Udział bakteryjnych dioksygenaz z rodziny AlkB w naprawie …ibb.waw.pl/sites/default/files/Beata...

Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego

w Warszawie

Wydział Rolnictwa i Biologii

Beata Krowisz Numer albumu 118999

Udział bakteryjnych dioksygenaz z

rodziny AlkB w naprawie

egzocyklicznych uszkodzeń DNA The role of bacterial AlkB dioxygenases in repair of exocylic

DNA adducts

Praca magisterska

na kierunku Biologia

Praca wykonana pod kierunkiem

dr Agnieszki Maciejewskiej

Zakład Biologii Molekularnej IBB PAN

Warszawa, rok 2010

3

Pragnę serdecznie podziękować

dr Agnieszce Maciejewskiej

za promotorska opiekę, teoretyczne i praktyczne zapoznanie mnie z tematem,

pomoc i wsparcie podczas pisania niniejszej pracy magisterskiej

prof. dr hab. Jarosławowi Kuśmierkowi

za wsparcie naukowe i umożliwienie mi wykonania części doświadczalnej w Zakładzie

Biologii Molekularnej IBB PAN

4

Praca została zrealizowana w ramach polsko-norweskiego grantu nr PNRF-143-AI-

1/07.

The AlkB protein and its eukaryotic homologues – the role in DNA repair and the

possible role in cancer etiology and target in cancer therapy (Białko AlkB i jego

eukariotyczne homologi – rola w naprawie DNA i potencjalny udział w etiologii

nowotworów oraz jako cel w terapii przeciwnowotworowej).

5

Oświadczenie promotora pracy

Oświadczam, że niniejsza praca została przygotowana pod moim kierunkiem i

stwierdzam, że spełnia ona warunki do przedstawienia jej w postępowaniu o nadanie

tytułu zawodowego.

Data ..................................... Podpis promotora pracy . ............................................

Oświadczenie autora pracy

Świadom odpowiedzialności prawnej oświadczam, że niniejsza praca dyplomowa

została napisana przeze mnie samodzielnie i nie zawiera treści uzyskanych w sposób

niezgodny z obowiązującymi przepisami.

Oświadczam również, że przedstawiona praca nie była wcześniej przedmiotem procedur

związanych z uzyskaniem tytułu zawodowego w wyższej uczelni.

Oświadczam ponadto, że niniejsza wersja pracy jest identyczna z załączoną wersją

elektroniczną.

Data ..................................... Podpis autora pracy . ..................................................

7

Streszczenie

Udział bakteryjnych dioksygenaz z rodziny AlkB w naprawie egzocyklicznych

uszkodzeń DNA

Gen alkB jest częścią systemu odpowiedzi adaptacyjnej na środki alkilujące bakterii

Escherichia coli. Białko AlkB jest dioksygenazą zależną od α-ketoglutaranu i Fe (II).

Usuwa grupy metylowe z m3C i m

1A oraz mostki etenowe z cytozyny

i adeniny, pozostawiając natywne DNA. Homologi genu alkB znaleziono u wielu

organizmów, także u człowieka.

Badano właściwości naprawcze białka AlkB i jego homologów: SA-1A i SA-2B,

występujących u Streptomyces avermitilis. Ustalono optymalne warunki naprawy

3,N4-α-hydroksyetanocytozyny i 3,N

4-α-hydroksypropanocytozyny przez AlkB

i SA-1A. Stwierdzono, że SA-1A nie naprawia 1,N6etenoadeniny i 3N

4etenocytozyny

natomiast SA-2B nie wykazuje aktywności wobec żadnego z badanych adduktów.

Słowa kluczowe — dioksygenaza, AlkB, modyfikacje DNA, addukty egzocykliczne,

naprawa DNA

Summary

The role of bacterial AlkB dioxygenases in repair of exocylic DNA adducts

The AlkB gene is a part of the system of adaptive response to alkylating agents in

Escherichia coli. AlkB is a member of the superfamily of α-ketoglutarate- and iron-

dependent dioxygenases. AlkB removes methyl groups from m3C and m

1A, and etheno

bridges from εC and εA, restoring native DNA structure. Analogous alkB genes were

found in various organisms including humans.

Repair activity of AlkB and its homologues from Streptomyces avermitilis: SA-1A and

SA-2B was studied. Optimal conditions for AlkB and SA-1A repair of

3,N4-α-hydroxyethanocytosine and 3,N

4-α-hydroxypropanocytosine were established.

SA-1A does not repair 3,N4-ethenocytosine and 1,N

6-ethenoadenine. SA-2B activity

against the studied adducts was not observed.

Keywords — dioxygenase, AlkB, DNA modifications, exocyclic adducts, DNA repair

9

Spis treści

I Wstęp ........................................................................................................................ 13

I.1 Czynniki uszkadzające DNA ............................................................................... 13

I.1.1. Chlorek winylu i produkty jego metabolizmu ............................................... 13

I.1.2. Czynniki alkilujące ...................................................................................... 14

I.1.3. Czynniki oksydacyjne .................................................................................. 15

I.1.4. Produkty peroksydacji lipidów ..................................................................... 16

I.1.5. Egzocykliczne addukty zasad DNA.............................................................. 18

I.1.5.1. Etenoaddukty ......................................................................................... 18

I.1.5.2. Propanoaddukty ..................................................................................... 19

I.2. Naprawa uszkodzonego DNA ............................................................................ 20

I.2.1. Rola białka AlkB w naprawie uszkodzeń DNA ............................................ 22

I.2.1.1. Budowa białka AlkB .............................................................................. 22

I.2.1.2. Mechanizm działania ............................................................................. 23

I.2.1.3. Bakteryjne homologi AlkB .................................................................... 24

I.2.1.4. Homologi AlkB występujące u ssaków .................................................. 26

II Cel pracy ................................................................................................................. 28

III.1. Materiały ......................................................................................................... 29

III.1.1. Odczynniki ................................................................................................ 29

III.1.2. Bufory ....................................................................................................... 30

III.1.2.1. Bufory stosowane do oczyszczania białka ........................................... 30

III.1.2.2. Bufory stosowane do reakcji modyfikacji pentametrów i ich naprawy

przez badane białka............................................................................................ 31

III.1.3. Pentamery ................................................................................................. 31

III.1.4. Enzymy ..................................................................................................... 31

III.1.5. Antybiotyki ............................................................................................... 31

III.1.6. Pożywki .................................................................................................... 31

III.1.7. Aparatura .................................................................................................. 32

III.1.7.1. Aparatura do oczyszczania białek ........................................................ 32

III.1.7.2. Aparatura do reakcji modyfikacji pentametrów i ich naprawy przez

badane białka ..................................................................................................... 32

III.1.8. Inne materiały ........................................................................................... 32

III.2. Metody ............................................................................................................ 33

III.2.1. Sporządzanie buforów ............................................................................... 33

III.2.1.1. Bufory stosowane do oczyszczania białka ........................................... 33


przez badane białka............................................................................................ 33

III.2.1.3. Bufor do chromatografii wysokociśnieniowej ...................................... 33

III.2.2. Transformacja bakterii szczepu E. coli BL21 (DE3) plazmidem

pET28a/pSA ......................................................................................................... 34

III.2.3. Ekspresja białka SA-2B w szczepie E. coli BL21 (DE3) niosącym plazmid

pET28a/pSA ......................................................................................................... 34

III.2.4. Dysrupcja komórek ................................................................................... 35

III.2.5. Oczyszczanie białka SA-2B ....................................................................... 35

III.2.6. Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym .................................................. 36

III.2.7. Oznaczanie stężenia białka metodą Bradford ............................................. 36

III.2.8. Przygotowanie substratów do reakcji naprawy przez badane białka ........... 36

10

III.2.8.1. Otrzymywanie pentamerów zawierających etanocytozynę TT(εC)TT

oraz hydroksyetanocytozynę TT(HEC)TT..........................................................36

III.2.8.2. Otrzymywanie pentamerów zawierających hydroksypropanocytozynę

TT(HPC)TT .......................................................................................................37

III.2.8.3. Otrzymywanie substratu zawierającego etenoadeninę TT(εA)TT.........37

III.2.9. Badanie aktywności białka AlkB, SA-1A i SA-2B .....................................38

III.2.9.1. Zależność naprawy od pH....................................................................38

III.2.9.2. Zależność naprawy od stężenia α-KG ..................................................39

III.2.9.3. Zależność naprawy od stężenia jonów Fe (II) ......................................40

III.2.9.4. Zależność naprawy od czasu ................................................................40

IV Wyniki ...................................................................................................................42

IV.1. Oczyszczanie białka SA-2B .............................................................................42

IV.2. Chemiczna modyfikacja pentamerów TTCTT i TTATT ..................................43

IV.2.1. Modyfikacja pentamerów zawierających cytozynę (TTCTT) .....................43

IV.2.2. Modyfikacja pentamerów zawierających adeninę (TTATT).......................45

IV.3. Badanie naprawy modyfikowanych oligomerów przez białko AlkB in vitro ....46

IV.3.1. Naprawa TT(HEC)TT ...............................................................................47

IV.3.1.1. Zależność naprawy od pH ...................................................................47

IV.3.1.2. Zależność naprawy od stężenia Fe (II) .................................................48

IV.3.1.3. Zależność naprawy od stężenia α-KG ..................................................49

IV.3.1.4. Zależność naprawy od czasu................................................................50

IV.3.2. Naprawa TT(HPC)TT ...............................................................................51




IV.3.2.4. Zależność naprawy od czasu................................................................54

IV.4. Badanie naprawy in vitro modyfikowanych oligomerów przez bakteryjne

homologi białka AlkB: SA-1A i SA-2B ....................................................................55

IV.4.1. Białko SA-1A ............................................................................................55




IV.4.2. Białko SA-2B ............................................................................................60

V Dyskusja ..................................................................................................................61

Aneks ..........................................................................................................................69

Spis literatury ..............................................................................................................71

Spis rysunków .............................................................................................................79

Spis tabel .....................................................................................................................81

11

Spis używanych skrótów VC (ang. vinyl chloride) – chlorek winylu

CEO (ang. chloroethylene oxide) – tlenek chloroetylenu

CAA (ang. chloroacetaldehyde) – aldehyd chlorooctowy

CRA (ang. crotonaldehyde) – aldehyd krotonowy

ACR (ang. acrolein) – akroleina

HNE (ang. trans-4-hydroxy-2-nonenal) – 4-hydroksynonenal

MDA, MA (ang. malondialdehyde) – dialdehyd malonowy

ROS (ang. reactive oxygen species) – reaktywne formy tlenu

εA – 1,N6-etenoadenina

εC – 3,N4-etenocytozyna

HEC – 3,N4-α-hydroksyetanocytozyna

HPC – 3,N4-α-hydroksypropanocytozyna

TT(εA)TT, TεA – pentamer zawierający 4 tyminy i 1,N6-etenoadeninę (εA)

TT(εC)TT, TεC – pentamer zawierający 4 tyminy i 3,N4-etenocytozynę (εC)

TT(HEC)TT, THEC – pentamer zawierający 4 tyminy i 3,N4-α-hydroksyetanocytozynę

(HEC)

TT(HPC)TT, THPC – pentamer zawierający 4 tyminy i 3,N4-α-

hydroksypropanocytozynę (HPC)

EcAlkB – dioksygenaza AlkB pochodząca z E. coli, główny przedstawiciel rodziny

białek AlkB

SA-1A – homolog białka EcAlkB pochodzący z bakterii Streptomyces avermitilis

SA-2B – homolog białka EcAlkB pochodzący z bakterii Streptomyces avermitilis

HPLC (ang. high performance / high pressure liquid chromatography) –

wysokosprawna / wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa

MeOH – metanol

TEAA – octan trójetyloaminy

IPTG – izopropylo-β-D-tiogalaktopiranozyd

SDS – dodecylosiarczan sodu

DTT – ditiotreitol

13

I Wstęp

Kwas deoksyrybonukleinowy jest podstawowym nośnikiem informacji

genetycznej, determinującym budowę, metabolizm, a nawet zachowanie organizmów

żywych. Uszkodzenia DNA odgrywają bardzo ważną rolę w procesach nowotworzenia

i starzenia się, dlatego też integralność i stabilność DNA jest niezbędna dla

prawidłowego funkcjonowania komórek. Wszystkie organizmy są wystawione na

działanie czynników mutagennych, zarówno pochodzenia egzo- jak i endogennego. Do

egzogennych czynników uszkadzających DNA zalicza się substancje występujące

w środowisku naturalnym (np.: aflatoksyna B1), substancje chemiczne powstałe podczas

procesów przemysłowych (np.: chlorek winylu), promieniowanie UV i jonizujące,

czynniki alkilujące (np.: metanosulfonian metylu - MMS), składniki dymu

papierosowego. Wśród czynnikami endogennych można wyróżnić aktywne formy tlenu

powstałe w procesie oddychania tlenowego w mitochondriach, czy też produkty

peroksydacji lipidów (Śliwiński i Błasiak 2005).

