tom 48 zeszyt 2 rok 2009 - Polskie Towarzystwo Mikrobiologózjum Stefana Batorego, student medycyny...

http://www.pm.microbiology.pl

RADA REDAKCYJNA

JACEK BIELECKI (Uniwersytet Warszawski), RYSZARD CHRÓST (Uniwersytet Warszawski),JERZY D£UGOÑSKI (Uniwersytet £ódzki), DANUTA DZIER¯ANOWSKA (Centrum Zdrowia Dziecka),

EUGENIA GOSPODAREK (Collegium Medicum UMK w Bydgoszczy), JERZY HREBENDA (Uniwersytet Warszawski),WALERIA HRYNIEWICZ (Narodowy Instytut Leków), MAREK JAKÓBISIAK (Akademia Medyczna w Warszawie),

ANDRZEJ PASZEWSKI (Instytut Biochemii i Biofizyki PAN), ANDRZEJ PIEKAROWICZ (Uniwersytet Warszawski),ANTONI RÓ¯ALSKI (Uniwersytet £ódzki), ALEKSANDRA SK£ODOWSKA (Uniwersytet Warszawski),

BOHDAN STARO�CIAK (Warszawski Uniwersytet Medyczny), BOGUS£AW SZEWCZYK (Uniwersytet Gdañski),EL¯BIETA TRAFNY (Wojskowy Instytut Higieny i Epidemiologii),

STANIS£AWA TYLEWSKA-WIERZBANOWSKA (Pañstwowy Zak³ad Higieny),GRZEGORZ WÊGRZYN (Uniwersytet Gdañski), PIOTR ZIELENKIEWICZ (Uniwersytet Warszawski)

REDAKCJA

JERZY HREBENDA (redaktor naczelny), JACEK BIELECKI (zastêpca),BOHDAN STARO�CIAK (sekretarz), MARTA BRZÓSTKOWSKA (korekta tekstów angielskich)

Adresy redakcji

Redaktorzy:Instytut Mikrobiologii, Wydzia³ Biologii, Uniwersytet Warszawski

ul. Miecznikowa 1, 02-096 Warszawa, tel. (0 22) 554 13 05/304, fax (0 22) 554 14 04e-mail: [email protected]; [email protected]

SekretarzZak³ad Mikrobiologii Farmaceutycznej, Warszawski Uniwersytet Medyczny

ul. Oczki 3 (parter), 02-007 Warszawa, tel. (0 22) 628 08 22, (0 22) 621 13 51e-mail: [email protected]

PUBLIKACJE METODYCZNE I STANDARDY

Redaktor odpowiedzialny: STEFANIA GIEDRYS-KALEMBA (Pomorska Akademia Medyczna w Szczecinie)

Adres Redaktora dzia³u Publikacje Metodyczne i Standardy

Katedra i Zak³ad Mikrobiologii i Immunologii Pomorskiej Akademii Medycznej, Al. Powstañców Wlkp. 72, 70-111 Szczecin,tel./fax: (091) 46 616 51, 52, lub fax: (091) 46 616 59, e-mail: [email protected] lub [email protected]

Stali recenzenci:

JERZY D£UGOÑSKI (Uniwersytet £ódzki), WALERIA HRYNIEWICZ (Narodowy Instytut Leków),JÓZEF KUR (Politechnika Gdañska), EUGENIUSZ MA£AFIEJ (Instytut Centrum Zdrowia Matki Polki),

ANNA PRZONDO-MORDARSKA (Akademia Medyczna we Wroc³awiu)

CZASOPISMO WYDAWANE Z FINANSOW¥ POMOC¥MINISTERSTWA NAUKI I SZKOLNICTWA WY¯SZEGO

Punktacja za publikacjê naukow¹ wg MNiSW4.0

Index Copernicus ICV = 3,16 (2008)

ISBN 978 - 83 - 923731 - 3 - 1

Na ok³adce: Konidiofor Aspergillus sp. (fot. Jaros³aw Wi�niewski, Instytut Mikrobiologii UW).

