Strona | 1

Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu

Wydział Nauk o Żywności i Żywieniu

mgr inż. Łukasz Tomczyk

Analiza czynników warunkujących występowanie mykobiota i mykotoksyn

w jajach konsumpcyjnych z uwzględnieniem możliwości ich ograniczenia

Promotor rozprawy doktorskiej:

prof. UPP dr hab. Renata Cegielska-Radziejewska

Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu

Promotor pomocniczy rozprawy doktorskiej:

Dr hab. Kinga Stuper-Szablewska

Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu

Poznań, 2019

Strona | 2

Podziękowania

Pragnę złożyć wyrazy wdzięczności mojemu promotorowi

prof. UPP dr hab. Renacie Cegielskiej-Radziejewskiej

za inspiracje, cenne wskazówki oraz motywację do

stałego rozwoju naukowego.

Szczególne podziękowania kieruję również do promotora pomocniczego

dr hab. Kingi Stuper-Szablewskiej za wszelką udzieloną pomoc,

cenne uwagi merytoryczne oraz serdeczność we współpracy.

Dziękuję również wszystkim

Współautorom

za owocną współpracę, która w konsekwencji przyczyniła się do powstania

publikacji będących częścią składową niniejszej rozprawy doktorskiej.

W szczególności pragnę podziękować dr inż. Tomaszowi Szablewskiemu

za wsparcie i wielokrotnie udzielaną pomoc.

Strona | 3

Streszczenie

Jakość i bezpieczeństwo zarówno surowców, jak i produktów spożywczych są ze sobą

nierozerwalnie związane. W przypadku jaj konsumpcyjnych szczególnym nadzorem objęto

zagrożenia mikrobiologiczne. Do tej pory monitoring tego typu zagrożeń skupiał się głównie

na bakteriach. Najnowsze doniesienia wskazują jednak na zagrożenie, które do tej pory,

w przypadku jaj konsumpcyjnych nie było rozpatrywane. Jak się okazało grzyby

mikroskopowe mogą rozwijać się na powierzchni skorup jaj i przerastać do ich treści. Dlatego

też w ramach niniejszej rozprawy doktorskiej podjęto badania, których wyniki uzupełnią

istniejący stan wiedzy na ten temat.

Celem pracy była ocena wpływu warunków pozyskiwania i przechowywania jaj

konsumpcyjnych na poziom mykobiota, dynamikę ich wzrostu i biosyntezę mykotoksyn

oraz zabiegu higienizacji jaj na ograniczenie ich występowania.

Pierwszym zadaniem badawczym była identyfikacja gatunków mykobiota obecnych

na powierzchni skorup jaj konsumpcyjnych pozyskanych z różnych systemów utrzymania kur

niosek oraz analiza mykotoksyn w treści jaj. W celu sprawdzenia potencjalnego

zanieczyszczenia jaj mykotoksynami oznaczono w nich stężenie trichotecenów z grupy A i B.

Wykazano zróżnicowanie w populacji mykobiota na powierzchni skorup jaj w zależności

od warunków utrzymania kur niosek. Wśród wyizolowanych grzybów mikroskopowych

zidentyfikowano toksynotwórcze gatunki patogeniczne, w tym F. culmorum i F. equseti.

Wykazano zależność pomiędzy stężeniem mykotoksyn, a rodzajem systemu utrzymania kur

niosek.

W kolejnym etapie badań oceniono wpływ poszczególnych czynników panujących|

na etapie pozyskiwania i przechowywania jaj na poziom ich zanieczyszczenia mykobiota,

wytwarzanie trichotecenów z grupy B oraz zachodzące w jajach zmiany jakościowe.

Stwierdzono, że wyjściowe zanieczyszczenie skorup jaj determinowane jest warunkami

panującymi na etapie ich pozyskiwania. Populacja mykobiota kolonizująca powierzchnie

skorup jaj najlepiej rozwija się w warunkach podwyższonej wilgotności i temperatury. Z kolei

szybkość przerastania grzybów i ich rozwój w białku jaj determinowany jest tylko względną

wilgotnością powietrza podczas przechowywania. W rezultacie profile mikotoksyn

zanieczyszczających treść jaj różnią się w zależności od źródła pochodzenia oraz warunków

występujących podczas przechowywania jaj.

Strona | 4

W końcowym etapie niniejszej pracy przeprowadzono badania nad zastosowaniem H2O2

z dodatkiem jonów srebra do higienizacji skorup jaj. Zabieg higienizacji jaj niniejszym

preparatem w przyjętych warunkach doświadczenia nie wykazywał negatywnego działania na

wytrzymałość wytrzymałości ich skorup. Najskuteczniejszy efekt higienizujący

zaobserwowano stosując roztwór badanego preparatu H2O2 z jonami srebra o stężeniu 0.3%,

co zapewniło istotną redukcję liczby wytypowanych drobnoustrojów na skorupie jaj. Efekt

higienizujący obserwowano bezpośrednio po zabiegu jak i w czasie 4 tygodniowego

przechowywania. Uzyskane wyniki badań wskazują, że zastosowanie preparatu H2O2

z jonami srebra jest zabiegiem bezpiecznym dla zachowania wymaganych cech

mechanicznych skorup jaj konsumpcyjnych i zapewniającym skuteczną poprawę ich czystości

mikrobiologicznej.

Wyniki niniejszych badań pozwoliły na uzyskanie wiedzy w zakresie zróżnicowania

jakościowego i ilościowego populacji mykobiota oraz ilości mykotoksyn w jajach

konsumpcyjnych w zależności od warunków utrzymania kur niosek, a także czynników

występujących na etapie przechowywania. Uzyskane rezultaty oprócz znaczenia

poznawczego mają również charakter aplikacyjny. Mogą zostać wykorzystane w opracowaniu

strategii prewencji występowania toksynotwórczych gatunków grzybów w jajach

konsumpcyjnych.

Strona | 5

Abstract

The quality and safety of raw materials and finished food products are inextricably linked.

Microbiological hazards related with the consumption of eggs are particularly carefully

monitored. Until now the monitoring of these hazards has chiefly concentrated on bacteria.

However, according to the latest reports, there is a threat which has not been considered in the

context of table eggs so far. As it turned out, microfungi can develop on the surface of

eggshells and penetrate into their content. The findings of the research conducted in this

doctoral dissertation will supplement the current state of knowledge on this subject.

The aim of the study was to assess how the conditions of egg acquisition and storage

applied to eggs influence changes in their qualitative traits, the contamination with

microfungi, dynamics of growth and biosynthesis of mycotoxins as well as the hygienisation

treatments to reduce their occurrence.

The first research task was to identify the species of mycobiota on the surface of shells of

table eggs acquired from hens maintained in various systems and to analyse mycotoxins in the

egg content. The concentration of type A and B trichothecenes was measured to check the

potential contamination of eggs with mycotoxins. The investigations revealed differences in

the population of eggshell mycobiota, which depended on the conditions of maintenance of

hens. Among the microfungi isolated on the eggshell surface, toxigenic and pathogenic

species were identified, including F. culmorum and F. equseti. The research revealed a

dependency between the concentration of mycotoxins and the system of maintenance of egg-

laying hens.

The next stage of the research involved assessment of the influence of individual factors

affecting the conditions of acquisition and storage of eggs on their contamination with

mycobiota, the production of type B trichothecenes and qualitative changes. The

investigations showed that the initial contamination of eggshells was determined by the

conditions of egg acquisition. The population of mycobiobota colonising the eggshell surface

developed best at elevated humidity and temperature. The rate of fungal overgrowth and the

development of fungi in the egg protein was determined only by the relative humidity of the

air during storage. As a result, the profiles of mycotoxins contaminating the content of eggs

varied according to the source of their acquisition and the conditions of their storage.

Strona | 6

The final stage of the research consisted in testing the use of H2O2 with silver ions to

hygienise eggshells. The experimental treatment did not have negative effect on the strength

of eggshells. The solution of the H2O2 preparation with 0.3% silver ions gave the best

hygienisation effect because it significantly reduced the count of selected microorganisms on

the eggshell. The effect of hygienisation was observed immediately after the treatment and

during four-week storage. The results of the tests showed that the treatment with the H2O2

preparation with silver ions was safe to the required mechanical characteristics of eggshells

and it significantly improved their microbiological purity.

The research findings provided knowledge about the qualitative and quantitative diversity

of the mycobiota population and the amount of mycotoxins in table eggs, depending on the

conditions of maintenance of egg-laying hens as well as egg storage factors. The research

results have not only cognitive but also applicatory significance. They can be used to prepare

strategies preventing the occurrence of toxinogenic fungal species in table eggs.

Strona | 7

Spis treści

Streszczenie ................................................................................................................................ 3

Abstract ...................................................................................................................................... 5

1. Wprowadzenie ..................................................................................................................... 8

2. Hipotezy badawcze, cel nadrzędny i cele szczegółowe rozprawy .................................... 12

3. Wyniki badań .................................................................................................................... 13

3.1 Charakterystyka mykobioty na powierzchni skorup jaj konsumpcyjnych pozyskanych

z różnych systemów utrzymania kur niosek (doświadczenie 1) ....................................... 13

3.2 Wpływ różnych warunków panujących na etapie pozyskiwania i przechowywania jaj

na zmiany jakościowe, występowanie mykobiota i mykotoksyn fuzaryjnych

(doświadczenie 2) .............................................................................................................. 16

3.3 Ocena wpływu preparatu nadtlenku wodoru z dodatkiem jonów srebra na stan skorupy jaj

konsumpcyjnych (doświadczenie 3) ................................................................................. 20

4. Wnioski ............................................................................................................................. 22

5. Bibliografia ....................................................................................................................... 23

6. ANEKS ............................................................................................................................. 29

I. Wykaz publikacji stanowiących przedmiot rozprawy doktorskiej ................................... 29

II. Publikacje stanowiące przedmiot rozprawy doktorskiej ................................................... 30

III. Oświadczenia współautorów publikacji stanowiących przedmiot rozprawy doktorskiej 55

Strona | 8

1. Wprowadzenie

W ostatnich latach obserwuje się wzrost produkcji jaj konsumpcyjnych na świecie,

również pochodzących z alternatywnych źródeł (FAOSTAT, 2017). Ilość produkowanych jaj

pozyskanych od kur niosek utrzymanych w systemie ekologicznym i przyzagrodowym

w 2018 roku wynosiła 20% całkowitej produkcji jaj (Agri). W związku z ich wysoką

konsumpcją niezwykle ważnym zagadnieniem jest zagwarantowanie bezpieczeństwa

zdrowotnego konsumentów.

Obok bezpieczeństwa istotnym aspektem jest jakość surowca. Wewnętrzne cechy

jakościowe jaj ocenia się na podstawie wielu wyróżników, takich jak: jednostki Haugha,

indeks białka, indeks żółtka oraz pH białka (Niewiarowicz, 1991; Eke i in., 2013). Najwyższą

jakością charakteryzują się jaja bezpośrednio po zniesieniu. Natomiast w czasie ich

przechowywania dochodzi do obniżenia jakości, a tempo tych zmian w znacznym stopniu

zależne jest od zastosowanych warunków. Optymalna temperatura przechowywania jaj to

około 18°C (Campo i in., 2000; Halaj i in., 2000). Magazynowanie w warunkach

chłodniczych, a w kolejnym etapie pozostawienie wychłodzonych jaj w temperaturze

pokojowej (półki sklepowe) może prowadzić do kondensacji pary wodnej na skorupie, co

stwarza korzystne warunki do rozwoju drobnoustrojów. Jaja muszą być zatem

przechowywane stałej temperaturze (Rozporządzenie UE 589/2008). Zmiany jakościowe

jakie występują podczas przechowywania jaj dotyczą wzrostu objętości komory powietrznej,

upłynnienia białka gęstego i osłabienia błony witelinowej otaczającej żółtko (Silversides i in.,

2001; Eke i in., 2013). Następuje utrata wody i dwutlenku węgla, co powoduje wzrost pH

białka i żółtka (Al-Hajo i in., 2012).

Czynnikiem oddziałującym na jakość jaj i wpływającym na zdrowie konsumentów jest

obecność drobnoustrojów. Mikroflorę jaj tworzą zarówno bakterie patogenne, takie jak

Salmonella i Campylobacter, będące przyczyną zatruć pokarmowych, jak również bakterie

powodujące psucie jaj (De Reu i in., 2006; Corry, 2007; Gantois i in., 2009). Dodatkowym

zagrożeniem jest możliwość przedostania ich przez pory skorupy do treści jaj (Baron

i Réhault, 2007). Wzrost i aktywność drobnoustrojów przyczynia się do zmian barwy białka

lub żółtka (Pseudomonas spp., Aeromonas spp., Enterobacter spp.), błony podskorupowej

(Flavobacterium spp. i Serratia spp.) oraz proteolizy białka i żółtka (Proteus spp.). W wyniku

namnożenia się mikroorganizmów, w białku jaja powstają związki, takie jak siarkowodór,

alkohole, aldehydy oraz amoniak, którego ilość jest wskaźnikiem świeżości jaj. Aktywność

Strona | 9

enzymatyczna drobnoustrojów prowadzi do zmian w wyglądzie, zapachu, smaku lub składzie

chemicznym jaj, a w konsekwencji warunkuje ich trwałość (Corry, 2007). Nie wszystkie

jednak bakterie rozwijające się w treści jaja powodują widoczne pogorszenie cech

organoleptycznych. Bakterie z rodzaju Citrobacter i Alcaligenes nie wywołują zmian cech

jakościowych nawet przy namnożeniu do poziomu 108 jtk/ml. Podobnie w przypadku wzrostu

pałeczek Salmonella, nie obserwuje się zmian wyglądu, zapachu i smaku treści jaj.

W ocenie zanieczyszczenia mikrobiologicznego jaj większe znaczenie przypisuje się

bakteriom, niż grzybom mikroskopowym. Należy jednak podkreślić, że zmiany wprowadzone

w sposobie chowu drobiu mogą ograniczać rozwój powszechnie występujących bakterii.

W wyniku ograniczonej konkurencji z ich strony, istnieje możliwość wzrostu mykobiota

i biosyntezy mykotoksyn, które już w niewielkich ilościach wykazują toksyczne działanie dla

ludzi i zwierząt. Mogą być wydzielane przez strzępki grzybni do środowiska zewnętrznego a

nawet uwalniać się po śmierci komórek grzybowych. Podkreślenia wymaga znaczna

stabilność termiczna wielu mikotoksyn, a także ich odporność na destrukcję czy dezaktywację

w trakcie stosowanych procesów technologicznych. Najnowsze badania wskazują na istotne

zagrożenie związane z zanieczyszczeniem powierzchni skorup jaj grzybami mikroskopowymi

(Gros i in., 2015). Dotychczas przedmiotem badań dotyczących występowania mykobiota

w jajach były przede wszystkim jaja wylęgowe. Warunki inkubacji (podwyższona wilgotność

powietrza i dyfuzja pary wodnej z treści jaj) sprzyjają rozwojowi grzybów mikroskopowych

bytujących na skorupie, co prowadzi do zanieczyszczenia zarodków grzybnią,

a w konsekwencji do ich zamierania (Harry i in. 1970; Girma i in. 2016). Mając na uwadze

opisane powyżej zagrożenia przeprowadzono badania dotyczące oceny poziomu

zanieczyszczenia mycobiota jaj konsumpcyjnych. Występowanie grzybów na powierzchni jaj

konsumpcyjnych oraz przerastanie strzępek grzybni przez skorupę i błony podskorupowe

zostało już wykazane w badaniach Szablewski i in. (2010b, 2015).

Głównymi czynnikami, które mogą znacząco wpłynąć na wyjściowe zanieczyszczenie

skorup jaj są warunki panujące na etapie pozyskiwania, takie jak jakość słomy oraz paszy,

obecność pyłu, temperatura oraz wilgotność powietrza. Mając na uwadze powyższe czynniki

można sądzić, że jaja pochodzące od niosek z chowów takich jak ściółkowy, przyzagrodowy,

a nawet ekologiczny są najbardziej narażone na zanieczyszczenia m.in. grzybami

mikroskopowymi. W tych systemach utrzymania kur niosek głównym źródłem

zanieczyszczenia jest ściółka. W badaniach nad różnymi jej rodzajami wykazano obecność

w ściółce grzybów z rodzaju Aspergillus, Cladosporium, Drechslera, Penicilium,

Stemphylium i Fusarium (Kokkonen i in., 2010; Rohweder i in., 2011; Stuper i in., 2014).

Strona | 10

Sieczka słomiasta charakteryzowała się najwyższą liczbą grzybów mikroskopowych (28,49

log JTK/g), jak również stężeniem ergosterolu (ERG) (605,74 mg/kg), zastosowanego w tym

przypadku jako chemiczny wskaźnik poziomu zanieczyszczenia mycobiota badanego

materiału (Stuper i in., 2014). Obecność mikroorganizmów powoduje zarówno degradację

podłoża, na którym się rozwijają oraz przyczynia się do występowania licznych chorób

związanych z obecnością zarodników w powietrzu. Najistotniejszym zagrożeniem

wynikającym z występowania grzybów mikroskopowych są wytwarzane przez niektóre

szczepy drugorzędowe metabolity wtórne - mykotoksyny. W literaturze przedmiotu często

wskazuje się na występowanie mykotoksyn w paszach wykorzystywanych do chowu zwierząt

gospodarskich (Sypecka i in., 2004). W Europie głównymi toksynami wykrytymi w próbach

paszy są deoksyniwalenol (DON) i toksyna T2 zaliczane do grupy trichotecenów oraz

zearalenon (ZON) (Binder i in., 2007). Udowodniono, że mykotoksyny z grupy trichotecenów

oraz zearalenon należą do toksycznych metabolitów gatunków Fusarium, których najbardziej

szkodliwe działanie stwierdzono po wprowadzeniu ich do organizmu drogą pokarmową, a nie

wziewną (Desjardins, 2006).

W związku z licznymi zagrożeniami występującymi w jajach opracowano szereg metod

obniżających początkowy poziom zanieczyszczenia ich skorup. W takich krajach jak USA,

Australia i Japonia przed dopuszczeniem ich do obrotu handlowego powszechnie stosuje się

zabieg mycia (Hutchison i in., 2003). Zastosowanie dodatkowo innych metod może

prowadzić do redukcji drobnoustrojów na powierzchni skorupy jaj, a w konsekwencji

spowolnienia procesów psucia się jaj. W tym celu wykorzystuje się również promieniowanie

jonizujące (Farkas 1998), promieniowanie UV (Coufal i in., 2003; Rodriguez-Romo i Yousef,

2005; Szablewski i in., 2010a), ozonowanie (Davies i Breslin, 2003; Rodriguez-Romo i

Yousef, 2005) oraz ultradźwięki (Cabeza, 2005). W takich przypadkach ważnym aspektem

jest ocena wpływu wybranych zabiegów higienizacji na wytrzymałość skorupy. Odpowiednia

jakość skorupy gwarantuje min. zabezpieczenie mechaniczne jaja, narażanego na uszkodzenia

w czasie magazynowania i dystrybucji.

