Uniwersytet Rolniczy im. H. Kołłątaja w Krakowie

Wydział Technologii Żywności

Katedra Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Technicznej

Tomasz Tarko

Załącznik II

Autoreferat

Kraków 2015

1

Załącznik II Kraków 02.02.2015

Autoreferat

1. Imię i Nazwisko: Tomasz Tarko

Miejsce pracy: Uniwersytet Rolniczy w Krakowie,

Wydział Technologii Żywności,

Katedra Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Technicznej,

ul. Balicka 122, 30-149 Kraków

2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe/ artystyczne - z podaniem nazwy, miejsca i

roku ich uzyskania oraz tytułu rozprawy doktorskiej.

- Dyplom magistra inżyniera technologii żywności, Akademia Rolnicza im.

Hugona Kołłątaja w Krakowie; 1998.

- Dyplom doktora nauk rolniczych w zakresie technologii żywności

i żywienia, Akademia Rolnicza im. Hugona Kołłątaja w Krakowie; 2004 r.

na podstawie rozprawy „Wpływ wybranych dodatków na stabilność

alkoholowych kremów jajowych”, promotor pracy: prof. dr hab. inż.

Tadeusz Tuszyński.

3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych/

artystycznych.

1998 - 2005 – asystent naukowo-dydaktyczny, Zakład Technologii Fermentacji i

Mikrobiologii Technicznej, Akademia Rolnicza im. Hugona

Kołłątaja w Krakowie.

2005 - obecnie – adiunkt, Zakład Katedra Technologii Fermentacji i Mikrobiologii

Technicznej, Akademia Rolnicza im. Hugona Kołłątaja w Krakowie,

aktualnie Katedra Technologii Fermentacji i Mikrobiologii

Technicznej, Uniwersytet Rolniczy im. Hugona Kołłątaja w

Krakowie.

4. Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003

r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki

(Dz. U. rok 2014, poz. 1852):

Osiągnięciem naukowym wynikającym z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003

roku o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki

2

(Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.) i stanowiącym podstawę do ubiegania się o stopień naukowy

doktora habilitowanego jest monografia pt.: „Występowanie i biodostępność związków

polifenolowych oraz możliwości ich wykorzystania w suplementacji żywności”, której

jestem autorem.

Praca opublikowana została w Zeszytach Naukowych Uniwersytetu Rolniczego im.

Hugona Kołłątaja w Krakowie, w serii Rozprawy, zeszyt 401, Wydawnictwo Uniwersytetu

Rolniczego w Krakowie, w grudniu 2014.

Recenzenci rozprawy : prof. dr hab. Jan Oszmiański,

Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu

dr hab. inż. Magdalena Mika

Uniwersytet Rolniczy w Krakowie

Omówienie celu naukowego w/w rozprawy, jak również osiągniętych wyników wraz z

omówieniem ich ewentualnego wykorzystania

Wprowadzenie

Reaktywne formy tlenu (RFT), z których wiele ma charakter rodnikowy, działają

destrukcyjnie na makrocząsteczki wchodzące w skład komórek, tj. białka, lipidy czy DNA.

Ich aktywność może prowadzić do takich chorób, jak miażdżyca, cukrzyca, reumatyzm,

zapalenie trzustki czy chorób autoimmunologicznych. Przyczyniają się także do chorób

nowotworowych, zawału serca, udaru i chorób neurodegeneracyjnych (Alzheimera,

Parkinsona oraz Huntingtona) [Singh i in. 2004, Valko i in. 2007].

Przeciwutleniacze są to związki zdolne do inaktywacji reaktywnych form tlenu.

Hamując powstawanie RTF oraz uczestnicząc w ich przemianie w nieaktywne pochodne,

odgrywają istotną rolę w zapobieganiu wywoływanym przez nie uszkodzeniom. W grupie

przeciwutleniaczy wyróżnić można witaminy C, E i A, karotenoidy oraz bardzo liczną grupę

związków polifenolowych. Podstawowym źródłem polifenoli w diecie ludzi są uprawiane i

dziko rosnące owoce (głównie jagody), warzywa (cebula, brokuły, kabaczki, soja) oraz ich

przetwory. Na uwagę zasługują również owoce o niskiej aktywności antyoksydacyjnej, ale

spożywane w dużych ilościach, np. jabłka. Rodzaj i ilość związków polifenolowych w

owocach i warzywach są zdeterminowane przez czynniki genetyczne i środowiskowe, mogą

jednak ulegać modyfikacji w wyniku przetwarzania i przechowywania [Manach i in. 2004].

3

Sposób metabolizmu związków polifenolowych oraz szybkość ich wchłaniania z

układu pokarmowego mają duży wpływ na stopień i rodzaj oddziaływania tych związków na

organizm ludzki. Przyswajalne są tylko polifenole uwolnione z matrycy żywności w żołądku,

jelicie cienkim i grubym. Na efektywność ich wchłaniania z układu pokarmowego ma wpływ

wiele czynników, m.in. masa cząsteczkowa, hydrofilowość związku, stopień polimeryzacji

oraz rodzaj cukru w cząsteczce, a także wartość pH środowiska. Spożywanie dużych ilości

surowców i produktów zawierających związki polifenolowe i witaminy nie przekłada się

bezpośrednio na wzrost ich stężenia we krwi i w tkankach. Wynika to z faktu, że albo są

słabo absorbowane w przewodzie pokarmowym, albo ulegają szybkim przemianom

metabolicznym lub eliminacji. Ponadto produkty metabolizmu polifenoli, które przedostają

się do krwi i tkanek, często znacznie się różnią od ich postaci natywnych pod względem

aktywności przeciwutleniającej [Olthof i in. 2003, Kroon i in. 2004, Manach i in. 2004].

Występowanie polifenoli w owocach i warzywach nie zawsze świadczy o ich

przydatności dla człowieka. Istotnym elementem jest możliwość ich oddzielenia od innych

składników żywności, z którymi często są związane. Ponieważ związki fenolowe cechują się

labilnością i nierównomiernym rozmieszczeniem w roślinie, ich ekstrakcja z materiału

roślinnego wymaga odpowiedniego przygotowania. Duże znaczenie ma też rodzaj

zastosowanego ekstrahenta [Naczk i Shahidi 2004].

Dostępna w sklepach żywność to coraz częściej tzw. żywność wygodna, czyli wysoko

przetworzone produkty, które w wyniku licznych zabiegów technologicznych zostały

pozbawione wielu cennych składników. Jedną z możliwości uzupełnienia produktów

spożywczych o składniki, które uległy usunięciu lub inaktywacji podczas procesów

produkcyjnych, jest fortyfikacja.

Cel pracy i hipotezy badawcze

Celem badań było:

1. określenie potencjału antyoksydacyjnego, zawartości polifenoli ogółem i ich profilu w

wybranych roślinach uznawanych za prozdrowotne oraz optymalizacja parametrów

ekstrakcji składników o charakterze przeciwutleniającym,

2. ocena biodostępności wybranych związków polifenolowych na każdym etapie

symulowanego trawienia i charakterystyka ich właściwości przeciwutleniających,

3. analiza frakcji powstających na poszczególnych etapach symulowanego trawienia

owoców oraz ekstraktów owocowych pod kątem ich aktywności przeciwutleniającej i

zawartości związków polifenolowych,

4

4. wykorzystanie ekstraktów owocowych do wytwarzania nowych produktów

spożywczych, charakteryzujących się podwyższoną aktywnością przeciwutleniającą.

Sformułowano następujące hipotezy badawcze:

za pomocą doboru rozpuszczalników i zastosowanych metod można zwiększyć

wydajność procesu ekstrakcji związków polifenolowych z surowców roślinnych.

biodostępność związków polifenolowych zależy od matrycy żywności, z którą są

związane.

fortyfikacja produktów spożywczych ekstraktami owocowymi korzystnie wpływa na

ich aktywność przeciwutleniającą i atrakcyjność sensoryczną.

Materiał i metody badawcze

Jako materiał biologiczny wykorzystano kwiaty bzu czarnego (Sambucus nigra L.),

głogu dwuszyjkowego (Crataegus oxyacantha L.) i robinii akacjowej (Robinia pseudoacacia

L.) oraz owoce roślin takich gatunków, jak: aronia czarna (Aronia melanocarpa (Michx.)

Elliott), borówka brusznica (Vaccinium vitis-idaea L.), borówka czarna (Vaccinium myrtillus

L.), bez czarny (Sambucus nigra L.), cytryniec chiński (Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.),

dereń jadalny (Cornus mas L.), głóg dwuszyjkowy (Crataegus oxyacantha L.), jabłoń

domowa (Malus domestica Borkh.), kolcowój chiński – goji (Lycium chinense Mill.), morwa

czarna (Morus nigra L.), pigwowiec japoński (Chaenomeles japonica (Thunb.) Lindl. ex

Spach.), pigwa pospolita (Cydonia oblonga Mill.), porzeczka czarna (Ribes nigrum L.),

truskawka (Fragaria ananassa Duchesne ex Rozier), żurawina drobnoowocowa (Oxycoccus

microcarpus (Turcz. ex Rupr.) Schmalh.).

Doświadczenia podzielono na trzy etapy. W pierwszym etapie określano aktywność

przeciwutleniającą oraz zawartość polifenoli i ich profil w wybranych roślinach. Związki

aktywne ekstrahowano metodą maceracji (mieszadło magnetyczne, 6 h) z wykorzystaniem

wodnego roztworu metanolu (80% obj.). Wykonano również doświadczenia związane z

optymalizacją procesu ekstrakcji polifenoli. Określano wpływ zastosowanego

rozpuszczalnika (metanol, gorąca woda, chlorek metylenu, etanol w różnych stężeniach) na

właściwości przeciwutleniające i zawartość polifenoli w ekstraktach, optymalizowano

parametry ekstraktora wysokoobrotowego (modyfikując obroty – 11, 19, 24 tys. obr./min oraz

czas działania urządzenia – 2, 5, 10 min) w kierunku maksymalnego odzysku związków o

charakterze antyoksydacyjnym oraz oceniano możliwość wykorzystania promieniowania

5

mikrofalowego (modyfikując moc 50-600 W i czas 0,5 lub 1 min) podczas wstępnej obróbki

surowców roślinnych do zwiększenia aktywności przeciwutleniającej ekstraktów.