I.1 Czynniki uszkadzające DNA

I.1.1. Chlorek winylu i produkty jego metabolizmu

Chlorek winylu (VC) jest związkiem chemicznym stosowanym do produkcji

polimerów i kopolimerów wykorzystywanych w przemyśle tworzyw sztucznych.

Należy do rodziny halogenowych pochodnych etylenowych. U ludzi narażonych na

długotrwałe działanie VC stwierdzono liczne zmiany naczyniowe i kostne. Już w latach

czterdziestych ubiegłego wieku obserwowano przypadki powstawania nowotworów

u ludzi wystawionych na długotrwałą ekspozycję chlorkiem winylu, dlatego też

prowadzono badania w celu ustalenia mechanizmów kancerogennego i mutagennego

działania VC i jego metabolitów (Mroczkowska-Słupska i Kuśmierek 1994).

Chlorek winylu jest metabolizowany w wątrobie przy udziale cytochromu P450

II E 1. Pierwotnym produktem utleniania chlorku winylu przez ten cytochrom jest

tlenek chloroetylenu (CEO). Jest to związek wysoce nietrwały, szybko ulega

przegrupowaniu do aldehydu chlorooctowego (CAA) oraz hydrolizie do aldehydu

glikolowego, które są związkami trwałymi. CEO i CAA reagują z kwasami

nukleinowymi i białkami. Posiadają dwie aktywne grupy funkcyjne.

W przypadku CEO są to chlor i ugrupowanie epoksydowe, natomiast w przypadku

CAA chlor i grupa aldehydowa. W wyniku reakcji z kwasami nukleinowymi oba te

14

związki tworzą etenopochodne oraz wiązania krzyżowe. Wśród adduktów zasad DNA

powstałych w wyniku działania VC można wyróżnić 7-(2-oksoetylo)guaninę (7oeG),

N2,3-etenoguaninę (N

2,3-εG), 3,N

4-etenocytozynę (3,N

4εC, εC) oraz 1,N

6-etenoadeninę

(1,N6εA, εA) (Mroczkowska-Słupska i Kuśmierek 1994).

C C

H

Cl

H

H

HOCH2

C

O

H

ClCH2

C

O

H

C C

H

Cl

H

H

O

chlorek winylu (VC)

[O]

cytochrom P-450 2E1

aldehyd glikolowy tlenek chloroetylenu

( CEO)

aldehyd chlorooctowy

( CAA)

hydroliza przegrupowanie

Rys 1. Aktywacja metaboliczna chlorku winylu (Mroczkowska-Słupska i Kuśmierek 1994)

I.1.2. Czynniki alkilujące

Do czynników alkilujących należy grupa mutagenów i kancerogenów, które

modyfikują DNA poprzez alkilację. Niektóre z tych czynników są rozpowszechnione

w środowisku, inne natomiast to produkty normalnego metabolizmu. Związki alkilujące

mogą zakłócać replikację, transkrypcję czy też sygnalizować aktywację apoptozy.

U ssaków mogą być zaangażowane w kancerogenezę, choroby neurodegeneracyjne,

procesy starzenia (Nieminuszczy J, Grzesiuk E, 2007). Czynniki alkilujące mogą

dołączać grupy metylowe i etylowe do wszystkich dostępnych atomów tlenu i azotu

w zasadach DNA produkując dużą liczbę uszkodzeń. Dwie spośród 11

zidentyfikowanych modyfikacji DNA: 3-metyloadenina (m3A) oraz O

6-metyloguanina

(O6meG), są głównie odpowiedzialne za biologiczne efekty alkilacji (Singer 1976).

Rodzaj wywoływanych uszkodzeń zależy od czynnika, mechanizmu reakcji i struktury

drugorzędowej substratu (Nieminuszczy i Grzesiuk 2007).

Ze względu na mechanizm reakcji, czynniki alkilujące można podzielić na dwie

podgrupy. Czynniki z podgrupy SN1, takie jak N-metylo-N-nitrozomocznik (MNU)

i N-metylo-N’-nitro-N-nitrozoguanidyna (MNNG), wykorzystują mechanizm

15

jednocząsteczkowy. Natomiast te z podgrupy SN2 np.: metanosulfonian metylu (MMS),

jodek metylu (MeI), bazują na mechanizmie dwucząsteczkowym. Czynniki alkilujące

typu SN1 przyłączają addukty do atomów tlenu i azotu, natomiast czynniki typu SN2

alkilują tylko atom azotu. Głównymi modyfikacjami wywołanymi przez czynniki

metylujące w dwuniciowym DNA są: m7G, m

3A, O

6meG, natomiast m

1A, m

3C, m

7A

i O4meT występują rzadziej. W jednoniciowym DNA m

1A i m

3C występują częściej niż

w dsDNA. Wśród czynników metylujących najbardziej mutagenny jest O6meG.

Modyfikacja ta w dsDNA powoduje tranzycję GC→AT (Falnes i Rognes 2003).

Jak już wspomniano, czynniki alkilujące występują nie tylko w środowisku,

mogą też mieć pochodzenie endogenne. Do takich związków można zaliczyć

S-adenozylometioninę (SAM), która jest głównym biologicznym donorem grup

metylowych oraz prekursorem grup aminopropylowych wykorzystywanych

w biosyntezie poliamin (Lu 2000). Ponieważ metylacja odgrywa niezwykle ważną rolę

w procesach odbywających się w komórce (np.: w ekspresji genów), każda zmiana

stężenia SAM może powodować zaburzenia w funkcjonowaniu komórki.

Nieprawidłowości w metabolizmie SAM mogą być przyczyną chorób wątroby,

niektórych zaburzeń neurologicznych i kancerogenezy (Lutz 1990). SAM może

spontanicznie metylować DNA. Wykorzystuje mechanizm typu SN2 i powoduje

powstawanie głównie m7G i m

3A, rzadziej O

6meG ( Nieminuszczy i Grzesiuk 2007).

Wśród czynników alkilujących występujących w środowisku, bardzo duży

wpływ na zdrowie ludzi mają nitrozoaminy będące składnikami dymu papierosowego.

Do najbardziej kancerogennych należą 4-(metylonitrozoamino)-1-(3-pirydylo)-

1-butanon (NNK), 4-(metylonitrozoamino)-1-(3-pirydylo)-1-butanol (NNAL)

i N’-nitrozonornikotyna (NNN) (Hecht 2002).

I.1.3. Czynniki oksydacyjne

W wyniku wielu procesów metabolicznych zachodzących w komórce powstają

reaktywne formy tlenu takie jak: nadtlenek wodoru, tlen atomowy czy rodnik

hydroksylowy. Związki te mogą reagować z DNA i powodować pęknięcia nici,

uszkodzenia pojedynczej zasady, tworzenie adduktów objętościowych. Termin addukty

objętościowe określa m.in.: wiązania krzyżowe oraz addukty pierścieniowe (Moller

i Tallin 1998). Wśród modyfikacji zasad azotowych można wyróżnić takie, które są

potencjalnie mutagenne oraz takie, które blokują proces replikacji. Jednym

16

z oksydacyjnych uszkodzeń hamujących replikację DNA jest glikol tyminy.

Prawdopodobnie produkty częściowego rozpadu pierścienia purynowego (FapyA

i FapyG) również mogą zablokować proces replikacji (Wallace 1994).

I.1.4. Produkty peroksydacji lipidów

Peroksydacja lipidów to proces fizjologiczny, podczas którego dochodzi do

utlenienia wielonienasyconych kwasów tłuszczowych (PUFA), będących podstawowym

składnikiem błon biologicznych. Powstałe wodoronadtlenki ulegają dalszym

przemianom, w wyniku których powstają stabilne, nierodnikowe związki zawierające

grupy funkcyjne: aldehydowe, ketonowe, hydroksylowe, karboksylowe, peroksylowe

i epoksydowe oraz węglowodory m.in. alkany i alkeny (Marnett 1999). Aktywne

chemicznie związki powstające w wyniku tych procesów, przeważnie o charakterze

aldehydów, są w stanie przemieszczać się do jądra komórkowego, gdzie reagują

z DNA. Mogą też powstawać in situ w wyniku peroksydacji lipidów chromatynowych,

głównie fosfolipidów (Matulewicz i Przybyszewski 2004).

Wśród związków powstałych w wyniku peroksydacji lipidów można wymienić

dwualdehyd malonowy (MDA), akroleinę, aldehyd krotonowy, glioksal, tlenek etylenu,

eten, propen, trans-4-hydroksy-2-nonenal (HNE), 4-hydroksyheksenal (HHE).

Wszystkie działają mutagennie i kancerogennie (Matulewicz i Przybyszewski 2004,

Pastoriza Gallego i Sarasin 2003, Plastaras i wsp. 2000). Wśród nich dużą

toksycznością charakteryzuje się HNE. Najbardziej mutagenny jest MDA (Marnett

1999, Niederhofer i wsp. 2003).

MDA jest czynnikiem mutagennym dla komórek bakterii i ssaków oraz

kancerogennym dla szczurów (Przybyszewski i wsp. 2005). Reakcje MDA z zasadami

DNA, prowadzące do powstawania adduktów, są złożone, m.in.: z powodu procesów

polimeryzacji, którym ulega ten związek. W wyniku tych procesów w komórkach

pojawiają się dimeryczne i trimeryczne postacie MDA, które również reagują

z zasadami azotowymi. Reakcja MDA z deoksyguanozyną prowadzi do powstania

struktury pirymidopurynonu, określanej symbolem M1dG. W wyniku reakcji MDA

z deoksyadenozyną i deoksycytydyną powstają związki oksopropenylowe:

N6-(3-oksopropenyl)deoksyadenozyny oraz śladowe ilości N

6-(3-

oksopropenyl)deoksycytydyny (Marnett 2002, Marnett i wsp. 2003).

17

Rys 2. Powstawanie eteno- i propanoadduktów pod wpływem produktów peroksydacji lipidów

(Przybyszewski i wsp. 2005)

Produkty peroksydacji lipidów: aldehyd krotonowy, akroleina i HNE są

przekształcane do epoksyaldehydów, które modyfikują zasady DNA tworząc

etenoaddukty. W wyniku reakcji epoksyaldehydów z DNA powstają: N2,3

etenoguanina

1,N2etenoguanina, 1,N

6etenoadenina i 3,N

4etenocytozyna. Oddziaływanie akroleiny

z zasadami azotowymi powoduje powstanie 1,N2-etenoguaniny (Golding i wsp. 1996).