Poszukuje się nowoczesnych, tanich i łatwych w aplikacji oraz skutecznych środków

o działaniu przeciwdrobnoustrojowym, które nie wykazują negatywnego wpływu na cechy

jakościowe jaj. Jednym z takich preparatów, który może być skuteczny w higienizacji

powierzchni skorup jaj konsumpcyjnych, jest nadtlenek wodoru. Przeciwdrobnoustrojowa

aktywność H2O2 opiera się na oksydacji białek. Jednoczesne zastosowanie jonów srebra może

zwiększyć efektywność zabiegu higienizacji, skracając czas ekspozycji preparatu

Strona | 11

na powierzchni jaj (Padron, 1995; Jung i in. 2008). Badania na ten temat nie były jednak

prowadzone w kontekście higienizacji powierzchni skorup jaj.

Poznanie czynników warunkujących wyjściowe zanieczyszczenie jaj, odpowiednich

warunków ich przechowywania oraz zastosowanie odpowiednich środków higienizujących

może przyczynić się do ograniczenia wzrostu grzybów mikroskopowych i wytwarzania przez

nie mykotoksyn.

Strona | 12

2. Hipotezy badawcze, cel nadrzędny i cele szczegółowe rozprawy

Hipotezy badawcze:

1. Sposób utrzymania kur niosek warunkuje zanieczyszczenie mykobiota jaj

konsumpcyjnych.

2. Warunki przechowywania jaj konsumpcyjnych wpływają na poziom i dynamikę wzrostu

mykobiota oraz biosyntezę mykotoksyn.

3. Rozwój mykobiota w treści jaj powoduje zmiany wewnętrznych cech jakościowych.

4. Zastosowanie preparatu H2O2 z jonami srebra stwarza możliwość ograniczenia

zanieczyszczenia mikrobiologicznego powierzchni jaj konsumpcyjnych z jednoczesnym

zachowaniem wymaganych cech mechanicznych skorup.

Cel rozprawy:

Nadrzędnym celem rozprawy była ocena wpływu warunków pozyskiwania

i przechowywania jaj konsumpcyjnych na poziom mykobiota, dynamikę ich wzrostu

i biosyntezę mykotoksyn oraz zabiegu higienizacji skorup jaj na ograniczenie ich

występowania.

Cele szczegółowe rozprawy obejmowały:

1. Identyfikacja mykobiota z jaj konsumpcyjnych pozyskanych z różnych systemów

utrzymania kur niosek,

2. Określenie wpływu poszczególnych czynników panujących na etapie pozyskiwania

i przechowywania jaj na poziom zanieczyszczenia grzybami mikroskopowymi,

wytwarzanie mykotoksyn oraz zmiany jakościowe zachodzące w jajach (badania

modelowe),

3. Określenie wpływu preparatu H2O2 z dodatkiem jonów srebra na zanieczyszczenie

mikrobiologiczne i wytrzymałość skorup jaj (badania modelowe).

Strona | 13

3. Wyniki badań

3.1 Charakterystyka mykobioty na powierzchni skorup jaj

konsumpcyjnych pozyskanych z różnych systemów utrzymania

kur niosek (doświadczenie 1)

Wyniki uzyskane w doświadczeniu 1 zostały opisane w publikacji:

Tomczyk Ł., Stępień Ł., Urbaniak M., Szablewski T., Cegielska-Radziejewska R., Stuper-

Szablewska K. 2018. Characterisation of the mycobiota on the shell surface of table eggs

acquired from different egg-laying hen breeding systems. Toxins. 10(7):293.

Zanieczyszczenie jaj konsumpcyjnych grzybami i ich metabolitami stanowiło do tej pory

nierozpoznany obszar badań. Problematyka badawcza przedstawiana dotychczas

koncentrowała się na występowaniu w jajach mikroflory bakteryjnej oraz mykotoksyn

transmitowanych z paszy przez układ pokarmowy do treści jaj (Prelusky i in., 1987; Prelusky

i in., 1989; Valenta oraz Dänicke, 2005; De Reu i in., 2006; Corry, 2007; Gantois i in., 2009;

Tangni i in., 2009). Dlatego też pierwszym etapem podjętych badań była identyfikacja

molekularna gatunków mykobiota obecnych na powierzchni skorup jaj konsumpcyjnych

pozyskanych z różnych systemów utrzymania kur niosek oraz analiza mykotoksyn w treści

jaj. Do badań wykorzystano jaja, poddane i nie poddane sterylizacji (kontrolne), pozyskane

z różnych systemów utrzymania niosek, takich jak: ekologiczny, przyzagrodowy, ściółkowy

i klatkowy. Zabieg sterylizacji powierzchniowej, skuteczny w usuwaniu przylegających

do skorupy drobnoustrojów, zastosowano w celu pozyskania izolatów również z porów

skorupy. Jaja przechowywano w zaprogramowanych warunkach wilgotności i temperatury,

jakie mogą występować na etapie ich magazynowania i dystrybucji.

Wykazano, że do grzybów najczęściej izolowanych z powierzchni skorup, należą:

Alternaria spp., Penicillium spp. i Chaetomium spp. Alternaria spp. zaliczane są do grzybów

zasiedlających głównie płody rolne w tym ziarno zbóż, o potencjale toksynotwórczym,

wytwarzające m.in. alternariol i kwas tenuazonowy (Zur i in., 2002). Zidentyfikowane

w ramach niniejszych badań gatunki z rodzaju Penicillium spp. przyspieszają psucie się jaj,

przyczyniając się do zmian jakościowych ich treści. Wyizolowane ze skorupy jaj grzyby

Chaetomium spp. należą do gatunków o zasięgu ogólnoświatowym i powszechnie występują

Strona | 14

w glebie, słomie, ziarnach zbóż oraz na powierzchni zawilgoconych budynków (Nielsen i in.,

1999; Fogle i in., 2007; Provost i in., 2013).

Uzyskane rezultaty wskazują, że największym zróżnicowaniem gatunkowym

charakteryzowała się populacja grzybów wyizolowanych z jaj pozyskanych od niosek

utrzymywanych w systemie ściółkowym. Najczęściej identyfikowane grzyby należały do

rodzaju Alternaria (5 gatunków). Wyizolowano również dwa gatunki grzybów z rodzaju

Fusarium. Z danych literaturowych wynika, że dotychczas nie wykazano ich obecności na

powierzchni skorup jaj. Na skutek przeprowadzonego zabiegu higienizacji jaj z powierzchni

skorup wyodrębniono również takie gatunki jak: Scopulariopsis brevicaulis, Trichothecium

roseum, Acrostalagmus luteoalbus, których nie stwierdzono na powierzchni skorup jaj

pozyskanych od niosek z innych systemów utrzymania. Różnorodność gatunków grzybów,

w tym również patogenicznych na powierzchni skorup jaj może być uwarunkowana

specyficznym mikroklimatem środowiska kurnika w systemie ściółkowym, który tworzą

min.: wysoka wilgotność i temperatura powietrza, słaba wentylacja pomieszczeń oraz

obecność zanieczyszczeń egzogennych tj.: ściółki, paszy oraz endogennych, np. pyłu (Gros

i in., 2015).

Dużą różnorodność gatunkową stwierdzono również wśród grzybów wyizolowanych z jaj

pozyskanych od niosek utrzymywanych w systemie przyzagrodowym. Na powierzchni

skorup stwierdzono patogeniczne gatunki tj. Alternaria i Fusarium, podobnie jak

w przypadku jaj pochodzących od niosek z systemu ściółkowego. W takim systemie

utrzymania niosek zróżnicowanie gatunkowe grzybów izolowanych z powierzchni jaj może

wynikać z ograniczonej możliwości kontroli warunków odchowu kur. Wraz z wolnym

dostępem ptaków do paszy (pełnowartościowej, jak i zielonki), ściółki oraz wybiegu wzrasta

zagrożenie wynikające z kontaktu niosek z patogenicznymi mikroorganizmami różnego

pochodzenia (Piskorska-Pliszczynska i in., 2014).

W systemie ekologicznym utrzymania niosek, populacja grzybów na powierzchni skorup

jaj ograniczała się do 10 gatunków, spośród których nie zidentyfikowano patogennych

gatunków z rodzaju Fusarium. Na skutek przeprowadzonego zabiegu higienizacji jaj z ich

powierzchni wyodrębniono większą populację gatunków grzybów. System ekologiczny

charakteryzuje ograniczona obsada niosek na m2, co przekłada się na efektywniejszą

możliwość kontroli warunków klimatycznych w kurniku. W sprzyjających warunkach

wilgotności i temperatury istnieje mniejsze ryzyko rozwoju patogenicznych gatunków

grzybów mikroskopowych.

Strona | 15

Populacja grzybów rozwijających się na powierzchni skorup jaj z systemu klatkowego jest

mniej liczna. Wśród zidentyfikowanych gatunków występowały tylko dwa o potencjale

toksynotwórczym. W wyniku sterylizacji jaj z powierzchni skorup wyizolowano gatunek

Engodontium album, występujący również w jajach pozyskanych od niosek z chowu

ściółkowego. Powyższy gatunek grzyba nie wykazuje zdolności biosyntezy mykotoksyn,

jednakże konsekwencją zainfekowania człowieka zarodnikami lub grzybnią może być

powstanie ropnia mózgu i zapalenie rogówki (Macêdo i in., 2007). Można przypuszczać,

że niewielka różnorodność grzybów pozyskiwanych z jaj niosek utrzymywanych w systemie

klatkowym wynika z warunków panujących w środowisku kurnika. Podczas projektowania

klatek umeblowanych uwzględniono nie tylko naturalne preferencje niosek, ale również

możliwość zapewnienia bezpieczeństwa produkowanych jaj (Wall i in. 2008; Holt i in.,

2011). Zaletą tego systemu w aspekcie bezpieczeństwa mikrobiologicznego jaj jest przede

wszystkim wyeliminowanie słomy, będącej potencjalnym wektorem patogenicznych

gatunków grzybów z pola.

Obecność grzybów Fusarium spp. na powierzchni skorup jaj stwarza zagrożenie

wystąpienia ich w treści jaj, co w konsekwencji prowadzić może do wytwarzania przez nie

mykotoksyn. Dlatego też w celu sprawdzenia potencjalnego zanieczyszczenia jaj

mykotoksynami oznaczono w nich zawartość trichotecenów z grupy A i B. Analizę

mykotoksyn wykonano wyłącznie dla białka jaja. Badania te oparto na wcześniejszych

doświadczeniach opisanych w pracy Szablewski i in. (2010b), gdzie po tygodniu

przechowywania jaj nie wykazano obecności grzybów w żółtku jaj. W świeżo zniesionych

jajach nie stwierdzono obecności mykotoksyn fuzaryjnych, co może wykluczyć transmisję

mykotoksyn z paszy przez układ pokarmowy do jaj. W próbach skorup jaj, w których

stwierdzono obecność F. culmorum w ich treści oznaczono zarówno trichoteceny z grupy A

i B. Dla tego gatunku charakterystyczne jest głównie wytwarzanie trichotecenów, takich jak

DON, 3-AcDON oraz NIV należących do grupy B (Desjardins, 2006; Scherm i in., 2013).

Natomiast obecność trichotecenów z grupy A może świadczyć o występowaniu takich

gatunków jak np. F. sporotrichioide (Kuzdraliński i in., 2017). W ramach niniejszych badań

nie zidentyfikowano jednak gatunków Fusarium wytwarzających trichoteceny z grupy A.

Wynika to prawdopodobnie z faktu, że analizie poddano wyłącznie żywe gatunki grzybów

rozwijające się na powierzchni skorup jaj. Po okresie przechowywania jaj patogeniczne

gatunki grzybów mikroskopowych mogły przerosnąć do treści jaj. Z kolei brak składników

odżywczych i mikroflory konkurencyjnej na powierzchni skorup jaj skutkował ich

obumieraniem. W niektórych próbach jaj zaobserwowano zjawisko odwrotne. Stwierdzono

Strona | 16

obecność potencjalnie toksynotwórczych szczepów grzybów mikroskopowych, natomiast nie

oznaczono mikotoksyn. W przeprowadzonych badaniach nie stwierdzono mikotoksyn

wytwarzanych przez F. equseti. Dane literaturowe wskazują, że biosynteza metabolitu tego

gatunku grzyba może być determinowana wystąpieniem stresogennych warunków

abiotycznych lub biotycznych co oznacza, że gatunek F. equseti jedynie w sprzyjających

warunkach jest zdolny do wytwarzania wybranych mykotoksyn z grupy trichotecenów

(Ciegler, 1978; Kuzdraliński i in., 2017). Wykazano zależność pomiędzy zawartością

mykotoksyn a rodzajem systemu utrzymania kur niosek. W białku jaj pochodzących od

niosek utrzymywanych w systemie ekologicznym i klatkowym zawartość mikotoksyn była

poniżej poziomu detekcji. W przypadku jaj z systemu ściółkowego i przyzagrodowego nie

wykazano różnic w stężeniu mikotoksyn.

Rezultaty przeprowadzonej analizy jakościowej grzybów wskazują, że skorupa jaj

konsumpcyjnych może stanowić potencjalne podłoże do wzrostu grzybów, w tym

patogennych i toksynotwórczych tj.: Fusarium i Alternaria. Wraz z czasem przechowywania

doszło do przerastania grzybów, w tym patogenicznych, przez skorupy jaj, a w konsekwencji

obecności mykotoksyn w białku jaj. Uzyskane wyniki pozwoliły potwierdzić postawioną

hipotezę o wpływie systemu utrzymania niosek na różnorodność gatunkową grzybów

w jajach konsumpcyjnych. Występujące na powierzchni skorup jaj gatunki grzybów

charakterystyczne są dla środowiska kurnika (Rohweder i in., 2011).

3.2 Wpływ różnych warunków panujących na etapie pozyskiwania

i przechowywania jaj na zmiany jakościowe, występowanie mykobiota

i mykotoksyn fuzaryjnych (doświadczenie 2)

Wyniki uzyskane w doświadczeniu 2 zostały opisane w publikacji:

Tomczyk Ł., Szablewski T., Stuper-Szablewska K., Nowaczewski S., Cegielska-

Radziejewska R. 2019. The influence of the conditions of acquisition and storage of table

eggs on changes in their quality and the presence of mycobiota and Fusarium mycotoxins.

Poultry Science. 98(7): 2964-2971.

W przypadku większości (ponad 90%) świeżo zniesionych jaj ich treść jest jałowa. Do

zanieczyszczenia powierzchni skorup dochodzi najczęściej w kurniku. Jednym z istotnych

elementów wpływających na poziom skażenia jaj jest sposób utrzymania kur niosek

Strona | 17

i warunkujący go charakterystyczny mikroklimat (Corry, 2007). Z kolei, dynamika wzrostu

drobnoustrojów związana jest ściśle z warunkami przechowywania jaj (Board i Tranter,

1995). W związku z powyższym wykonano badania mające na celu określenie wpływu

poszczególnych czynników panujących na etapie pozyskiwania i przechowywania jaj na

zawartość biomasy grzybowej, wytwarzanie trichotecenów z grupy B oraz zachodzące

w jajach zmiany jakościowe. Na podstawie oznaczenia w jajach ergosterolu, oceniono

potencjalne ich zanieczyszczenie grzybami. W badaniach analizie poddano jaja pozyskane od

niosek z różnych systemów chowu, takich jak ekologiczny, przyzagrodowy, ściółkowy

i klatkowy. Aby odwzorować zmienne warunki panujące na etapie przechowywania,

przeprowadzono badania modelowe, w których jaja przechowywano przez okres 4 tygodni

w programowanych warunkach wilgotności i temperatury powietrza.

Wykazano istotne statystycznie różnice cech jakościowych jaj przechowywanych

w różnych warunkach wilgotności i temperatury. Po upływie 4 tygodni ich przechowywania

w warunkach podwyższonej wilgotności (95%) i temperaturze (20°C) stwierdzono obniżenie

wartości indeksu żółtka, indeksu białka, indeksu Haugha odpowiednio o około 44,44%,

41,57%, 34,78%. Z kolei w przypadku jaj przechowywanych w warunkach chłodniczych

(8°C) wykazano spowolnienie zmian jakości i obniżenie ww. wyróżników odpowiednio

o 22,41%, 19,42% i 17,45%. Niekorzystne zmiany jakości jaj podczas przechowywania

spowodowane są rozkładem kwasu węglowego i jednoczesnym uwolnieniem dwutlenku

węgla i wody. W wyniku dyfuzji dwutlenku węgla dochodzi do wzrostu pH treści jaj.

W przeprowadzonych badaniach zastosowanie warunków chłodniczych o obniżonej

wilgotności powietrza spowodowało spowolnienie postępowania tych procesów. Podobne

rezultaty uzyskano również w badaniach innych autorów (Jin i in. 2011; Eke i in., 2013; Jones

i in., 2018).

Stwierdzono, że sposób utrzymania niosek różnicuje dynamikę zmian cech jakościowych

jaj. Najszybszym tempem zmian jakościowych charakteryzowały się jaja pozyskane od niosek

utrzymywanych w systemie ściółkowym i przyzagrodowym, co może być wynikiem

charakterystycznego mikroklimatu środowiska kurnika, który tworzą min.: wysoka

wilgotność oraz temperatura powietrza, zanieczyszczenia egzogenne tj.: ściółka, pasza oraz

endogenne tj.: pył (Gros i in., 2015).

Na podstawie przeprowadzonej analizy stwierdzono, że stężenie ERG w skorupie jak

i w treści świeżo zniesionych jaj było poniżej poziomu detekcji. Obecność grzybów

na powierzchni skorup jaj stwierdzono po pierwszym tygodniu ich przechowywania.

W wyniku przeprowadzonej analizy estymacji nieliniowej wykazano istotny statystyczny

Strona | 18

wzrost grzybów na powierzchni skorup jaj po upływie 3 tygodni przechowywania,

niezależnie od przyjętych warunków przechowywania. Po 4 tygodniach przechowywania jaj,

stężenie ERG oznaczone w jajach pozyskanych od niosek z chowu przyzagrodowego było

najwyższe i kształtowało się w zakresie (0.79-4.06 mg/kg), co można tłumaczyć ograniczoną

kontrolą warunków odchowu. Wraz z wolnym dostępem ptaków do paszy

(pełnowartościowej, jak i zielonki), ściółki oraz wybiegu, wzrasta zagrożenie wynikające z

kontaktu niosek z mikroorganizmami różnego pochodzenia (Piskorska-Pliszczynska i in.,

2014). Ponadto wykazano, że podwyższona wilgotność (95%) oraz temperatura (20°C)

przechowywania stanowią optymalne warunki do wzrostu grzybów w treści jaj.