W drugim etapie oszacowano biodostępności związków fenolowych w symulowanym

układzie pokarmowym człowieka. Doświadczenia wykonano na roztworach modelowych

wybranych polifenoli (kwas ferulowy, kwas p-kumarowy, (+)katechina, kwercetyna,

hesperetyna i hesperydyna) oraz na owocach różnych gatunków roślin, uznawanych za bogate

źródło przeciwutleniaczy. Oceniono także różnice w biodostępności polifenoli z owoców i ich

ekstraktów. Zastosowano następujący model trawienia: próbki roztworów polifenoli, owoców

lub ich ekstraktów zakwaszano do pH 2 (HCl), dodawano roztworu pepsyny i inkubowano

(37°C, 2 h). Następnie zobojętniano (NaHCO3), dodawano roztworu pankreatyny i żółci,

inkubowano (37°C, 4 h) i wirowano (1380×g, 10 min). Supernatanty zlewano, pozostałości

przepłukiwano dwa razy wodą redestylowaną, za każdym razem mieszając i wirując, a

supernatanty łączono. Pozostałości po wirowaniu (osad) wykorzystywano później do

symulacji trawienia w jelicie grubym. Supernatanty przenoszono do worków dializacyjnych i

wytrząsano w buforze PBS (37°C, 3 h). Zawartość worków (retentat) łączono z osadem

pozostałym po wirowaniu (z wcześniejszego etapu trawienia), alkalizowano do pH 8 i

zaszczepiano inokulum zawierającym mieszaninę jelitowych bakterii (Bacteroides

galacturonicus, Enterococcus caccae, Bifidobacterium catenulatum, Ruminococcus

gauvreauii, Lactobacillus sp., Escherichia coli), inkubowano (37°C, 16 h) i wirowano. Po

przeprowadzonym procesie trawienia uzyskano następujące frakcje:

supernatant – frakcja rozpuszczalna związków polifenolowych, trawiona w żołądku i

dwunastnicy, powstała po zwirowaniu próbki poddanej trawieniu enzymatycznemu,

osad – frakcja nierozpuszczalna związków polifenolowych poddawanych trawieniu w

żołądku i dwunastnicy, będąca pozostałością po zwirowaniu próbki poddanej

trawieniu enzymatycznemu,

retentat – frakcja rozpuszczalna związków polifenolowych, które nie migrują przez

membranę dializacyjną,

permeat – bufor PBS zawierający składniki, które przeszły przez membranę

dializacyjną,

pozostałość po fermentacji – frakcja związków polifenolowych, która pozostała z

osadu i retentatu po trawieniu bakteryjnym w jelicie grubym.

6

Ostatni etap prac obejmował sprawdzenie przydatności ekstraktów owocowych w

technologii żywności do wytwarzania nowych produktów spożywczych, charakteryzujących

się podwyższoną aktywnością przeciwutleniającą. Do badań wykorzystano napoje jabłkowe,

pomarańczowe i grejpfrutowe (zestawione z zagęszczonych soków owocowych) oraz chipsy

jabłkowe [Opis patentowy 214196], które suplementowano ekstraktami owocowymi,

mającymi zwiększyć ich potencjał antyrodnikowy. Istotnym wyróżnikiem jakościowym była

wysoka ocena sensoryczna uzyskanych produktów.

W ekstraktach, roztworach, napojach oraz wszystkich frakcjach uzyskanych podczas

symulowanego trawienia oznaczano:

aktywność przeciwutleniającą – metoda z ABTS [Tarko i in. 2009b],

zawartość polifenoli ogółem – metoda Folina-Ciocalteu [Tarko i in. 2009b],

profil związków polifenolowych – metoda HPLC [Duda-Chodak i in. 2010].

Ponadto oznaczono właściwości sensoryczne wytworzonych chipsów jabłkowych oraz

napojów [PN-A-04022:1964].

Omówienie wyników

Występowanie i odzysk polifenoli z surowców roślinnych

Do badań wybrano rożne części roślin (kwiaty, owoce) oraz różne rozpuszczalniki

(80% metanol, 80% etanol, gorącą wodę oraz chlorek metylenu). Aktywność

antyoksydacyjna oraz zawartość polifenoli ogółem były najwyższe w przypadku ekstraktów

metanolowych, z wyjątkiem ekstraktów z owoców borówki brusznicy. Ekstrakty metanolowe

owoców bzu czarnego odznaczały się wyjątkowo wysokim potencjałem przeciwutleniającym

(2829 mg troloksu/100 g ś.m.) oraz zawartością polifenoli ogółem (5342 mg (+)katechiny/100

g ś.m.). Dużą zdolnością zmiatania wolnych rodników charakteryzowały się również

ekstrakty z owoców derenia jadalnego i pigwowca japońskiego (odpowiednio 1577 i 1448 mg

troloksu/100 g ś.m.). Potencjał antyoksydacyjny ekstraktów metanolowych z owoców pigwy

pospolitej i morwy czarnej był niski (161 mg troloksu/100 g ś.m.). W grupie analizowanych

kwiatów wysoką aktywność przeciwutleniającą stwierdzono w przypadku głogu

dwuszyjkowego (1443 mg troloksu/100 g ś.m.), który odznaczał się także bardzo dużym

stężeniem polifenoli (4119 mg (+)katechiny/100 g ś.m.). Wyniki aktywności

przeciwutleniającej ekstraktów metanolowych były dodatnio skorelowane z zawartością

polifenoli ogółem (r = 0,84). W grupie owoców, oprócz bzu czarnego, duże stężenie

polifenoli w ekstraktach metanolowych obserwowano w przypadku pigwowca japońskiego,

borówki brusznicy i pigwy pospolitej.

7

Zawartość związków polifenolowych ogółem i aktywność przeciwutleniająca

ekstraktów roślinnych, uzyskanych z użyciem etanolu (80% obj.), były mniejsze niż po

zastosowaniu metanolu. Wyjątek stanowiły ekstrakty z owoców borówki brusznicy – po

ekstrakcji etanolem obserwowano wyższą aktywność antyoksydacyjną (o 41%) i większą

zawartość polifenoli ogółem (o 13%), niż po użyciu metanolu. Wysoki potencjał

przeciwutleniający miały ekstrakty etanolowe z owoców bzu czarnego, derenia jadalnego i

pigwowca japońskiego. Wysoką aktywnością przeciwutleniającą (679 mg troloksu/100 g

ś.m.) charakteryzowały się również ekstrakty z kwiatów głogu dwuszyjkowego. Zawartość

polifenoli ogółem w próbach ekstrahowanych etanolem była o ok. 30% mniejsza niż w

przypadku użycia metanolu. Duże stężenie polifenoli obserwowano w ekstraktach z owoców

bzu czarnego, borówki brusznicy i pigwowca japońskiego oraz z kwiatów głogu

dwuszyjkowego.

Ekstrakty uzyskane za pomocą gorącej wody charakteryzowały się istotnie mniejszą,

niż w przypadku metanolu i etanolu, skutecznością odzysku związków fenolowych i niższą

aktywnością przeciwutleniającą. Wartości potencjału antyoksydacyjnego kształtowały się w

zakresie od 27 do 1688 mg troloksu/100 g ś.m., przy czym najwyższe wyniki stwierdzono dla

ekstraktów z owoców bzu czarnego, borówki brusznicy i pigwowca japońskiego. Zawartość

polifenoli w ekstraktach wodnych z owoców bzu czarnego i kwiatów głogu dwuszyjkowego

(odpowiednio 2430 i 2241 mg (+)katechiny/100 g ś.m.) była wyraźnie większa niż w

wodnych wyciągach z pozostałych badanych surowców roślinnych, jednak znacząco mniejsza

od uzyskanej za pomocą alkoholi.

Ekstrakcja chlorkiem metylenu okazała się zupełnie nieskuteczna w przypadku

przeciwutleniaczy roślinnych. Uzyskano znacząco gorsze wyniki, praktycznie na granicy

wykrywalności metod.

Rodzaj zastosowanego rozpuszczalnika miał bardzo duży wpływ na odzysk związków

polifenolowych, przy czym wpływ ten był różny w zależności od użytego surowca. W

większości przypadków najlepszym ekstrahentem polifenoli był metanol. Etanol wydajniej

niż inne rozpuszczalniki ekstrahował (+)katechinę, procyjanidynę B1 i kwercetynę z kwiatów

bzu. Metanol okazał się lepszy niż inne rozpuszczalniki do odzysku pochodnych

glikozydowych badanych flawonoli i większości kwasów fenolowych. Obserwowano również

zbliżony poziom flawonów w ekstraktach metanolowych i etanolowych. Gorąca woda była

znacznie gorszym ekstrahentem związków polifenolowych z ocenianych kwiatów niż użyte

alkohole. Rezultaty uzyskane dla owoców również potwierdziły wysoką skuteczność alkoholu

8

metylowego i etylowego, jednak różnice nie były już tak wyraźne, jak w przypadku kwiatów.

Metanol okazał się wydajniejszym ekstrahentem flawonoli, antocyjanów, (-)epikatechiny i

kwasu chlorogenowego, etanol natomiast – procyjanidyny B2, a w przypadku owoców bzu i

pigwowca także (+)katechiny.

Dla większości prób najwydajniejszym rozpuszczalnikiem okazał się wodny roztwór

metanolu o stężeniu 80%. Nieznacznie niższą wydajnością ekstrakcji charakteryzował się

roztwór etanolu o stężeniu 80%. Etanol, jako rozpuszczalnik nietoksyczny, dopuszczony do

kontaktu z żywnością, może z powodzeniem zostać zastosowany do odzysku związków

przeciwutleniających dla przemysłu spożywczego [Ustawa 2006]. Dlatego do dalszych

doświadczeń wykorzystywano etanol jako rozpuszczalnik. Wykazano, że wodny roztwór

etanolu o stężeniu 80% obj. jest optymalny do ekstrakcji związków polifenolowych z

owoców.

Zastosowanie homogenizatora wysokoobrotowego do ekstrakcji związków

polifenolowych z owoców przekładało się na większy (od 33 do 40%) ich odzysk, niż w

przypadku maceracji. Natomiast aktywność przeciwutleniająca ekstraktów uzyskanych tą

metodą zwiększała się, w odniesieniu do maceracji, o 40-60%, w zależności od użytego

surowca. Wykazano, że optymalnymi parametrami procesu ekstrakcji związków

przeciwutleniających z analizowanych surowców są: prędkość obrotowa homogenizatora

rzędu 19 000 obr./min i czas 5 minut. Takie warunki umożliwiały odpowiednie rozdrobnienie

surowca, uwolnienie z komórek polifenoli i zwiększenie powierzchni kontaktu z

ekstrahentem. Wydłużanie czasu homogenizacji oraz zwiększanie prędkości homogenizatora

nie poprawiały wydajności ekstrakcji.

Kontynuacją doświadczeń było poddanie owoców przed homogenizacją wstępnej

obróbce mikrofalowej. Działanie promieniowania mikrofalowego zwiększa aktywność

antyoksydacyjną produktów spożywczych oraz zawartość polifenoli ogółem w tych

produktach. Efekt taki przypisuje się inaktywacji oksydaz polifenolowych, które podczas

kontaktu z tlenem utleniają związki fenolowe do składników nieaktywnych lub o niższej

aktywności przeciwutleniającej [Tarko i in. 2009a]. Wstępne traktowanie mikrofalami

owoców przygotowanych do ekstrakcji nie zwiększyło aktywności antyoksydacyjnej

wyciągów etanolowych i zawartości w nich polifenoli. W porównaniu z wynikami samej

homogenizacji rezultaty uzyskane dla próbek traktowanych promieniowaniem mikrofalowym

były znacznie gorsze, co może być spowodowane degradacją związków termolabilnych

zawartych w owocach. Szczególnie wrażliwy na zmiany temperatury jest kwas askorbinowy.

Wraz ze wzrostem temperatury drastycznie maleją jego właściwości przeciwutleniające i

9

dochodzi do rozpadu, w wyniku którego powstaje furfural i dwutlenek węgla [Jabłońska-Ryś

i in. 2009].

Biodostępność polifenoli w symulowanym układzie pokarmowym człowieka

Doświadczenia rozpoczęto od symulacji trawienia roztworów czystych polifenoli.