Pochodna aldehydu krotonowego, 3-epoksybutanal, prowadzi do powstania 1,N6-

etenoadenozyny, 3,N4-etenocytydyny, 1,N

2-etenoadenozyny (Nair i Offerman 1985).

Natomiast pochodna HNE, 2,3-epoksy-4-hydroksynonenal (EH), w wyniku

podstawienia grup hydroksyheptanowych do guaniny i adeniny tworzy 1,N2- i N

2,3-

etenoguaninę oraz 1,N6-etenoadeninę (Sodum i Chung 1989, 1991).

18

I.1.5. Egzocykliczne addukty zasad DNA

Egzocykliczne addukty zasad DNA charakteryzują się dodatkowym

pierścieniem przy atomie azotu grupy aminowej. Uszkodzenia te, jeżeli nie są

naprawione, mogą wywoływać u ssaków różnego rodzaju choroby chroniczne

i nowotworowe. Wiele z adduktów egzocyklicznych ma pochodzenie endogenne,

prawdopodobnie jako rezultat reakcji produktów peroksydacji lipidów z zasadami DNA

(Borys-Brzywczy i wsp. 2005).

I.1.5.1. Etenoaddukty

Etenoaddukty należą do grupy egzocyklicznych adduktów zasad DNA i są

tworzone przez różne czynniki egzo- i endocykliczne takie jak chlorek winylu, aldehyd

chlorooctowy, produkty peroksydacji lipidów (Maciejewska i wsp. 2010). Powstają

w wyniku utworzenia dodatkowego pierścienia imidazolowego w strukturze cząsteczek

zasad DNA. Możliwe jest utworzenie 4 etenoadduktów: 1,N6-etenoadeniny (εA);

3,N4-etenocytozyny (εC); N

2,3-eteonoguaniny (N

2,3-εG) oraz 1,N

2-etenoguaniny

(1,N2-εG) (Barbin 2000). W reakcjach aldehydu chlorooctowego lub tlenku

chloroetylenu z adeniną i cytozyną zaobserwowano powstawanie uwodnionych form

pośrednich takich jak 3,N4-α-hydroksyetanocytozyna (HEC) (Krzyżosiak i wsp. 1979,

Kuśmierek i Singer 1982, Guengerich i Raney 1992). W DNA formy te są

przekształcane do pochodnych etenowych. W dwuniciowym DNA etenopochodne są

stosunkowo trwałe. εA może być jednak degradowane do 4-amino-5(-imidazol-2-

yl)imidazolu (β) (Yip i Tsou 1973). Natomiast 1,N2-εG może być przekształcona do

N1-2-(oksoetyl)guaniny (Akasaka i Guengerich 1999).

Pierwsze badania nad właściwościami mutagennymi etenoadduktów były

prowadzone w 1981 roku w trzech niezależnych laboratoriach i wykazały, że εA może

powodować błędy w przyłączaniu guaniny lub adeniny. Natomiast εC może wpływać

na niewłaściwe przyłączanie tyminy lub adeniny (Barbin i wsp. 1981, Hall i wsp. 1981,

Spengler i Singer 1981). Kolejne badania wykazały, że u Escherichia coli

i w komórkach nerki małpy εA powoduje tranzycję A→G oraz rzadziej transwersję

A→T i A→C. εC wywołuje w tych komórkach substytucje C→A i C→T, rzadziej

C→G. Dodatkowo εC powoduje jedno- i dwuzasadowe delecje (Basu i wsp. 1993,

Shibutani i wsp. 1996, Palejwala i wsp. 1993). HEC, podobnie jak εC, prowadzi do

tranzycji C→T u E.coli (Jacobsen i wsp. 1989, Borys i wsp. 1994). N2,3-εG in vitro

i w komórkach E.coli może wywoływać tranzycje G→A (Singer i wsp. 1983),

19

natomiast 1,N2-εG powoduje transwersje GC→TA oraz GC→CG (Langouët

i wsp.1997). Badania in vitro wykazały też, że 1,N2-εG silnie hamuje replikację

i sprzyja powstawaniu delecji i mutacji punktowych (Akasaka i Guengerich 1999).

Rys 3. Wzory chemiczne etenoadduktów powstałych pod wpływem aldehydu chlorooctowego (wg

Maciejewska i wsp. 2010)

I.1.5.2. Propanoaddukty

Propanoaddukty powstają w reakcjach produktów peroksydacji lipidów:

aldehydu krotonowego (CRA), akroleiny (ACR) i 4-hydroksynonenalu (HNE) z DNA

i obserwowane są w tkankach zawierających dużo tłuszczu, takich jak mózg, wątroba,

okrężnica (Nath i wsp. 1996). Inkubacja aldehydu krotonowego z DNA sprzyja

powstawaniu adduktów propanowych z guanozyną takich jak 1,N2-(1-hydroksy-3-

metylopropano)-2’-deoksyguanozyna. (Hecht i wsp. 2001). Akroleina i aldehyd

krotonowy tworzą też propanoaddukty z deoksycytozyną. Akroleina powoduje

powstawanie 3,N4-α-hydroksypropano-deoksycytozyny (HPC). Natomiast aldehyd

krotonowy w reakcji z deoksycytozyną tworzy 3,N4-α-hydroksy-γ-metylopropano-

deoksycytozynę (mHPC). (Borys-Brzywczy i wsp. 2005). W wyniku bezpośredniej

20

reakcji HNE z DNA powstaje głównie propanowy addukt guaniny podstawiony

łańcuchem alifatycznym (Douki i wsp. 2004). Badania in vitro wykazały, że HNE

oddziałuje z deoksynukleozydami tworząc propano- i etenocykliczne addukty

posiadające boczny łańcuch hydroksyalkilowy. Powodują one wzrost częstości mutacji

oraz hamują syntezę DNA in vitro u E. coli (Kowalczyk i wsp. 2004).

Rys 4. Wzory chemiczne propanoadduktów akroleiny i aldehydu krotonowego z deoksycytozyną

(na podstawie Borys-Brzywczy i wsp. 2005)

I.2. Naprawa uszkodzonego DNA

DNA wszystkich żywych organizmów jest nieustannie modyfikowane przez

związki pochodzenia endo- i egzogennego. Aby zachować prawidłowe funkcjonowanie

komórek, wykształcone zostały różne mechanizmy naprawy DNA, które zapobiegają

kumulacji szkodliwych mutacji w komórce.

U bakterii Escherichia coli można wyróżnić cztery mechanizmy naprawy

uszkodzeń kwasów nukleinowych spowodowanych przez związki alkilujące. Pierwszy

z nich to BER (ang. base excision repair), czyli naprawa przez wycinanie zasad.

Kolejnym jest NER (ang. nucleotide excision repair), który polega na wycinaniu

uszkodzonych nukleotydów. Trzeci mechanizm, MMR (ang. mismatch repair),

21

naprawia błędnie sparowane zasady. Ostatni sposób to naprawa bezpośrednia przez

odwrócenie np.: przez metylotransferazy (Nieminuszczy i Grzesiuk 2007).

Większość oksydacyjnych modyfikacji DNA np.: zmiany struktury chemicznej

zasady, jest naprawiana z wykorzystaniem mechanizmu naprawy przez wycinanie zasad

(BER) (Gros i wsp. 2003). Wycięcie zmodyfikowanej zasady polega na hydrolizie

wiązania N-glikozydowego pomiędzy zmienioną chemicznie zasadą a cukrem.

N-glikozylaza rozpoznaje uszkodzoną zasadę i przecina wiązanie β-N-glikozydowe

między uszkodzoną zasadą a cząsteczką deoksyrybozy, tworząc miejsce

apurynowe/pirymidynowe. Następnie endonukleaza AP rozpoznaje to miejsce i nacina

DNA w kierunku 5' od miejsca AP tworząc wolny koniec 3'-OH. Polimeraza DNA,

Pol I, wydłuża nić DNA od wolnego końca 3'-OH wykorzystując aktywność

egzonukleazy do zastąpienia nukleotydu z uszkodzoną zasadą oraz kilku następnych.

Na końcu nowa nić jest łączona ze starą za pomocą ligazy DNA (Roszkowski 2002,

Krwawicz i wsp. 2007).

Naprawa przez wycięcie nukleotydu (NER) jest bardziej złożonym procesem niż

BER oraz wymaga ATP jako źródła energii. Jest też mniej specyficznym systemem niż

BER (Wood 1996; Sancar 1996). Fragment DNA, który zawiera uszkodzenie jest

nacinany po obu stronach przez nukleazę, a następnie usuwany. U bakterii jest to

fragment składający się z 12-13 nukleotydów. W komórkach eukariotycznych fragment

ten ma długość 27-29 nukleotydów (Pietrzykowska i Krwawicz 1999; Ma i wsp. 1995).

System naprawy błędnie sparowanych zasad azotowych (MMR) usuwa głównie

błędy, które powstały podczas replikacji DNA i nie zostały naprawione przez

polimerazę DNA oraz niewłaściwe pary zasad tworzące się w wyniku rekombinacji

DNA oraz spontanicznej lub indukowanej deaminacji, utleniania bądź metylacji zasad

azotowych (Modrich i Lahue 1996).

Do naprawy DNA, oprócz skomplikowanych kompleksów naprawczych,

komórka może wykorzystywać także proste mechanizmy naprawy kwasów

nukleinowych, które nie naruszają ich integralności. Należy do nich bezpośrednia

naprawa przez odwrócenie, w której bierze udział wysoce specyficzne białko. Białko to

eliminuje dodatkowe grupy atomów bezpośrednio w miejscu ich przyłączenia. Dzieje

się tak na przykład w przypadku dioksygenazy AlkB naprawiającej 3-metylocytozynę

oraz 1-metyloadeninę (Falnes i wsp. 2002).

22

I.2.1. Rola białka AlkB w naprawie uszkodzeń DNA

Gen alkB został odkryty ponad 20 lat temu podczas izolacji mutantów E. coli ze

zwiększoną wrażliwością na czynniki alkilujące (Hataoka i wsp. 1983). Gen ten

wchodzi w skład systemu odpowiedzi adaptacyjnej na czynniki alkilujące u E. coli wraz

z genami ada, alkA i aidB. Białka Ada, Alka i AlkB naprawiają uszkodzone zasady

DNA przy użyciu różnych mechanizmów. Funkcja AidB nie została jeszcze ostatecznie

ustalona (Nieminuszczy i Grzesiuk 2007). Białko AlkB preferuje jednoniciowe DNA

jako substrat (Falnes i wsp. 2004). Badania biochemiczne wykazały, że najlepszymi

substratami dla AlkB są 3-metylocytozyna (m3C) oraz 1-metyloadenina (m

1A) (Dinglay

i wsp. 2000). Analiza bioinformatyczna wykazała, że białko AlkB należy do rodziny

dioksygenaz zależnych od Fe(II) i α-ketoglutaranu (Aravind i Koonin 2001).

I.2.1.1. Budowa białka AlkB

Badania nad strukturą przestrzenną białka AlkB wykazały, że składa się ono

z 216 aminokwasów i zawiera trzy ważne domeny. Są to:

C-terminalna domena dioksygenazowa, część katalityczna (aa 90-216)

Sekwencja NRL rozpoznająca nukleotyd (aa 46-89),

N-terminalna domena (aa 1-45) (Yang i wsp. 2008; Yu i wsp. 2006).