Prawdopodobnie jest to konsekwencją wysychania i kurczenia się kutikuli w podwyższonej

temperaturze, co prowadzi do zwiększenia rozmiaru porów skorupy i ułatwia drobnoustrojom

przedostanie się do treści jaj (Eke i in., 2013). Wysokie stężenie ERG stwierdzono również

w jajach pozyskanych od niosek utrzymywanych w systemie ściółkowym. W białku jaj

pozyskanych od niosek utrzymywanych w tym systemie po pierwszym tygodniu ich

przechowania nie stwierdzono obecności grzybów, niezależnie od przyjętych warunków. Po 2

i 4 tygodniach przechowywania jaj stężenie ergosterolu wzrosło średnio 2 krotnie, co oznacza

że bezpośredni kontakt jaj ze słomą podczas ich znoszenia stwarza wysokie ryzyko

zanieczyszczenia skorup grzybami mikroskopowymi. Niższe stężenie ergosterolu stwierdzono

w jajach pochodzących od niosek z ekologicznego systemu utrzymania. System ten cechuje

ograniczona obsada niosek, co przekłada się na efektywną możliwość kontroli warunków

klimatycznych w kurniku. Najniższe wartości ERG wykazano w przypadku białka jaj

pozyskanego od niosek z systemu klatkowego. Warunki charakterystyczne dla środowiska

kurnika w klatkowym systemie chowu niosek wpływają na ograniczenie populacji grzybów

na powierzchni skorup jaj. Odchody oraz wszelkie inne nieczystości są na bieżąco usuwane

przez specjalne, ruchome taśmy, dzięki czemu możliwe jest utrzymanie względnie wysokiej

czystości kurnika. Zaletą tego systemu w aspekcie bezpieczeństwa mikrobiologicznego jaj

jest niestosowanie słomy, będącej potencjalnym wektorem patogenicznych gatunków

grzybów z pola (Wall i in., 2008; Holt i in., 2011).

Obecność grzybów mikroskopowych na powierzchni skorup oraz w białku jaj stwarza

ryzyko wystąpienia mykotoksyn. W strefie klimatu umiarkowanego główny problem

stanowią grzyby z rodzaju Fusarium. Wytwarzane przez nie trichoteceny należą do

mykotoksyn najczęściej występujących w ziarnie zbóż oraz produktach ich przerobu. W celu

sprawdzenia potencjalnego zanieczyszczenia jaj mykotoksynami oznaczono w nich stężenie

trichotecenów z grupy B. Analizę mykotoksyn podobnie jak analizę grzybów

Strona | 19

mikroskopowych wykonano jedynie dla białka jaj. Brak mykotoksyn w świeżo zniesionych

jajach wskazuje na brak transmisji mykotoksyn fuzaryjnych z paszy przez układ pokarmowy

do treści jaj. W czasie przechowywania jaj oznaczono w nich jednak mykotoksyny. Istotną

zwiększoną biosyntezę mikotoksyn w treści jaj wykazano po 2 tygodniu ich przechowywania.

W przeprowadzonych badaniach nie stwierdzono istotnego wpływu temperatury

przechowywania na wytwarzanie mykotoksyn. Wykazano natomiast istotność wilgotności

powietrza w trakcie przechowywania jaj na biosyntezę mykotoksyn przez grzyby

mikroskopowe.

Na podstawie analizy składowych głównych (PCA) wykazano ujemną korelację pomiędzy

wyróżnikami jakościowymi, a stężeniem mykotoksyn i ERG w jajach. Wraz ze wzrostem

stężenia ERG i mykotoksyn w jajach stwierdzono pogorszenie ich cech jakościowych.

Otrzymano też ujemną korelację pomiędzy stężeniem mykotoksyn, a pH białka i systemem

utrzymania niosek. Stwierdzono, że stężenie ERG na powierzchni i w treści oraz stężenie

mykotoksyn są dodatnio skorelowane z wilgotnością powietrza. Dodatnią korelację wykazano

również pomiędzy temperaturą przechowywania, a zmianami cech jakościowych.

W ramach niniejszych badań wykazano istotne zróżnicowanie zmian cech jakościowych

jaj w zależności od systemu utrzymania kur niosek i warunków panujących podczas ich

przechowywania. W jajach pozyskanych od niosek z systemu przyzagrodowego

i ściółkowego niekorzystne zmiany wyróżników jakościowych były najszybsze. Po tygodniu

przechowywania stwierdzono przerastanie grzybów do treści jaj. Podwyższona wilgotność

i temperatura podczas przechowywania jaj przyczynia się do dynamicznego rozwoju grzybów

w treści jaj. Na podstawie analizy PCA wykazano zależność pomiędzy ERG a stężeniem

trichotecenów w białku jaj. Obecność mikotoksyn w treści jaj świadczy o występowaniu

w nich patogenicznych gatunków grzybów mikroskopowych. W białku jaj z systemu

klatkowego oznaczono najmniejsze stężenie mykotoksyn. Uzyskane wyniki potwierdzają

hipotezę o istotności wpływu systemu utrzymania kur niosek na wyjściowe zanieczyszczenie

skorup jaj. Warunki podczas przechowywania jaj wpływają na wzrost grzybów

na powierzchni skorup jaj, dynamikę przerastania ich do treści jaj i wytwarzanie mikotoksyn.

Strona | 20

3.3 Ocena wpływu preparatu nadtlenku wodoru z dodatkiem jonów srebra na

stan skorupy jaj konsumpcyjnych (doświadczenie 3)

Wyniki uzyskane w doświadczeniu 3 zostały opisane w publikacji:

Tomczyk Ł., Szablewski T., Cegielska-Radziejewska R., Lewko L., Konieczny P. 2018. An

assessment of the influence of silver stabilized hydrogen peroxide on the eggshell condition.

Emirates Journal of Food and Agriculture. 30(2): 131-136.

Środowisko kurnika w znaczący sposób kształtuje zanieczyszczenie mikrobiologiczne jaj,

a nieodpowiednie warunki magazynowania i dystrybucji mogą przyspieszyć rozwój

mikroflory. Istnieje zatem konieczność poprawy stanu mikrobiologicznego powierzchni

skorup jaj, przy zachowaniu jej cech mechanicznych. Dlatego też w prowadzonych badaniach

oceniono stan skorupy jaj konsumpcyjnych higienizowanych preparatem H2O2 z jonami

srebra. Jaja poddano działaniu roztworu preparatu i przechowywano przez okres 4 tygodni.

Przeprowadzono analizę mikrobiologiczną, która obejmowała oznaczenie ogólnej liczby

bakterii tlenowych, drożdży i pleśni, bakterii z rodzaju Psudomanas oraz z rodziny

Enterobacteriaceae na powierzchni skorup jaj. Wykonano także pomiary odkształcenia

elastycznego skorupy jaj, ze względu na istotność wytrzymałości skorupy w obrocie

handlowym.

Rezultaty przeprowadzonych badań mikrobiologicznych wskazują na efektywne działanie

H2O2 z jonami srebra wobec testowanych grup drobnoustrojów. Zabieg higienizacji jaj

w roztworach 0.1-0.9 % nadtlenku wodoru i jonów srebra spowodował całkowitą inaktywację

bakterii z rodziny Enterobacteriaceae oraz drożdży i pleśni, czego rezultatem był brak ich

wzrostu w okresie 4 tygodni przechowywania. Podobne wyniki dotyczące wpływu H2O2

na bakterie z rodziny Enterobacteriaceae otrzymano w badaniach Padron (1995), jednakże

w tym przypadku redukcję liczby bakterii uzyskano stosując wyższe stężenia nadtlenku

wodoru (6%). Skuteczność działania znacznie niższych stężeń preparatu wobec tej grupy

bakterii związana jest prawdopodobnie z obecnością w nim jonów srebra. Wskazuje się,

że srebro w postaci jonowej lub nanocząstek wykazuje silne działanie

przeciwdrobnoustrojowe (Choi i in., 2008; Rai i in., 2008). W przypadku preparatu o stężeniu

0.3% liczba bakterii tlenowych i bakterii z rodzaju Pseudomonas obniżyła się istotnie

statystycznie odpowiednio o 1.9 i 0.7 log jtk/g. Po 4 tygodniach przechowywania jaj

stwierdzono, że wzrost stężenie preparatu powyżej 0.3% nie przyczyniał się do istotnej

statystycznie redukcji liczby drobnoustrojów. Zastosowanie najwyższego stężenia preparatu

Strona | 21

0.9% pozwoliło obniżyć liczbę bakterii tlenowych i bakterii z rodzaju Pseudomonas

odpowiednio o 1.8 i 1.7 cyklu log na powierzchni jaj przechowywanych przez 4 tygodnie.

Redukcję zanieczyszczenia mikrobiologicznego na powierzchni jaj wylęgowych uzyskano

w badaniach Sheldon i in. (1991) stosując 5% roztwór nadtlenku wodoru bez udziału jonów

srebra.

Nie wykazano istotnego statystycznie wpływu działania niskich stężeń preparatu zakresie

od 0.01-0.9% na stan skorupy bezpośrednio po jego zastosowaniu jak równiej po 4

tygodniach przechowywania jaj. Spadek wytrzymałości skorupy jaj po 4 tygodniach ich

przechowywania stwierdzono natomiast w przypadku prób jaj poddanych higienizacji

preparatem o wyższych stężeniach 1-3%. Obserwowane zmiany odkształcenia elastycznego

mogą być wynikiem reakcji preparatu H2O2 z jonami srebra z zewnętrzną warstwą skorupy

zbudowanej prawie wyłącznie z węglanu wapnia.

Liczne zabiegi którym poddawane są jaja podczas procesu pozyskiwania, magazynowania

i dystrybucji, wymagają wytrzymałej, elastycznej skorupy. Stwierdzono, że wybór

odpowiedniego systemu chowu kur niosek oraz sposób układania i pakowania jaj

konsumpcyjnych stanową krytyczne punkty w zapewnieniu nienaruszonej skorupy (Martens

i in., 2006). W badaniach Batkowskiej i in. (2014) większą odporność skorupy jaj

na uszkodzenia uzyskano stosując zabieg ich mycia poprzez zanurzenie w wodzie

o temperaturze 10-21°C. Stwierdzono, że szybsza dyfuzja pary wodnej z treści jaj przyczynia

się do uelastycznienia skorupy. Wykazano natomiast negatywny wpływ podchlorynu sodu

zawierającego wolny chlor na zewnętrzną strukturę skorupy jaj.

W przyjętych warunkach doświadczenia (5 minut zanurzenie w roztworach o stężeniach do

0.9%) zabieg higienizacji jaj preparatem H2O2 z jonami srebra nie wpływał na pogorszenie

wytrzymałości ich skorup. Najskuteczniejszy efekt higienizujący zaobserwowano stosując

roztwór badanego preparatu H2O2 z jonami srebra o stężeniu 0.3%, co zapewniło istotną

redukcję liczby wytypowanych drobnoustrojów na skorupie jaj. Efekt higienizujący

obserwowano bezpośrednio po zabiegu jak i w czasie 4 tygodniowego przechowywania.

Uzyskane wyniki badań wskazują, że zastosowanie preparatu H2O2 z jonami srebra zapewnia

skuteczną poprawę czystości mikrobiologicznej jaj i jest zabiegiem bezpiecznym dla

zachowania wymaganych cech mechanicznych skorupy.

Strona | 22

4. Wnioski

1. W zależności od warunków utrzymania kur niosek występuje zróżnicowanie jakościowe i

ilościowe populacji mykobiota na powierzchni skorup jaj konsumpcyjnych. Największe

zróżnicowanie oraz ilość grzybów mikroskopowych na powierzchni skorup wykazano dla

jaj pozyskanych od niosek utrzymywanych w systemie ściółkowym i przyzagrodowym.

2. Wśród wyizolowanych z powierzchni skorup jaj grzybów mikroskopowych,

zidentyfikowano toksynotwórcze gatunki patogeniczne, w tym Fusarium culmorum

i Fusarium equseti.

3. System utrzymania niosek, temperatura i wilgotność powietrza oraz czas

przechowywania jaj mają istotny wpływ na zawartość mykobiota na powierzchni skorup i

w białku jaj. Stwierdzono, że podwyższona temperatura i wilgotność powietrza stanowią

szczególnie sprzyjające warunki do wzrostu grzybów mikroskopowych na powierzchni

skorup jaj oraz w ich treści.

4. Zawartość mykotoksyn w białku jaj zależy od czasu przechowywania i wilgotności

powietrza. Podczas przechowywania jaj w warunkach podwyższonej wilgotności

wykazano wzmożoną produkcję mykotoksyn.

5. Warunki przechowywania jaj: czas, temperatura i wilgotność powietrza oraz zawartość

grzybów mikroskopowych wpływają na cechy jakościowe jaj.

6. Zastosowanie preparatu H2O2 z jonami srebra do higienizacji jaj konsumpcyjnych

pozwala zredukować zanieczyszczenie mikrobiologiczne skorup jaj przy braku

niekorzystnego wpływu na ich wytrzymałość.

Strona | 23

5. Bibliografia

Agri, E.C.D. Eggs. https://ec.europa.eu/agriculture/eggs_es (Dostępny w Internecie:

29.07.2019)

Al-Hajo N. N., Zangana B. S., Al-Janabi L.A., Al-Khalani M. H. F. 2012. Effect of coating

materials (gelatin) and storage timeon internal quality of chicken and quail eggs under

refrigerated storage. Egypt. Poult. Sci. J. 32:107–115.

Baron R., Réhault S. 2007. Bioactive Egg Compounds: Compounds with antibacterial

activity. Berlin (BE): Springer.

Batkowska J., Brodacki A. 2014. Wpływ mycia skorupy na wybrane cechy jakości jaj

kurzych w czasie przechowywania. ZYWN-NAUK TECHNOL JA. 93: 204-213.

Binder, E. M., Tan L. M., Chin L. J., Handl J., Richard J. 2007. Worldwide occurrence of

mycotoxins in commodities, feeds and feed ingredients. Anim. Feed Sci. Technol. 137: 265–

282.

Board R.G., Tranter H.S. 1995. The microbiology of eggs. W: Egg science and technology.

Red. J. Standelman, O.J. Cotteril. New York: Food Products Press –The Haworth Press, Inc.,

81-104.

Cabeza C.M., García M.M., Hoz L., Cambero I. 2005. Thermoultrasonication eliminates

salmonellae from intact eggshells without changing the functional properties of their

components. J. Food Sci. 70(6): 292–295.

Campo J.L., Garcia G. M., Muńdoz I., Alonso M. 2000. Effects of breed, hen age, and storage

on the indirect prediction of the albumen quality. Arch. Geflugelkd. 64 (3): 109-114.

Choi O. K.K., Deng N.J., Kim L. Jr., Ross R.Y, Surampalli Z. Hu. 2008. The inhibitory

effects of silver nanoparticles, silver ions, and silver chloride colloids on microbial growth.

Water Res. 42(12): 3066-3074.

Ciegler A. 1978. Fungi that produce mycotoxins, Conditions and occurrence.

Mycopathologia. 65: 5–11.

Strona | 24

Corry J. E. L. 2007. Microbiological analysis of eggs and egg products. W: Microbiological

analysis of red meat, poultry and eggs. Red. G. C. Mead. CRC Press Cambridge England.

182-187.

Coufal C.D., Chavez C., Knape K.D., Carey J.B. 2003. Evaluation of a method of ultraviolet

light sanitation of broiler hatching eggs. Poult. Sci. 82(5): 754-9.

Davies, R.H., Breslin M. 2003. Investigations into possible alternative decontamination

methods for Salmonella enteritidis on the surface of table eggs. J. Vet. Med. B Infect. Dis.

Vet. Public Health. 50(1): 38-41.

De Reu, K., K. Grijspeerdt, M. Heyndrickx, M. Uyttendaele, J. Debevere, and L. Herman.

2006. Bacterial shell contamination in the egg collection chains of different housing systems

for laying hens. Br. Poult. Sci. 47(2):163-72.

Desjardins A.E. 2006. Fusarium mycotoxins chemistry, genetics and biology. ASP Press;

Eagan, MN, USA.

Eke, M.O., Olaitan N.I., Ochefu J.H. 2013. Effect of Storage Conditions on the Quality

Attributes of Shell (Table) Eggs. NIFOJ. 31(2):18- 24.

FAOSTAT. Production: Livestock Primary: Hen Eggs in Shell. 2017.

http://fenixservices.fao.org/faostat/static/documents/EI/EI_e.pdf (Dostępny w Internecie:

02.07.2019)

Farkas J. 1998. Irradiation as a method for decontaminating food. A review. Int. J. Food

Microbiol. 44(3): 189-204.

Fogle M.R., Douglas D.R., Jumper C.A., Straus D.C. 2007. Growth and mycotoxin

production by Chaetomium globosum. Mycopathologia. 164: 49-56.

Gantois I., Ducatelle R., Pasmans F., Haesebrouck F., Gast R., Humphrey T.J., Van

Immerseel F. 2009. Mechanisms of egg contamination by Salmonella Enteritidis. FEMS

Microbiol. Lett. 33: 718–738.

Girma G., Abebaw M., Zemene M., Mamuye Y., Getaneh G. 2016. A Review on

Aspergillosis in Poultry. J. Vet. Sci. Tech. 7: 382.

Strona | 25

Gros R.V., Nichita I., Șereș M., Ilie M.S., Marcu A., Cucerzan A., Tîrziu E. 2015. Study of

the fungi dynamics in a poultry house with permanent litter. Lucr. St. Med. Vet. 48: 257-262.

Halaj M., Halaj P., Golian J., Valaśek F., Moravićik F., Melen M. 2000. The influence of

storage time and temperature on weight loss in eggs and yolk pigmentation. Acta Fytotechn.

Zootechn. 3(2):52-54.

Harry E.G., Cooper D.M. 1970. The treatment of hatching eggs for the control of egg

transmitted aspergillosis. Br. Poult. Sci. 11: 269-272.

Holt P.S., Davies R.H., Dewulf J., Gast R.K., Huwe J.K., Jones D.R., Waltman D., Willian

K.R. 2011. The impact of different housing systems on egg safety and quality. Poult. Sci. 90,

251–262.

Hutchison M., Gittins J., Walker A., Moore A. 2003. Washing table eggs: a review of the

scientific and engineering issues. Worlds Poult Sci J. 59(2): 233-248.

Jin Y. H., Lee K. T., Lee W. I., Han K. 2011. Effects of storage temperature and time on the

quality of eggs from laying hens at peak production. Asian-Australas J. Anim. Sci. 24:279–

284.

