytowanie na str. 12]

[39] H Lodish, A Berk, P Matsudaira, CA Kaiser, P Krieger, MP Scott, L Zipur-

sky, and J Darnell. Molecular Cell Biology. www.whfreeman.com/lodish, 2003.


[40] JS Mandel. Colorectal cancer screening. Cancer and Metastasis Reviews,

(16):263279, 1997. [cytowanie na str. 4]

[41] S Marquina, N Maldonado, ML Garduno-Ramirez, E Aranda, ML Villarreal, Navarro

V, R Bye, G Delgado, and L Alvarez. Bioactive oleanolic acid saponinc and other

constituents from the roots of Viguiera decurrens. Phytochemistry, (56):9397, 2001.


[42] GH McIntosh, GO Regester, RK Le Leu, PJ Royle, and GW Smithers. Dairy proteins

protect against dimethylhydrazine-induced intestinal cancers in rats. The Journal of

Nutrition, 4(125):809816, 1995. [cytowanie na str. 5]

[43] Y Mimakia, M Fukushimaa, A Yokosukaa, SashidaaY, S Furuyab, and H Sakagamib.

Triterpene glycosides from the roots of Sanguisorba officinalis. Phytochemistry,

(57):773779, 2001. [cytowanie na str. 11]

[44] Y Mizushina, A Ikuta, K Endoh, M Oshige, N Kasai, K Kamiya, T Satake, H Taka-

zawa, H Morita, H Tomiyasu, H Yoshida, SugawaraF, and K Sakaguchi. Inhibition

of dna polymerases and dna topoisomerase ii by triterpenes produced by plant cal-

lus. Biochemical and Biophysical Research Communications, (305):365373, 2003.


[45] RGMontoya and MJWargovich. Chemoprevention of gastrointestinal cancer. Cancer

and Metastasis Reviews, (16):405419, 1997. [cytowanie na str. 5]

[46] RK Murray, DK Granner, PA Mayes, and Rodwell VW. Biochemia Harpera. War-

szawa, 2006. [cytowanie na str. 8, 9]

BIBLIOGRAFIA 52

[47] A Najid, A Simon, J Cook, EL Chable-Rabinovitch, C Delageb, AJ Chulia, and

M Rigaud. Characterization of ursolic acid as a lipoxygenase and cyclooxygenase

inhibitor using macrophages, platelets and differentiated hl60 leukemic cells. FEBS

Letters, (299):213217, 1992. [cytowanie na str. 9, 40]

[48] T Narisawa, Y Fukaura, M Hasebe, S Nomura, S Oshima, and T Inakuma. Pre-

vention of n-methylnitrosourea-induced colon carcinogenesis in rats by oxygenated

carotenoid capsanthin and capsanthin-rich paprika juice. Proceedings of the Society

for Experimental Biology and Medicine, 2(224):116122, 2000. [cytowanie na str. 5]

[49] T Narisawa, Y Fukaura, M Hasebe, S Nomura, S Oshima, H Sakamoto, T Inakuma,

Y Ishiguro, J Takayasu, and H Nishino. Prevention of n-methylnitrosourea induced

colon carcinogenesis in f344 rats by lycopene and tomato juice rich in lycopene.

Japanese journal of cancer research, 10(89):10031008, 1998. [cytowanie na str. 5]

[50] T Oguro, J Liu, CD Klaassen, and T Yoshida. Inhibitory effect of oleanolic acid on

12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetate-induced gene expression in mouse skin. Toxi-

cological Sciences, (45):88 93, 1998. [cytowanie na str. 9, 40]

[51] W Oleszek, K Gowniak, and B Leszczyski. Biologiczne oddziaywania rodowiskowe.

Number 13. Akademia Medyczna Lublin, 2001. [cytowanie na str. 6, 7]

[52] MJ ONeil, A Smith, and PE Heckelman. The Merck Index - An Encyclopedia of

Chemicals, Drugs and Biologicals. Number 753. New York, 2001. [cytowanie na str. 7, 8]

[53] J Ostrowski, Z Szczepirkowski, L Trzeciak, M Rochowska, K Skurzak, and E Butruk.

Induction of ornithine decarboxylase in normal and protein kinase c-depleted human

colon carcinoma cells. Journal of Physiology and Pharmacology, (43):373382, 1992.


[54] MA Pereira, CJ Grubbs, LH Barnes, H Li, GR Olson, I Eto, M Juliana,

LM Whitaker, GJ Kelloff, Steele VE, and RA Lubet. Effects of the phyto-

chemicals, curcumin and quercetin, upon azoxymethane-induced colon cancer and

7,12-dimethylbenz--anthracene-induced mammary cancer in rats. Carcinogenesis,

6(17):13051311, 1996. [cytowanie na str. 5]

BIBLIOGRAFIA 53

[55] D Ruszkowski, A Szakiel, and W Janiszowska. Metabolism of [3-3h]oleanolic acid in

Calendula officinalis roots. Anatomy, Physiology and Pharmacology, (25):311, 2003.