Rys 5. Struktura kompleksu białka AlkB z Fe(II), α-ketoglutaranem i metylowanym

trójnukleotydem (Yu i wsp. 2006). Niebieskim kolorem oznaczona jest domena rozpoznająca nukleotyd, zielonym rdzeń katalityczny, a żółtym fragment N-końcowy.

23

Wszystkie homologi AlkB posiadają motywy i reszty niezbędne dla

enzymatycznej aktywności (motyw HXD, pojedyncze H i motyw RXXXXR). U AlkB

motywy te wyglądają następująco: H131XD133………H187………R204YNLTFR210. Dwie

histydyny i kwas asparaginowy biorą udział w wiązaniu żelaza, natomiast pierwsza

arginina oddziałuje z α-KG (Wei i wsp. 1996; Aas i wsp. 2003; Kurowski i wsp. 2003).

I.2.1.2. Mechanizm działania

Białko AlkB usuwa alkilacyjne oraz etenowe uszkodzenia zasad DNA. W obu

przypadkach mechanizm naprawy odbywa się w dwóch etapach.

W przypadku naprawy modyfikacji alkilowych pierwszy etap polega na

hydroksylacji wiązania C-H w grupie alkilowej dołączonej do zasady. Wiąże się to

z oksydatywną dekarboksylacją α-ketoglutaranu, w wyniku czego następuje uwolnienie

cząsteczki bursztynianu i dwutlenku węgla. Jeden z atomów cząsteczki tlenu zostaje

wbudowany we fragment alkilowy jako grupa hydroksylowa, drugi natomiast stanowi

cześć grupy karboksylowej bursztynianu (Schofield i Hang 1999; Prescott i Lloyd 2000;

Ryle i Hausinger 2002). W ten sposób białko AlkB bezpośrednio przekształca

3-metylocytozynę i 1-metyloadeninę w cytozynę i adeninę z jednoczesnym

uwolnieniem utlenionej grupy metylowej w postaci formaldehydu. Produktami

przejściowymi w tych reakcjach są niestabilne 3-hydroksymetylocytozyna

i 1-hydroksymetyloadenina (Trewick i wsp. 2002) (Rys. 6).

Rys 6. Mechanizm naprawy uszkodzeń alkilacyjnych przez białko AlkB (Begley i Samson 2003)

W podobny sposób naprawiane są uszkodzenia etenowe. W pierwszej kolejności

mostek eteonowy utleniany jest do epoksydu, który w wyniku addycji cząsteczki wody

24

tworzy glikol. Następnie powstały alkohol uwalnia się spontanicznie w postaci

glioksalu z odtworzeniem natywnej formy zasady (Delaney i wsp. 2005) (Rys. 6).

Rys 6. Mechanizm naprawy uszkodzeń etenowych przez białko AlkB (Delaney i wsp. 2005)

I.2.1.3. Bakteryjne homologi AlkB

Van den Born i współpracownicy na podstawie analizy sekwencji bakteryjnych

białek AlkB opracowali drzewo filogenetyczne i wyodrębnili 4 grupy: 1A, 1B, 2A i 2B.

Dowiedziono, że białka z grup 1A i 2B posiadają kilka tych samych konserwowanych

ewolucyjnie aminokwasów co białka 1B, znajdujących się w regionie odpowiadającym

domenie NRL. Pozwala to przypuszczać, że te 3 grupy białek mogą oddziaływać z tym

samym substratem. (van den Born i wsp. 2009). W białkach grup 1B i 2B w domenie

N-terminalnej występują takie same konserwowane sekwencje. Również w obrębie

domeny NRL występują wspólne dla grup 1B i 2B konserwowane ewolucyjnie

aminokwasy. Nie wykazano natomiast wspólnych konserwowanych sekwencji dla

białek z grup 1A i 2A. W trakcie badań nie ujawniono podobieństwa sekwencji domeny

N-terminalnej białek z grup 1A i 1B. Przypuszcza się jednak, że zawierają one kilka

kluczowych reszt w obrębie domeny NRL, łącznie z resztami Trp69 i Tyr76. (Yu i wsp.

2006) Wykazano też, że białka z grup 1A, 1B oraz 2B uczestniczą głównie w naprawie

DNA, podczas gdy funkcją białek z grupy 2A jest przede wszystkim modyfikacja tRNA

(van den Born i wsp. 2009).

Grupa 1A

Białka z tej grupy są szeroko rozpowszechnione w królestwie bakterii,

zwłaszcza u Proteobacteria. W grupie tej znajduje się białko AlkB E. coli, a także białka

SA-1A i SC-1A występujące u bakterii z rodzaju Streptomyces. Białka te mają w 79%

identyczne sekwencje aminokwasowe i wykazują podobne właściwości. Przypuszcza

się, że grupa 1A zawiera białka o funkcji podobnej do białka modelowego dla rodziny

AlkB – EcAlkB (van den Born i wsp. 2009).

25

Grupa 1B

Białka z grupy 1B występują u β- i γ-proteobacteria, a także u cyanobacteria.

Wykazują podobieństwo do homologów AlkB występujących u kręgowców: ALKBH2

i ALKBH3, które posiadają podobną aktywność naprawczą do EcAlkB. W grupie tej

znajduje się białko XC-1B, występujące u Xanthomonas campestris i wykazujące

wysoką aktywność naprawczą. Analiza bioinformatyczna i badania doświadczalne

wykazały, że białka z grupy 1B posiadają aktywność naprawczą, a ich funkcja jest

zbliżona do EcAlkB (van den Born i wsp. 2009).

Grupa 2B

Białka z grupy 2B występują głównie u Actinobacteria. Wykazano również

występowanie tych białek u kilku patogenów roślinnych z rodzaju Xanthomonas

(γ-proteobacteria) i Burkholderia (β-proteobacteria). Bakterie te mogły nabyć geny

kodujące białka AlkB przez horyzontalny transfer genów od Actinobacteria, będących

w większości bakteriami glebowymi (Madigan i wsp. 2003). Analiza sekwencji

wykazała, że białka z grupy 1B i 2B posiadają kilka takich samych zakonserwowanych

reszt w regionie NRL. Białka z grupy 2B, takie jak: MT-2B, SC-2B, SA-2B i XC-2B

wykazują aktywność naprawczą. Ich specyficzność substratowa jest jednak dość

zróżnicowana. Białko MT-2B, w przeciwieństwie do XC-2B, wykazuje wysoką

aktywność w stosunku do uszkodzeń metylowych i niską w stosunku do etenoadduktów

(van den Born i wsp. 2009).

Grupa 2A

Białka z grupy 2A występują u proteobacteria takich jak: Agrobacterium,

Rickettsia i Rhizobium. Część z tych bakterii to patogeny roślin, które podczas inwazji

na gospodarza przenoszą fragmenty swojego DNA do komórek roślinnych.

U niektórych bakterii np.: Roseobacter denitrificans, Roseobacter etli, Sinorhizobium

meliloti, Sinorhizobium medicae, geny kodujące białka z grupy 2A znajdują się częściej

na plazmidach niż na chromosomach, co sugeruje że być może zostały one uzyskane

z genomu gospodarza (van den Born i wsp. 2009). Białka z grupy 2A wykazują dużą

homologię względem zwierzęcych i roślinnych białek ALKBH8 (Falnes i wsp. 2009).

Po analizach bioinformatycznych zasugerowano, że białka te są raczej zaangażowane

w modyfikację tRNA niż w naprawę DNA (van den Born i wsp. 2009).

26

Tabela 1. Rozmieszczenie bakteryjnych białek AlkB w kompletnie zsekwencjonowanych genomach

Liczba białek

AlkB

Grupa Liczba

gatunków

Przykłady rodzajów/gatunków bakterii

1

1

1

1

1

2

2 2

2

2

2

2

2

2 2

2

3

3

3

1A

1B

2A

2B

Razem

1A

1A+1B 1A+2A

1A+2B

1B

1B+2A

1B+2B

2A

2A+2B 2B

Razem

1A(2)+1B

1B

Razem

65

61

6

12

144

1

2 5

3

1

0

4

0

0 2

18

1

1

2

Escherichia, Salmonella, Bradyrhizobium

Shewanella, Burkholderia, Xylella

Agrobacterium, Rickettsia

Mycobacterium, Nocardia

Ralstonia metallidurans

Pseudomonas fluorescens Sinorhizobium, Rhizobium, Roseobacter

Streptomyces, Rhodococcus

Acaryochloris marina

-

Xanthomonas, Burkholderia enovorans

-

- Frankia

Burkholderia sp. 383

Flavobacterium johnsoniae

Razem 164

I.2.1.4. Homologi AlkB występujące u ssaków

Geny kodujące homologi białka AlkB wykryto nie tylko u bakterii, ale również

w DNA ssaków. U ssaków zidentyfikowano 9 homologów tego białka: ALKBH1-

ALKBH8 (Drablos i wsp. 2004; Aravind i Koonin 2001) oraz białko FTO, które jest

związane z otyłością (Gerken i wsp. 2007; Sanchez-Pulido i Andrade-Navarro 2007).

Ekspresja poszczególnych genów kodujących homologi AlkB nie jest taka sama

we wszystkich tkankach ludzkich i może wynikać z rozbieżności funkcji tych białek

(Lee i wsp. 2005). Zaobserwowano wysoki poziom hABH2 w nieproliferujących

tkankach wątroby, natomiast wysoka ekspresja hABH3 występowała w sercu, wątrobie,

prostacie i jądrach (Sedgwick i wsp. 2007).

Pierwszy ludzki homolog, hABH1, wykazuje 52% podobieństwo i jest w 23%

identyczne z EcAlkB (Mishina i He 2006). Jest funkcjonalnym mitochondrialnym

homologiem AlkB, który naprawia m3C w jednoniciowym DNA i RNA, ale nie

naprawia m1A, ani dsDNA. Aktywność naprawcza hABH1 jest niższa niż AlkB,

hABH2 i hABH3, ale nie można wykluczyć, że białko to ma jeszcze inne substraty

(Westbye 2008). hABH1 wykazuje też aktywność liazy wobec miejsc AP w DNA

(Muller i wsp. 2010).

27

Odkryto, że hABH2 jest odpowiedzialny głównie za naprawę m1A, natomiast ta

sama funkcja u hABH3 pozostaje niejasna (Ringvoll i wsp. 2006). hABH2 jako substrat

bardziej preferuje dwuniciowe DNA (dsDNA) niż jednoniciowe (ssDNA) oraz ma

niskie powinowactwo w stosunku do RNA. Tymczasem hABH3 i AlkB jest bardziej

aktywne w przypadku substratów ssDNA i ssRNA (Aas i wsp. 2003; Falnes i wsp.

2004). hABH2 i hABH3, oprócz tego że preferują różne substraty, mają też inną

lokalizację w komórce. hABH2 występuje tylko w jądrze komórkowym i uczestniczy

w naprawie DNA w pobliżu widełek replikacyjnych. Natomiast hABH3 występuje

w jądrze komórkowym i w cytoplazmie (Duncan i wsp. 2002; Aas i wsp. 2003).

W 2007 roku wielką niespodzianką było odkrycie, że związany z otyłością gen

FTO koduje funkcjonalny homolog białka AlkB (Gerken i wsp. 2007; Sanchez-Pulido

i Andrade-Navarro 2007). Wysoka ekspresja tego genu występuje w podwzgórzu,

a defekt genu FTO powiązano ze zwiększeniem się ilości tkanki tłuszczowej

w organizmie (Dina i wsp. 2007; Frayling i wsp. 2007, Scott i wsp. 2007). Białko FTO

posiada homologiczną sekwencję do białek z rodziny AlkB. Wykazano, że enzym ten

w obecności żelaza, α-KG i O2 ma zdolność do demetylacji m3T w jednoniciowym

DNA (Gerken i wsp. 2007).