Jones D. R., Ward G. E., Regmi P., Karcher D. M. 2018. Impact of egg handling and

conditions during extended storage on egg quality. Poult. Sci. 97:716–723.

Jung W. K., Koo H. C., Kim K. W., Shin S., Kim S. H., Park. Y. H. 2008. Antibacterial

activity and mechanism of action of the silver ion in Staphylococcus aureus and Escherichia

coli. Appl. Environ. Microbiol. 74(7): 2171-2178

Kokkonen M., Ojala L., Parikka P., Jestoi M. 2010. Mycotoxin production of selected

Fusarium species at different culture conditions. Int. J. Food Microbiol. 30,143(1-2): 17-25.

Kuzdraliński A., Nowak M., Szczerba H., Dudziak K., Muszyńska M., Leśniowska-Nowak. J.

2017. The composition of Fusarium species in wheat husks and grains in south-eastern

Poland. J. Integr. Agric. 16, 1530-1536.

Macêdo D.P.C., Neves R.P., De Souza-Motta C.M., Magalhães O.M.C. 2007. Engyodontium

album fungaemia, the first reported case. Braz. J. Microbiol. 38, 110-112.

Strona | 26

Mertens K., Bamelis F., Kemps B., Kamers B., Verhoelst E., Ketelaere B. D., Bain M.,

Decuypere E., De Baerdemaeker J. 2006. Monitoring of eggshell breakage and eggshell

strength in different production chains of consumption eggs. Poult. Sci. 85(9): 1670-1677.

Nielsen K.F., Gravesen S., Nielsen P.A., Andersen B., Thrane U., Frisvad J.C. 1999.

Production of mycotoxins on artificially and naturally infested building materials.

Mycopathologia. 145, 43-56.

Niewiarowicz, A. 1991. Budowa, skład chemiczny, właściwości fizykochemiczne i

funkcjonalne oraz wartość odżywcza jaj. Technologia jaj. red. A. Płotka. s.101-196, WNT,

Warszawa.

Padron M. 1995. Egg dipping in hydrogen peroxide solution to eliminate Salmonella

typhimurium from eggshell membranes. Avian Dis. 39(3):627-630.

Piskorska-Pliszczynska J., Mikolajczyk M., Warenik-Bany M., Maszewski S. Strucinski P.

2014. Soil as a source of dioxin contamination in eggs from free-range hens on a Polish farm.

Sci. Total. Environ. 145, 43-56.

Prelusky D.B., Trenholm H.L., Hamilton R.M.G., Miller J.D. 1987. Transmission of [14

C]

Deoxynivalenol to Eggs following Oral Administration to Laying Hens. J. Agric. Food Chem.

35, 182-186.

Prelusky D.B., Hamilton R.M.G., Trenholm H.L. 1989. Transmission of Residues to Eggs

Following Long-Term Administration of 14C-Labelled Deoxynivalenol to Laying Hens.

Poult. Sci. 68, 744-8.

Provost N., Shi C., She Y., Cyr T., Miller D. 2013. Characterization of an antigenic

chitosanase from the cellulolytic fungus Chaetomium globosum. Med. Mycol. 51, 290-299.

Rai M., Yadav A., Gade A. 2008. Silver nanoparticles as a new generation of antimicrobials.

Biotechnol. Adv. 27(1): 76-83.

Rodriguez-Romo L.A., Yousef A.E. 2005. Inactivation of Salmonella enterica serovar

Enteritidis on shell eggs by ozone and UV radiation. J. Food Prot. 68(4): 711-717.

Rohweder D., Valenta H., Sondermann S., Schollenberger M., Drochner W., Pahlow G., Döll

S., Dänicke. S. 2011. Effect of different storage conditions on the mycotoxin contamination of

Fusarium culmorum-infected and non-infected wheat straw. Mycotoxin Res. 27, 145-153.

Strona | 27

Rozporządzenie Komisji (WE) nr 589/2008 z dnia 23 czerwca 2008 r. ustanawiające

szczegółowe zasady wykonywania rozporządzenia Rady (WE) nr 1234/2007 w sprawie norm

handlowych w odniesieniu do jaj.

Scherm B., Balmas V., Spanu F., Pani G., Delogu G., Pasquali M., Migheli Q. 2013.

Fusarium culmorum, causal agent of foot and root rot and head blight on wheat. Mol. Plant

Pathol.14, 323-341.

Sheldon B.W., Brake J. 1991. Hydrogen peroxide as an alternative hatching egg disinfectant.

Poult. Sci. 70(5): 1092-1098.

Silversides F., Scott T. 2001. Effect of storage and layer age on quality of eggs from two lines

of hens. Poult. Sci. 80:1240-1245.

Stuper-Szablewska K., Szablewski T., Cegielska-Radziejewska R., Ostrowska A., Matysiak

A., Perkowski J. 2014. Contamination of different kind of litter by microscopic fungi from

hen house. Apar. Bad. Dydakt. 2:199-204.

Sypecka Z., Kelly M., Brereton P. 2004. Deoxynivalenol and zearalenone residues in eggs of

laying hens fed with a naturally contaminated diet, effects on egg production and estimation

of transmission rates from feed to eggs. J. Agric. Food Chem. 25, 5463-5471.

Szablewski T., Kijowski J., Cegielska-Radziejewska R., Dziedzic A. Kamińska A. 2010a.

Wpływ promieniowania UV na stan mikrobiologiczny skorupy oraz jakość treści jaj. ZYWN-

NAUK TECHNOL JA. 2(63): 40-52.

Szablewski T., Stuper K., Cegielska-Radziejewska R., Kijowski J. Perkowski J. 2010b.

Ergosterol as an indicator of the presence of microscopic fungi in eggs for human

consumption produced in different husbandry systems. Poult. Sci. 89(11): 2491-3

Szablewski T., Tomczyk Ł., Cegielska-Radziejewska R. 2015. Characterization of fungal

microflora isolated from table eggs. Apar. Bad. Dydakt. 1:8–11

Tangni E.K., Waegeneersa N., Van Overmeireb I., Goeyensb L., Pussemier L. 2009.

Mycotoxin analyses in some home produced eggs in Belgium reveal small contribution to the

total daily intake. Sci. Total Environ. 407, 4411-4418.

Valenta H., Dänicke S. 2005. Carry-over of deoxynivalenol into eggs of laying hens -

Preliminary results. Mycotoxin Res. 21, 136-138.

Strona | 28

Wall H., Tauson R., Sorgjerd S. 2008. Bacterial contamination of eggshells in furnished and

conventional cages. J. Appl. Poult. Res. 17, 11–16.

Zur G., Shimoni E., Hallerman E., Kashi Y. 2002. Detection of Alternaria fungal

contamination in cereal grains by a polymerase chain reaction-based assay. J. Food Prot. 65,

1433-1440.

Strona | 29

6. ANEKS

I. Wykaz publikacji stanowiących przedmiot rozprawy doktorskiej

1. Tomczyk Ł., Stępień Ł., Urbaniak M., Szablewski T., Cegielska-Radziejewska R.,

Stuper-Szablewska K. 2018. Characterisation of the Mycobiota on the Shell Surface of

Table Eggs Acquired from Different Egg-Laying Hen Breeding Systems. Toxins.

10(7):293.

if2018=3,895; 35 pkt MNiSW

Udział procentowy:

Tomczyk Ł. 50%, Stępień Ł. 10%, Urbaniak M. 10%, Szablewski T. 10%, Cegielska-

Radziejewska R. 10%, Stuper-Szablewska K. 10%.

2. Tomczyk Ł., Szablewski T., Stuper-Szablewska K., Nowaczewski S., Cegielska-

Radziejewska R. 2019. The Influence of the Conditions of Acquisition and Storage of

Table Eggs on Changes in Their Quality and the Presence of Mycobiota and Fusarium

Mycotoxins. Poultry Science. 98(7): 2964-2971.

if2018=2,027; 40 pkt MNiSW

Udział procentowy:

Tomczyk Ł. 60%, Szablewski T. 10%, Stuper-Szablewska K. 10%, Nowaczewski S.

10%, Cegielska-Radziejewska R. 10%,

3. Tomczyk Ł., Szablewski T., Cegielska-Radziejewska R., Lewko L., Konieczny P.

2018. An Assessment of the Influence of Silver Stabilized Hydrogen Peroxide on the

Eggshell Condition. Emirates Journal of Food and Agriculture. 30(2): 131-136.

if2018=0,609; 20 pkt MNiSW

Udział procentowy:

Tomczyk Ł. 60%, Szablewski T. 10%, Cegielska-Radziejewska R. 10%, Stuper-

Szablewska K. 10%, Konieczny P. 10%.

Łącznie: if2018=6,531; MNiSW2016=95

We wszystkich pracach jestem pierwszym autorem i autorem korespondencyjnym.

Dla powyższych publikacji ilość punktów odpowiada punktacji czasopism

umieszczonych na liście MNiSW z dnia 12.12.2016 roku.

Praca powstała w wyniku realizacji projektu badawczego o nr 2012/07/D/NZ9/01004

finansowanego ze środków Narodowego Centrum Nauki

Strona | 30

II. Publikacje stanowiące przedmiot rozprawy doktorskiej

toxins

Article

Characterisation of the Mycobiota on the ShellSurface of Table Eggs Acquired from DifferentEgg-Laying Hen Breeding Systems

Łukasz Tomczyk *, Łukasz Stepien ID , Monika Urbaniak, Tomasz Szablewski,Renata Cegielska-Radziejewska and Kinga Stuper-Szablewska

Department of Food Safety and Quality Management, Poznan University of Life Sciences, 60-624 Poznan,Poland; lste@igr.poznan.pl (Ł.S.); murb@igr.poznan.pl (M.U.); tomasz.szablewski@up.poznan.pl (T.S.);renatara@au.poznan.pl (R.C.-R.); kinga.stuper@up.poznan.pl (K.S.-S.)* Correspondence: tomczyk@up.poznan.pl

Received: 14 June 2018; Accepted: 14 July 2018; Published: 16 July 2018�����������������

Abstract: Microbial safety is an important factor contributing to the egg quality. During eggacquisition, there is significant risk of contamination of the eggshell surface with microscopic fungi.Mycelial hyphae may grow on the eggshell surface and penetrate into the egg content. However, thereis no information on the populations of microscopic fungi on the eggshell surface and, consequently,on possible production of mycotoxins. Therefore, the aim of the study was to identify the species ofmicroscopic fungi present on the eggshell surface acquired from different breeding systems and tomeasure the number of selected mycotoxins. The qualitative analysis resulted in the identification of41 isolates on the surface of eggs. There were 7 isolates from the organic production system, 11 fromthe free-range production system, 14 from the deep litter indoor housing system and 9 from thecage farming production system. The research proved that the diversification in the population ofmycobiota on the eggshells depended on the egg-laying hen breeding system. The microscopic fungiisolated from the eggshells included toxigenic and pathogenic species such as Fusarium culmorumand F. equiseti. As the egg storage time increased, fungi, including the pathogenic species, penetratedthrough the eggshells. In consequence, mycotoxins were identified in the egg whites. Type-A andtype-B trichothecenes were found in the eggshell samples containing F. culmorum.

Keywords: eggs; hen breeding systems; microscopic fungi; mycotoxins

Key Contribution: Fungal species isolated from eggshells differed among egg-laying hen housingsystems. Microscopic fungi isolated from the eggshells included toxigenic and pathogenic species.

1. Introduction

Eggs are important food all over the world. Following China, the European Union is the secondlargest producer of eggs for consumption—its share in the global production amounts to about 10% [1].Due to the high consumption of eggs it is important to guarantee high standards of consumer safetyduring production process. Therefore, scientists are conducting research to identify potential risks toconsumers’ health. Most of their attention is concentrated on the bacterial microflora [2–4]. However,latest studies point out a threat caused by the eggshell contamination with microscopic fungi [5]. So far,the problem of mycobiota has been studied on hatching eggs. The conditions of incubation (high airhumidity and diffusion of vapour from egg content) favour the development of microscopic fungi oneggshells. In consequence, embryos become contaminated with mycelium and they die [6,7]. Due tothese risks, also table eggs were subjected to investigations. It was already proven that the shells of

Toxins 2018, 10, 293; doi:10.3390/toxins10070293 www.mdpi.com/journal/toxins

Toxins 2018, 10, 293 2 of 10

table eggs become contaminated with fungi and that mycelial hyphae penetrate through eggshellmembranes [8].

Eggshell contamination may be initiated due to the conditions of egg acquisition, that is,the quality of straw and feed, the presence of dust, temperature and moisture. We can supposethat the eggs produced in the deep litter indoor housing, free-range or even organic systems are atthe highest risk of contamination with microscopic fungi. In the deep litter indoor housing system,the contamination is usually caused by moist litter or dirty nests. Researchers studying differenttypes of litter found that it contained fungi from Aspergillus, Cladosporium, Drechslera, Penicillium,Stemphylium and Fusarium genera [9–11]. Straw chaff was found to be the most contaminated as itsCFU/g was the highest (28.49 log CFU/g). It also displayed the highest concentration of ergosterol(ERG) (605.74 mg/kg), which is a chemical indicator of material contamination with microscopicfungi [11]. Fungi not only degrade the substrate on which they occur but they also cause numerousdiseases due to the presence of spores in the air [12].

Mycotoxins, which are secondary metabolites produced by some fungal strains, are the greatestrisk caused by microscopic fungi, particularly in feeds used for breeding farm animals [13]. The contentof mycotoxins in more than a half of the farm animal feeds samples collected in 2010 exceeded themaximum legal limit. In Europe, the feed samples usually contained deoxynivalenol (DON) andT-2 toxin, which belong to the trichothecenes, as well as zearalenone (ZON). The feed samplesfrom Asia and the Pacific region were usually contaminated with DON, ZON, fumonisins andaflatoxins [14]. Mycotoxins from the trichothecene group, fumonisins and zearalenone belong tothe most toxic metabolites produced by the Fusarium species and were proven to be the most harmfulwhen consumed [15]. Due to the increasing number of reports on the contamination of food productsand ingredients with microscopic fungi, it seems interesting to investigate their populations oneggshells and their potential to produce mycotoxins.

The aim of the study was to conduct molecular identification of the species found in mycobiotapresent on the shell surface of table eggs acquired from different egg-laying hen breeding systems andto identify and quantify the mycotoxins in the respective egg white samples.

2. Results and Discussion

2.1. Mycobiota Species Identification

Eggs selected for analyses were stored at programmed humidity and temperature, which weresimilar to the conditions in warehouses and shops. The analyses were conducted on eggs laidby hens kept in 4 systems and in 2 experimental variants, that is, with and without sterilisation(control variant). Surface sterilisation effectively eliminates microorganisms adhering to the eggshellsurface. The procedure is applied to acquire isolates from eggshell pores. The qualitative analysisresulted in the identification of 41 isolates on the surface of eggs. In total, there were 7 isolates from theorganic production system, 11 from the free-range production system, 14 from the deep litter indoorhousing system and 9 from the cage farming production system.

Fungi belonging to the Alternaria, Penicillium and Chaetomium genera were the most frequentlyisolated from the eggshell surface (Figure 1). Alternaria species isolated in the experiment chieflycolonise crops, including cereal grains [16]. These fungi have the potential to generate toxins suchas alternariol and tenuazonic acid. It was found that the Penicillium sp. isolated in the experimentaccelerated the egg rotting process and caused qualitative changes in the egg content (results notshown). Chaetomium sp., which was isolated from the eggshells, is a fungal species commonly foundin soil, straw, cereal grains and on wet surfaces of buildings all over the World [17–19].

Toxins 2018, 10, 293 3 of 10Toxins 2018, 10, x FOR PEER REVIEW 3 of 10

Figure 1. The overall occurrence frequencies of 9 mycobiota (represented by 41 isolates) identified in eggs laid by hens kept in different housing systems.

2.2. Mycobiota Strains Isolated from Eggs Acquired from Different Egg-Laying Hen Breeding System

This research showed that composition of fungal species isolated from the eggshells differed according to the egg-laying hen housing system (Table 1). There were qualitative and quantitative differences in the fungal species between the sterilised eggs and the control samples (without sterilisation). The highest species diversity was noted in the population of fungi isolated from eggs laid by hens kept in the deep litter indoor housing system. Samples originating from this system mostly contained fungi of the Alternaria genus (5 species). There were also two fungal species of the Fusarium genus isolated. So far, no reports became available on the occurrence of these species on the eggshell surface. The hygienisation procedure enabled the isolation of Scopulariopsis brevicaulis, Trichothecium roseum and Acrostalagmus luteoalbus species from the shell surface of eggs laid by hens kept in the deep litter indoor housing system. These species were not observed on the shell surface of eggs laid by hens kept in the other housing systems. The diversity of potentially pathogenic fungal species on the eggshell surface is related to the unique microclimate inside the henhouse with the deep litter system, that is, high air humidity and temperature, poor ventilation, exogenous contamination, (litter, feed) and endogenous contamination (dust) [5].

Table 1. Mycobiota strains isolated from the eggs in the present study.

Hen Housing System Sample Treatment Identified Fungal Isolates

Cage

Native mycobiota

Alternaria brassicae Alternaria obovoidea

Botryotrichum spirotrichum Chaetomium murorum

Surface-sterilised

Alternaria arborescens Alternaria burnsii

Alternaria tenuissima Engyodontium album

Deep litter housing

Native mycobiota

Alternaria alternata Alternaria tenuissima Chaetomium globosum Engyodontium album Fusarium culmorum

Fusarium equiseti

Surface-sterilised

Acrostalagmus luteoalbus Alternaria arborescens

Alternaria brassicae Alternaria infectoria

Figure 1. The overall occurrence frequencies of 9 mycobiota (represented by 41 isolates) identified ineggs laid by hens kept in different housing systems.

2.2. Mycobiota Strains Isolated from Eggs Acquired from Different Egg-Laying Hen Breeding System

This research showed that composition of fungal species isolated from the eggshellsdiffered according to the egg-laying hen housing system (Table 1). There were qualitative andquantitative differences in the fungal species between the sterilised eggs and the control samples(without sterilisation). The highest species diversity was noted in the population of fungi isolatedfrom eggs laid by hens kept in the deep litter indoor housing system. Samples originating from thissystem mostly contained fungi of the Alternaria genus (5 species). There were also two fungal speciesof the Fusarium genus isolated. So far, no reports became available on the occurrence of these specieson the eggshell surface. The hygienisation procedure enabled the isolation of Scopulariopsis brevicaulis,Trichothecium roseum and Acrostalagmus luteoalbus species from the shell surface of eggs laid by henskept in the deep litter indoor housing system. These species were not observed on the shell surface ofeggs laid by hens kept in the other housing systems. The diversity of potentially pathogenic fungalspecies on the eggshell surface is related to the unique microclimate inside the henhouse with the deeplitter system, that is, high air humidity and temperature, poor ventilation, exogenous contamination,(litter, feed) and endogenous contamination (dust) [5].