Wykazano spadek stężenia analizowanych związków polifenolowych na kolejnych etapach

trawienia. Po pierwszym etapie trawienia kwasu ferulowego obserwowano w osadzie (frakcja

nierozpuszczalna) stosunkowo dużą jego ilość (35% dawki wejściowej), a supernatant był

znacznie uboższy w ten związek (8,2%). Fakt ten może świadczyć o częściowym rozkładzie

kwasu ferulowego pod wpływem soków i enzymów żołądka i dwunastnicy. Po dializie z

użyciem membran w retentacie pozostało tylko około 1% ilości kwasu ferulowego poddanego

procesowi trawienia, podczas gdy do permeatu przeszło blisko 4%, co pozwala przypuszczać,

że kwas ferulowy może być biernie pobierany z jelita. Kwas ferulowy ulegał znacznemu

rozkładowi pod wpływem mikroflory jelitowej. Po symulacji trawienia kwasu

p-kumarowego stwierdzono, że jego ilość w osadzie stanowiła ok. 50% dawki poddanej

procesowi trawienia, a supernatant zawierał niewiele ponad 2% tego kwasu. Uzyskane wyniki

wskazują na istotne przemiany tego związku w żołądku i dwunastnicy, z wytworzeniem

produktów o istotnie wyższej aktywności antyoksydacyjnej. Zawartość badanego kwasu w

pozostałości po fermentacji była niższa o ok. 64% niż w osadzie po trawieniu, co pozwala

wnioskować, że bakterie jelitowe wykazują aktywność metabolizowania kwasu

p-kumarowego. Pod względem biodostępności flawonoidy istotnie się różniły od

fenolokwasów. Po symulowanym trawieniu (+)katechiny wykazano znaczny spadek jej

zawartości w próbach już po pierwszym etapie trawienia. Ilość pozostająca w osadzie

stanowiła ok. 28% dawki poddanej procesowi trawienia, a w supernatancie obserwowano

jedynie 1,5% ilości wejściowej. Niska zawartość oznaczanego związku polifenolowego w

supernatancie korespondowała z umiarkowanym potencjałem antyoksydacyjnym tej frakcji.

Po fermentacji z bakteriami jelitowymi zawartość (+)katechiny zmniejszyła się 5-krotnie w

stosunku do jej ilości w osadzie. Może to potwierdzać przemiany (+)katechiny do

niskocząsteczkowych kwasów fenolowych o niższym potencjale antyoksydacyjnym. Wśród

analizowanych związków polifenolowych największym potencjałem przeciwutleniającym

cechowała się kwercetyna. Po przeprowadzeniu symulacji trawienia in vitro wykazano, że

ponad 96% tego związku przechodzi do osadu. Frakcje nierozpuszczalne również miały

bardzo wysoki potencjał przeciwutleniający. Supernatant zawierał śladowe ilości kwercetyny,

a pozostałe frakcje uzyskiwane podczas symulacji trawienia nie zawierały tego związku. Brak

10

kwercetyny w pozostałości po fermentacji może świadczyć, że jest ona rozkładana przez

bakterie w jelicie grubym. Hesperetyna i jej 7-O-rutynozyd (hesperydyna) występują

naturalnie w owocach cytrusowych, a ich aktywność antyoksydacyjna, w porównaniu do

innych polifenoli, jest stosunkowo niska. Po trawieniu enzymatycznym in vitro zawartość

hesperetyny w osadzie była niewiele niższa (o ok. 9%) niż przed tym trawieniem, podczas

gdy zawartość hesperydyny po tym etapie zmniejszyła się aż o 98%. Wyniki te sugerują, że

hesperydyna jest rozkładana w żołądku i jelicie cienkim, podczas gdy jej aglikon jest

metabolizowany tylko w niewielkim stopniu. Po dializie nie wykryto hesperetyny w

permeacie, a retentat zawierał śladowe jej ilości. Hesperydyna nie została wykryta w żadnej

próbie na tym etapie symulowanego trawienia. Na uwagę zasługuje bardzo duży spadek

zawartości hesperetyny w próbie po fermentacji z mikroflorą jelitową – o ok. 99% w

porównaniu do frakcji nierozpuszczalnej związków polifenolowych trawionych w żołądku i

dwunastnicy – co świadczy o rozkładzie hesperetyny dopiero przez bakterie bytujące w jelicie

grubym.

Zasadniczą częścią tego etapu doświadczeń była jednak ocena biodostępności

związków polifenolowych z owoców, a nie roztworów modelowych. Do doświadczeń

wybrano zarówno gatunki popularne i spożywane w naszym kraju (aronia czarna, borówka

czarna, jabłoń domowa, porzeczka czarna, truskawka), jak i gatunki dziko rosnące i uznawane

za bogate źródło przeciwutleniaczy (bez czarny, dereń jadalny, głóg dwuszyjkowy, kolcowój

chiński – goji, pigwowiec japoński, żurawina drobnoowocowa).

Jabłka należą do owoców niezbyt bogatych w związki polifenolowe, ale bardzo często

spożywanych w większości krajów europejskich. Po symulowanym trawieniu tych owoców

wykazano, że supernatant charakteryzował się mniejszą zawartością polifenoli ogółem niż

owoce, a jednocześnie umiarkowanie wyższą aktywnością antyoksydacyjną. Przyczyną może

być pojawienie się podczas trawienia polifenoli metabolitów o wysokim potencjale

przeciwutleniającym. W owocach dominowały procyjanidyny oraz (+)katechina, których nie

obserwowano już w supernatancie. Związki polimerowe zostały prawdopodobnie rozłożone

do monomerów, które mają większy potencjał przeciwutleniający. Wykazano, że do osadu po

symulacji trawienia jabłek przechodzi niewielka ilość związków polifenolowych, o niskiej

aktywności antyoksydacyjnej. Fakt ten ma związek z budową owocu jabłoni – wysokim

udziałem miąższu w stosunku do skórki i nasion. Badane jabłka charakteryzowały się

umiarkowanym stopniem migracji związków polifenolowych przez membrany dializacyjne

(29% w odniesieniu do supernatantu). Większość polifenoli (58%) pozostawała w retentacie.

Były to głównie kwasy fenolowe oraz florydzyna. Na uwagę zasługuje wzrost potencjału

11

przeciwutleniającego pozostałości po fermentacji, w odniesieniu do materiału przed

działaniem bakterii jelitowych. We frakcji tej obserwowano przede wszystkim kwasy

fenolowe o przeciętnej aktywności antyoksydacyjnej, jednak prawdopodobnie zawierała ona

także produkty rozkładu procyjanidyn i florydzyny o wysokiej aktywności.

Analiza supernatantów uzyskanych po pierwszym etapie trawienia owoców borówki

czarnej i kolcowoju chińskiego wykazała brak istotnych statystycznie różnic pod względem

aktywności przeciwutleniającej, w porównaniu do owoców, ale zawartość polifenoli ogółem

okazała się istotnie niższa. W przypadku kolcowoju chińskiego zawartość polifenoli

stanowiła 26% ilości obserwowanej w owocach, a borówki zaledwie 7%. Na podstawie

analizy profilu polifenoli na różnych etapach trawienia borówki czarnej można stwierdzić, że

zarówno owoce, jak i supernatant były bogate w antocyjany, głównie glikozydy cyjanidyny,

oraz (-)epikatechinę i kwasy fenolowe. W wyniku symulacji trawienia w żołądku i

dwunastnicy nastąpił znaczny spadek zawartości antocyjanów (o ponad 80%), procyjanidyny

B2 (o 98%) i (-)epikatechiny (o ponad 55%) oraz wzrost stężenia kwasów fenolowych w

stosunku do wartości obserwowanych w owocach. Na uwagę zasługuje również rozkład

glikozydów kwercetyny na tym etapie symulacji trawienia, w wyniku czego w supernatancie

wykryto aglikony w ilościach większych niż w surowcu przed trawieniem. W wyniku

działania na owoce kolcowoju chińskiego kwasu oraz enzymów żołądka i dwunastnicy

rozkładowi ulegały głównie glikozydy. W pozostałości po fermentacji kolcowoju chińskiego

odnotowano ponad 2-krotnie więcej kwercetyny niż w owocach przed trawieniem. Wykazano

również, że aktywność przeciwutleniająca osadu otrzymanego po trawieniu borówki czarnej

była ponad 2-krotnie wyższa od aktywności osadu kolcowoju chińskiego, ale zawartość

polifenoli ogółem w obu frakcjach owoców nie różniła się istotnie. Można zatem

wnioskować, że w nierozpuszczalnej frakcji związków polifenolowych borówki czarnej

znajdują się silne antyoksydanty. Owoce kolcowoju chińskiego miały stosunkowo wysoki

(29%) stopień migracji związków polifenolowych przez membranę dializacyjną. Dla borówki

czarnej wskaźnik ten był niższy i wynosił 19%. Dializaty otrzymane na tym etapie trawienia

cechowały się zbliżoną aktywnością przeciwutleniającą, mimo że stężenie polifenoli w

dializacie borówki czarnej było dwukrotnie niższe. Borówka czarna, jako owoc bogaty w

barwniki antocyjanowe, podczas trawienia uwalnia w dużych ilościach cyjanidynę i jej

glikozydy. Wykazano również, że bakterie jelitowe znacznie wydajniej metabolizowały

związki fenolowe pochodzące z owoców kolcowoju chińskiego niż z owoców borówki.

Jedynie w przypadku derenia jadalnego supernatant uzyskany po trawieniu miał niższą

aktywność antyoksydacyjną niż owoce przed trawieniem. Jednocześnie odznaczał się on

12

największym, spośród analizowanych prób, spadkiem zawartości polifenoli ogółem w

odniesieniu do owoców przed trawieniem. Dereń jadalny zalicza się do produktów bogatych

w związki pektynowe, a pektyna łatwo wiąże polifenole i utrudnia ich uwalnianie w czasie

trawienia [Mazzaracchio i in. 2004]. Wykazano znaczną migrację związków polifenolowych

derenia jadalnego przez membranę dializacyjną, ale komponenty fenolowe permeatu

charakteryzowały się umiarkowaną aktywnością antyoksydacyjną. Aktywność

antyoksydacyjna pozostałości po fermentacji była mniejsza o 65% od aktywności roztworu

przed symulowanym trawieniem w jelicie grubym. Jednoczesne zmniejszenie się stężenia

związków polifenolowych o 20% wskazuje na obecność w pozostałości po fermentacji

metabolitów o niskim potencjale antyoksydacyjnym. We frakcji tej dominowały kwasy

fenolowe, charakteryzujące się stosunkowo niską aktywnością przeciwutleniającą w

porównaniu z innymi polifenolami.

W supernatantach uzyskanych po trawieniu pigwowca japońskiego i żurawiny

drobnoowocowej zaobserwowano podobne stężenie związków polifenolowych, w obu

przypadkach mniejsze niż w odpowiednich owocach. Natomiast aktywność

przeciwutleniająca supernatantu z pigwowca japońskiego była istotnie wyższa od aktywności

owoców. Owoce pigwowca japońskiego były bogatym źródłem procyjanidyn o znacznej

aktywności przeciwrodnikowej, które w niewielkim stopniu ulegały rozkładowi w żołądku i

dwunastnicy. W supernatancie stwierdzono znacznie większe ilości (+)katechiny niż w

surowcu przed trawieniem. Można przypuszczać, że do wzrostu ilości (+)katechiny w tej

frakcji przyczynił się niewielki stopień rozkładu procyjanidyn (spolimeryzowanych tanin). W

owocach żurawiny dominowały glikozydy kwercetyny i kwasy fenolowe, które, przechodząc

do supernatantu, nie wpływały tak istotnie na aktywność tej frakcji. Stężenie związków

polifenolowych ogółem w osadzie otrzymanym po symulacji trawienia pigwowca

japońskiego było znacznie wyższe niż w przypadku żurawiny. Fakt ten wynika z wysokiej

zawartości skórek w stosunku do miąższu w owocach pigwowca japońskiego. Symulacja

transportu biernego związków polifenolowych przez membrany dializacyjne wykazała także

znacznie większy stopień migracji z owoców pigwowca niż z żurawiny. Bakterie jelitowe w

jednakowym stopniu metabolizowały polifenole zawarte w owocach żurawiny i pigwowca

japońskiego, jednak produkty rozkładu polifenoli żurawiny charakteryzowały się wyższym

potencjałem antyoksydacyjnym.