Zróżnicowanie właściwości występujących u ssaków homologów białka AlkB

sugeruje, że mogą pełnić one różne funkcje w komórce (Sundheim i wsp. 2006).

28

II Cel pracy

Celem pracy było ustalenie warunków naprawy HEC i HPC przez białko AlkB

oraz określenie specyficzności substratowej homologów AlkB w stosunku do adduktów

egzocyklicznych i wyznaczenie optymalnych warunki naprawy tych uszkodzeń

w zależności od pH buforu, stężenia -ketoglutaranu i jonów żelaza. Wykorzystano tu

modyfikujące własności aldehydu chlorooctowego i akroleiny. Naprawa

powodowanych przez nie uszkodzeń przebiega w sposób bezpośredni - bez naruszania

ciągłości nici DNA. Przedmiotem badań były wyizolowane i oczyszczone białka: AlkB

oraz SA-1A i SA-2B, pochodzące od bakterii Streptomyces avermitilis.

29

III Materiały i metody

III.1. Materiały

III.1.1. Odczynniki

α-ketoglutaran (α-KG) – Fluka

Akroleina (ACR) – Fluka

Aldehyd chlorooctowy (CAA) – Fluka

Bis-Tris – Sigma

Ditiotreitol (DTT) – Sigma

Kwas octowy (CH3COOH, AcOH) – POCh

Kwas solny (HCl) – Chempur

Kwas 4-(2-hydroksyetylo)piperazino-1-etanosulfonowy (HEPES) – Sigma

Metanol (CH3OH, MeOH) – Lab-scan

Octan sodu (NaCOOH) – Chempur

Sześciouwodniony siarczan amonowo-żelazawy (NH4)2Fe(SO4)2 · 6H2O – Fluka

Trietyloamina (TEA, Et3N) – Merck

Wodorotlenek sodu (NaOH) – Stanlab

Odczynniki do elektroforezy

Żel rozdzielający (15%):

30% akrylamid - 2,5ml – Fluka

1,5M Tris (pH 8.8) – 1,3ml

10% SDS – 0,05ml

miliQ H2O – 1,1ml

10% nadsiarczan amonu (APS) - 0,05ml – Bio-Rad

N, N, N’ N’ - tetrametyletylenodiamina (TEMED) – 0,002ml - Fluka

Żel zagęszczający (4,5%):

30% akrylamid – 0,17ml

1M Tris (pH 6,8) – 0,13ml

10% SDS – 0,01ml

miliQ H2O – 0,68ml

10% nadsiarczan amonu (APS) – 0,01ml

N, N, N’ N’ - tetrametyletylenodiamina (TEMED) – 0,001ml

30

Marker

SigmaMarker™ Low Range (M.W. 6,500 - 66,000) – Sigma

Barwnik Coomasie Brillant Blue G – 250

0,2 % Coomasie Brillant Blue G – 250

10 % kwas octowy

45 % metanol

Odbarwiacz

10 % kwas octowy

25 % metanol

III.1.2. Bufory

III.1.2.1. Bufory stosowane do oczyszczania białka

Bufor sodowo-fosforanowy 160mM pH 7,4

Bufor do wiązania (BB) pH 7,4

Bufor do elucji (EB) pH 7,4

Bufor do przechowywania (ST) pH 7,4

Bufor do elektroforezy SDS-PAGE (pH 8,3)

0,125M Tris/HCl pH 8,3

0,96M glicyna

0,5% SDS

Bufor Laemmli’ego (pH 6,8)

0,25M Tris/HCl pH 6,8

50% glicerol

25% β-merkaptoetanol

10% SDS

0,05% błękit bromofenolowy

Bufor do dializy (pH 7,4)

40mM Tris/HCl pH 7,4

200mM NaCl

10% glicerol

5mM DTT

1mM PMSF

31


przez badane białka

0,5M Bis-Tris w zakresie pH 5,8 – 7,0

0,5M bufor octanowy w zakresie pH 4,2 – 5,6

0,5M HEPES w zakresie pH 6,8 – 7,8

Bufor kakodylanowy pH 6,5 – (CH3)2AsO2Na x 3H2O (BDH)

Bufor TE pH 7,8 (10mM Tris-HCl pH 7,8 + 1mM EDTA pH 8,0)

1,5M TEAB pH ok. 7-8 (węglan trietyloaminy)

Bufor do chromatografii wysokociśnieniowej

1M TEAA (octan trietyloaminy) pH ok. 6,5

30% metanol w H2O

III.1.3. Pentamery

TTATT – Metabion, Martinsried, Germany

TTCTT – Metabion, Martinsried, Germany

III.1.4. Enzymy

Plazmid niosący sklonowany gen alkB z E. coli otrzymano z pracowni prof.

Seeberga (Uniwersytet w Oslo). Plazmidy pET28a niosące sklonowane geny białek

SA-1A i SA-2B otrzymano z pracowni prof. Falnesa (Uniwersytet w Oslo). Plazmidem

transformowano szczep E. coli BL21 (DE3). Preparaty oczyszczonych białek EcAlkB,

SA-1A, SA-2B (His-tag) zostały otrzymane w Zakładzie Biologii Molekularnej IBB

PAN wykorzystując plazmid pET28a. Białka EcAlkB i SA-1A zostały otrzymane przez

dr Jadwigę Nieminuszczy, natomiast białko SA-2B zostało otrzymane przeze mnie.

III.1.5. Antybiotyki

Kanamycyna – Sigma

III.1.6. Pożywki

Pożywka LB płynna

0,5 % NaCl

0,5 % ekstrakt drożdżowy

1 % trypton

32

Pożywka LB stała

Podłoże LB płynne z dodatkiem 1 % agaru

III.1.7. Aparatura

III.1.7.1. Aparatura do oczyszczania białek

Zestaw do chromatografii niskociśnieniowej Äcta prime (Amersham)

Kolumna niklowa HisTrap (Amersham)

Spektrofotometr: Cary 3 UBV – Visible Spectrophotometer Varian

Spektrofotometr ULTROSPEC PLUS 4054 UV/VISIBLE Spectrophotometer LKB

BIOCHROM

Elektroporator: TransPorator Plus - BTX

Wirówka J2-21M/E – Beckman

Wirówka miniSpin – Eppendorf

Sonikator Branson Sonifier 250

pH-metr - inoLab

III.1.7.2. Aparatura do reakcji modyfikacji pentametrów i ich naprawy przez

badane białka

HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) firmy Knauer na bazie systemu

podwójnego, zapewniającego gradient dwuskładnikowy, obsługiwany przez program

EuroChrom Basic Edition (wersja 3.05) i wyposażony w detektor UV.

Analityczny i preparatywny rozdział próbek prowadzono na kolumnach:

- Waters Nova-Pak® C18, 60Å, 4μm, 4,6mm x 250mm, z prędkością przepływu

1 ml/min,

- HR C18, 60Å, 6μm, 3,9mm x 300mm, z prędkością przepływu 1,75 ml/min,

z użyciem liniowego gradientu 20mM octanu trietyloaminy o pH 6,5 x 30% MeOH

w wodzie przez 30 minut i detekcją UV przy długości fali 270nm

Spektrofotometr: Cary 3 UBV – Visible Spectrophotometer Varian

Wirówka miniSpin – Eppendorf

pH-metr – MeterLab®

III.1.8. Inne materiały

bibuła 3mm – Whatman

33

folia spożywcza do przykrywania żeli

kuwety do elektroporacji – Bio-Rad

kuwety do spektrofotometrii – Medlab

papierki wskaźnikowe – MERCK

szyby 14cm x 16cm z przekładkami i grzebieniem 0,4mm

III.2. Metody

III.2.1. Sporządzanie buforów

Wszystkie bufory zostały wykonane na bazie wody dejonizowanej mQ.

III.2.1.1. Bufory stosowane do oczyszczania białka

Bufor wiążący (BB)

400ml buforu wiążącego uzyskano poprzez zmieszanie 50ml buforu sodowo-

fosforanowego z 2ml 10mM imidazolu i uzupełnienie wodą miliQ. Mieszaninę

stabilizowano kwasem solnym do pH o wartości 7,4.

Bufor do elucji (EB)

W celu sporządzenia buforu do elucji zmieszano 12,5ml buforu sodowo-

fosforanowego z 25ml 500mM imidazolu i uzupełniono wodą do 100ml.

pH ustabilizowano również do wartości 7,4. Tak przygotowane bufory BB i EB

schłodzono.

Bufor do przechowywania (ST)

Aby przygotować bufor do przechowywania zmieszano 40mM Tris/HCl,

200mM NaCl, 10% glicerolu. pH ustabilizowano do wartości 7,4.


przez badane białka

Sporządzono 0,2M bufory z przygotowanych wcześniej 0,5M buforów:

octanowego, HEPES i Bis-Tris. Do każdego dodano DTT do końcowego stężenia 5mM.

III.2.1.3. Bufor do chromatografii wysokociśnieniowej

1M octan trójetyloaminy (TEAA) o pH ~ 6,5 przygotowano w dwóch etapach.

I etap: Destylacja TEA

Kilka sit molekularnych wrzucono do kolby (o objętości 500ml) z TEA ~ 300ml

i ogrzano do wrzenia. Następnie obniżono temperaturę do 1800C. Przedgon zbierano do

34

momentu ustabilizowania się temperatury na termometrze (była nieco niższa niż 90ºC).

Następnie zebrano ok. 200ml destylatu TEA. Wyłączono transformator i pozostawiono

wszystko do wystygnięcia.

II etap

Schłodzono 1 mol (139,2 ml) świeżo destylowanej trójetyloaminy (Et3N, TEA),

1 mol (57,5 ml z 17,4M) kwasu octowego (AcOH) i 700 ml H2O mQ. Zlewkę z wodą

wstawiono w łaźni lodowej na mieszadło. Dodano TEA, który pływał po powierzchni

jak olej. Następnie powoli dodawano AcOH aż do uzyskania pH 6,5. Uzupełniono wodą

do 1000 ml i całość przesączono na sączku do HPLC.

Do rozdziałów chromatograficznych używano 20mM TEAA.

III.2.2. Transformacja bakterii szczepu E. coli BL21 (DE3) plazmidem pET28a/pSA

Dwie porcje zawierające po 100μl komórek elektrokompetentnych bakterii

szczepu E. coli BL21 (DE3) rozmrożono na lodzie. Do jednego z nich dodano 1μl

plazmidu pET28a/pSC, niosącego sklonowany gen białka SA-2B z Streptomyces

avermitilis, drugi natomiast stanowił kontrolę negatywną. Przygotowaną mieszaninę

transformacyjną przenoszono następnie do schłodzonej w lodzie kuwety. Kuwetę

wstawiono do elektroporatora i poddawano działaniu impulsu elektrycznego o napięciu

2,5 kV/cm. Do mieszaniny transformacyjnej dodawano następnie 1ml LB i inkubowano

przez 1 godz. w 37ºC w celu wyrażenia genu oporności na kanamycynę. Po

transformacji mieszaninę bakteryjną wysiano na płytki ze stałym podłożem LB

zawierającym kanamycynę o końcowym stężeniu 50 μg/ml. Płytki inkubowano przez

noc w temperaturze 37ºC. Następnie sprawdzano na płytkach obecność transformantów

oraz brak wzrostu na kontroli negatywnej.