There was similar diversity of fungal species observed in the eggs laid by hens kept in thefree-range system. Similarly, to the eggs from the deep litter system, there were also pathogenic speciesof Alternaria and Fusarium isolated on the eggshell surface (Table 1). The possibility to control henbreeding conditions in the free-range system is limited. As hens have a free access to full-value feed orgreen forage, litter and the range, there is higher risk of contact with pathogenic organisms of differentorigin [20].

There were ten fungal species observed on the shell surface of eggs laid by hens kept in the organicsystem with no pathogenic species of the Fusarium genus among them (Table 1). The hygienisationprocedure enabled the isolation of a large population of fungal species in this system. Most of thespecies were characteristic for the henhouse environment. In the organic system, a limited numberof hens is kept per square meter. Consequently, effective control of the henhouse climate is possible.Adequate humidity and temperature reduce the risk of the extensive growth of pathogenic fungi.

Toxins 2018, 10, 293 4 of 10

Table 1. Mycobiota strains isolated from the eggs in the present study.

Hen Housing System Sample Treatment Identified Fungal Isolates

Cage

Native mycobiota

Alternaria brassicaeAlternaria obovoidea

Botryotrichum spirotrichumChaetomium murorum

Surface-sterilised

Alternaria arborescensAlternaria burnsii

Alternaria tenuissimaEngyodontium album

Deep litter housing

Native mycobiota

Alternaria alternataAlternaria tenuissimaChaetomium globosumEngyodontium albumFusarium culmorum

Fusarium equiseti

Surface-sterilised

Acrostalagmus luteoalbusAlternaria arborescens

Alternaria brassicaeAlternaria infectoria

Alternaria multiformisAlternaria tenuissimaChaetomium globosum

Penicillium chrysogenumPenicillium riseofulvum

Scopulariopsis brevicaulisTrichothecium roseum

Free range

Native mycobiota

Alternaria infectoriaAlternaria tenuissimaChaetomium funicola

Chaetomium globosumEpicoccum nigrum

Fusarium culmorumFusarium tricinctumTrichothecium roseum

Surface-sterilised

Alternaria sp.Acrostalagmus luteoalbus

Chaetomium globosumPurpureocillium lilacinum

Organic

Native mycobiotaAlternaria alternataEpicoccum nigrum

Trichothecium roseum

Surface-sterilised

Alternaria infectoriaAlternaria multiformis

Alternaria brassicaeAlternaria tenuissimaChaetomium elatum

Chaetomium globosumEpicoccum nigrum

Purpureocillium lilacinumTrichothecium roseum

There were eight fungal species isolated on the shell surface of eggs laid by hens kept in the cagesystem. Only two of them had the potential to produce mycotoxins (Table 1). The sterilisation procedureallowed for the isolation of the Engodontium album species on the eggshell surface. This species wasalso isolated from the eggs with the mycoflora native to the deep litter system. Although E. album

Toxins 2018, 10, 293 5 of 10

has not been reported to be mycotoxigenic, its spores and mycelium can cause infections in humanscausing brain abscess and keratitis [21]. In the present study, the conditions in a henhouse with thecage system resulted in low fungal diversity on the eggshell surface. The design of furnished cagesallowed for the natural preferences of hens and the safety of eggs produced [22,23]. As far as themicrobial safety of eggs is concerned, the advantage of the cage system results from the fact that itdoes not use straw, which is a potential vector of pathogenic fungal species from the field.

In conclusion, the qualitative analysis of the fungi isolated showed that the shell of table eggs wasa potential substrate for the growth of numerous fungi, including pathogenic and toxin-producingspecies, for example, Fusarium and Alternaria. Moreover, the diversity of the fungal population differedaccording to the egg-laying hen housing system. The fungal species present on the eggshell surfacemay occur in the environment of the henhouse [9].

2.3. Toxin Content Analysis

The presence of Fusarium spp. fungi on the eggshell surface involves the potential risk oftheir presence and production of mycotoxins in the egg content. The content of type-A and type-Btrichothecenes was measured in order to check the potential contamination of eggs with mycotoxins(Tables 2 and 3). Only the egg white was analysed for the content of mycotoxins. Szablewski et al. [8]proved that there were no fungi in the yolk after two weeks of storage. There were no Fusariummycotoxins found in freshly laid eggs. This means that no Fusarium mycotoxins were transmitted fromthe feed through the alimentary tract into the eggs. There were type-A and type-B trichothecenes inthe content of the eggs whose shell samples contained F. culmorum. This species chiefly synthesizesDON, 3-AcDON and NIV [15,24]. The content of type-A trichothecenes may indicate the presence ofspecies such as F. sporotrichioides [25,26]. We did not identify any Fusarium species producing type-Atrichothecenes in our study. It may have been caused by the fact that only viable fungal species growingon the eggshell surface were analysed. After the period of egg storage, the pathogenic species ofmicroscopic fungi may have penetrated into the egg content. They may have died because of shortageof nutrients or competitive microflora on the eggshell surface.

Table 2. Mean values and standard deviations of type-A trichothecenes present in egg samplescontaminated with Fusarium species.

Fusarium sp.Concentration of Type-A Trichothecenes (µg/kg)

Scirpentriol T-2 Tetraol T-2 Triol DAS HT-2 T-2

Fc 3 ± 1 5 ± 1 2 ± 1 11 ± 9 16 ± 8 22 ± 7Fe <LOD <LOD <LOD <LOD <LOD <LODFt <LOD <LOD <LOD <LOD <LOD <LOD

none 10 ± 9 <LOD <LOD <LOD <LOD 13 ± 9

Fc—Fusarium culmorum, Fe—F. equiseti, Ft—F. tricinctum.

Table 3. Mean values and standard deviations of type-B trichothecenes present in egg samplescontaminated with Fusarium species.

Fusarium sp.Concentration of Type-B Trichothecenes (µg/kg) ± SD

DON FUS-X 3-AcDON 15-AcDON NIV

Fc 16 ± 3 2 ± 1 4 ± 2 3 ± 1 55 ± 11Fe <LOD <LOD <LOD <LOD <LODFt <LOD <LOD <LOD <LOD <LOD

none 10 ± 4 <LOD <LOD <LOD 19 ± 9

Fc—Fusarium culmorum, Fe—F. equiseti, Ft—F. tricinctum.

Toxins 2018, 10, 293 6 of 10

The opposite situation was observed in some samples. They contained the viable mycelia ofmicroscopic fungi which potentially produce mycotoxins but no mycotoxins were found in the samples.This finding is not surprising, as the biosynthesis of these metabolites may be modified by theoccurrence of abiotic or biotic stress factors. For example, under specific conditions the F. equseti speciesis capable of producing selected trichothecene mycotoxins and zearalenone [25,27,28]. Unfortunately,no mycotoxins produced by F. equseti were analysed in our study.

2.4. Toxin Content Analysis in Eggs Acquired from Different Egg-Laying Hen Breeding System

Our study did not prove any correlation between the content of mycotoxins in egg white and theegg-laying hen breeding system (Table 4). The content of mycotoxins in egg white from hens bred in theorganic and cage breeding systems was below the detectable level. There were no significant differencesin the concentrations of mycotoxins in egg white from hens bred in the deep litter and free-rangesystems. Until recently, the issue of the egg content contamination with mycotoxins produced bypathogenic species growing on the egg surface and in the egg content has not been scientificallyinvestigated. So far, the experiments were focused on the transmission of mycotoxins from feedthrough the alimentary tract into the egg content [29–32]. In the present study, we have shown that thelevel of mycotoxins in eggs is not harmful to the human body. However, attention should be paid tothe possibility of the bioaccumulation of mycotoxins in the human body [33]. Our study reports thenew potential source of chemical and microbial risks in the production of table eggs.

Table 4. The range and mean concentrations of total toxins in eggs laid by hens kept in differenthousing systems.

Egg ContentTotal Toxin Concentrations (µg/kg)

Range Mean

Native mycobiota

Organic <LOD -Free range 0.1–55 36 a

Deep litter 0.1–38 27 a

Cage <LOD -

Surface-sterilised

Organic <LOD -Free range <LOD -Deep litter 13–19 14

Cage <LOD -a—no differences at the level of significance α = 0.05.

3. Conclusions

The research showed that the diversity of the mycobiota population on the eggshell surfacedepended on the conditions of maintenance of egg-laying hens. The microscopic fungi isolatedfrom the eggshells included toxigenic and pathogenic species such as F. culmorum and F. equiseti.As a consequence, there were mycotoxins present in the egg whites. The production of mycotoxins inthe egg content may indicate that microscopic fungi competed with other microorganisms. The resultsshowed that the conditions of the henhouse environment significantly influenced the initial eggshellcontamination. These main sources of contamination should be taken into consideration whenpreparing strategies preventing the occurrence of toxin-producing fungal species in table eggs.

4. Materials and Methods

4.1. Egg Collection

The research was conducted on 240 eggs (class M, average weight 53 g) acquired from hens keptin the cage farming production system (Hy-Line White), deep litter indoor housing system (Hy-Line),

Toxins 2018, 10, 293 7 of 10

free-range production system (Green-Legged Hens) and organic production system (Green-LeggedHens) with the ‘PL-Eko’ certificate. The henhouses were located in central Poland.

4.2. Mycobiota Isolation, Media and Culture Conditions

On being laid, half of all egg samples were subjected to surface sterilisation in an aqueous ethanol(70%) solution for 30 seconds. All the eggs were stored at high humidity (95%) and temperature(20–25 ◦C) in a climate chamber (Binder KBF 115, Tuttlingen, Germany). After two weeks of storagethe eggs were broken and divided into fractions. Shredded eggshells were aseptically cultured onPotato Dextrose Agar (PDA, Oxoid, Basingstoke, UK). Eggshell mycobiota were incubated at 20–25 ◦Cfor 5–7 days. The purification of cultures was conducted according to the manual [34]. Pure fungalcultures were grown on the PDA medium until the genomic DNA extraction.

4.3. DNA Extraction

Forty-one fungal cultures were isolated and purified from eggshells. The following moleculartechniques were used in the pre-validated procedure. Mycelia of individual isolates were harvestedfrom the PDA plates after 7 days of incubation. Genomic DNA was extracted using thehexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) method used previously [35]. DNA extracts werestored at −20 ◦C.

4.4. Molecular Species Identification

The species were identified by analysing the sequences of a variable fragment ofthe translation elongation factor 1α gene (tef-1α). Diagnostic fragments were PCR-amplifiedusing the following primer pair: Ef728M—5′-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3′ and Tef1R—5′-GCCATCCTTGGAGATACCAGC-3′ [36,37]. Identification of other fungi species was confirmed onthe basis of the sequence analysis of the Internal Transcribed Spacers of the ribosomal DNA region(ITS1-ITS2). For the PCR, specific primers were used: ITS4—5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′ andITS5—5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′ [38]. PCRs were conducted in 20 µL volumes usingC-1000 thermal cyclers (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Each reaction tube contained 0.4 µL of Phire IIHotStart Taq DNA polymerase (Thermo Scientific, Espoo, Finland), 4 µL of 5× PCR buffer, 12.5 pmolof forward/reverse primers, 2.5 mM of each dNTP and 20 ng of fungal DNA. The PCR conditions wereas follows: 30 s at 98 ◦C; 35 cycles of 5 s at 98 ◦C, 5 s at 63 ◦C (for tef-1α) or 5 s at 56 ◦C (for ITS1-ITS2)and 15 s at 72 ◦C and, finally, 1 min at 72 ◦C. The amplicons were electrophoresed in 1.5% (w/v)agarose gels (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) with Midori Green dye (Nippon Genetics Europe GmbH,Dueren, Germany).

For sequence analysis, PCR-amplified DNA fragments were purified with exonuclease I(Thermo Scientific, Espoo, Finland) and shrimp alkaline phosphatase (Thermo Scientific, Espoo,Finland) using the following programme: 30 min at 37 ◦C and 15 min at 80 ◦C. DNA fragmentswere labelled using forward primer and the BigDyeTerminator 3.1 kit (Applied Biosystems,Foster City, CA, USA), according to the method described in Stepien et al. [39] and precipitatedwith 96% ethanol. Sequences were read using Applied Biosystems equipment (Applied Biosystems,Foster City, CA, USA). The sequences were aligned using BLASTn algorithm to the sequences ofreference strains belonging to individual fungal species, deposited in the GenBank Database (NationalCenter for Biotechnology Information, Bethesda, MD, USA). They were assigned to the referencespecies, where both sequence coverages and nucleotide identities matched the query at 99–100%.

4.5. Analysis of Mycotoxins in Egg White

Lyophilised egg white was analysed for the content of selected mycotoxins. The concentrationsof the following mycotoxins were measured: type A trichothecenes, that is, scirpentriol (STO),diacetoxyscirpenol (DAS), HT-2 toxin, T-2 toxin, T-2 tetraol, T-2 triol and type B trichothecenes, that is,deoxynivalenol (DON), 3-acetyl-deoxynivalenol (3-AcDON), 15-acetyl-deoxynivalenol (15-AcDON),

Toxins 2018, 10, 293 8 of 10

nivalenol (NIV), fusarenone X (FUS-X). Samples (10 g) were extracted with 100 ml mixture ofacetonitrile/water (82:18). The extracts were purified by means of a solid phase extraction, usingcolumns filled with a mixture of active carbon (Draco G 60, 100 mesh), celite (Celite 545) and neutralaluminium oxide (70–230 mesh) at a weight ratio of 1:1:1. Type B trichothecenes were analysedas trimethylsilyl derivatives, using an external model. They were separated chromatographicallyand analysed individually by means of a gas chromatograph (Hewlett Packard 6890, Waldbronn,Germany) coupled with a mass detector (Hewlett Packard 5972 A, Waldbronn, Germany). Selectedions (SIM) were analysed in type B trichothecenes: for DON—ions 103 and 512; for 3-AcDON—ions117 and 482; for 15-AcDON—ions 193 and 482; for FUS-X—ions 103 and 570; for NIV—ions 191and 600. A full-range scan of masses was analysed (100–700 amu) to confirm that analysed toxinswere present in the samples. The mass spectrum was compared with the analogical spectrumreferring to the standard. Apart from the qualitative analysis, the toxin concentrations were measured.The results were processed with the ChemStation program. Type A trichothecenes were analysed astrifluoroacetyl derivatives. The analysis consisted in searching for selected ions (SIM). The followingions were identified in type B trichothecenes: for STO—ions 456 and 555; for T-2 tetraol—ions 455and 568; for T-2 triol—ions 455 and 569; for DAS—ions 402 and 374; for HT-2—ions 455 and 327;for T-2—ions 327 and 401. The method of analysis resulted in the following percentages of toxinrecovery: STO 82 ± 5.3%; T-2 triol 79 ± 5.1%; T-2 86 ± 3.8%; T-2 tetraol 88 ± 4.0%; FUS-X 79 ± 3.1%;HT-2 91 ± 3.3%; DON 84 ± 3.8%; 3-AcDON 78 ± 4.8%; 15-AcDON 74 ± 2.2% and NIV 81 ± 3.8%.The limit of detection was 0.001 mg/kg.

Author Contributions: Conceptualization, T.S. Ł.T. Ł.S. and R.C.-R.; Methodology, Ł.S., K.S.-S. and M.U.;Investigation, Ł.T., M.U. and K.S.-S.; Data Curation, Ł.T., M.U.; Writing-Original Draft Preparation, Ł.T., R.C.-R.and K.S.-S.

Funding: This research was financially supported from the Polish National Science Centre project2012/07/D/NZ9/01004.

Conflicts of Interest: The authors declare no conflict of interest.

References

1. Commission Regulation (EC) 1881/2006. Off. J. Eur. Commun. 2006, 558, L364.2. De Reu, K.; Grijspeerdt, W.; Messensa, M.; Heyndrickxa, M.; Uyttendaeleb, J.; Debevereb, L.; Hermana, L.

Eggshell factors influencing eggshell penetration and whole egg contamination by different bacteria,including Salmonella enteritidis. Int. J. Food Microbiol. 2006, 112, 2532–2560. [CrossRef] [PubMed]

3. Gantois, I.; Ducatelle, R.; Pasmans, F.; Haesebrouck, F.; Gast, R.; Humphrey, T.J.; Van Immerseel, F.Mechanisms of egg contamination by Salmonella enteritidis. FEMS Microbiol. Lett. 2009, 33, 718–738.[CrossRef] [PubMed]

4. Corry, J.E.L. Microbiological analysis of eggs and egg products. In Microbiological Analysis of Red Meat, Poultryand Eggs; Mead Red, G.C., Ed.; CRC Press: Cambridge, UK, 2007; pp. 183–201.

5. Gros, R.V.; Nichita, I.; S, eres, , M.; Ilie, M.S.; Marcu, A.; Cucerzan, A.; Tîrziu, E. Study of the fungi dynamics ina poultry house with permanent litter. Lucr. St. Med. Vet. 2015, 48, 2572–2662.

6. Harry, E.G.; Cooper, D.M. The treatment of hatching eggs for the control of egg transmitted aspergillosis.Br. Poult. Sci. 1970, 11, 2692–2772. [CrossRef] [PubMed]

7. Girma, G.; Abebaw, M.; Zemene, M.; Mamuye, Y.; Getaneh, G. A Review on Aspergillosis in Poultry. J. Vet.Sci. Technol. 2016, 7, 6. [CrossRef]

8. Szablewski, T.; Stuper, K.; Cegielska-Radziejewska, R.; Kijowski, J.; Perkowski, J. Ergosterol as an indicator ofthe presence of microscopic fungi in eggs for human consumption produced in different husbandry systems.Poult. Sci. 2010, 89, 2491–2493. [CrossRef] [PubMed]

9. Rohweder, D.; Valenta, H.; Sondermann, S.; Schollenberger, M.; Drochner, W.; Pahlow, G.; Döll, S.; Dänicke, S.Effect of different storage conditions on the mycotoxin contamination of Fusarium culmorum-infected andnon-infected wheat straw. Mycotoxin Res. 2011, 27, 1451–1453.

10. Kokkonen, M.; Ojala, L.; Parikka, P.; Jestoi, M. Mycotoxin production of selected Fusarium species at differentculture conditions. Int. J. Food Microbiol. 2010, 30, 172–175. [CrossRef] [PubMed]

Toxins 2018, 10, 293 9 of 10

11. Stuper-Szablewska, K.; Szablewski, T.; Cegielska-Radziejewska, R.; Ostrowska, A.; Matysiak, A.; Perkowski, J.Contamination of different kind of litter by microscopic fungi from hen house. Apar. Bad. Dydakt. 2014, 2,1992–2004.