Supernatanty otrzymane po symulacji trawienia głogu dwuszyjkowego i truskawki

zawierały podobne, mniejsze (ok. 11-krotnie) ilości polifenoli ogółem niż owoce.

Jednocześnie wzrost aktywności antyoksydacyjnej supernatantów otrzymanych z owoców

13

truskawki był ponad dwukrotnie wyższy niż w przypadku głogu. Może to sugerować, że na

tym etapie trawienia związki polifenolowe metabolizowane są najszybciej, co skutkuje

wytworzeniem silnych przeciwutleniaczy. Związki polifenolowe zawarte w owocach głogu

migrowały przez membrany dializacyjne jedynie w 12%, zachowując jednocześnie 45%

aktywności przeciwutleniającej wyjściowego supernatantu. Na wysoką aktywność

przeciwutleniającą dializatów z głogu wpływały metabolity obecnych w nim polifenoli,

głównie pochodnych kwercetyny. Większość polifenoli głogu była metabolizowana z

udziałem bakterii fermentacyjnych, co może się wiązać ze zwartą strukturą pektynową

owoców.

Supernatanty uzyskane po symulacji trawienia bogatych w barwniki antocyjanowe

owoców aronii czarnej, porzeczki czarnej oraz bzu czarnego charakteryzowały się znacznie

mniejszym (16–18-krotnie) stężeniem związków polifenolowych ogółem niż owoce.

Aktywność antyoksydacyjna tych supernatantów była wyższa niż w przypadku owoców,

szczególnie porzeczki czarnej. Wśród wszystkich badanych owoców aronia wyróżniała się

największą ilością związków polifenolowych ogółem w permeacie uzyskanym po dializie

(174 mg (+)katechiny/100 g ś.m.) oraz najwyższą aktywnością przeciwutleniającą tej frakcji

(3609 mg troloksu/100 g ś.m.). Bakterie przewodu pokarmowego w znacznym stopniu

przyczyniały się do rozkładu związków polifenolowych zawartych w owocach aronii, istotnie

redukując aktywność antyoksydacyjną pozostałości po fermentacji. Rozkładowi ulegały

przede wszystkim antocyjany pozostałe po wcześniejszych etapach trawienia. Supernatant z

pierwszego etapu trawienia owoców bzu czarnego, w porównaniu z innymi badanymi

owocami, odznaczał się największą zdolnością zmiatania wolnych rodników (7519 mg

troloksu/100 g ś.m). Za wysoki potencjał antyrodnikowy odpowiadały przede wszystkim

antocyjany – cyjanidyno-3-O-sambubiozyd i kwercetyno-3-O-rutynozyd. Po

przeprowadzonej dializie supernatantu bzu czarnego stwierdzono 3-krotne zmniejszenie

stężenia polifenoli ogółem, podczas gdy permeat wykazywał o 30% mniejszą aktywność

przeciwutleniającą niż supernatant. W przypadku porzeczki czarnej stopień migracji

związków polifenolowych przez membranę dializacyjną wynosił 23%, przy czym permeat w

porównaniu do supernatantu miał o 20% niższy potencjał antyoksydacyjny. Bakterie jelitowe

w nieznacznym stopniu przyczyniły się do rozkładu związków polifenolowych pochodzących

z owoców bzu czarnego i porzeczki czarnej, metabolizując głównie glikozydy cyjanidyny i

kwercetyny.

Bardzo duży wpływ na biodostępność związków polifenolowych ma ich powiązanie z

matrycą żywności oraz innymi składnikami występującymi w rzeczywistych racjach

14

żywieniowych. Tylko polifenole uwolnione z matrycy żywności w jelicie cienkim i grubym

mogą być przyswajane przez organizm. Zauważono bardzo duże różnice w trawieniu

pomiędzy czystymi związkami polifenolowymi, a związkami występującymi w różnych

owocach. Wykazano, że po trawieniu in vitro czystych związków polifenolowych do osadu

przechodziła przeważająca część tych komponentów, a dominującą rolę odgrywała

fermentacja z udziałem bakterii jelitowych. W przypadku owoców to supernatant był

najbogatszą w polifenole frakcją, co sugeruje, że największy wpływ na polifenole zawarte w

tkankach owoców miało działanie kwasu i enzymów żołądkowych oraz warunki panujące w

jelicie cienkim.

Wiele produktów spożywczych, suplementów diet oraz preparatów farmaceutycznych o

właściwościach przeciwutleniających zawiera ekstrakty z roślin. Ekstrakty te, najczęściej

wyciągi etanolowe, są bogate w polifenole. Dlatego też, w kolejnej części doświadczeń

porównano biodostępność związków polifenolowych z owoców oraz odpowiednich

ekstraktów etanolowych. Do doświadczeń wybrano owoce aronii czarnej, bzu czarnego,

derenia jadalnego, głogu dwuszyjkowego, jabłoni domowej i pigwowca japońskiego.

Do supernatantów uzyskanych w wyniku trawienia ekstraktów etanolowych

przechodziło znacznie więcej polifenoli, niż miało to miejsce w przypadku trawienia owoców,

a stopień migracji związków polifenolowych przez membranę dializacyjną był od 2 do 8 razy

wyższy. W osadach otrzymanych po procesie trawienia in vitro ekstraktów owocowych

związki polifenolowe występowały w śladowych ilościach (0,2–0,6 mg (+)katechiny/100 ml).

Wyniki te korespondowały z aktywnością antyoksydacyjną poszczególnych frakcji.

Supernatanty uzyskane po trawieniu ekstraktów odznaczały się relatywnie wyższą (o 13-40%)

aktywnością antyoksydacyjną niż ich odpowiedniki po trawieniu owoców. Potencjał

przeciwutleniający osadów był bardzo niski i stanowił od 0,03 do 2,6% aktywności

ekstraktów poddanych symulacji trawienia, podczas gdy w przypadku owoców potencjał ten

wynosił od 12 do 46%. Różnice te można tłumaczyć odmiennym składem próbek poddanych

procesowi symulowanego trawienia. Związki polifenolowe owoców – bogatych w takie

składniki, jak np. pektyny, włókna pokarmowe, polisacharydy, mogące wiązać polifenole – w

większej ilości przechodziły do osadów, natomiast polifenole w ekstraktach etanolowych nie

były związane z matrycą pokarmową.

15

Wykorzystanie ekstraktów owocowych w technologii żywności

Soki, nektary, a przede wszystkim napoje należą do produktów bardzo często

wybieranych przez konsumentów i z racji bogatego asortymentu smakowego oraz dużego

spożycia, stanowią dobry materiał do suplementacji. Do doświadczeń wykorzystano napoje

jabłkowe, pomarańczowe i grejpfrutowe. Wśród ocenianych prób napoje jabłkowe

charakteryzowały się najniższą aktywnością przeciwutleniającą i najmniejszą zawartością

polifenoli ogółem. Z tego względu fortyfikacja podnosiła ich zdolność antyrodnikową

znacznie bardziej niż w przypadku pozostałych napojów. Wykazano, że dodatki ekstraktów

owocowych wpłynęły na wzrost ilości związków polifenolowych w napojach jabłkowych (od

48 do 138%, w stosunku do napoju bez dodatków). Zwiększył się również, chociaż w

mniejszym stopniu (od 10 do 32%), potencjał antyoksydacyjny prób. Największe różnice

obserwowano po wprowadzeniu 5% dodatku ekstraktu z pigwowca japońskiego. Wykazano,

że jedynie ten dodatek wpływał pozytywnie na wyniki oceny sensorycznej. Fortyfikacja

ekstraktami borówki brusznicy i derenia jadalnego została negatywnie odebrana przez panel

sensoryczny. Wprowadzenie do napoju pomarańczowego ekstraktów z pigwowca

japońskiego oraz borówki brusznicy przyczyniało się do wzrostu zarówno ich potencjału

antyoksydacyjnego, jak i zawartości polifenoli ogółem. Zastosowane dodatki w podobny

sposób zwiększały wartości analizowanych parametrów jakościowych napoju

pomarańczowego. Dodatek do napoju pomarańczowego ekstraktu z pigwowca w ilości 5%

powodował wzrost jego aktywności przeciwutleniającej oraz zawartości polifenoli ogółem

(odpowiednio o 24 i 56%). Na uwagę zasługuje fakt, że suplementacja napojów

pomarańczowych ekstraktami z pigwowca japońskiego przyczyniła się do wyższych ocen

panelu sensorycznego. Suplementacja napojów grejpfrutowych ekstraktami owocowymi w

niewielkim stopniu przyczyniała się do wzrostu potencjału antyoksydacyjnego i zawartości

polifenoli ogółem. Wartości ocenianych wyróżników, szczególnie ilości polifenoli, uzyskane

dla napojów z poszczególnymi dodatkami nie różniły się istotnie statystycznie. Jedynie

dodatek 10% ekstraktu z derenia jadalnego w znacznej mierze podnosił wartości

analizowanych parametrów. Tak duży udział ekstraktu w napoju został jednak negatywnie

odebrany przez panel sensoryczny, a noty okazały się istotnie niższe niż dla napoju bez

dodatków.

Tempo, styl życia oraz przyzwyczajenia żywieniowe często skłaniają kupujących do

wyboru przekąsek. Z tego względu coraz większą popularność zyskują przekąski owocowe i

warzywne, będące wyrobami beztłuszczowymi, niskokalorycznymi, o małej zawartości soli,

nadające się do fortyfikacji w związki polifenolowe. Do suplementacji chipsów jabłkowych

16

wykorzystano ekstrakty etanolowe uzyskane z owoców żurawiny drobnoowocowej, derenia

jadalnego, aronii czarnej, głogu dwuszyjkowego, cytryńca chińskiego, pigwowca japońskiego

i kolcowoju chińskiego (goji). Największym potencjałem antyoksydacyjnym odznaczały się

próby z dodatkiem ekstraktu z cytryńca, żurawiny i goji. Wartości te były wyższe o

odpowiednio 77, 68 i 67% w porównaniu z kontrolą. Najniższą aktywnością,

charakteryzowały się próbki suplementowane ekstraktem z aronii. Fortyfikacja przyczyniła

się do wzrostu stężenia związków polifenolowych w badanych chipsach. Największą

zawartością polifenoli cechowały się chipsy z dodatkiem ekstraktu z aronii (o 30% większą

od wartości kontrolnej) oraz derenia (o 28% większą). Najmniejszy wpływ natomiast miał

dodatek ekstraktu z goji i cytryńca (wzrost o 5%). W wyniku oceny sensorycznej chipsów

wzbogacanych różnymi ekstraktami owocowymi prawie wszystkie wyroby otrzymały

zbliżoną liczbę punktów (3,98–4,18). Jedynie chipsy suplementowane ekstraktem z cytryńca

dostały istotnie niższe noty (3,54 pkt), ze względu na cierpko-gorzki smak. Wszystkie próby z

dodatkami ekstraktów owocowych dawały słabsze odczucie słodkości i cechowały się wyższą

kwasowością niż próbka kontrolna. Ze względu na oceniane wyróżniki najlepszymi

dodatkami wzbogacającymi chipsy jabłkowe były ekstrakty z owoców pigwowca, goji i

głogu.