III.2.3. Ekspresja białka SA-2B w szczepie E. coli BL21 (DE3) niosącym plazmid

pET28a/pSA

100ml płynnej pożywki LB z dodatkiem kanamycyny (50μg/ml) zaszczepiano

pojedynczą kolonią szczepu E. coli BL21 (DE3), niosącego plazmid kodujący białko

AlkB pET28a-SA-2B. Bakterie hodowano przez noc w 37ºC z wytrząsaniem 200 rpm.

Następnie hodowlę przeszczepiano na świeżą pożywkę (3 x 1 litr). 20 ml hodowli

nocnej dodano do każdej kolby zawierającej 1 litr płynnej pożywki LB z kanamycyną,

zawartość kolb połączono. Całość hodowano w 37ºC z wytrząsaniem do momentu

35

osiągnięcia gęstości OD600=0,6 (ok. 2,5 godziny) Z zawiesiny bakterii pobrano 1 ml

(kontrola nieindukowana). Resztę przeniesiono do 16ºC i hodowano przez 1 godzinę

w celu schłodzenia hodowli. Następnie indukowano ekspresję białka poprzez dodanie

izopropylo-β-tiogalaktopiranozyd (IPTG) do końcowego stężenia 0,1mM. Po indukcji

bakterie hodowano przez 16 godzin w 16ºC z wytrząsaniem 150 rpm. Po tym czasie

hodowle wirowano (6000 rpm w 4ºC przez 15 min). Supernatant odrzucono, a osady

zamrożono w -20ºC.

III.2.4. Dysrupcja komórek

Do osadu komórek bakteryjnych dodano β-merkaptoetanol (70μl/100ml)

i PMSF (1ml/100ml). Całość zawieszono w 60 ml buforu wiążącego pH 7,4 (20mM

bufor fosforanowy, 0,5M NaCl, 10mM imidazol). Zawiesinę przeniesiono do falkonów

i umieszczono w ciekłym azocie w celu szybkiego zamrożenia, następnie rozmrożono

pod zimną, bieżącą wodą. Po przeniesieniu zawartości falkonów do dwóch zlewek

i umieszczeniu w łaźni lodowej komórki sonikowano 2 razy po 3 minuty za pomocą

ultradźwięków o energii 250W, używając sonikatora Branson Sonifier 250. Kolejnym

etapem było zwirowanie próbek z prędkością 12000 x g/10 min w 4ºC (ultrawirówka

Beckman J2-21M/E). Osad odrzucono, a supernatant zebrano i przefiltrowano przez filtr

celulozowo-nitrowy 0,2μm (Milipore).

III.2.5. Oczyszczanie białka SA-2B

Plazmid bakteryjny pSA kodujący białko SA-2B (homologi AlkB) otrzymano od

prof. Falnesa z Uniwersytetu w Oslo. Plazmid pET28a/pSA zawierał wklonowaną

sekwencję cDNA kodującą białko SA-2B.

Wszystkie etapy oczyszczania białka odbywały się w temperaturze 4ºC.

Supernatant nakładano na kolumny ze złożem niklowym HisTrap (Amersham)

z wykorzystaniem urządzenia Äcta Prime. Białko eluowano w buforze elucyjnym

gradientem stężenia imidazolu od 10mM do 0,5M. Zebrane frakcje zachowano do

dalszej analizy, natomiast frakcje, które zawierały białko SA-2B zostały poddane

dializie do buforu do przechowywania 2xST (storage buffer) o pH 7,4 (40mM

Tris-HCl, 200mM NaCl, 10% glicerol). Na koniec dodano glicerol do końcowego

stężenia 50%.

Oczyszczone białka przechowywano w temperaturze -80ºC.

36

III.2.6. Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym

Białka obecne w zebranych frakcjach (osad bakterii nieidukowanych IPTG,

supernatant przed nałożeniem na złoże, frakcje zebrane po dializie) zostały rozdzielone

elektroforetycznie w żelu poliakrylamidowym w obecności SDS-PAGE (warunki

denaturujące). Zastosowano metodę według modyfikacji Laemmli’ego, czyli w tzw.

systemie nieciągłym. W metodzie tej żel składa się z dwóch części. Część górna

zawiera 4,5% akrylamid o pH 6,8 i służy do zagęszczenia białek. Natomiast część dolna

zawiera 15% akrylamid o pH 8,8. Dochodzi w niej do rozdziału białek w zależności od

ich wielkości. Zanim próbki o objętości 5µl nałożono na żel, dodano do nich 1,5µl

5x stężonego buforu Laemmli’ego. Elektroforezę prowadzono w buforze do

elektroforezy SDS-PAGE (1x) pod napięciem 200 V do momentu wyjścia barwnika

z żelu. Rozdziałowi poddano też marker wielkości białek SigmaMarker™ Low Range

w zakresie 6,5 - 66 kDa, służący do oceny wielkości białka. Po rozdziale białka

barwiono Coomassie Brillant Blue G-250 przez 30 minut. Następnie barwnik zlewano,

a żel umieszczano w odbarwiaczu, który zmieniano kilkakrotnie, aż do całkowitego

odbarwienia się tła.

III.2.7. Oznaczanie stężenia białka metodą Bradford

Każdy pomiar wykonano w trzech powtórzeniach, ostateczny wynik stanowił

średnią arytmetyczną wszystkich wyników dla danej frakcji. 5μl każdej

z analizowanych frakcji rozcieńczano w kuwetach zawierających po 795μl sterylnej

wody miliQ, dodawano 200μl odczynnika Bradford, mieszano i odstawiano na 10 minut

w ciemności. Po tym czasie mierzono absorbancję roztworów przy długości fali 595 nm

względem kontroli (mieszanina 800μl wody i 200μl odczynnika Bradford). Stężenie

białka w analizowanych frakcjach określano na podstawie krzywej wzorcowej.

III.2.8. Przygotowanie substratów do reakcji naprawy przez badane białka

III.2.8.1. Otrzymywanie pentamerów zawierających etanocytozynę TT(εC)TT oraz

hydroksyetanocytozynę TT(HEC)TT

Do 276,5μl 1,5M buforu TEAB pH ok. 7-8 dodano 12,5μl pentameru TTCTT

o stężeniu 2 OD/μl (555nmoli) oraz 29,75μl (180μmol) 45% roztworu aldehydu

37

chlorooctowego (CAA). Całość inkubowano przez 2,5h w 37°C. Następnie mieszaninę

reakcyjną (nieprzereagowany TTCTT oraz TT(HEC)TT i TT(εC)TT) oczyszczono

i rozfrakcjonowano za pomocą HPLC na kolumnie preparatywnej, nakładając całkowitą

objętość reakcji. W celu określenia stężenia oligomeru zebrane frakcje poddano

pomiarowi absorbancji, po czym rozdzielono je za pomocą rozdziału analitycznego na

HPLC w celu sprawdzenia ich składu (nakładano po ok. 1nmol substancji). Następnie

frakcje zawierające modyfikowane pentamery liofilizowano do sucha i zawieszono

w buforze TE pH 8 w końcowym stężeniu 500pm/μl. Frakcje zawierające czysty THEC

umieszczono w temp. - 20ºC. Do frakcji zawierających mieszaninę TεC i THEC dodano

1M bufor kakodylanowy pH 6,5 i poddano procesowi dehydratacji przez ogrzewanie

w 37ºC w pH 6,5 przez 72h.

III.2.8.2. Otrzymywanie pentamerów zawierających hydroksypropanocytozynę

TT(HPC)TT

Do 214μl 1M buforu octanowego o pH 4,5 dodano 5μl pentameru TTCTT

o stężeniu 2 OD/μl (222nmoli) oraz 39μl (1nmol) akroleiny (ACR). Całość inkubowano

przez 4h w 37°C. Następnie mieszaninę reakcyjną oczyszczono za pomocą HPLC na

kolumnie preparatywnej, nakładając całkowitą objętość reakcji. W celu określenia

stężenia oligomeru zebrane frakcje zawierające TT(HPC)TT poddano pomiarowi

absorbancji, po czym rozdzielono je za pomocą HPLC na kolumnie analitycznej

(nakładano po ok. 1nmol substancji). Frakcje zawierające pożądany produkt połączono,

zliofilizowano, a następnie rozpuszczono w buforze TE do stężenia 500pmoli/μl.

III.2.8.3. Otrzymywanie substratu zawierającego etenoadeninę TT(εA)TT

Do 442,4μl 0,5 M buforu octanowego o pH 4,6 dodano 5μl pentameru TTATT

o stężeniu 2 OD/μl (222 nmole) oraz 47,6 μl (288 μmol) 45 % roztworu aldehydu

chlorooctowego (CAA). Całość inkubowano przez 24 h w 37°C. Następnie mieszaninę

reakcyjną oczyszczano za pomocą HPLC na kolumnie, nakładając całkowitą objętość

reakcji. Zebrane frakcje zawierające TTεATT poddano pomiarowi absorbancji w celu

określenia stężenia oligomeru, a następnie rozdziałowi za pomocą HPLC na kolumnie

analitycznej (nakładano po ok. 1 nmol substancji). Frakcje zawierające pożądany

produkt połączono, zliofilizowano, a następnie rozpuszczono w buforze TE do stężenia

500 pmoli/μl.

38

III.2.9. Badanie aktywności białka AlkB, SA-1A i SA-2B

W celu badania aktywności badanych białek przygotowano 0,2M bufory:

Bis-Tris, HEPES i octanowy w różnych zakresach pH wraz z dodatkiem 1M DTT

(5μl/ml). Reakcje prowadzono w zależności od pH buforu, czasu, stężenia jonów Fe (II)

i stężenia α-ketoglutaranu. Objętości wszystkich mieszanin reakcyjnych wynosiły 20μl,

a ich inkubacja w temp. 37ºC trwała 30 minut (w przypadku badania zależności od

czasu inkubacja trwała do 30 minut). Po upływie tego czasu reakcje zatrzymywano

przez dodanie 230μl wody i zamrożenie. Analizę składu mieszaniny reakcyjnej

prowadzono za pomocą HPLC na kolumnie analitycznej.

Wydajność naprawy obliczano porównując procentowy udział modyfikowanego

i niemodyfikowanego pentameru w rozdziale chromatograficznym HPLC przed i po

reakcji z badanym białkiem.

III.2.9.1. Zależność naprawy od pH

Reakcje startowano buforem o odpowiednim pH. α-ketoglutaran i jony Fe (II)

w postaci (NH4)2Fe(SO4)2 x 6H2O dodawano tuż przed reakcją ze względu na ich

nietrwałość.

TT(HEC)TT

W przypadku białka AlkB reakcje naprawy prowadzono w buforze octanowym

o pH 5,4 oraz w buforze Bis-Tris o pH: 5,8; 6,0; 6,2 lub 6,6. Reakcje z białkami SA-1A

i SA-2B prowadzono w buforze Bis-Tris o pH: 5,8; 6,0; 6,2; 6,6 i 7,0. We wszystkich

mieszaninach z białkiem SA-1A i SA-2B końcowe stężenia α-ketoglutaranu i Fe (II)

wynosiły po 0,5mM. Natomiast w reakcjach z białkiem AlkB stężenie Fe (II) wynosiło

1mM, a stężenie α-KG 0,5mM. Pozostałe składniki reakcji stanowiły: woda miliQ,

substrat TT(HEC)TT (500pm) oraz białko (AlkB 25pm, SA-1A 20pm i SA-2B 50pm).