[56] A Schatzkin, E Lanza, D Corle, P Lance, F Iber, B Caan, M Shike, J Weissfeld,

R Burt, MR Cooper, JW Kikendall, and J Cahill. Lack of effect of a low-fat, high-fiber

diet on the recurrence of colorectal adenomas. polyp prevention trial study group.

The New England Journal of Medicine, 16(342):1149 1155, 2000. [cytowanie na str. 5]

[57] WA Schulz. Molecular Biology of Human Cancers. Dordrecht, 2005. [cytowanie na str. 10]

[58] Shimada, 2007. http://www.shimadadesigns.com/gallery/v/beet.html.

[cytowanie na str. 6, 57]

[59] A Simon, A Najid, AJ Chulia, C Delage, and M Rigaud. Inhibition of lipooxy-

genase activity and hl60 leukemic cell proliferation by ursolic acid isolated from

heater flowers (Calluna vulgaris). Biochimica et Biophysica Acta, (1125):6872, 1992.


[60] A Simon, A Najid, AJ Chulia, C Delage, and M Rigaud. Inhibition of lipooxy-

genase activity and hl60 leukemic cell proliferation by ursolic acid isolated from

heater flowers Calluna vulgaris. Biochmica et Biophysica Acta, (1125):6872, 1992.


[61] American Cancer Society. Cancer facts and figures 2007, 2007.

http://www.cancer.org/downloads/STT/CAFF2007PWSecured.pdf. [cytowanie na str. 3]

[62] LO Somova, A Nadar, P Rammanan, and FO Shode. Cardiovascular, antihy-

perlipidemic and antioxidant effects of oleanolic and ursolic acids in experimental

hypertension. Phytomedicine, (10):115121, 2003. [cytowanie na str. 9]

[63] SG Sprag, ME Light, and J van Staden. Biological activities and distribution of plant

saponins. Journal of Ethnopharmacology, (94):219 243, 2004. [cytowanie na str. 9, 11]

[64] H Strzelecka and J Kowalski. Encyklopedia zielarstwa i zioolecznictwa. Warszawa,


BIBLIOGRAFIA 54

[65] K Subbaramaiah, P Michaluart, MB Sporn, and AJ Dannenberg. Ursolic acid inhibits

cyklooxygenase-2 transcription in human mammary epithelial cells. Cancer Research,

(60):23992404, 2000. [cytowanie na str. 9, 11]

[66] MK Sung and RAO AV Kendall, CWC and. Effect of soybean saponins and

gypsophila saponin on morphology of colon carcinoma cells in culture. Food and

Chemical Toxicology, (33):357366, 1995. [cytowanie na str. 40]

[67] SunHX, YP Ye, and YJ Pan. Cytotoxic oleanane triterpenoids from the rhizomes

of Astilbe chinensis (maxim.) franch. et savat. Journal of Ethnopharmacology,

(90):261265, 2004. [cytowanie na str. 45]

[68] JP Vincken, L Heng, A Groot, and H Gruppen. Saponins, classification and occur-

rence in the plant kingdom. Phytochemistry, (68):275297, 2007. [cytowanie na str. 8]

[69] MP Wasilewicz and D Bielicki. The role of cyclooxygenase and lipoxygenase in

pathogenesis of colorectal neoplasmatic tumors - review of current knowledge. Ga-

stroenterologia Polska, (12):133136, 2005. [cytowanie na str. 9]

[70] P Wgleski. Genetyka molekularna. Warszawa, 2002. [cytowanie na str. 8]

[71] G Wulf. Neuere Entwicklungen auf dem Saponingebiet. Number 108. Deutsche

Apotheker Zeitung, 1968. [cytowanie na str. 7]

[72] HJ You, CY Choi, JY Kim, SJ Park, KS Hahm, and HG Jeong. Ursolic

acid enhances nitric oxide and tumor necrosis factor-alpha production via nuclear

factor-kappab activation in the resting macrophages. FEBS Letters, (509):156160,


Spis symboli i skrtw

Skrt Opis Strona

COX cyklooksygenaza 4

FAP rodzinna polipowato gruczolakowata 4

HNPCC zesp Lyncha (dziedziczny rak jelita grubego niezwi-

zany z polipowatoci

4

OA kwas oleanolowy 7

UA kwas ursolowy 7

LOX lipooksygenaza 8

GPx peroksydaza glutationowa 9

SOD dysmutaza ponadtlenkowa 9

PKC kinaza biakowa C 9

PMA 12-octan-13-mirystynianoforbolu ??