Wnioski

1. Kwiaty bzu czarnego i głogu dwuszyjkowego oraz owoce bzu czarnego, pigwowca

japońskiego i derenia jadalnego odznaczały się wysoką aktywnością antyoksydacyjną

i wysokim stężeniem polifenoli. Profil związków fenolowych zależał od gatunku

owoców, a ich potencjał antyoksydacyjny był w dużej mierze związany z obecnością

polifenoli. Każdy z analizowanych surowców roślinnych może zostać wykorzystany

jako bogate źródło związków o charakterze przeciwutleniającym.

2. Wodny roztwór metanolu (80% obj.) okazał się najwydajniejszym rozpuszczalnikiem

do odzysku związków polifenolowych, ale wydajność ekstrakcji prowadzonej przy

użyciu wodnego roztworu etanolu (80% obj.) była tylko nieznacznie niższa. Etanol,

jako rozpuszczalnik nietoksyczny, dopuszczony do kontaktu z żywnością, może z

powodzeniem zostać zastosowany w odzysku związków przeciwutleniających dla

przemysłu spożywczego.

3. Homogenizacja wysokoobrotowa okazała się znacznie lepszym sposobem ekstrakcji

niż maceracja i pozwoliła na uzyskanie wyciągów o wyższej zawartości polifenoli

oraz wyższej aktywności antyoksydacyjnej. Prędkość obrotowa 19 000 obr./min i czas

17

5 minut stanowiły optymalne parametry homogenizatora wysokoobrotowego do

ekstrakcji związków fenolowych z większości analizowanych surowców roślinnych.

Wstępna obróbka mikrofalami nie poprawiała właściwości antyoksydacyjnych

wyciągów z owoców.

4. Większość analizowanych związków fenolowych (z wyjątkiem kwercetyny i

hesperetyny) ulega częściowemu rozkładowi podczas symulowanego trawienia w

żołądku i dwunastnicy, a powstałe metabolity wykazują zwykle wyższy potencjał

przeciwutleniający niż związki wyjściowe. Badane polifenole w różnym stopniu

przenikały przez membrany dializacyjne. Najłatwiej wchłanianiu, w symulacji in vitro

procesu trawienia, ulegały kwasy fenolowe, ze względu na małe rozmiary cząsteczek,

a większe flawonoidy słabiej przenikały przez pory w membranach.

5. Mikroflora jelitowa odgrywała istotną rolę w trawieniu związków polifenolowych.

Część polifenoli, która nie uległa rozkładowi i wchłanianiu w żołądku i jelicie

cienkim, trafiła do okrężnicy, gdzie związki te zostały zmetabolizowane przez bakterie

jelitowe. Mikroflora jelita grubego w największym stopniu wpływała na trawienie

flawonoidów, głównie kwercetyny i hesperetyny, a w znacznie mniejszym – na

metabolizm kwasów fenolowych.

6. Biodostępność czystych polifenoli oraz polifenoli związanych z matrycą pokarmową

owoców była różna. Po trawieniu in vitro czystych polifenoli przeważająca część tych

komponentów przechodziła do osadu, a dominującą rolę odgrywała tu fermentacja z

udziałem bakterii jelitowych. W przypadku owoców, najbogatszą w polifenole frakcją

był supernatant, co sugeruje, że na polifenole owocowe największy wpływ ma

działanie kwasów i enzymów żołądkowych oraz warunki panujące w jelicie cienkim.

7. Polifenole występujące w ekstraktach były bardziej podatne na działanie enzymów

przewodu pokarmowego i kwasów żołądkowych niż ich odpowiedniki w owocach,

dając frakcje o odpowiednio wyższej zdolności zmiatania wolnych rodników. Szybsza

hydroliza polifenoli pochodzących z ekstraktów umożliwiała intensywniejszą

migrację tych związków przez membranę dializacyjną, co odpowiadało większej ich

biodostępności. Intensywniejszy rozkład polifenoli zawartych w ekstraktach

owocowych, na początkowych odcinkach przewodu pokarmowego, ograniczał

znaczenie mikroflory jelitowej i metabolizmu tych związków w okrężnicy.

8. Fortyfikacja napojów owocowych i chipsów jabłkowych za pomocą ekstraktów

owocowych korzystnie wpływało na ich potencjał antyoksydacyjny oraz zawartość

polifenoli ogółem. Najlepszym dodatkiem do napojów okazał się ekstrakt z owoców

18

pigwowca japońskiego (w przypadku napojów jabłkowych i pomarańczowych) oraz

borówki brusznicy (napój grejpfrutowy). Chipsy jabłkowe najlepiej wzbogacać

ekstraktami z owoców pigwowca japońskiego, goji i głogu dwuszyjkowego.

Otrzymane wyniki potwierdziły hipotezę, że za pomocą doboru odpowiednich

rozpuszczalników oraz zastosowanych metod można zwiększyć wydajność procesu ekstrakcji

związków polifenolowych z surowców roślinnych. Wysoką wydajność odzysku związków

polifenolowych z materiału roślinnego pozwala osiągnąć zastosowanie roztworu metanolu i

etanolu o stężeniu 80% i homogenizacji wysokoobrotowej. Wstępna obróbka mikrofalami nie

poprawia właściwości antyoksydacyjnych wyciągów z owoców.

Potwierdzenie znalazła również hipoteza, że biodostępność związków polifenolowych

zależy od matrycy żywności, z którą są związane. W wyniku symulowanego trawienia

czystych związków polifenolowych znaczna ich część przechodzi do osadu i jest

metabolizowana głównie przez bakterie jelitowe. Po trawieniu in vitro owoców najbogatszą w

polifenole frakcją jest supernatant. Enzymy przewodu pokarmowego i kwasy żołądkowe

szybciej metabolizują polifenole występujące w ekstraktach niż ich odpowiedniki w owocach,

dając frakcje o wyższej aktywności antyoksydacyjnej i ograniczając znaczenie mikroflory

jelitowej przy ich trawieniu. Wydajniejszy rozkład polifenoli pochodzących z ekstraktów

owocowych przekłada się na intensywniejszą migrację tych związków przez membrany

dializacyjne, co odzwierciedla większą ich biodostępność.

Wyniki pracy potwierdziły także hipotezę, że wzbogacanie produktów spożywczych

ekstraktami owocowymi korzystnie wpływa na ich aktywność przeciwutleniającą i

atrakcyjność sensoryczną. Zastosowanie ekstraktów z owoców pigwowca japońskiego, goji i

głogu dwuszyjkowego, jako dodatku do chipsów jabłkowych podnosi ich potencjał

antyrodnikowy. Fortyfikacja napojów jabłkowych i pomarańczowych ekstraktami z

pigwowca japońskiego, a napojów grejpfrutowych wyciągami z owoców borówki brusznicy

najkorzystniej wpływa na jakość nowych produktów: aktywność antyoksydacyjną, zawartość

polifenoli oraz ocenę sensoryczną.

Literatura

Duda-Chodak A., Tarko T., Satora P., Sroka P., Tuszyński T. 2010. The profile of

polyphenols and antioxidant properties of selected apples cultivars grown in Poland, J.

Fruit Ornament. Plant Res., 18(2), 39-50.

19

Jabłońska-Ryś E., Zalewska-Korona M., Kalbarczyk J. 2009. Antioxidant capacity, ascorbic

acid and phenolics content in wild edible fruit. J. Fruit Ornament. Plant Res., 17, 115-

120.

Kroon P., Clifford M., Crozier A., Day A., Donovan J., Manach C., Williamson G. 2004.

How should we assess the effects of exposure to dietary polyphenols in vitro? Am. J.

Clin. Nutr., 80, 15-21.

Manach C., Scalbert A., Morand C., Remesy C., Jimenez L. 2004. Polyphenols: Food sources

and bioavailability. Am. J. Clin. Nutr., 79, 727-747.

Mazzaracchio P., Pifferi P., Kindt M., Munyaneza A., Barbiroli G. 2004. Interactions

beetween antocyanins and organic food molecules in food model systems. Int. J. Food

Sci. Technol., 39, 53-59.

Naczk M., Shahidi F. 2004. Extraction and analysis of phenolics in food. J. Chromatogr. A,

1054, 95-111.

Olthof M., Hollman P., Buijsman M., Amelsvoort J., Katan M. 2003. Chlorogenic acid,

quercetin-3-rutinoside and black tea phenols are extensively metabolized in humans. J.

Nutr., 133, 1806-1814.

Opis patentowy, 214196, PL. Zgłosz. 383488. z 05.10.07. Opubl. 28.06.2013. Sposob

wytwarzania chipsow jabłkowych. Uniwersytet Rolniczy im. Hugona Kołłątaja w

Krakowie, Krakow (PL). Tworcy: Tomasz Tarko, Aleksandra Duda-Chodak, Tadeusz

Tuszyński.

PN-A-04022:1964 Metody analizy sensorycznej. Analiza jakości cząstkowej i całkowitej

metoda punktową. Wytyczne sporządzania szczegołowych wzorow oceny.

Singh R.P., Sharad S., Kapur S. 2004. Free radicals and oxidative stress in neurodegenerative

diseases: Relevance of dietary antioxidants. J. Indian Acad. Clin. Med., 5, 218-225.

Tarko T., Duda-Chodak A., Ignacok M. 2009a. Odzysk związkow przeciwutleniających z

roślinnych surowcow odpadowych. Przem. Ferm. Owoc.-Warz., 10, 18-22.

Tarko T., Duda-Chodak A., Sroka P., Satora P., Michalik J. 2009b. Transformations of

phenolic compounds in an in vitro model simulating the human alimentary tract. Food

Technol. Biotechnol., 47, 456-463.

Valko M., Leibfritz D., Moncol J., Cronin M.T., Mazur M., Telser J. 2007. Free radicals and

antioxidants in normal physiological functions and human disease. Int. J. Biochem. Cell

Biol., 39, 44-84.

5. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo - badawczych

Egzamin maturalny zdałem 1993 r. i w tym samym roku rozpocząłem studia na

Wydziale Technologii Żywności Akademii Rolniczej im. Hugona Kołłątaja w Krakowie. W

1998 r. obroniłem pracę magisterską, uzyskując tytuł magistra inżyniera technologii

żywności. Po ukończeniu studiów zostałem zatrudniony (od 01.09.1998) na stanowisku

asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Technologii Fermentacji i Mikrobiologii

Technicznej (obecnie Katedra Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Technicznej)

Akademii Rolniczej (obecnie Uniwersytet Rolniczy) w Krakowie, gdzie dołączyłem do

zespołu kierowanego przez prof. dr hab. inż. Tadeusza Tuszyńskiego.

Stopień doktora nauk rolniczych w zakresie żywności i żywienia uzyskałem 14 lipca

2004 r. na Wydziale Technologii Żywności Akademii Rolniczej w Krakowie. Promotorem

20

pracy pt. „Wpływ wybranych dodatków na stabilność alkoholowych kremów emulsyjnych”

był prof. dr hab. inż. Tadeusz Tuszyński. Na realizację swoich badań otrzymałem grant

promotorski (KBN 3 P06T 059 23).

Z dniem 01.06.2005 r. zostałem zatrudniony na stanowisku adiunkta na Wydziale

Technologii Żywności, w Katedrze Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Technicznej

Akademii Rolniczej w Krakowie (obecnie Uniwersytet Rolniczy w Krakowie).