12. Skóra, J.; Gutarowska, B.; Pielech-Przybylska, K.; Stepien, Ł.; Pietrzak, K.; Piotrowska, M.; Pietrowski, P.Assessment of microbiological contamination in the work environments of museums, archives and libraries.Aerobiologia 2015, 31, 3894–3901. [CrossRef] [PubMed]

13. Sypecka, Z.; Kelly, M.; Brereton, P. Deoxynivalenol and Zearalenone Residues in Eggs of Laying Hens Fedwith a Naturally Contaminated Diet, Effects on Egg Production and Estimation of Transmission Rates fromFeed to Eggs. J. Agric. Food Chem. 2004, 25, 5463–5471. [CrossRef] [PubMed]

14. Binder, E.M.; Tan, L.M.; Chin, L.J.; Handl, J.; Richard, J. Worldwide occurrence of mycotoxins in commodities,feeds and feed ingredients. Anim. Feed Sci. Technol. 2007, 137, 265–282. [CrossRef]

15. Desjardins, A.E. Fusarium Mycotoxins Chemistry, Genetics and Biology; ASP Press: Eagan, MN, USA, 2006.16. Zur, G.; Shimoni, E.; Hallerman, E.; Kashi, Y. Detection of Alternaria fungal contamination in cereal grains by

a polymerase chain reaction-based assay. J. Food Prot. 2002, 65, 1433–1440. [CrossRef] [PubMed]17. Nielsen, K.F.; Gravesen, S.; Nielsen, P.A.; Andersen, B.; Thrane, U.; Frisvad, J.C. Production of mycotoxins

on artificially and naturally infested building materials. Mycopathologia 1999, 145, 435–436. [CrossRef]18. Fogle, M.R.; Douglas, D.R.; Jumper, C.A.; Straus, D.C. Growth and mycotoxin production by

Chaetomium globosum. Mycopathologia 2007, 164, 495–496. [CrossRef] [PubMed]19. Provost, N.; Shi, C.; She, Y.; Cyr, T.; Miller, D. Characterization of an antigenic chitosanase from the cellulolytic

fungus Chaetomium globosum. Med. Mycol. 2013, 51, 2902–2999. [CrossRef] [PubMed]20. Piskorska-Pliszczynska, J.; Mikolajczyk, M.; Warenik-Bany, M.; Maszewski, S.; Strucinski, P. Soil as a source

of dioxin contamination in eggs from free-range hens on a Polish farm. Sci. Total Environ. 2014, 145, 435–436.[CrossRef] [PubMed]

21. Macêdo, D.P.C.; Neves, R.P.; De Souza-Motta, C.M.; Magalhães, O.M.C. Engyodontium album fungaemia,the first reported case. Braz. J. Microbiol. 2007, 38, 1101–1112. [CrossRef]

22. Holt, P.S.; Davies, R.H.; Dewulf, J.; Gast, R.K.; Huwe, J.K.; Jones, D.R.; Waltman, D.; Willian, K.R. The impactof different housing systems on egg safety and quality. Poult. Sci. 2011, 90, 251–262. [CrossRef] [PubMed]

23. Wall, H.; Tauson, R.; Sorgjerd, S. Bacterial contamination of eggshells in furnished and conventional cages.J. Appl. Poult. Res. 2008, 17, 11–16. [CrossRef]

24. Scherm, B.; Balmas, V.; Spanu, F.; Pani, G.; Delogu, G.; Pasquali, M.; Migheli, Q. Fusarium culmorum, causalagent of foot and root rot and head blight on wheat. Mol. Plant Pathol. 2013, 14, 3233–3241. [CrossRef][PubMed]

25. Kuzdralinski, A.; Nowak, M.; Szczerba, H.; Dudziak, K.; Muszynska, M.; Lesniowska-Nowak, J.The composition of Fusarium species in wheat husks and grains in south-eastern Poland. J. Integr. Agric.2017, 16, 1530–1536. [CrossRef]

26. Stepien, Ł.; Waskiewicz, A.; Urbaniak, M. Wildly growing asparagus (Asparagus officinalis L.) hosts pathogenicFusarium species and accumulates their mycotoxins. Microb. Ecol. 2016, 71, 9279–9337. [CrossRef] [PubMed]

27. Ciegler, A. Fungi that produce mycotoxins, Conditions and occurrence. Mycopathologia 1978, 65, 5–11.[CrossRef] [PubMed]

28. Stepien, Ł.; Gromadzka, K.; Chełkowski, J. Polymorphism of mycotoxin biosynthetic genes among Fusariumequiseti isolates from Italy and Poland. J. Appl. Genet. 2012, 53, 227–236. [CrossRef] [PubMed]

29. Prelusky, D.B.; Hamilton, R.M.G.; Trenholm, H.L. Transmission of Residues to Eggs Following Long-TermAdministration of 14C-Labelled Deoxynivalenol to Laying Hens. Poult. Sci. 1989, 68, 744–748. [CrossRef][PubMed]

30. Prelusky, D.B.; Trenholm, H.L.; Hamilton, R.M.G.; Miller, J.D. Transmission of [14C] Deoxynivalenol to Eggsfollowing Oral Administration to Laying Hens. J. Agric. Food Chem. 1987, 35, 1821–1886. [CrossRef]

31. Valenta, H.; Dänicke, S. Carry-over of deoxynivalenol into eggs of laying hens—Preliminary results.Mycotoxin Res. 2005, 21, 136–138. [CrossRef] [PubMed]

32. Tangni, E.K.; Waegeneersa, N.; Van Overmeireb, I.; Goeyensb, L.; Pussemier, L. Mycotoxin analyses in somehome produced eggs in Belgium reveal small contribution to the total daily intake. Sci. Total Environ. 2009,407, 4411–4418. [CrossRef] [PubMed]

33. Escrivá, L.; Font, G.; Manyes, L.; Berrada, H. Studies on the Presence of Mycotoxins in Biological Samples:An Overview. Toxins 2017, 9, 251. [CrossRef] [PubMed]

Toxins 2018, 10, 293 10 of 10

34. Leslie, J.F.; Summerell, B.A. The Fusarium Laboratory Manual; Blackwell Publishing: Ames, IA, USA, 2006;pp. 1–388.

35. Stepien, Ł.; Jestoi, M.; Chełkowski, J. Cyclic hexadepsipeptides in wheat field samples and esyn1 genedivergence among enniatin producing Fusarium avenaceum strains. World Mycotoxin J. 2013, 6, 399–409.[CrossRef]

36. Carbone, I.; Kohn, L.M. A method for designing primer sets for speciation studies in filamentous ascomycetes.Mycologia 1999, 91, 553–556. [CrossRef]

37. Kullnig-Gradinger, C.M.; Szakacs, G.; Kubicek, C.P. Phylogeny and evolution of genus Trichodermaa multigene approach. Mycol. Res. 2002, 106, 757–767. [CrossRef]

38. White, T.J.; Bruns, T.; Lee, S.; Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genesfor phylogenetic. In PCR Protocols, a Guide to Methods and Applications; Innis, M.A., Gelfand, D.H., Shinsky, J.J.,White, T.J., Eds.; Academic Press: San Diego, CA, USA, 1990; pp. 315–322.

39. Stepien, Ł.; Waskiewicz, A. Sequence divergence of the enniatin synthase gene in relation to production ofbeauvericin and enniatins in Fusarium species. Toxins 2013, 5, 537–555. [CrossRef] [PubMed]

© 2018 by the authors. Licensee MDPI, Basel, Switzerland. This article is an open accessarticle distributed under the terms and conditions of the Creative Commons Attribution(CC BY) license (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

The influence of the conditions of acquisition and storage of table eggs onchanges in their quality and the presence of mycobiota and Fusarium

mycotoxins

�Lukasz Tomczyk,∗,1 Tomasz Szablewski,∗ Kinga Stuper-Szablewska,† Sebastian Nowaczewski,‡and Renata Cegielska-Radziejewska∗

∗Department of Food Safety and Quality Management, Poznan University of Life Sciences, Poznan 60-637,Poland; †Department of Chemistry, Poznan University of Life Sciences, Poznan 60-637, Poland; and

‡Department of Animal Breeding and Product Quality Assessment, Poznan University of Life Sciences, Poznan60-637, Poland

ABSTRACT The study showed that the hen housingsystem and egg storage conditions had significant influ-ence on differences in the qualitative traits of eggs. Themost rapid qualitative traits changes were observed inthe eggs laid by the hens kept in the free-range and lit-ter systems. After the first week of storage fungi werefound on the eggshell surface but significant growthof fungi on the eggshell surface was noted after 3 wk,regardless of the storage conditions. Higher humidityduring egg storage causes the dynamic development offungi in the albumen. The principal component analy-sis proved the dependency between ergosterol and the

trichothecene concentration in the albumen. Mycotox-ins in the albumen indicate the presence of pathogenicspecies of microscopic fungi. The albumen of the eggslaid by the hens kept in cages had the lowest concen-tration of mycotoxins. The results of the study showedthat the conditions of the henhouse environment signifi-cantly influenced the initial contamination of eggshells.Egg storage conditions, i.e., high air humidity, favorthe development of fungi on the eggshell surface, affectthe dynamics of fungal growth into the albumen andthe production of mycotoxins.

Key words: egg, hen breeding systems, microscopic fungi, mycotoxin2019 Poultry Science 98:2964–2971

http://dx.doi.org/10.3382/ps/pez156

INTRODUCTION

The quality of table eggs is assessed according to var-ious determinants. On being laid eggs have the high-est quality (Haugh Units > 75, albumen index > 0.09,yolk index > 0.45, albumen pH < 7.6) (Niewiarowicz,1991; Eke et al., 2013). Egg quality decreases duringstorage. The rate of changes depends on the acquisi-tion and storage conditions. Refrigerated storage hasthe greatest impact on maintaining egg quality factors(Jones et al., 2018). On the other hand, research hasshown that the optimal storage temperature for eggsis 18◦C (Campo et al., 2000; Halaj et al., 2000). Leav-ing eggs on shelves in shops at room temperature aftercold storage may lead to the condensation of water onshells and thus it may provide favorable conditions forthe development of microorganisms. Therefore, if possi-ble, eggs should be stored and transported at constanttemperature and they should not be cooled before theyare sold to final consumers (Commission Regulation

C© 2019 Poultry Science Association Inc.Received December 6, 2018.Accepted March 10, 2019.1Corresponding author: tomczyk@up.poznan.pl

589/2008). Qualitative traits changes occurring duringthe storage of eggs consist in the increase in the volumeof the air chamber, liquefaction of the dense albumen,and weakening of the vitelline membrane surroundingthe yolk (Eke et al., 2013; Silversides and Scott, 2001).The yolk absorbs water from the white, and thus it in-creases its size and simultaneously weakens the vitellinemembrane. During storage, eggs lose water and carbondioxide. The dynamics of this process is determined bythe air temperature and humidity. The exchange of car-bon dioxide and water vapor through the eggshell in-creases the pH of the albumen and yolk, reduces thewater content in the protein and the mass of the wholeegg (Al-Hajo et al., 2012).

The presence of microorganisms deteriorates thequality of albumen and yolk (Eke et al., 2013; Singhet al. 2009). They can mostly be found on the un-washed consumer eggshell surface and their numberdepends on hygiene at the place where eggs are laid(De Reu et al., 2006; Corry, 2007; Gantois et al.,2009). Eggs may be further contaminated during stor-age and transport. Outer layers of eggs, such as thecuticle, shell, and subshell membranes, constitute a me-chanical barrier preventing microbial contamination. As

2964

Dow

nloaded from https://academ

ic.oup.com/ps/article-abstract/98/7/2964/5429433 by guest on 01 July 2019

MYCOBIOTA AND MYCOTOXINS IN TABLE EGGS 2965

eggs age during storage, their protective mechanismsweaken, so bacteria and fungi can penetrate the shelland subshell membranes (Baron and Rehault, 2007;Szablewski et al., 2010; Tomczyk et al., 2018). Bac-teria of the Salmonella, Shigella, Proteus, and Es-cherichia genera can be found on the eggshell surface(Gondek et al., 2013). They are the main causesof food poisonings (Ogori and Ogori, 2014). Theegg microflora also contains bacteria such as Pseu-domonas, Proteus, Alcaligenes, Enterobacter, Serratia,Stenotrophomonas, Cloaca, Acinetobacter, Moraxella,and Citrobacter spp., which causes decay, unfavorablechanges in the color of the albumen and yolk, and rot-ten smell (Corry, 2007). Bacteria of the Flavobacteriumand Cytophaga genera cause the pigmentation of sub-shell membranes (Mayes and Takeballi, 1983; Corry,2007). Apart from bacteria, microscopic fungi of thePenicillium, Alternaria, Chaetomium, Fusarium, Stem-phylium, Mucor, and Rhizopus genera are also impor-tant microorganisms, which can be found in table eggs(Tomczyk et al., 2018; Szablewski et al., 2015). Theyproduce mycotoxins, which contaminate eggs. The fol-lowing toxinogenic strains of microscopic fungi canmostly be found in eggs: aflatoxins, ochratoxin, type Aand B trichothecenes, moniliformin, zearalenone, andfumonisins (Desjardins, 2006).

Straw, which is commonly used as a substrate in lit-ter, free-range, and organic housing systems for egg-laying hens in Europe, may be a source of microbialcontamination of eggs. There were more microorgan-isms on the shells of eggs laid by hens kept in deeplitter than on the shells of eggs laid by hens kept incages (Englmaierova et.al. 2014). Chips and straw areoften contaminated with microscopic field fungi suchas: Alternaria, Cladosporium, Drechslera, and Fusar-ium (Kokkonen et al., 2010; Rohweder et al., 2011;Stuper et al., 2014). Apart from that, cereals used asfeed in the Central and Northern European countriesare often contaminated with deoxynivalenol (DON)and other toxic trichothecenes such as T-2 and HT-2(Binder et al., 2007; EFSA, 2013). Studies have provedthat trichothecene, fumonisins, and zearalenone myco-toxins are toxic Fusarium metabolites, which are themost harmful after consumption (Desjardins, 2006).Hens kept in cages lay eggs with the microbial cleanli-ness shells. Eggs laid in this system immediately rolldown to a collective trough or onto a conveyor belt(De Reu et al., 2006).

Understanding the determinants of initial egg con-tamination and adequate storage conditions may helpto reduce the growth of microscopic fungi and the gen-eration of mycotoxins. Therefore, the aim of this studywas to determine how the conditions of egg acquisi-tion, storage, and distribution influence the quantity ofmicroscopic fungi, the production of mycotoxins, andqualitative traits changes of eggs. In order to reproducethe variable conditions of egg storage and distribution,model tests were conducted, where eggs were stored for4 wk at programmed humidity and temperature.

MATERIALS AND METHODS

Egg Collection

The research was conducted on 775 eggs laid byhens of different breeds, which were kept in enrichedcages (Hy-Line White 36), in litter (Hy-Line Brown),in a free-range system (Green-Legged Partridge), andin an organic system (Green-Legged Partridge) with the“PL-Eko” certificate (Table 1). All 12 henhouses werelocated in Central Poland. The eggs belonged to classM and weighed 53.2 ± 0.4 g on average.

Storage Conditions

On being laid the eggs were stored in a climate cham-ber (Binder KBF 115, Poland) at programmed tem-perature (8◦C and 20◦C) and humidity (35, 65, and95%) for 4 wk. Eggs in amount of 129 were stored inindividual selected conditions of humidity and temper-ature. Egg sampling was collected at the start of theexperiment and after 7, 14, and 21 D. In each samplingset, 125 eggs were collected. On being laid and afterthe storage period the eggs were broken and separatedinto fractions. Next, albumen samples were lyophilisedat a pressure of 0.003 mBar and at a temperature of−50◦C (FreeZone Plus, Labconco, Kansas City, MO)and the shells were dried in a laboratory dryer at 50◦C(Binder KBF 115, Tuttlingen, Germany).

Egg Quality Evaluation

Selected egg quality traits, i.e., the albumen in-dex, yolk index, Haugh units, and albumen pH wereevaluated according to the Polish standard PN-A-86,503:1998. Analyzes were performed at a temperatureof 20◦C. In 1 sampling period, 155 eggs were analyzed.

ERG Analysis

The measurement of the total mycobiota content wasbased on the concentration of ergosterol (ERG). TheERG measurement method was described in detail byPerkowski et al., (2008) and we modified this procedurein our experiment according to Szablewski et al., (2010).It consisted in releasing the metabolite from the biolog-ical material by means of microwave-assisted saponifi-cation and simultaneous extraction. The ERG analysiswas conducted by means of HPLC (Waters Corpora-tion, Milford, MA, USA) with an absorption detector ata wavelength λ = 282 nm, using an external standard.The ERG recovery was 97%, whereas the detection levelwas 0.01 mg/kg.

Albumen Mycotoxin Analysis

The following albumen mycotoxins were ana-lyzed in the experiment: type B trichothecenes, i.e.,

Dow

nloaded from https://academ

ic.oup.com/ps/article-abstract/98/7/2964/5429433 by guest on 01 July 2019

2966 TOMCZYK ET AL.

Table 1. Management information of laying hens.

Henhousingsystem

Henage(wk)

Stockingdensity

(m2 per hen)

Nest boxdensity(hen pernest box)

Feederspace(m)

Floorsubstrate

Nest boxsubstrate

Cage 37 0,75 6 2.5 Wire mesh Artificial turfDeeplitterhousing

36 0,12 6 2.5 Straw Straw

Free-range

36 1,4 + 4 7 3.5 Straw Straw

Organic 39 1,7 + 4 7 3.5 Straw Straw

deoxynivalenol, 3-acetyl-deoxynivalenol (3-AcDON),15-acetyl-deoxynivalenol (15-AcDON), nivalenol(NIV), and fusarenon X. The content of trichotheceneswas measured by extracting them from the testedmaterial by means of acetonitrile and water mixed ata ratio of 82:18 (v/v). The extracts were purified tothe solid phase by means of columns filled with 5 cm3of activated carbon (Draco G 60, 100 mesh), celite(Celite 545), and neutral aluminium oxide (70–230mesh) mixed at a weight ratio of 1:1:1. Type Btrichothecenes were analyzed as trimethylsilyl deriva-tives, using an external standard. The chromatographicseparation and analysis of type B trichothecenes werecarried out separately by means of a gas chromatograph(Hewlett Packard 6890) coupled with a mass detector(Hewlett Packard 5972 A). In order to measure typeB trichothecenes selected ions were analyzed usingSIMS: for DON—ions 103 and 512; for 3-AcDON—ions117 and 482; for 15-AcDON—ions 193 and 482; forFUS—ions 103 and 570; for NIV—ions 191 and 600.The presence of the toxins in the sample was confirmedby making the analysis within the full range of masses(100 to 700 amu). It provided a mass spectrum,which was compared with the analogically obtainedspectrum for the standard. Apart from the qualitativetraits analysis, the concentration of the mycotoxinswas measured. The results were processed with theChemStation program. The methodology resulted inthe following mycotoxin recovery values: DON—84 ±3.8%; 3AcDON—78 ± 4.8%; 15 AcDON—74 ± 2.2%;NIV—81 ± 3.8%. The detection limit was 0.01 mg/kg.