TT(HPC)TT

Reakcje z udziałem białka AlkB i SA1A prowadzono w buforze HEPES

o pH: 6,8; 7,2; 7,4; 7,6 oraz 7,8. W reakcji z białkiem SA-1A stężenie α-KG było równe

0,5mM, natomiast stężenie Fe (II) wynosiło 0,1mM. W reakcjach z białkiem AlkB

stężenie Fe (II)i α-KG wynosiło 0,05mM. Pozostałe składniki stanowiła woda, substrat

TT(HPC)TT (500pm) i białko (AlkB 25pm, SA-1A 20pm).

39

TT(εC)TT i TT(εA)TT

Reakcje dla białek SA-1A i SA-2B prowadzono w buforze octanowym o pH:

4,2; 4,6; 5,0; 5,4 i 5,6. Stężenie α-ketoglutaranu wynosiło 0,5mM, natomiast stężenie Fe

(II) 3mM. Pozostałe składniki stanowiła woda miliQ, substrat (500pm) oraz białko

(50pm).

III.2.9.2. Zależność naprawy od stężenia α-KG

W celu porównania uzyskanych wyników i zminimalizowania błędu

pipetowania z wyjściowego roztworu o stężeniu 100mM przygotowano szereg

rozcieńczeń α-KG.

TT(HEC)TT

Reakcje z białkiem AlkB i SA-1A prowadzono w buforze Bis-Tris o pH 5,8.

Stężenia α-KG w reakcjach z AlkB wynosiły 0,01mM; 0,025mM; 0,05mM; 0,1mM;

0,25mM; 0,5mM, a w reakcjach z SA-1A wynosiły 0mM; 0,01mM; 0,025mM;

0,05mM; 0,1mM i 0,5mM. Pozostałe składniki reakcji to: Fe (II) (1mM w reakcji

z AlkB, 500μM w reakcji z SA-1A), woda miliQ, substrat TT(HEC)TT (500pm)

i białko (AlkB 25pm, SA-1A 20pm).

TT(HPC)TT

Reakcje z białkiem AlkB prowadzono w buforze HEPES o pH 7,4, natomiast

reakcje z białkiem SA-1A prowadzono w buforze HEPES o pH 7,4. Stężenia α-KG

w reakcjach z AlkB wynosiły 0,025mM; 0,05mM; 0,1mM; 0,25mM; 0,5mM i 1mM.

Natomiast w reakcjach z SA-1A stężenia α-KG wynosiły 0mM; 0,01mM; 0,025mM;

0,05mM; 0,1mM i 0,5mM. Pozostałe składniki reakcji to: 100μM Fe (II), woda miliQ,

substrat TT(HPC)TT (500pm) i białko (50pm).

TT(εA)TT i TT(εC)TT

Reakcje naprawy przez białko SA-1A przeprowadzono w buforze octanowym

o pH 5,0. Stężenia α-KG w reakcjach wynosiły 0mM; 0,01mM; 0,025mM; 0,05mM;

0,1mM i 0,5mM. Pozostałe składniki stanowiły: Fe (II) o stężeniu 3mM, woda miliQ,

substrat (500pm) i białko (50pm).

40

III.2.9.3. Zależność naprawy od stężenia jonów Fe (II)

W celu porównania uzyskanych wyników i zminimalizowania błędu

pipetowania z wyjściowego roztworu o stężeniu 100mM przygotowano szereg

rozcieńczeń jonów Fe (II) w postaci (NH4)2Fe(SO4)2 x 6H2O.

TT(HEC)TT

Reakcje z białkiem AlkB, SA-1A i SA-2B prowadzono w buforze Bis-Tris o pH

5,8. Stężenia Fe (II) w reakcjach z AlkB wynosiły 0,25mM; 0,5mM; 1mM; 1,5mM;

2mM; 2,5mM i 3mM, a w reakcjach z SA-1A i SA-2B: 0mM; 0,1mM; 0,5mM; 1mM;

2mM i 3mM. Pozostałe składniki reakcji to: α-ketoglutaran (500 μM w reakcji z AlkB,

25μM w reakcji z SA-1A i 250μM w reakcji z SA-2B), woda miliQ, substrat

TT(HEC)TT (500pm) i białko (AlkB 25pm, SA-1A i SA-2B 50pm).

TT(HPC)TT

Reakcje z białkiem AlkB i SA-1A prowadzono w buforze HEPES o pH 7,4.

Stężenia Fe (II) w reakcjach z AlkB wynosiły 0,01mM; 0,025mM; 0,05mM; 0,1mM;

0,25mM, a w reakcjach z SA-1A: 0mM; 0,01mM; 0,05mM; 0,1mM; 0,25mM i 0,5mM.

Pozostałe składniki reakcji to: α-ketoglutaran (50μM), woda miliQ, substrat

TT(HPC)TT (500pm) i białko (AlkB 25pm, SA-1A 50pm).

TT(εA)TT i TT(εC)TT

Reakcje naprawy przez białko SA-2B przeprowadzono w buforze octanowym

o pH 5,0. Użyto α-KG o stężeniu 250μM. Stężenia Fe (II) w reakcjach wynosiły

0,5mM, 1,5mM, 3mM i 5mM. Pozostałe składniki stanowiła woda, substrat (500pm)

i białko (50pm).

III.2.9.4. Zależność naprawy od czasu

W reakcjach z białkiem AlkB inkubacja mieszaniny reakcyjnej w temp. 37ºC

trwała odpowiednio: 1; 2,5; 5; 10; 20 lub 30 minut.

TT(HEC)TT

Reakcje z białkiem AlkB prowadzono w buforze Bis-Tris o pH 5,8; przy

stężeniu Fe (II) równym 1mM i stężeniu α-ketoglutaranu wynoszącym 500 μM.

41

Pozostałe składniki mieszaniny reakcyjnej to: woda miliQ, substrat TT(HEC)TT

(500pm) i białko (25pm).

TT(HPC)TT

Reakcje z białkiem AlkB prowadzono w buforze HEPES o pH 7,5; przy stężeniu

Fe (II) równym 100 μM i stężeniu α-ketoglutaranu 500 μM. Pozostałe składniki

mieszaniny reakcyjnej stanowiły: woda miliQ, substrat TT(HPC)TT (500pm) i białko

(12,5pm).

42

IV Wyniki

IV.1. Oczyszczanie białka SA-2B

Otrzymane w wyniku oczyszczania frakcje białka charakteryzowały się różną

czystością. W związku z tym, w doświadczeniach wykorzystano najbardziej czyste

frakcje, zawierające w większości niezdegradowane białka, które posiadają sekwencję

aminokwasową pełnej długości.

Rys 7. Zdjęcie żelu z frakcjami po oczyszczaniu białka SA-2B. Frakcje: O- osad, S- supernatant, 3, 10,

18-27.

Największe stężenie białka SA-2B otrzymano we frakcji 25. Uzyskano 2ml

preparatu w stężeniu 0,92 μg/μl. Frakcja ta została podzielona na porcje i zamrożona

w -800C do czasu przeprowadzania reakcji napraw z wykorzystaniem tego białka.

43

IV.2. Chemiczna modyfikacja pentamerów TTCTT i TTATT

IV.2.1. Modyfikacja pentamerów zawierających cytozynę (TTCTT)

Oligomer TTCTT modyfikowano za pomocą związków chemicznych: aldehydu

chlorooctowego (CAA) oraz akroleiny (ACR). W tych warunkach tymina nie ulega

przekształceniom, modyfikacji ulegają jedynie cząsteczki cytozyny.

Gdy TTCTT inkubowano z CAA w 1,5 M buforze TEAB o pH ok. 7-8 przez

2,5h w temperaturze 37°C otrzymaną główną pochodną była hydroksyetanocytozyna

(HEC) (Rys. 8). Po dodaniu do oligomeru akroleiny w 1 M buforze octanowym o pH

4,5 i 3,5h inkubacji w temperaturze 37°C uzyskano hydroksypropanocytozynę (HPC)

(Rys. 9).

Do monitorowania postępu reakcji i czystości otrzymanych pochodnych

posłużyło HPLC.

Rys 8. Chromatogram przedstawiający analityczny rozdział produktów reakcji modyfikacji

pentameru TTCTT (T/C) aldehydem chlorooctowym

W reakcji T/C z CAA użyto 10 j.op substratu (220 nmoli) i otrzymano

następującą wydajność reakcji: uzyskano 70% modyfikacji, w tym 55% T/HEC i 15%

T/εC.

44

Rys 9. Chromatogram przedstawiający analityczny rozdział produktów reakcji modyfikacji

pentameru TTCTT (T/C) akroleiną

W reakcji T/C z akroleiną użyto 10 j.op substratu (220 nmoli) i uzyskano 100%

wydajność reakcji, gdyż cała ilość TTCTT przereagowała z czynnikiem modyfikującym

substrat.

Następnie dokonano izolacji produktów za pomocą preparatywnego rozdziału na

HPL (rys. 10 i 11). Wybrane frakcje po połączeniu i zliofilizowaniu rozpuszczono

w buforze TE. Próbki te zostały rozdzielone analitycznie na HPLC.

Rys 10. Chromatogram przedstawiający preparatywny rozdział produktów reakcji modyfikacji

pentameru TTCTT (T/C) aldehydem chlorooctowym. Pik 1 reprezentuje niezmodyfikowany substrat

T/C; 2 - T/HEC; 3 – T/ εC, 4 i 5 – niezidentyfikowane produkty reakcji.

45

Rys 11. Chromatogram przedstawiający preparatywny rozdział produktów reakcji modyfikacji

pentameru TTCTT (T/C) akroleiną

IV.2.2. Modyfikacja pentamerów zawierających adeninę (TTATT)

Oligomer TTATT modyfikowano za pomocą aldehydu chlorooctowego (CAA).

Reakcję modyfikacji przeprowadzano w 0,5 M buforze octanowym o pH 4,6 w ciągu 23

h i w temperaturze 25°C. W jej wyniku uzyskano pochodną etenową (εA). Postęp

reakcji i czystość otrzymanej pochodnej monitorowano przy użyciu HPLC.

Następnie dokonano izolacji produktu za pomocą preparatywnego rozdziału na

HPLC. Ponieważ reakcja zaszła ze 100% wydajnością, rozdział ten miał na celu

usunięcie toksycznego dla białka AlkB aldehydu chlorooctowego. Wybrane frakcje po

połączeniu i zliofilizowaniu rozpuszczono w buforze TE. Otrzymana próbka została

rozdzielona analitycznie na HPLC.

46

Rys 12. Chromatogram przedstawiający analityczny rozdział produktów reakcji modyfikacji pentameru TTATT (T/A) aldehydem chlorooctowym

IV.3. Badanie naprawy modyfikowanych oligomerów przez białko

AlkB in vitro

W celu analizy aktywności naprawczej białka wobec otrzymanych substratów

przeprowadzono inkubację oczyszczonych pentametrów z białkiem AlkB w obecności

α-ketoglutaranu (α-KG), jonów żelaza (II), buforu o odpowiednim pH, ditiotreitolu

(DTT) oraz wody. Badano wpływ różnych czynników takich jak: pH, stężenie Fe (II),

stężenie α-KG, czas; na wydajność naprawy poszczególnych substratów przez białko

AlkB. Stopień naprawy oligomeru przez białko AlkB był określany na podstawie

analizy uzyskanych chromatogramów.

47

IV.3.1. Naprawa TT(HEC)TT

IV.3.1.1. Zależność naprawy od pH

Rys 13. Chromatogram przedstawiający skład mieszaniny reakcyjnej po inkubacji TT(HEC)TT

z białkiem AlkB w pH 5,8. Wydajność naprawy wynosiła 67,7%.