Profil moich zainteresowań badawczych dotyczył wielu obszarów związanych z

szeroko pojętą technologią żywności. Realizowana przeze mnie tematyka naukowo-badawcza

obejmuje następujące zagadnienia:

5.1. wytwarzanie napojów alkoholowych i ich charakterystyka jakościowa,

5.2. analiza związków polifenolowych i właściwości przeciwutleniających roślin

i produktów spożywczych,

5.3. biodostępność związków polifenolowych w symulowanym układzie

pokarmowym człowieka,

5.4. ocena możliwości wykorzystania drobnoustrojów na potrzeby człowieka.

Ad. 5.1. Wytwarzanie napojów alkoholowych i ich charakterystyka jakościowa

Na początku swojej działalności badawczej włączyłem się w tematykę realizowaną w

Katedrze Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Technicznej, związaną ze związkami

lotnymi w napojach alkoholowych. Związki sześciowęglowe, głównie alkohol heksylowy i

jego pochodne, charakteryzują się stosunkowo niskimi progami wyczuwalności, wpływają

niekorzystnie na smak i zapach napojów, przyczyniając się między innymi do ostrego,

piekącego i trawiastego ich posmaku. Efektem prowadzonych badań były publikacje

(Załącznik IV, pkt. A1, D2, Załącznik V, pkt. B1), w których wykazano, że w celu

zmniejszenia zawartości heksanolu i komponentów pochodnych w napojach alkoholowych,

należy eliminować z przerobu surowce niedojrzałe oraz ich zanieczyszczenia, głównie zielone

części roślin. Podczas procesów technologicznych powinno się maksymalnie ograniczyć

napowietrzanie surowców w trakcie ich rozdrabniania. Dodatek SO2, kwasu askorbinowego,

CO2 i innych inhibitorów enzymów wpływa hamująco na powstawanie heksanolu w czasie

przygotowania i obróbki owoców, maceracji miazgi oraz fermentacji moszczów. W napojach

destylowanych można dodatkowo ograniczyć zawartość heksanolu poprzez odpowiednią

destylację korekcyjną z odbiorem frakcji pogonowych lub rektyfikację.

21

Jednym z kierunków badań były również doświadczenia związane z wykorzystaniem

propolisu, jako składnika napojów alkoholowych (Załącznik IV, pkt. D1; Załącznik V., pkt.

B2), których efektem było zgłoszenie patentowe (Załącznik IV, pkt. B1). Propolis

charakteryzuje się gorzkim, lekko piekącym smakiem, który uwydatnia się zwłaszcza w

roztworach etanolowych. Ekstrakty propolisowe otrzymane przy udziale 40 i 50% etanolu są

stabilne i charakteryzują się stosunkowo niskim progiem wyczuwalności smaku (45 ppm)

oraz zapachu (75 ppm). Wódki (czyste i gatunkowe) zestawione z niewielkim dodatkiem

przygotowanych wyciągów odznaczały się oryginalnym zapachem i specyficznym smakiem,

tzw. nutą propolisową.

Ważną częścią moich zainteresowań była stabilność alkoholowych kremów

emulsyjnych, a zwieńczeniem badań związanych z tą tematyką było opracowanie rozprawy

naukowej i uzyskanie na jej podstawie stopnia naukowego doktora. Doświadczenia

prowadziłem w ramach projektu badawczego „Optymalizacja procesów otrzymywania

alkoholowych kremów emulsyjnych w celu poprawy ich stabilności” (grant KBN 3 P06T 059

23). Najważniejsze wyniki tych badań zostały przestawione w publikacjach (Załącznik IV,

pkt. D3, D6, D7. D9) i doniesieniach na konferencjach naukowych (Załącznik V, pkt. B3, B4,

B5, B6, B7). Wykazano, że niskie stężenie lecytyny w emulsjach alkoholowych, przy

stosunkowo wysokim udziale kwasów tłuszczowych, prowadzi najczęściej do szybkiego

rozwarstwiania kremu. Wzbogacenie kremów lecytyną (0,3%) oraz kazeinianem sodu (0,2%)

warunkowało pełną trwałość przechowalniczą, w czasie pięciomiesięcznego składowania.

Wykazano także synergistyczny efekt oddziaływania lecytyny i kazeinianu sodu na trwałość

przechowalniczą alkoholowych kremów emulsyjnych. Frakcje lipidowe emulsji ulegały

silniejszemu, w odniesieniu do kontroli, zdyspergowaniu oraz wolniejszej koalescencji. Ich

dyspersja do rozmiarów poniżej 20 μm wydłużała w zasadniczy sposób trwałość badanych

emulsji. Wprowadzanie do kremów składników przeciwutleniających (szczególnie

tokoferolu) przyczyniało się do ograniczenia rozkładu karotenoidów, ale nie spowalniało

brunatnienia. Opracowano także metodę prognozowania stabilności alkoholowych kremów

emulsyjnych.

Od 2005 roku Polska zaliczana jest do najchłodniejszej strefy uprawy winorośli w

Europie, dlatego kolejny etap moich badań dotyczył win wytwarzanych w Polsce (Załącznik

IV, pkt. A8, A16, D11, D31, D32, D36). Wina gronowe, produkowane w rejonie chłodnego

klimatu, z wykorzystaniem nowych odmian (mieszańców złożonych) mogą stanowić

konkurencję dla win uzyskiwanych w tradycyjnych krajach winiarskich. Do szczepów tych

zostały zaliczone m.in. Marechal Foch, Leon Millot, Aurora, Rondo, Regent, Bianca, Perła

22

Zali. Odmiany te charakteryzowały się zawartością ekstraktu w zakresie 12,85-21,85 g/100 g

oraz zbliżoną kwasowością ogólną. Wina pochodzące z regionów chłodnego klimatu

spełniały wymagania normatywne EU. Charakteryzowały się niewielką zawartością ekstraktu

ogółem (poniżej 4%), stężeniem alkoholu w zakresie od 9,9 do 14,5% obj. oraz kwasowością

od 4,0 do 8,7 g/l. Dominującymi związkami lotnymi tych win były alkohole wyższe, głównie

alkohole izoamylowe oraz izobutanol. Polskie wina gronowe, ze względu na wysoką

kwasowość, były również bogate w octan etylu. Nie można jednak zapominać o winach

owocowych, których tradycja wytwarzania sięga XIII w. Jednym z kierunków moich badań

było wytwarzanie i ocena jakościowa win owocowych (Załącznik IV, pkt. A2, A5, A17;

Załącznik V. pkt. B18, B24, B29, B31, B42, B49). Umiarkowany klimat w Polsce sprzyja

wysokiej produkcji jabłek. Rocznie zbiera się około 1,5 mln ton tych owoców, a przemysł

przetwarza około 700 tysięcy ton. Jabłka stanowią bardzo dobry surowiec do produkcji wina.

Wykazano, że wytworzone z nich moszcze charakteryzowały się stosunkowo niską

kwasowością (1,5-4,7 g/l) i zawartością ekstraktu na poziomie 11°Blg. W wyniku fermentacji

otrzymano wina o niskim stężeniu cukru resztkowego, zawierające bardzo bogaty profil

związków lotnych, w którym dominowały alkohole fuzlowe, aldehyd octowy, octan etylu,

butanol i kwas octowy. Wina jabłkowe były również wysoko oceniane przez panel

sensoryczny.

Fermentacja wysokostężonych brzeczek, m.in. podczas wytwarzania miodów pitnych,

stanowiła także jeden z obszarów moich zainteresowań i badań (Załącznik IV, pkt. D21, D43;

Załącznik V, pkt. B10, B39, B44, B50), których efektem było zgłoszenie patentowe

(Załącznik IV, pkt. B3). Wysokie stężenie cukru może hamować wzrost drożdży z powodu

ciśnienia osmotycznego. W wyniku przeprowadzonych badań wykazano, że brzeczki

wysokostężone należy fermentować z wykorzystaniem szczepów drożdży osmofilnych, mniej

wrażliwych na wysokie ciśnienie osmotyczne roztworu. Obecne w brzeczkach inhibitory

fermentacji (krótko- i średniołańcuchowe kwasy tłuszczowe) istotnie spowalniały lub

zatrzymały fermentację. Wykazano, że dodatek kwasu benzoesowego (5-50 mg/l) lub

sorbowego (25-50 mg/l) zwiększał wydajność fermentacji. Suplementacja brzeczek

miodowych hydrokoloidami (0,01-0,5%) i jonami magnezu chroniła komórki przed

niekorzystnymi czynnikami zawartymi w roztworze, przyczyniając się do zwiększenia stopnia

odfermentowania. Bardzo dobre efekty ochronne osiągnięto się również po immobilizacji

komórek, np. z wykorzystaniem gumy arabskiej, przyspieszając równocześnie klarowanie

miodów pitnych.

23

Zainteresowanie procesami fermentacji i doświadczenie zdobyte podczas omówionych

powyżej badań nad parametrami wpływającymi na technologię pozwoliło na wydanie skryptu

dla studentów Wydziałów Technologii Żywności, pt. „Procesy Fermentacyjne. Przewodnik

do ćwiczeń” (Załącznik IV, pkt. D28), którego jestem współredaktorem i współautorem.

Ad. 5.2 Analiza związków polifenolowych i właściwości przeciwutleniających roślin

i produktów spożywczych

Tematyką związaną ze związkami polifenolowymi zainteresowałem się w 2003 roku,

uczestnicząc w projekcie zamawianym (094/P06/2003/28) (Załącznik IV, pkt. I2)

„Weryfikacja zasad technologii wytwarzania i wykorzystania żywności bogatej w naturalne

antyoksydanty pod względem jej działania prozdrowotnego: Właściwości antyoksydacyjne

wybranych odmian jabłek i innych przetworów z tych owoców w aspekcie oddziaływania

prozdrowotnego”. W ramach projektu brałem udział w doświadczeniach związanych z

pomiarem aktywności antyoksydacyjnej oraz zawartości polifenoli w różnych odmianach

jabłek i ich przetworach (chipsach, suszach, cydrach i winach) (Załącznik IV, pkt. A2, A4,

A5, A9, D4, D5, D10, D33, D38; Załącznik V, pkt. B8, B9, B12, B22, B23, B30). Wykazano,

że największą aktywnością antyoksydacyjną charakteryzowały się jabłka odmiany

Antonówka: 4059,2 mg troloksu/100 g s.s., Boskoop (3315,0), Złota Reneta (3109,6) oraz

Kronselska (3023,7), a najmniejszą Koksa pomarańczowa (1691,3). Najbogatsze w polifenole

były odmiany: Antonówka (524,7 mg (+)katechiny/100 g s.s.), Ligol (445,74), Red Boskoop

(408,38) oraz Złota Reneta (368,11). Profil związków polifenolowych różnił się w

poszczególnych odmianach, jednak cechą wspólną wszystkich badanych owoców była

znacząca przewaga ilościowa 3 substancji: (-)epikatechiny, procyjanidyny B2 oraz kwasu

chlorogenowego. Wysoka zawartość związków polifenolowych i znaczące właściwości

przeciwutleniające zależały w głównej mierze od kwasu chlorogenowego. Zdolności

przeciwutleniające jabłek malały w trakcie ich dojrzewania, natomiast podczas

przechowywania owoców w chłodni rosły. W czasie dojrzewania owoców znacząco zmalała

zawartość kwasu chlorogenowego, (-)epikatechiny i florydzyny. Natomiast podczas

przechowywania owoców w chłodni wykazano wzrost udziału procyjanidyny B1, C1 i

(+)katechiny. W skórach jabłek dominowały: glikozydy kwercetyny (-)epikatechiny i

procyjanidyny B2, a w miąższu: kwas chlorogenowy, (-)epikatechiny i procyjanidyna B2.