Statistical Analysis

The data were processed with the STATISTICA 12.0software (Statsoft, Tulsa, OK, USA). Nonlinear esti-mation, correlation analysis and principal componentanalysis (PCA) were used for sample discrimination.

RESULTS AND DISCUSSION

Basic Changes in Egg Quality

Haugh units, the albumen index, yolk index, and al-bumen pH were measured in order to investigate theinfluence of the conditions of egg acquisition, storage,

and distribution on the dynamics of changes occurringin the albumen and decomposition processes. The anal-yses were conducted on eggs laid by hens kept in 4 dif-ferent housing systems. The eggs were stored for 4 wkat programmed humidity and temperature. The mul-tiple regression analysis revealed significant differences(P < 0.05) in the qualitative traits of the egg sam-ples stored at different humidity and temperature.After 4 wk of storage at elevated humidity (95%)and temperature (20◦C), the yolk index, albumen in-dex, and Haugh index decreased by 44.44, 41.57, and34.78%, respectively. As far as cold-stored eggs areconcerned (8◦C), the qualitative traits changes wereslower and the values of the aforementioned param-eters decreased by 22.41, 19.42, and 17.45%, respec-tively (Figure 1). The decrease in the egg qualityduring storage was caused by the decomposition ofcarbonic acid and the simultaneous release of carbondioxide and water. In consequence of the diffusion ofcarbon dioxide, the pH of the albumen increases. Mucinfibers lose their strength and the albumen turgor de-creases. In our study cold storage at lower air humidityslowed down these processes. Other authors Eke et al.,(2013) and Jones et al., (2018) noted similar resultsof temperature in their studies. The rate of unfavor-able qualitative traits changes slowed down significantly(P < 0.05) when eggs were refrigerated (8◦C).

The adjustment coefficients of the multiple regres-sion equation showed the significant dynamics of qual-itative traits changes. The highest dynamics of qual-itative traits changes were observed in the eggs laidby hens kept in the litter and free-range systems(Figure 1). The hen-housing-system-dependent differ-ences in the dynamics of changes in egg quality mayhave been caused by the characteristic microclimate ofthe henhouse environment in the free-range and littersystems, i.e., high air humidity and temperature, as wellas exogenous (litter, feed) (Singh et al. 2009) and en-dogenous contaminants (dust) (Gros et al., 2015; Joneset al., 2015).

ERG Analysis in Eggshells and in Albumen

The potential contamination of eggs with fungi wasassessed on the basis of ERG concentration in them.Only the albumen and shell were tested, because

Dow

nloaded from https://academ

ic.oup.com/ps/article-abstract/98/7/2964/5429433 by guest on 01 July 2019

MYCOBIOTA AND MYCOTOXINS IN TABLE EGGS 2967

Figure 1. Changes in the value of the Haugh units in the eggs laid by hens kept in different systems, stored for 4 wk at 8◦C and 20◦C andhumidity of 35% (n = 258).

Figure 2. A fitting graph of the ergosterol scattering model in the eggshell of all the eggs used in the study (n = 775).

Szablewski et al., (2010) did not found any fungi inthe yolk after 1 wk of storage. The chemical analysisshowed that the ERG concentration in the eggshell andin the albumen was unmeasurable. After the first weekof storage fungi were found on the eggshell surface butthe analysis of nonlinear estimation showed a significantgrowth (P < 0.05) of fungi on the eggshell surface after3 wk (Figure 2), regardless of the storage conditions.

After the first week of storage the highest ERG con-centration, i.e., 0.01 to 0.25 mg/kg was found in the

free-range eggs. Microscopic fungi continued to growalong with the storage time. After 4 wk of storage theERG concentration reached the highest level, i.e., 0.79to 4.06 mg/kg (Figure 3A and B).

The highest amount of fungi which was observedin the free-range eggs was determined by limited con-trol of the rearing conditions. Birds’ free access to feed(wholesome feed and forage), litter, and the range in-creases the risk of contact with pathogenic microor-ganisms of various origin (Piskorska-Pliszczynska et al.,

Dow

nloaded from https://academ

ic.oup.com/ps/article-abstract/98/7/2964/5429433 by guest on 01 July 2019

2968 TOMCZYK ET AL.

Figure 3. A. The dependency between storage time, humidity, and the ergosterol (ERG) concentration in the albumen (n = 775). B. Thedependency between storage time, temperature, and the ERG concentration in the albumen (n = 775).

2014). Apart from that, the research showed that the el-evated humidity (95%) and temperature (20◦C) of stor-age were optimal conditions for the growth of fungi inthe albumen (Figure 3A and B). At elevated tempera-ture the cuticle on the eggshell surface dries up fasterand begins to shrink (Rodrıguez-Navarro et al., 2013).In consequence, eggshell pores become open and it iseasier for microorganisms to enter the albumen (Ekeet al., 2013).

After the first week there were no fungi in the albu-men from the hens kept in the litter system, regardlessof the egg storage conditions. However, after 2 wk ofstorage, the ERG concentration in the albumen ranged

from to 0.17 to 2.16 mg/kg. After 4 wk of storage theERG concentration in the albumen was much higher,i.e., 1.35 to 3.17 mg/kg. This means that when eggshave direct contact with straw on being laid, the risk ofeggshell contamination with microscopic fungi is veryhigh.

After 4 wk of storage of the eggs laid by the hens keptin the organic system the ERG content in the albumenwas lower than earlier sample points (P < 0.05). In thepresent study, this system is characterized by a limitednumber of hens, so it is possible to control climatic con-ditions in the henhouse effectively. Adequate humidityand temperature decrease the risk of development of

Dow

nloaded from https://academ

ic.oup.com/ps/article-abstract/98/7/2964/5429433 by guest on 01 July 2019

MYCOBIOTA AND MYCOTOXINS IN TABLE EGGS 2969

Figure 4. Variation in the concentration of trichothecenes in allthe egg samples (n = 775).

pathogenic species of microscopic fungi producing my-cotoxins.

The lowest ERG values, indicating the presence offungi, were found in the white of eggs laid by the henskept in cages. After the first week the ERG concentra-tion in the albumen was undetectable. After 4 wk ofstorage at 20◦C and 95% humidity the ERG concentra-tion ranged from 0.01 to 1.88 mg/kg (Figure 3A andB). The environmental conditions of a henhouse withcages result in low diversity of fungal populations on theeggshell surface. The designers of furnished cages tookhens’ natural preferences into account so as to ensurethe safety of eggs (Wall et al., 2008; Holt et al., 2011).

As far as the microbial safety of eggs is concerned, theadvantage of the cage system is that it does not usestraw, which is a potential vector of pathogenic fungalspecies from the field.

Mycotoxins in Albumen

The presence of microscopic fungi on the surfaceof shells and in the albumen poses the risk of my-cotoxins. Fungi of the Fusarium genus are the mainproblem in the temperate climate zone. They producetrichothecenes, which are some of the most commonmycotoxins in cereal grains and products of their pro-cessing. The concentration of type B trichothecenes wasmeasured to check the potential contamination of albu-men with mycotoxins (Figure 4). Similarly to the anal-ysis of microscopic fungi, only the albumen was ana-lyzed for the presence of mycotoxins. There were noFusarium mycotoxins in freshly laid eggs, which meansthat they were not transmitted from the feed throughthe hen’s gastrointestinal tract into the albumen. How-ever, mycotoxins were detected during the storage ofeggs. The biosynthesis of mycotoxins in the albumenincreased significantly (P < 0.05) after the second weekof storage (Figure 3).

The multiple regression analysis did not show anysignificant influence of the storage temperature on theproduction of mycotoxins in the albumen (P < 0.05).However, it proved that the air humidity during thestorage of eggs significantly influenced the productionof mycotoxins by microscopic fungi (Figure 5). During

Figure 5. The dependency between egg storage time and air humidity and the variation in the concentration of total type B trichothecenes(n = 775).

Dow

nloaded from https://academ

ic.oup.com/ps/article-abstract/98/7/2964/5429433 by guest on 01 July 2019

2970 TOMCZYK ET AL.

Figure 6. The principal component and load analysis in the analysis of traits of eggs, ergosterol, and mycotoxin concentrations depending ondifferent storage conditions (n = 775).

the storage of eggs laid by hens kept in all the housingsystems lower humidity (35%) reduced the growth ofmicroscopic fungi producing mycotoxins. On the otherhand, at high humidity (95%) the biosynthesis of my-cotoxins was observed during the storage of all eggs,regardless of their origin.

Analysis of Factors Affecting ResearchParameters

The egg samples stored for 4 wk at different humid-ity and temperature variants were subjected to PCA(Figure 6). All the results were used in the analysis.2 principal components, which explain 54.03% of to-tal variability (PC1–41.49%, PC2–12.54%) were iden-tified based on the correlation matrix. The results ofERG and mycotoxin concentrations were distributedalong PCA1. They formed separate clusters from theresults of qualitative traits, and simultaneously they in-dicated a negative correlation between qualitative traitsof eggs differences and the concentration of mycotoxinsand ERG in the eggs. As the ERG and mycotoxin con-centrations in the eggs increased, the qualitative traitsof eggs deteriorated. The analysis proved that the con-centration of mycotoxins was negatively correlated withthe albumen pH and the hen housing system. The al-bumen pH dropped below 5 in the samples stored atunfavorable humidity (95%) and temperature (20◦C)for 4 wk. This phenomenon stands in opposition to thenatural processes that take place during storage at ahumidity of 50 to 60% (Jin et al., 2011). A lower pH in

the environment may induce further rapid developmentof microscopic fungi (Pitt and Hocking, 2009). ThePCA based on the load signs showed that the ERG con-centration on the eggshell surface and in the albumenand the concentration of mycotoxins were positivelycorrelated with air humidity. The PCA also showed thatthe storage temperature was positively correlated withchanges in egg quality.

Summary

The study showed that the hen housing system andegg storage conditions had significant influence on dif-ferences in the qualitative traits of eggs. The most rapidqualitative traits changes were observed in the eggs laidby the hens kept in the free-range and litter systems.After 1 wk of storage fungi were found in the albu-men. The process of fungal growth strictly depends onthe conditions of egg acquisition and storage. Higherhumidity during egg storage causes the dynamic devel-opment of fungi in the albumen. The PCA proved thedependency between ERG and the trichothecene con-centration in the albumen. Mycotoxins in the albumenindicate the presence of pathogenic species of micro-scopic fungi. The white of the eggs laid by the hens keptin cages had the lowest concentration of mycotoxins.The results of the study showed that the conditions ofthe henhouse environment significantly influenced theinitial contamination of eggshells. Egg storage condi-tions, i.e., high air humidity, favor the development offungi on the eggshell surface, affect the dynamics of

Dow

nloaded from https://academ

ic.oup.com/ps/article-abstract/98/7/2964/5429433 by guest on 01 July 2019

MYCOBIOTA AND MYCOTOXINS IN TABLE EGGS 2971

fungal growth into the albumen, and the production ofmycotoxins.

ACKNOWLEDGMENTS

This research was financially supported from thePolish National Science Centre project 2012/07/D/NZ9/01004.

REFERENCES

Al-Hajo, N. N., B. S. Zangana, L.A. Al-Janabi, and M. H. F. Al-Khalani. 2012. Effect of coating materials (gelatin) and storagetime on internal quality of chicken and quail eggs under refriger-ated storage. Egypt Poult. Sci. J. 32:107–115.

Baron, R., and S. Rehault. 2007. Bioactive Egg Compounds. in Com-pounds with Antibacterial Activity. Springer, Berlin (BE).

Binder, E. M., L. M. Tan, L. J. Chin, J. Handl, and J. Richard. 2007.Worldwide occurrence of mycotoxins in commodities, feeds andfeed ingredients. Anim. Feed Sci. Technol. 137:265–282.

Campo, J.L., G. M. Garcia, I. Mundoz, and M. Alonso. 2000. Effectsof breed, hen age, and storage on the indirect prediction of thealbumen quality. Arch. Geflugelkd. 64:109–114.

Commission Regulation (EC) No 589/2008 of 23 June 2008.Corry, J. E. L. 2007. Microbiological Analysis of Red Meat, Poultry

and Eggs. in Microbiological Analysis of Eggs and Egg Products.CRC Press Cambridge, Sawston, (UK).

De Reu, K., K. Grijspeerdt, M. Heyndrickx, M. Uyttendaele, J. De-bevere, and L. Herman. 2006. Bacterial shell contamination inthe egg collection chains of different housing systems for layinghens. Br. Poult. Sci. 47:163–172.

Desjardins, A. E. 2006. Fusarium Mycotoxins: Chemistry, Geneticsand Biology. 259 Genet Biol APS, St Paul, USA.

Eke, M.O., N.I. Olaitan, and J.H. Ochefu. 2013. Effect of storageconditions on the quality attributes of shell (table) eggs. NIFOJ.31:18–24.

Englmaierova, M., E. Tumova M., V. Charvatova, and M. Skrivan.2014. Effects of laying hens housing system on laying perfor-mance, egg quality characteristics, and egg microbial contami-nation. Czech J. Anim. Sci. 59:345–352.

Europen Food Safety Authority, Scientific report of EFSA. 2013.Deoxynivalenol in food and feed: occurrence and exposure. EFSAJ. 11:3379.

Gantois, I., R. Ducatelle, F. Pasmans, F. Haesebrouck, T.J.Humphrey R.Gast, and F. Van Immerseel. 2009. Mechanisms ofegg contamination by Salmonella Enteritidis. FEMS Microbiol.Rev. 33:718–738.

Gondek, M., K. Szkucik, and Z. Belkot. 2013. Presence of pathogenicmicroorganisms on the surface of eggs from different hen-housingsystems. Med. Weter. 69:374–377.

Gros, R. V., I. Nichita, M. Seres, M. S. Ilie, A. Marcu, A. Cucerzan,and E. Tırziu. 2015. Study of the fungi dynamics in a poul-try house with permanent litter. Lucrari Stiin. Med. Vet. 48:257–262.

Halaj, M., P. Halaj, J. Golian, F. Valasek, F. Moravicik, and M.Melen. 2000. The influence of storage time and temperatureon weight loss in eggs and yolk pigmentation. Acta. Fytotechn.Zootechn. 3:52–54.

Holt, P. S., R. H. Davies, J. Dewulf, R. K. Gast, J. K. Huwe, D.R. Jones, D. Waltman, and K. R. Willian. 2011. The impact of

different housing systems on egg safety and quality. Poult. Sci.90:251–262.

Jin, Y. H., K. T. Lee, W. I. Lee, and Y. K. Han. 2011. Effects ofstorage temperature and time on the quality of eggs from layinghens at peak production. Asian Australas. J. Anim. Sci. 24:279–284.

Jones, D. R., G. E. Ward, P. Regmi, and D. M. Karcher. 2018. Impactof egg handling and conditions during extended storage on eggquality. Poult. Sci. 97:716–723.

Jones, D. R., N. A. Cox, J. Guard, P. J. Fedorka-Cray, R. J. Buhr, R.K. Gast, Z. Abdo, L. L. Rigsby, J. R. Plumblee, D. M. Karcher, C.I. Robison, R. A. Blatchford, and M. M. Makagon. 2015. Microbi-ological impact of three commercial laying hen housing systems.Poult. Sci. 94:544–551.

Kokkonen, M., L. Ojala, P. Parikka, and M. Jestoi. 2010. Mycotoxinproduction of selected Fusarium species at different culture con-ditions. Int. J. Food Microbiol. 143:17–25.

Mayes, J. F., and M. A. Takeballi. 1983. Microbial contamination ofthe hen’s egg: a review. J. Food Prot. 46:1092–1098.

Niewiarowicz, A. 1991. Budowa, sk�lad chemiczny, w�lasciwosci fizyko-chemiczne i funkcjonalne oraz wartosc odzywcza jaj. Pages 101–196 In Technologia jaj, ed. A. P�lotka, WNT, Warsaw.

Ogori, A.F, and J. J. Ogori. 2014. Review on mechanism of foodpoisoning by microorganisms. Int.J.Adv. Res.Biol.Sci. 1:19–32.

Perkowski, J., M. Busko, K. Stuper, M. Kostecki, A. Matysiak, andL. Szwajkowska-Micha�lek. 2008. Concentration of ergosterol insmallgrained naturally contaminated and inoculated cereals. Bi-ologia. 63:542–547.

Piskorska-Pliszczynska, J. S., M. Mikolajczyk, M. Warenik-Bany, S.Maszewski, and P. Strucinski. 2014. Soil as a source of dioxincontamination in eggs from free-range hens on a Polish farm. Sci.Total Environ. 145:43–56.

Pitt, J. I., and A. D. Hocking. 2009. Fungi and Food Spoilage. BlackieAcademic and Professional, London (LDN).

Rodrıguez-Navarro, A. B., N. Domınguez-Gasca, A. Munoz, and M.Ortega-Huertas. 2013. Change in the chicken eggshell cuticle withhen age and egg freshness. Poult. Sci. 92:3026–3035.

Rohweder, D., H. Valenta, S. Sondermann, M. Schollenberger, W.Drochner, G. Pahlow, S. Doll, and S. Danicke. 2011. Effectof different storage conditions on the mycotoxin contaminationof Fusarium culmorum-infected and non-infected wheat straw.Mycotox Res. 27:145–153.

Silversides, F., and T. Scott. 2001. Effect of storage and layer age onquality of eggs from two lines of hens. Poult. Sci. 80:1240–1245.

Singh, R., K. M. Cheng, and F. G. Silversides. 2009. Productionperformance and egg quality of four strains of laying hens keptin conventional cages and floor pens. Poult. Sci. 88:256–264.

Stuper-Szablewska, K., T. Szablewski, R. Cegielska-Radziejewska, A.Ostrowska, A. Matysiak, and J. Perkowski. 2014. Contaminationof different kind of litter by microscopic fungi from hen house.Apar. Bad. Dydakt. 2:199–204.

Szablewski, T., K. Stuper, R. Cegielska-Radziejewska, J. Kijowski,and J. Perkowski. 2010. Ergosterol as an indicator of the presenceof microscopic fungi in eggs for human consumption produced indifferent husbandry systems. Poult. Sci. 89:2491–2493

Szablewski, T., �L. Tomczyk, and R. Cegielska-Radziejewska. 2015.Characterization of fungal microflora isolated from table eggs.Apar. Bad. Dydakt. 1/2015:8–11

Tomczyk, �L., �L. St ↪epien, M. Urbaniak, T. Szablewski, R. Cegielska-Radziejewska, and K. Stuper-Szablewska. 2018. Characterisationof the mycobiota on the shell surface of table eggs acquired fromdifferent egg-laying hen breeding systems. Toxins. 10:293.