0

20

40

60

80

5 5,4 5,8 6,2 6,6pH

% n

ap

raw

y

Rys 14. Zależność wydajności naprawy substratu TT(HEC)TT przez białko AlkB od pH buforu

w mieszaninie reakcyjnej

Najlepszą naprawę HEC przez AlkB obserwowano przy pH 5,8.

48

IV.3.1.2. Zależność naprawy od stężenia Fe (II)


z białkiem AlkB przy stężeniu Fe (II) równym 0,5mM. Wydajność naprawy wynosiła 64,4%.

0

20

40

60

80

0 1 2 3Fe (II) [mM]

% n

ap

raw

y

Rys 16. Zależność wydajności naprawy substratu TT(HEC)TT przez białko AlkB od stężenia Fe


Najlepszą naprawę HEC przez AlkB obserwowano przy stężeniu żelaza równym 1mM.

49

IV.3.1.3. Zależność naprawy od stężenia α-KG


z białkiem AlkB przy stężeniu α-KG równym 0,05mM. Wydajność naprawy wynosiła 71,8%.

0

20

40

60

80

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6αKG [mM]

% n

ap

raw

y

Rys 18. Zależność wydajności naprawy substratu TT(HEC)TT przez białko AlkB od stężenia α-KG


Najlepszą naprawę HEC przez AlkB obserwowano przy stężeniu α-ketoglutaranu

równym 0,025mM.

50

IV.3.1.4. Zależność naprawy od czasu


z białkiem AlkB w czasie 30min. Wydajność naprawy wynosiła 42%.

0

10

20

30

40

50

0 10 20 30czas [min.]

% n

ap

raw

y

Rys 20. Zależność wydajności naprawy substratu TT(HEC)TT przez białko AlkB od czasu

Najlepszą naprawę HEC przez AlkB obserwowano przy reakcji prowadzonej przez

30min.

51

IV.3.2. Naprawa TT(HPC)TT


Rys 21. Chromatogram przedstawiający skład mieszaniny reakcyjnej po inkubacji TT(HPC)TT

z białkiem AlkB w pH 6,8. Wydajność naprawy wynosiła 23,2%.

0

10

20

30

40

50

60

70

6,5 7 7,5 8

pH

% n

ap

raw

y

Rys 22. Zależność wydajności naprawy substratu TT(HPC)TT przez białko AlkB od pH buforu


Najlepszą naprawę HPC przez AlkB obserwowano przy pH 7,4.

52



z białkiem AlkB przy stężeniu Fe (II) równym 0,1mM. Wydajność naprawy wynosiła 68%.

0

20

40

60

80

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3

Fe (II) [mM]

% n

ap

raw

y

Rys 24. Zależność wydajności naprawy substratu TT(HPC)TT przez białko AlkB od stężenia Fe

(II) w mieszaninie reakcyjnej

Najlepszą naprawę HPC przez AlkB obserwowano przy stężeniu żelaza równym

0,1mM.

53



z białkiem AlkB przy stężeniu α-KG równym 0,1mM. Wydajność naprawy wynosiła 69,3%.

0

20

40

60

80

100

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6αKG [mM]

% n

ap

raw

y

Rys 26. Zależność wydajności naprawy substratu TT(HPC)TT przez białko AlkB od stężenia α-KG


Najlepszą naprawę HPC przez AlkB obserwowano przy stężeniu α-ketoglutaranu

równym 0,05mM.

54

IV.3.2.4. Zależność naprawy od czasu


z białkiem AlkB po 20min. Wydajność naprawy wynosiła 63,4%.

0

20

40

60

0 10 20 30czas [min.]

% n

ap

raw

y

Rys 28. Zależność wydajności naprawy substratu TT(HPC)TT przez białko AlkB od czasu

Najlepszą naprawę HPC przez AlkB obserwowano przy reakcji prowadzonej przez

30min.

55

IV.4. Badanie naprawy in vitro modyfikowanych oligomerów przez

bakteryjne homologi białka AlkB: SA-1A i SA-2B

Przeprowadzono analizę aktywności naprawczej białka SA-1A i SA-2B wobec

zsyntetyzowanych substratów. W tym celu inkubowano w 37°C otrzymane oczyszczone

pentamery z każdym z tych białek w obecności α-ketoglutaranu (α-KG), jonów Fe (II),

buforu o odpowiednim pH, ditiotreitolu (DTT) oraz wody. W celu zatrzymania reakcji

mieszaniny reakcyjne rozcieńczano wodą i zamrażano. Badano wpływ różnych

czynników takich jak: pH, stężenie Fe, stężenie α-KG, czas; na wydajność naprawy

poszczególnych substratów przez białko SA-1 i SA-2. Analizując wyniki reakcji po

rozdziale chromatograficznym określano stopień naprawy oligomeru przez homologi

białka AlkB.

IV.4.1. Białko SA-1A

Na rys. 29, 30, 31 i 32 przedstawiono wzorce substratów użytych do badania

specyficzności substratowej białka SA-1:

Rys 29. Chromatogram przedstawiający wzorzec substratu (poddany następnie inkubacji

z białkiem SA-1A), otrzymany po reakcji TTCTT z CAA

56


z białkiem SA-1A), otrzymany po reakcji TTCTT z CAA


z białkiem SA-1A), otrzymany po reakcji TTCTT z akroleiną

57


z białkiem SA-1A), otrzymany po reakcji TTATT z CAA



z białkiem SA-1A w pH 5,8. Wydajność naprawy wynosiła 80,8%.

58

0%

20%

40%

60%

80%

100%

4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8

pH

% n

ap

raw

y

HEC εC εA HPC

Rys 34. Zależność wydajności naprawy uzyskanych substratów przez białko SA-1A od pH buforu


Najlepszą naprawę HEC obserwowano przy pH 5,8; natomiast najlepszą

naprawę HPC obserwowano przy pH 7,4. Wyniki napraw εC i εA były zbyt niskie, by

można było stwierdzić naprawę i ustalić optimum.



z białkiem SA-1A przy stężeniu α-ketoglutaranu równym 0,05mM. Wydajność naprawy wynosiła 22,4%.

59

0%

20%

40%

60%

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

stężenie alfa-KG (w mM)

% n

ap

raw

y

HEC εC εA HPC

Rys 36. Zależność wydajności naprawy uzyskanych substratów przez białko SA-1A od stężenia

α-KG w mieszaninie reakcyjnej

Najlepszą naprawę HEC obserwowano przy stężeniu α-KG równym 0,01mM;

natomiast HPC było najlepiej naprawiane przy stężeniu α-KG równym 0,05mM.

Wyniki napraw εC i εA były zbyt niskie, by można było stwierdzić naprawę i ustalić

optimum.



z białkiem SA-1A przy stężeniu Fe (II) równym 2mM. Wydajność naprawy wynosiła 74,5%.

60

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3

Stężenie Fe (w mM)

% n

ap

raw

y

HPC HEC

Rys 38. Zależność wydajności naprawy substratu uzyskanych substratów przez białko SA-1A od

stężenia Fe w mieszaninie reakcyjnej

Optimum stężenia Fe (II) dla naprawy HEC 0,5mM, natomiast HPC najlepiej

naprawiało się przy stężeniu Fe (II) równym 0,05mM.

IV.4.2. Białko SA-2B

W sposób analogiczny do badań dla SA-1A przeprowadzono reakcje mające na

celu sprawdzenie specyficzności substratowej oraz zależności wydajności naprawy

substratów od pH i stężenia żelaza. W przeprowadzonych reakcjach białka SA-2B

z pięciomerami zawierającymi HEC, εC i εA nie uzyskano naprawy, dlatego też

wyciągnięto wniosek, że w warunkach stosowanych w reakcjach SA-2B nie naprawia

badanych substratów. Stąd też nie prowadzono dalszych badań nad zależnością

wydajności naprawy substratów od stężenia α-ketoglutaranu i od czasu.

61

V Dyskusja

Białko AlkB jest enzymem, który naprawia DNA według unikalnego

mechanizmu, polegającego na usuwaniu uszkodzeń z zasady bez naruszania

integralności nici DNA, podczas gdy większość znanych mechanizmów naprawy polega

na usuwaniu i wymianie uszkodzonych fragmentów podwójnej helisy DNA. AlkB

utlenia grupy metylowe 1-metyloadeniny i 3-metylocytozyny w ssDNA (Trewick i wsp.

2002, Falnes i wsp. 2002), dsDNA oraz ssRNA (Aas i wsp. 2003). Efektywniej

naprawia uszkodzenia w ssDNA niż w dsDNA (Dinglay i wsp. 2000). Naprawia

również etenoadeninę, etenocytozynę oraz hydroksyetanocytozynę (Delaney i wsp.

2005, Mishina i wsp. 2005, Maciejewska i wsp. 2010). Badania prowadzone w

Zakładzie Biologii Molekularnej IBB przez prof. Jarosława Kuśmierka i dr Agnieszkę

Maciejewską wykazały, że białko AlkB naprawia również z dużą wydajnością

hydroksypropanocytozynę (Maciejewska i wsp., publikacja w przygotowaniu).

Niniejsza praca miała na celu ustalenie optymalnych warunkach naprawy

3,N4-α-hydroksyetanocytozyny i 3,N

4-α-hydroksypropanocytozyny przez AlkB oraz

określenie specyficzności substratowej homologów AlkB: SA-1A i SA-2B,

pochodzących z Streptomyces avermitilis. Te występujące w glebie bakterie, należące

do rzędu promieniowców, produkują wiele metabolitów wtórnych, w tym awermektyny,

które są wykorzystywane w medycynie jako czynniki antypasożytnicze (Ōmura

i współpracownicy 2001). Efektywność naprawy przez SA-1 i SA-2B badano dla

3,N4-α-hydroksyetanocytozyny (HEC), 3,N

4-α-hydroksypropanocytozyny (HPC),

1,N6-etenoadeniny oraz 3,N

4-etenocytozyny. Dla naprawianych przez te homologi

substratów ustalono optymalne warunki naprawy.

Pierwszym etapem badań było uzyskanie oczyszczonych białek

wykorzystywanych następnie do reakcji naprawy. Jak pokazują wyniki metoda,

polegająca na transformacji bakterii szczepu E. coli BL21 (DE3) plazmidem

pET28a/alkB, następnie ekspresji białka w szczepie E. coli BL21 (DE3) i oczyszczaniu

go na kolumnie niklowej HisTrap (Amersham) z wykorzystaniem urządzenia Akta

Prime, jest skuteczna i pozwala uzyskać aktywne enzymy, które można przechowywać

w temperaturze -800C i wykorzystywać do badań nad ich specyficznością substratową.

Drugim etapem badań była modyfikacja komercyjnie dostępnych pentamerów

DNA, które służyły jako substraty do reakcji naprawy przez białko AlkB i jego

homologi. Używane do modyfikacji pentamery składają się z 4 tymin i A lub C,

62

ponieważ tymina jako jedyna zasada nie ma egzocyklicznej grupy NH2 i nie tworzy

adduktów egzocyklicznych, ponieważ nie reaguje z aldehydem chlorooctowym

i akroleiną. Za pomocą ACR i CAA modyfikowano pentamery zawierające cytozynę.

W reakcji z akroleiną otrzymywano HPC, natomiast w reakcji

z aldehydem chloroocrowym otrzymywano HEC i εC. P

Udział bakteryjnych dioksygenaz z rodziny AlkB w naprawie …ibb.waw.pl/sites/default/files/Beata...

Documents

Transcript of Udział bakteryjnych dioksygenaz z rodziny AlkB w naprawie …ibb.waw.pl/sites/default/files/Beata...