Nasiona jabłek odznaczały się większą aktywnością przeciwutleniającą oraz zawartością

polifenoli w porównaniu do skórek i miąższu. W nasionach dominowała florydzyna,

stanowiąca od 72 do 84% wszystkich oznaczanych antyutleniaczy oraz kwas chlorogenowy.

24

Nie stwierdzono obecności glikozydów kwercetyny, które stanowiły istotną frakcję polifenoli

skórek. Chipsy jabłkowe i susz jabłkowy odznaczały się mniejszą (1500-2500 mg

troloksu/100 g s.m.) zdolnością do zmiatania wolnych rodników niż jabłka (2829 - 4140 mg

troloksu/100 mg s.m.). Uzyskane produkty odznaczały się tym samym składem jakościowym

związków polifenolowych jak surowce – głównymi związkami były kwas chlorogenowy,

(-)epikatechina i procyjanidyny B2 i C1. Dodatkowo stwierdzono obecność

5-hydroksymetylofurfuralu (HMF). Zróżnicowanie odmianowe miało istotny wpływ na

smakowitość końcowego produktu. Ostatecznie stwierdzono, że spośród ocenianych odmian,

najbardziej przydatną do produkcji chipsów są jabłka Golden Delicious. Wykazano również,

że grubość plastrów jabłek w zakresie od 3 do 3,5 mm oraz temperatura suszenia na poziomie

90°C była optymalna do zapewnienia wysokiej zawartości polifenoli, aktywności

przeciwutleniającej oraz odpowiednich, korzystnych cech sensorycznych produktu.

Zastosowanie wstępnej obróbki mikrofalowej (300 W, 5 min) wiązało się ze znacznym

skróceniem czasu suszenia i nie wpływało negatywnie na ocenę organoleptyczną chipsów, a

jednocześnie przyczyniało się do znacznego wzrostu zawartości polifenoli (o około 60%) i

aktywności przeciwutleniającej (80%). Konsekwencją prowadzonych badań było otrzymanie

patentu „Sposób wytwarzania chipsów jabłkowych” (patent nr 214196) (Załącznik IV, pkt.

B2). Oceniano również wpływ warunków fermentacji na zawartość związków

polifenolowych i potencjał antyoksydacyjny win. Najlepszymi właściwościami

antyoksydacyjnymi wśród badanych napojów, odznaczały się wina z jabłek Šampion

(466,1 mg troloksu/100 ml), natomiast w przypadku odmiany Gloster aktywność ta była

ponad 7-krotnie niższa. Aktywność antyoksydacyjna była bezpośrednio związana z ilością

polifenoli oraz ich profilem. Dominującym związkiem we wszystkich próbach był kwas

chlorogenowy, którego zawartość mieściła się w zakresie od 12,7 (Gloster) do 25,8 mg/l

(Šampion). Udział pozostałych związków był silnie zróżnicowany i uzależniony od odmiany

jabłek użytej do fermentacji. Cechą wspólną tych prób była zbliżona zawartość pochodnych

kwasu cynamonowego i (-)epikatechiny oraz mała ilość pochodnych glikozydowych

kwercetyny. Pasteryzacja moszczu przeznaczanego do fermentacji istotnie wpłynęła na

wzrost stężenia procyjanidyn, w odniesieniu do prób bez obróbki termicznej. Fermentacja w

miazdze zwiększała aktywność przeciwutleniającą otrzymywanych win jabłkowych, co było

bezpośrednio związane z ilością polifenoli. Obecność tlenu wpłynęła niekorzystnie na

charakterystykę chemiczną win – stwierdzono zmniejszenie aktywności przeciwutleniającej i

ogólnej ilości polifenoli o ponad 60%. Immobilizacja komórek drożdży z wykorzystaniem

alginianu wapnia poprawiała aktywność przeciwutleniającą win jabłkowych, powodując

25

znaczący wzrost stężenia kwasu chlorogenowego, a przede wszystkim (+)katechiny i

(-)epikatechiny. Zwieńczeniem grantu zamawianego nr 094/P06/2003/28 było

współautorstwo monografii pt. „Przeciwutleniacze w żywności. Aspekty zdrowotne,

technologiczne, molekularne i analityczne”, pod redakcją prof. Włodzimierza Grajka

(Załącznik IV, pkt. D8).

Po zakończeniu prac związanych z omawianym projektem badawczym

kontynuowałem moje badania dotyczące analizy związków polifenolowych i właściwości

przeciwutleniających roślin i produktów spożywczych (Załącznik IV, pkt. A10, A13, A15,

D12, D14-D17, D19, D22-D27, D34, D39, Załącznik V, pkt. B11, B16, B17, B19-B22, B25,

B26, B33, B34, B38). Na część doświadczeń otrzymałem finansowanie z Ministerstwa Nauki

i Szkolnictwa Wyższego (projekt N N310 079636) (Załącznik IV, pkt. I3). W ramach

przeprowadzonych badań wykazano, że owoce niewykorzystywane powszechnie w

przetwórstwie, np. pigwowca japońskiego, derenia jadalnego czy morwy czarnej odznaczały

się silnymi właściwościami prozdrowotnymi, związanymi głównie z zawartością polifenoli.

Owoce pigwowca japońskiego i derenia jadalnego miały wysoką aktywność antyoksydacyjną

(odpowiednio 2631 i 1782 mg troloksu/100 g), w porównaniu z innymi owocami krajowymi

(jabłka – około 500 mg troloksu/100 g, gruszki – 324, śliwki – 448, melony – 38). Ich

potencjał antyrodnikowy wynikał głównie z dużego stężenia związków polifenolowych.

Owoce pigwowca japońskiego i derenia jadalnego charakteryzowały się także interesującym

smakiem i aromatem. Ze względu na skład chemiczny oraz możliwości uprawy w krajach o

klimacie umiarkowanym mogą stanowić ciekawą alternatywę dla innych owoców

stosowanych w przetwórstwie. Owoce pigwowca japońskiego i derenia jadalnego, z powodu

wysokiej kwasowości i niekorzystnego stosunku cukrów do kwasów nadają się tylko do

przetwórstwa. W tym celu w recepturze muszą być uwzględnione działania powodujące

zmianę profilu cukrowo-kwasowego, lub też owoce mogą występować jako składnik

przetworów wieloowocowych. Zalecane kierunki przetwórstwa to przede wszystkim

produkcja nalewek, win do kupażu oraz przetworów dżemowych. Cennym źródłem związków

polifenolowych o wysokiej aktywności przeciwutleniającej są zioła i herbaty. Zbadano

potencjał antyoksydacyjny i zawartość polifenoli ogółem w piętnastu ziołach

wykorzystywanych w ziołolecznictwie. Największą aktywność antyoksydacyjną

(1753 mg troloksu/g s.m.) i najwyższy poziom polifenoli wykazano dla borówki brusznicy

(200 mg (+)katechiny/g s.m.). Kora dębu, dziurawiec oraz kwiaty głogu i bzu czarnego były

również bardzo cennym źródłem związków przeciwutleniających. Niskim potencjałem

antyrodnikowym odznaczały się liście pokrzywy, ziele skrzypu, jemioły i fiołka. Potencjał

26

przeciwutleniający herbat okazał się ponad 5-krotnie silniejszy niż wysokoaktywnych ziół.

Wykazano, że herbaty zielone zawierają więcej związków aktywnych niż czerwone i czarne,

a ich aktywność istotnie maleje podczas przechowywania (do 35% na miesiąc). Jednym z

kierunków zainteresowań o charakterze naukowym i utylitarnym było wykorzystanie

odpadów z przemysłu owocowo-warzywnego. Właściwe ich zagospodarowanie stanowi duży

problem, a wtórne wykorzystanie odpadów pozwala uniknąć kosztów magazynowania lub

utylizacji. Złożony skład chemiczny daje wiele możliwości, a najpopularniejsze dotąd

przeznaczanie ich na paszę lub nawóz nie rozwiązuje problemu. Atrakcyjną alternatywą jest

odzysk substancji, które mogą być wykorzystane w różnych gałęziach przemysłu, głównie w

przemyśle spożywczym. Preparaty uzyskane w ten sposób mają niską cenę i stanowią

doskonały zamiennik popularnych obecnie związków wytwarzanych na drodze reakcji

chemicznych. Dodatkową zaletą jest obecność związków towarzyszących, które

niejednokrotnie pozytywnie wpływają na organizm człowieka. Wykazano, że wytłoki z

winogron i jabłek charakteryzowały się względnie wysoką aktywnością przeciwutleniającą

(odpowiednio 1452 i 415 mg troloksu/100 g ś.m.) i zawartością związków polifenolowych

(130 i 142 mg (+)katechiny/100 g ś.m.) i stanowiły dobre źródło błonnika pokarmowego.

Wytłoki marchwiowe, mimo małej zawartości suchej masy, były również cennym źródłem

β-karotenu. Oceniano także wpływ różnych rozpuszczalników na odzysk związków

aktywnych z wytłoków owocowo-warzywnych i wykazano, że rozpuszczalniki organiczne

stanowiły najlepsze ekstrahenty, jednak niektóre z nich są toksyczne dla człowieka. Dlatego,

ze względu na niską toksyczność, zaleca się wykorzystywać do tego procesu 60-80% roztwór

etanolu.

Ad. 5.3. Biodostępność związków polifenolowych w symulowanym układzie

pokarmowym człowieka

Badania nad związkami polifenolowymi, zapoczątkowane w czasie wykonywania

projektu badawczego nr 094/P06/2003/28 (Załącznik IV, pkt. I2), oraz doświadczenia

omawiane w punkcie 5.2, skierowały moje zainteresowania na biodostępność i

bioprzyswajalność polifenoli w układzie pokarmowym człowieka. Wysokie ilości polifenoli

w owocach i warzywach nie zawsze są dostępne dla człowieka. Istotny jest sposób

metabolizmu i wchłaniania do ustroju tych składników oraz ich uwolnienie z matrycy

żywności. Dlatego rozpocząłem badania związane z tą tematyką, a w 2011 roku uzyskałem

grant pt. „Biodostępność i bioprzyswajalność związków polifenolowych w symulowanym

układzie pokarmowym człowieka” (nr 2011/01/B/NZ9/00218), finansowany przez Narodowe

27

Centrum Nauki (Załącznik IV, pkt. I4). Rezultaty przeprowadzonych doświadczeń stanowią

istotną część monografii „Występowanie i biodostępność związków polifenolowych oraz

możliwości ich wykorzystania w suplementacji żywności”, która stanowi osiągnięcie

naukowe będące podstawą do ubiegania się o stopień naukowy doktora habilitowanego. W

tym samym czasie uczestniczyłem również w grancie (nr 2011/01/B/NZ9/00226) związanym

z tematyką interakcji związków polifenolowych z mikroflorą przewodu pokarmowego

człowieka, jako główny wykonawca (Załącznik IV, pkt. I5). Część wyników z obu projektów

została już opublikowana w czasopismach naukowych i zaprezentowana na konferencjach

krajowych i zagranicznych (Załącznik IV, pkt. A3, A6, D13, D42; Załącznik V, pkt. B15,

B27, B37, B40, B41, B43, B45, B46, B48, B51). Istnieje wiele metod in vivo oraz in vitro

oceniających stopień i szybkość trawienia oraz przyswajanie związków polifenolowych.