Wall, H., R. Tauson, and S. Sorgjerd. 2008. Bacterial contaminationof eggshells in furnished and conventional cages. J. Appl. Poult.Res. 17:11–16.

Dow

nloaded from https://academ

ic.oup.com/ps/article-abstract/98/7/2964/5429433 by guest on 01 July 2019

Emir. J. Food Agric ● Vol 30 ● Issue 2 ● 2018 131

An assessment of the influence of silver stabilized hydrogen peroxide on the eggshell conditionŁukasz Tomczyk1*, Tomasz Szablewski1, Renata Cegielska-Radziejewska1, Lidia Lewko2, Piotr Konieczny1

1Department of Food Quality Management, Poznań University of Life Sciences, ul. Wojska Polskiego 71, 60-625 Poznań, Poland, 2National Research Institute of Animal Production, Department of Animal Genetic Resources Conservation, Zakrzewo, ul. Poznańska 18, 62-070 Dopiewo, Poland

*Corresponding author: Łukasz Tomczyk, Department of Food Quality Management, Poznań University of Life Sciences, ul. Wojska Polskiego 28, 60-625 Poznań, Poland. Phone: +48 628 486 262. E-mail: tomczyk@up.poznan.pl

Received: 07 August 2017; Accepted: 31 January 2018

INTRODUCTION

Due to the high consumption of eggs in recent years, producers have been obliged to guarantee adequate quality of their products. The quality of eggs is determined by a set of traits, such as their size, weight, shape (Haugh unit > 75), appearance (clean and undamaged shell), nutritional value, safety (absence of pathogenic microorganisms, toxins and heavy metals). Other important factors are the health of egg-laying hens and the conditions of egg acquisition, storage and distribution.

The environmental conditions of a henhouse significantly determine the microbiological state of eggs. Inappropriate storage and distribution conditions may accelerate the development of microflora. During storage the microflora on the eggshell surface may penetrate through pores into the egg content (Baron, 2007; Szablewski et al., 2010b).

The presence of microorganisms results in changes in the colour of the egg white or yolk (Pseudomonas, Aeromonas, Enterobacter), changes in the eggshell membrane (Flavobacterium and Serratia), as well as egg white and yolk proteolysis (Proteus) (Corry, 2007).

In the USA, Australia and Japan it is common to wash eggs before they are offered for sale in order to reduce microorganisms on the eggshell surface (Hutchison et al., 2003). At the stage of acquisition eggs are dirty because of the contact with the substrate and feed. Eggshells can be washed. Other treatments may also reduce microorganisms on the eggshell surface and in consequence, the process of egg spoilage can be delayed. These treatments include ionising radiation (Farkas, 1998), UV radiation (Coufal et al., 2003; Rodriguez-Romo and Yousef, 2005; Szablewski et al., 2010a), ozonation (Davies and Breslin, 2003; Rodriguez-Romo and Yousef, 2005) and ultrasound

The aim of the study was to assess the condition of eggshells hygienised with an silver stabilized hydrogen peroxide of different concentrations. Eggs were treated with a solution of the preparation and stored for four weeks. In preliminary investigations the elastic deformation of eggshells was measured and analysed in order to determine the influence of a preparation concentrated at 0.01-3% on the eggshell strength. The research proved that a preparation concentrated at 1-3% significantly reduced the eggshell strength. At the next stage of the research, having excluded the high concentrations with a negative effect on eggshell strength, i.e. 1-3%, the experiment was conducted again. It was followed by a microbiological analysis in which the total count of aerobic bacteria, yeasts, moulds ad also bacteria from the Pseudomonas genus and Enterobacteriaceae family were measured. The investigations confirmed that the preparation concentrated at 0.01-0.9% did not have a significant influence on eggshell strength. Hygienisation in solutions concentrated at 0.01-0.9% caused complete inactivation of bacteria of the Enterobacteriaceae family, yeasts and moulds. Immediately after treatment with the preparation concentrated at 0.3% the count of aerobic bacteria and the bacteria of the Pseudomonas genus decreased by 1.9 log CFU/g and 0.7 log CFU/g, respectively. The hygienisation of eggs with the preparation concentrated at 0.9% and storing them for four weeks under controlled conditions reduced the count of aerobic bacteria by 1.9 log and the count of Pseudomonas bacteria by 1.7 log, as compared with the reference sample.

Keywords: Silver ions; Hydrogen peroxide; Eggs; Eggshell strength; Microbiological quality

A B S T R A C T

Emirates Journal of Food and Agriculture. 2018. 30(2): 131-136doi: 10.9755/ejfa.2018.v30.i2.1605http://www.ejfa.me/

R E G U L A R A R T I C L E

Tomczyk, et al.

132 Emir. J. Food Agric ● Vol 30 ● Issue 2 ● 2018

treatment (Cabeza, 2005). It is important to consider the influence of selected hygienising treatments on eggshell strength. Appropriate eggshell quality guarantees the mechanical safety of eggs, which may be damaged during storage and distribution.

Hydrogen peroxide can be successfully applied to hygienise the egg surface. The method of H2O2 antimicrobial activity is based on protein oxidation. Simultaneous application of an H2O2 solution and silver ions may improve the effectiveness of hygienisation by reducing the time of exposure to the preparation on the egg surface (Jung et al., 2008). Therefore, the aim of the study was to determine the influence of different concentrations of silver stabilized hydrogen peroxide on the eggshell strength and microbiological quality.

MATERIAL AND METHODS

The research material was 490 eggs from Hy-Line White hens kept in cages. The eggs were acquired in the 32nd week of the laying phase. A preparation containing hydrogen peroxide (50%) with silver ions (0.5%) at different concentrations was used for the analysis. The hygienisation procedure consisted in immersing an egg for 5 minutes in water solutions of the preparation concentrated at 0.01-3% at a temperature of 10°C. Analyses were made on the egg laying day and after four weeks of storage. The eggs were dried at a temperature of 15°C and transferred to sterile boxes. Then they were stored at a controlled temperature (6±2oC) and humidity (65%), which were applied by means of chilling chamber (Binder KBF 115, Poland). The eggshell strength was assessed by measuring its elastic deformation under pressures of 0.05 kg, 1.00 kg and 1.50 kg, which were applied by means of a manual apparatus (N.V. Marius, Poland). In the next stage of the study, having excluded high concentrations, i.e. 0.9-3%, the experiment was repeated. The investigations were extended by microbiological analysis, which involved measurements of the total count of aerobic bacteria, bacteria of the Pseudomonas genus and Enterobacteriaceae family, yeasts and moulds by means of the pour-plate method. The microbiological analyses were carried by International Organization for Standardization (ISO) reference methods (according to the Polish Standard of PN-ISO). Analyses of eggshell strength and microbiological analysis were conducted on the egg-laying day and on the 7th, 14th, 21st and 28th day of storage. For microbiological analysis of eggshells, the surface of the 3 eggs was considered a sample. Each group of 3 eggs was kept in in contact witch 90 ml of buffered peptone water for 10 min. The broth was transferred to a dilution serie. The solution

was spread on Nutrient Agar, Agar with Cetrimide, Fucidin and Cephaloridine (BTL, Lodz, Poland), Agar with Crystal Violet, Neutral Red, Bile and Glucose (BTL, Lodz, Poland) and Agar with Dichloran, Rose Bengal and Chloramphenicol (BTL, Lodz, Poland). Duplicates were made for all plates. The plates were incubated for 24-48 hours at 30 °C, except for the agar with crystal violet, neutral red, bile and glucose which was incubated at 42 °C. The swabs were spread on the same kind of plates as the eggs. The eggshell strength and microbiological analysis were analyzed using means of a linear function of the regression including the interaction of concentrations (0–3 %), eggshell strength (0.05 kg, 1.00 kg and 1.50 kg) and microbiological analysis (count of aerobic bacteria, bacteria of the Pseudomonas genus, Enterobacteriaceae family, yeasts and moulds). All analyses were undertaken using the Statistica 12.5 statistical package.

RESULTS AND DISCUSSION

Analysis of eggshell strength conducted immediately after treatment with the preparation at low concentrations, i.e. 0.01-3%, did not reveal any significant influence (Fig. 1). After four weeks of storage, the eggshell strength was reduced in the samples hygienised with the preparation at higher concentrations, i.e. 1-3% (Fig. 2). The changes in elastic deformation may have been caused by the reaction of the silver stabilized hydrogen peroxide with the outer layer of the shell, which is composed almost only of pure calcium carbonate.

The eggshell strength tests were repeated with the preparation at lower concentrations, i.e. 0.01-0.9%. They confirmed that the concentrations of silver stabilized hydrogen peroxide applied did not have a statistically significant influence on the control samples immediately after treatment or after 4 weeks of storage (Fig. 3). As eggs undergo numerous treatments during acquisition, storage and distribution, it is necessary for the eggshell to be strong and elastic. Studies revealed that the choice of an appropriate breeding system of egg-laying hens and the method of egg sorting and packaging were critical elements for guaranteeing undamaged shells (Mertens et al., 2006). Batkowska and Brodacki (2014) observed in their study, the eggshell was more resistant to damage when eggs were washed by immersion in water at a temperature of 10-21°C. Their research revealed that the faster diffusion of steam from the egg content made the eggshell more elastic. On the other hand, treatment with sodium hypochlorite containing free chlorine had a negative influence on the outer eggshell structure. At the same time, the research revealed that chemicals may have penetrated into the egg content (Favier et al., 2000).

Tomczyk, et al.

Emir. J. Food Agric ● Vol 30 ● Issue 2 ● 2018 133

The results of the microbiological analysis of the eggshell surface conducted immediately after treatment with the preparation at different concentrations showed that bacteria of the Enterobacteriaceae family, yeasts and moulds were sensitive to it. Egg hygienisation in hydrogen peroxide

and silver ions concentrated at 0.1-0.9% caused complete inactivation of the microorganisms. As a result, they did not proliferate during the four weeks of storage. The study by Padron (1995) gave similar results regarding the influence of H2O2 on bacteria from the Enterobacteriaceae

Fig 1. The mean values of elastic deformation of eggshells hygienised with the silver stabilized hydrogen peroxide, n=61.

Fig 2. The mean values of elastic deformation of eggshells hygienised with the silver stabilized hydrogen peroxide after 4 weeks of storage, n=61.

Tomczyk, et al.

134 Emir. J. Food Agric ● Vol 30 ● Issue 2 ● 2018

family, but the bacterial count was reduced by treatment with hydrogen peroxide at a higher concentration (6%). The effectiveness of much lower concentrations of the preparation in reducing the bacteria was probably caused by silver ions. Studies showed that silver in the form of ions or nanoparticles had a strong antimicrobial effect (Choi et al., 2008; Rai et al., 2008).

The increase in the concentration of the preparation to 0.03% also caused statistically significant changes in the count of aerobic bacteria and bacteria of the Pseudomonas genus immediately after treatment. When silver stabilized hydrogen peroxide concentrated at 0.3% was applied, the count of aerobic bacteria and bacteria of the Pseudomonas genus decreased by 1.9 and 0.7 log CFU/g, respectively (Fig 4). Tukey’s test proved that a further increase in the

concentration of the preparation to 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8 and 0.9% resulted in an insignificant reduction in the count of microorganisms in comparison with eggs hygienised in a 0.3% silver stabilized hydrogen peroxide. In the study by Sheldon et al. (1991), the bacterial count on the shell of hatching eggs was reduced by 5 log CFU/g when a 5% hydrogen peroxide solution without silver ions was applied.

The influence of the concentration of the preparation and the storage time was assessed by means of a linear function of the regression analysis. The highest concentration of the preparation, i.e. 0.9%, reduced the count of aerobic bacteria and bacteria of the Pseudomonas genus in eggs stored for four weeks under controlled conditions by 1.8 and 1.7 log CFU/g, respectively (Fig 5).

Fig 3. The mean values of elastic deformation of eggshells hygienised with the silver stabilized hydrogen peroxide at different storage periods, n=122.

Tomczyk, et al.

Emir. J. Food Agric ● Vol 30 ● Issue 2 ● 2018 135

Many studies showed that the effectiveness of treatments applied to eggs also depended on the storage temperature. The storage temperature of washed eggs affected the egg quality to a greater extent than the storage time (Yu-Chi et al., 2016). Washing reduces the temperature inside the egg at a faster rate. This affects the microbiological quality and physiochemical traits of eggs (Caudill et al., 2010). The method of egg hygienisation with silver stabilized hydrogen peroxide at a temperature of 8oC significantly reduced the count

of microorganisms on the eggshell surface and cooled the egg content quickly.

CONCLUSIONS

The egg hygienisation treatment with the silver stabilized hydrogen peroxide did not worsen the eggshell strength under the experimental conditions (immersion in solutions concentrated up to 0.9% for 5 minutes). The best hygienising effect was observed when the solution of the

Fig 4. The influence of silver stabilized hydrogen peroxide concentration on the count of bacteria of the Pseudomonas genus and aerobic bacteria, n=61.

Fig 5. The influence of the concentration of silver stabilized hydrogen peroxide and the storage time on the count of aerobic bacteria and bacteria of the Pseudomonas genus, n=245.

Tomczyk, et al.

136 Emir. J. Food Agric ● Vol 30 ● Issue 2 ● 2018

silver stabilized hydrogen peroxide was concentrated at 0.3%. It resulted in a significant reduction of the count of selected microorganisms on the eggshell. The hygienising effect was observed both immediately after the treatment and during storage for four weeks. The research findings show that treatment with a silver stabilized hydrogen peroxide under the experimental conditions is a safe procedure because eggshells retain the required mechanical properties and their microbiological cleanness is improved.

Authors’ contributionsŁ.T, R.CR, P.K and T.Sz designed and directed the project; Ł.T and L.L performed the experiments, R.CR developed the theoretical framework; Ł.T and R.CR wrote the article.

REFERENCES

Baron, F., M. F. Cochet, N. Grosset, M. N. Madec, R. Briandet, S. Dessaigne, S. Chevalier, M. Gautier and S. Jan. 2007. Isolation and characterization of a psychrotolerant toxin producer, Bacillus weihenstephanensis, in liquid egg products. J. Food Prot. 70(12): 2782-2791.

Batkowska, J. and A. Brodacki. 2014. Wpływ mycia skorupy na wybrane cechy jakości jaj kurzych w czasie przechowywania. Zywn Nauk Technol. Ja. 93: 204-213.

Cabeza, C. M., M. M. García, L. Hoz and I. Cambero. 2005. Thermoultrasonication eliminates salmonellae from intact eggshells without changing the functional properties of their components. J. Food Sci. 70(6): m292-m295.

Caudill, A. B., P. A. Curtis, K. E. Anderson, L. K. Kerth, O. Oyarazabal, D. R. Jones and M. T. Musgrove. 2010. The effects of commercial cool water washing of shell eggs on Haugh unit, vitelline membrane strength, aerobic microorganisms, and fungi. Poult Sci. 89(1): 160-168.

Choi, O., K. K. Deng, N. J. Kim, L. Jr., Ross, R. Y, Surampalli, Z. Hu. 2008. The inhibitory effects of silver nanoparticles, silver ions, and silver chloride colloids on microbial growth. Water Res. 42(12): 3066-3074.

Coufal, C. D., C. Chavez, K. D. Knape and J. B. Carey. 2003. Evaluation of a method of ultraviolet light sanitation of broiler hatching eggs. Poult Sci. 82(5): 754-759.

Corry, J. E. L. 2007. Microbiological analysis of eggs and egg products. W: Microbiological analysis of red meat, poultry and

eggs. In: Red. G. C. M., (Ed.), CRC Press, Cambridge England, pp. 182-187.

Davies, R. H. and M. Breslin. 2003. Investigations into possible alternative decontamination methods for Salmonella enteritidis on the surface of table eggs. J. Vet. Med. B Infect. Dis. Vet. Public Health. 50(1): 38-41.

Farkas, J. 1998. Irradiation as a method for decontaminating food. A review. Int. J. Food Microbiol. 44(3): 189-204.

Favier, G. I., M. E. Escudero, L. Velázquez and A. M. De Guzmán. 2000. Reduction of Yersinia enterocolitica and mesophilic aerobic bacteria in egg-shell by washing with surfactants and their effect on the shell microstructure. Food Microbiol. 17(1): 73-81.

Hutchison, M., J. Gittins, A. Walker and A. Moore. 2003. Washing table eggs: A review of the scientific and engineering issues. Worlds Poult Sci. J. 59(2): 233-248.

Jung, W. K., H. C. Koo, K. W. Kim, S. Shin, S. H. Kim and Y. H. Park. 2008. Antibacterial activity and mechanism of action of the silver ion in Staphylococcus aureus and Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 74(7): 2171-2178.

Mertens, K., F. Bamelis, B. Kemps, B. Kamers, E. Verhoelst, B. D. Ketelaere, M. Bain, E. Decuypere and J. De Baerdemaeker. 2006. Monitoring of eggshell breakage and eggshell strength in different production chains of consumption eggs. Poult. Sci. 85(9): 1670-1677.

Padron, M. 1995. Egg dipping in hydrogen peroxide solution to eliminate Salmonella typhimurium from eggshell membranes. Avian Dis. 39(3): 627-630.

Rai, M., A. Yadav and A. Gade. 2008. Silver nanoparticles as a new generation of antimicrobials. Biotechnol. Adv. 27(1): 76-83.

Rodriguez-Romo, L. A. and Yousef A.E. 2005. Inactivation of Salmonella enterica serovar enteritidis on shell eggs by ozone and UV radiation. J Food Prot. 68(4): 711-717.

Sheldon, B. W. and J. Brake. 1991. Hydrogen peroxide as an alternative hatching egg disinfectant. Poult Sci. 70(5): 1092-1098.

Szablewski, T., J. Kijowski, R. Cegielska-Radziejewska, A. Dziedzic and A. Kamińska. 2010a. Wpływ promieniowania UV na stan mikrobiologiczny skorupy oraz jakość treści jaj. Zywn Nauk Technol. JA. 2(63): 40-52.

Szablewski, T., K. Stuper, R. Cegielska-Radziejewska, J. Kijowski and J. Perkowski. 2010b. Ergosterol as an indicator of the presence of microscopic fungi in eggs for human consumption produced in different husbandry systems. Poult Sci. 89(11): 2491-2493.

Yu-Chi, L., C. Ter-Hsin, W. Ying-Chen, L. Yi-Chain and T. Fa-Jui. 2016. Effects of egg washing and storage temperature on the quality of eggshell cuticle and eggs. Food Chem. 211: 687-693.

Strona | 55

III. Oświadczenia współautorów publikacji stanowiących przedmiot

rozprawy doktorskiej