IAP inhibitory apoptozy 10

AIF czynnik indukujcy apoptoz 10

DeTa linia ludzkich komrek nowotworowych jelita grubego 12

FCS podowa surowica cielca 14

HEPES kwas 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowy 14

SPE ekstrakcja do fazy staej 15

TLC chromatografia cienkowarstwowa 17

CC chromatografia kolumnowa 17

MS spektrometria mas 18

55

SPIS SYMBOLI I SKRTW 56

Skrt Opis Strona

EtOH alkohol etylowy 24

HepG2 linia komrkowa ludzkiego wtrobiaka zarodkowego 40

B16 linia komrkowa mysich melanoma 45

HaCat linia komrkowa ludzkich keratynocytw 45

Hela linia komrkowa 45

HO-8910 linia komrkowa 45

HL60 linia komrkowa 45

HT-29 linia komrkowa ludzkiego raka jelita grubego 44

IC50 wspczynnik, przy ktrym miertelno wynosi 50% 45

Spis rysunkw

1 Burak wikowy [58] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

2 Kwas oleanolowy i kwas ursolowy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

3 Korzenie buraka wikowego . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

4 Schemat aparatury uytej do SPE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

5 Schemat izolowania saponin triterpenowych z korzenia buraka wikowego . . . 20

6 Wstpna analiza TLC frakcji po ekstrakcji SPE . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

7 Widmo MS mieszaniny saponin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

8 Widmo MS oczyszczonego triglikozydu kwasu oleanolowego . . . . . . . . . . . 23

9 Zawarto procentowa ywych komrek hodowanych z kwasem oleanolowym . 24

10 Zawarto procentowa ywych komrek hodowanych z 3-O-monoglukozydem

kwasu oleanolowego . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

11 Zawarto procentowa ywych komrek hodowanych z triglikozydem kwasu

oleanolowego . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

12 Schemat analizy cytometrycznej . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

13 Analiza cytometryczna komrek hodowanych z kwasem oleanolowym . . . . . 28

14 Zawarto procentowa komrek apoptotycznych i nekrotycznych po analizie

cytometrycznej hodowanych z kwasem oleanolowym . . . . . . . . . . . . . . 28

15 Analiza cytometryczna komrek hodowanych z kwasem ursolowym . . . . . . 30


cytometrycznej hodowanych z kwasem uroslowym . . . . . . . . . . . . . . . . 30

57

SPIS RYSUNKW 58

17 Analiza cytometryczna komrek hodowanych z kwasem ursolowym i oleanolo-

wym . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32


cytometrycznej hodowanych z kwasem uroslowym i oleanolowym . . . . . . . 32

19 Analiza cytometryczna komrek hodowanych z monoglukozydem kwasu ole-

anolowego . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34


cytometrycznej hodowanych z monoglukozydem kwasu oleanolowego . . . . . 35

21 Analiza cytometryczna komrek hodowanych z triglikozydem kwasu oleanolo-

wego . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36


cytometrycznej hodowanych z triglikozydem kwasu oleanolowego . . . . . . . 36

23 Analiza cytometryczna komrek hodowanych z mieszanin saponin . . . . . . 38


cytometrycznej hodowanych z mieszanin saponin . . . . . . . . . . . . . . . . 38

25 Porwnanie analiz cytometrycznych prb kontrolnych . . . . . . . . . . . . . . 42

26 Porwnanie analiz cytometrycznych prb kontrolnych z etanolem 100 M . . . 42

Spis tabel

1 Zwizki podawane komrkom . . . . . . . . . . . . . . 19

2 Zawarto procentowa ywych komrek hodowanych z kwasem oleanolowym . 24

3 Zawarto procentowa ywych komrek hodowanych z 3-O-monoglukozydem

kwasu oleanolowego . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

4 Zawarto procentowa ywych komrek hodowanych z triglikozydem kwasu

oleanolowego . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

5 Analiza cytometryczna komrek hodowanych z kwasem oleanolowym 27

6 Analiza cytometryczna komrek hodowanych z kwasem ursolowym 29

7 Analiza cytometryczna komrek hodowanych z kwasem ursolowym i oleanolowym 31

8 Analiza cytometryczna komrek hodowanych z monoglukozydem kwasu ole-

anolowego . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

9 Analiza cytometryczna komrek hodowanych z triglikozydem kwasu oleanolowego 35

10 Analiza cytometryczna komrek hodowanych z mieszanin saponin . 37

11 Porwnanie analiz cytometrycznych prb kontrolnych 41

12 Porwnanie analiz cytometrycznych prb kontrolnych z etanolem 100 M 41

59

Uniwersytet Warszawski Wydział Biologii · Praca magisterska na ... Pani prof. dr hab. Wirginii...

Documents

Transcript of Uniwersytet Warszawski Wydział Biologii · Praca magisterska na ... Pani prof. dr hab. Wirginii...