Metodami zapewniającymi uzyskanie najbardziej pewnych wyników są metody in vivo,

jednak mają one wiele ograniczeń. Dlatego też powstało wiele modeli in vitro symulujących

pracę układu pokarmowego człowieka i starających się odtworzyć warunki w nim panujące.

Jednym z pierwszych etapów tej części doświadczeń było opracowanie modelu in vitro

uwzględniającego wszystkie etapy symulacji trawienia, który umożliwiał badanie

biodostępności polifenoli z owoców i przetworów owocowych. W modelu uwzględniono etap

żołądka i jelita cienkiego, z odpowiednią regulacją pH i symulacją wydzielania enzymów

trawiennych, etap wchłaniania z użyciem membran dializacyjnych oraz jelita grubego z

mikroflorą rezydującą. Wykazano, że w wyniku działania enzymów trawiennych aktywność

antyoksydacyjna jabłek i śliwek wzrastała, co było związane ze zwiększeniem ilości

polifenoli i z lepszą ich przyswajalnością, wywołaną głównie przemianami do związków

prostszych (monomery, aglikony). Udowodniono także dobrą przyswajalność katechiny,

zarówno naturalnie obecnej w badanych owocach, jak i tej pochodzącej z trawienia

procyjanidyn. Po symulacji trawienia owoców aronii, gruszek i bananów aktywność

antyoksydacyjna malała, odwrotnie niż w przypadku jabłek i śliwek. Wszystkie dializaty

uzyskane po symulowanym trawieniu charakteryzowały się mniejszą zawartością polifenoli

ogółem w porównaniu do surowca wyjściowego. Podczas symulowanego trawienia

rozkładowi ulegały głównie glikozydy kwercetyny i cyjanidyny. Fenolokwasy oraz

procyjanidyny odznaczały się mniejszym stopniem wchłaniania. Mikroflora jelitowa, użyta w

doświadczeniu, oddziaływała na związki polifenolowe obecne w badanych owocach w

zróżnicowany sposób. Można było zauważyć istotny wpływ metabolizmu bakteryjnego na

trawienie polifenoli obecnych w jabłkach oraz truskawkach. Prawidłowe funkcjonowanie

mikroflory jelitowej jest kluczowe dla metabolizmu licznych substancji chemicznych

28

dostarczanych wraz z pożywieniem. Równowaga pomiędzy układem immunologicznym

gospodarza a komensalnymi gatunkami mikroflory jest także niezbędna dla zachowania

zdrowia, a jej zaburzenia powodują rozwój licznych chorób. Dlatego w badaniach, w których

uczestniczyłem oceniano wpływ wybranych polifenoli oraz ekstraktów owocowych na

mikroflorę jelitową. Wykazano, że kemferol silnie hamował wzrost wszystkich badanych

bakterii, działając najmocniej wobec Ruminococcus gauvreauii (minimalne stężenie hamujące

– MIC 20 µg/ml) oraz Eubacterium cylindroides (MIC 50 µg/ml). Słabszymi inhibitorami

były rezweratrol i florydzyna. Rezweratrol silnie hamował wzrost Lactobacillus sp. i

Ruminococcus gauvreauii (MIC 100 µg/ml) oraz Enterococcus caccae (MIC 250), a

florydzyna słabo hamowała Enterococcus caccae i Ruminococcus gauvreauii (MIC>250). W

wyniku oceny wpływu ekstraktów z 13 różnych roślin na bakterie jelitowe wykazano, że

Lactobacillus sp. był wrażliwy tylko na ekstrakt z borówki brusznicy. Najsilniejszy wpływ na

bakterie E. coli miał ekstrakt z nasion grejpfruta, podczas gdy ekstrakty z owoców kolcowoju

chińskiego i bzu czarnego działały hamująco na wzrost Enterococcus caccae. Wiele z

badanych ekstraktów roślinnych miało negatywny wpływ na mikroflorę jelitową człowieka,

w tym gatunków pożądanych i korzystnych. Uzyskane wyniki wskazują na konieczność

przemyślanego doboru suplementów diety, gdyż stosowane bez kontroli i w nadmiarze

składniki przeciwutleniające mogą negatywnie wpłynąć na funkcjonowanie fizjologicznej

mikroflory jelitowej. Wykazano także, że związki polifenolowe chronią komórki nabłonkowe

jelita przed stresem oksydacyjnym i proliferacją. Udowodniono, że kwas chlorogenowy i

kwercetyna wykazują silniejsze działanie ochronne niż epigalokatechina.

Ad. 5.4. Ocena możliwości wykorzystania drobnoustrojów na potrzeby człowieka

Ostatnim, pobocznym obszarem moich zainteresowań jest wykorzystanie

drobnoustrojów dla szeroko rozumianych potrzeb człowieka. Jednym z nich były

cyjanobakterie (sinice) rodzaju Arthrospira (dawniej Spirulina) (Załącznik IV, pkt. A7, A12,

A14). Cyjanobakterie z rodzaju Arthrospira, znane komercyjnie jako Spirulina, zawierają ok.

60-70% białka wysokiej jakości, w którego skład wchodzi 9 aminokwasów egzogennych.

Sinice należące do tego rodzaju są również bogatym źródłem wielu witamin, głównie z grupy

B (m.in. B12), a także witamin D, A, E i mikroelementów. Dodatkowo cyjanobakterie

zawierają znaczne ilości nienasyconych kwasów tłuszczowych, w tym ω-3 i ω-6. Bardzo

ważnym składnikiem sinic są barwniki (fikocyjaniny; chlorofile; karotenoidy, głównie

β-karoten). Suplementy diety oparte na liofilizowanych bakteriach Arthrospira aktywują

układ odpornościowy, głównie przez modulowanie poziomu cytokin. Fikocyjaniny są

29

silnymi, selektywnymi inhibitorami cyklooksygenazy-2, zaangażowanymi w syntezę

prostaglandyn i hamowanie uwalniania histaminy z komórek tucznych. Część

przeprowadzonych doświadczeń dotyczyła oceny wpływu podłoża hodowlanego na syntezę

związków bioaktywnych (β-karotenu, fikobiliprotein) oraz właściwości antyoksydacyjnych u

sześciu wybranych gatunków cyjanobakterii z rodzaju Arthrospira. Wykazano, że rodzaj

zastosowanego podłoża wzrostowego (Zarrouk’a, RM6) wpływa na ilość związków

syntetyzowanych w komórkach badanych cyjanobakterii. Skład ilościowy i jakościowy

podłoża Zarrouk’a wpływał korzystniej na syntezę β-karotenu w biomasie sinic wszystkich

badanych szczepów, natomiast w biomasie wzrastającej na podłożu RM6 zanotowano

większą zawartość fikobiliprotein (z wyjątkiem A. platensis 85.79). Również w przypadku

oznaczenia całkowitej zdolności antyoksydacyjnej bardziej korzystnym okazał się być skład

medium Zarrouk’a (z wyjątkiem A. platensis 86. 79 i A. platensis 257.80). W zespole

badawczym oceniano także możliwości wykorzystania immobilizowanych bakterii

Arthrospira platensis (w alginianie sodu, żelu krzemionkowym i agarozowym) do biosorpcji

ołowiu. Maksymalne możliwości sorpcyjne dla komórek unieruchomionych w alginianie,

żelu agarozowym i krzemionkowym wynosiły odpowiednio 425, 273 i 2 mg Pb/g suchej

masy biosorbenta. Największą wydajność biosorpcji ołowiu przez bakterie immobilizowane

w żelu alginianowym i agarozowym obserwowano w pH = 5,0 i przy początkowym stężeniu

ołowiu około 500 mg/l. Dla żelu krzemionkowego korzystniejsze wyniki osiągano przy

pH = 4,0 i stężeniu ołowiu na poziomie 100 mg/l.

Innymi badaniami związanymi z usuwaniem ołowiu z wody były doświadczenia nad

wykorzystaniem biomasy odpadowej różnych szczepów drożdży (Załącznik IV, pkt. A11).

Testowane drożdże usuwały z roztworu ponad 90% ołowiu w ciągu 20 min procesu, przy

czym jedynie zastosowanie drożdży piekarskich umożliwiało obniżenie poziomu Pb poniżej

1 mg/l z roztworów o wyjściowym stężeniu 200 i 500 mg Pb/l. Największą wydajność

usuwania Pb wykazano stosując drożdże piekarskie, gdy wyjściowe stężenie ołowiu wynosiło

500 mg/l.

Biomasa drożdży może też znaleźć zastosowanie w technologii żywności. W ramach

badań nad wykorzystaniem drożdży jako zamiennika mięsa w produktach spożywczych

(Załącznik IV, pkt. B29 i B30), wykazano, że drożdże piekarnicze i ich hydrolizaty mogą

stanowić ciekawą alternatywę dla wegetarian. Hydrolizaty drożdży nadawały wytworzonym

pasztetom „mięsny” posmak, zastępując całkowicie użycie mięsa i wątroby wieprzowej do

wyrobu. Stanowiły także dobre źródło białek i mikroelementów w tych produktach.

30

Mój dotychczasowy dorobek publikacyjny obejmuje:

L.p. Nazwa czasopisma Liczba

publikacji IF

a IF

b Punkty wg

MNiSWa

Punkty wg

MNiSWb

1. Food Chemistry 1 2,696 3,259 24 40

2. Food Science and Technology

International 1 0,467 0,981 15 20

3. Journal of Food Processing and

Preservation 2 0,944 1,876 26 30

4. Journal of Agricultural and Food

Chemistry 1 2,469 3,107 24 40

5. Food Technology and Biotechnology 1 0,976 0,977 20 25

6. Journal of Food Composition and

Analysis 1 1,948 2,259 32 35

7. Journal of Elementology 1 0,381 0,643 15 15

8. Czech Journal of Food Science 1 0,685 0,741 20 20

9.

Journal of Environmental Science and

Health Part A-Toxic/Hazardous

Substances & Environmental

Engineering

1 1,135 1,135 20 20

10. Journal of Food Science and

Technology 1 2,024 2,024 20 20

11. Fruits 1 0,800 0,800 25 25

12. FEMS Yeast Research 1 2,436 2,436 25 25

13. Postępy Mikrobiologii 1 0,140 0,271 13 15

14. Żywność, Nauka, Technologia, Jakość 3 0,190 0,311 26 45

15. Przemysł Fermentacyjny i Owocowo-

Warzywny 7 — — 29 35

16. Acta Scientiarum Polonorum

Technologia Alimentaria 10 — — 51 100

17. Polish Journal of Food and Nutrition

Science 1 — — 6 10

18. Electronic Journal of Polish Agricultural

Universities 2 — — 8 14

19. Herba Polonica 2 — — 15 16

20. Journal of International Scientific

Publication 2 — — 4 4

21. Journal of Fruit and Ornamental Plant

Research 1 — — 6 —

22. Przemysł Spożywczy 1 — — 6 5

23. Żywienie Człowieka i Metabolizm 1 — — 1 4

24. Roczniki Państwowego Zakładu Higieny 1 — — 6 6

25. Rozdział w monografii 15 — — — —

26. Udzielone patenty 3 — — — —

27. Doniesienia opublikowane w

materiałach konferencyjnych 51 — — — —

OGÓŁEM 111 17,291 20,820 437 569 a – obowiązujące w roku opublikowania

b – zgodne z aktualną ministerialną listą czasopism punktowanych