Projekt ok³adki: Jerzy Grzegorkiewicz

P O L S K I E T O W A R Z Y S T W O M I K R O B I O L O G Ó W

Nak³ad 1150 + 15 egz., Objêto�æ 10 arkuszy wyd., Papier offser 80 g

Sk³ad i druk:Zak³ad Wydawniczy Letter Quality, 01-216 Warszawa, Brylowska 35/38,tel. 0 22 631 45 18, 0 607 217 879, e-mail: [email protected]

POST. MIKROBIOL.,2009, 48, 2, 89�91http://www.pm.microbiology.pl

Profesor Piotr P. S³onimski urodzi³ siê 9 listopada1922 roku w Warszawie w rodzinie o tradycjachpatriotycznych i legionowych. W czasie okupacji nie-mieckiej � pocz¹tkowo jako ¿o³nierz Szarych Szere-gów a nastêpnie jako podchor¹¿y zwi¹zany z �Agry-kol¹� � nale¿a³ do grup specjalnych Kedywu OkrêguWarszawskiego Armii Krajowej. Bra³ udzia³ w Po-

wstaniu Warszawskim w �Zgrupowaniu Baszta� naMokotowie. Odznaczony zosta³ Krzy¿em Walecz-nych. W latach 1945�1947 pracowa³ jako asystentw Zak³adzie Embriologii Uniwersytetu Jagieloñskie-go, gdzie ukoñczy³ studia i otrzyma³ dyplom doktoranauk medycznych. W tym okresie by³ te¿ w Krakowiewiê�niem politycznym sowieckich s³u¿b specjalnych.

Profesor Piotr S³onimski(9 XI 1922 � 25 IV 2009)

Doktor honoris causa Uniwersytetu Wroc³awskiego,uhonorowany Z³otym Medalem uczelni. Emerytowa-ny profesor paryskiego Uniwersytetu Pierre et MarieCurie. �wiatowej s³awy biolog, wybitny genetyk,twórca genetyki mitochondrialnej. Absolwent Gimna-zjum Stefana Batorego, student medycyny na tajnychkompletach. ¯o³nierz Armii Krajowej i uczestnik po-wstania warszawskiego. Doktorat z medycyny uzyska³w 1947 r. na UJ, a doktorat z nauk przyrodniczychna Sorbonie w 1952 r. Pracowa³ naukowo we Francjiod 1947 r. Kierownikiem Zak³adu w CNRS zosta³w 1954 r. Stworzy³ w 1971 r. Centrum Genetyki Mole-kularnej CNRS w Gif-sur-yvette pod Pary¿em, którymkierowa³ ponad 20 lat, a od 1992 r. by³ jego dyrektoremhonorowym. Dyrektor francuskich zespo³ów badañ nadgenomami. Pasjonowa³ siê mitochondriami, w tej dzie-dzinie by³ wielkim autorytetem. Jego zespó³ odkry³niezale¿ny od j¹dra zestaw genów mitochondrialnychi zasady rz¹dz¹ce ich dziedziczeniem. W ostatnich la-tach po�wiêci³ siê genomice teoretycznej i formalnejanalizie jêzyka genomów, publikuj¹c nowatorskie pra-ce z matematykami UW. By³ cz³onkiem FrancuskiejAkademii Nauk i Academii Europea, cz³onkiem za-granicznym Królewskiej Belgijskiej Akademii Nauk,Niemieckiej Akademii Nauk, Polskiej Akademii Naukoraz Amerykañskiej Akademii Sztuk i Nauk, a i in-nych. Uhonorowany doktoratem hc tak¿e przez Uni-wersytet Warszawski i w Bratys³awie oraz Uniwersy-tet w Louvain. W 1984 r. otrzyma³ Legiê Honorow¹,rok pó�niej najwy¿sze odznaczenie naukowe we Fran-

cji � Z³oty Medal CNRS. W czasie stanu wojennegow Polsce wspomaga³ opozycjê. Wspó³za³o¿yciel sto-warzyszenia Solidarno�æ Francja Polska. W latach 90.by³ wspó³organizatorem i patronem polsko-francus-kiego programu studiów doktoranckich w biologii mo-lekularnej. Pogrzeb Profesora odby³ siê 5 maja nacmentarzu w Gif-sur-yvette pod Pary¿em.

WSPOMNIENIE

25 kwietnia 2009 roku o godzinie 17:00 zmar³ Profesor paryskiej Sorbony Piotr P. S£ONIMSKI,wielki przyjaciel Instytutu Genetyki i Mikrobiologii i Uniwersytetu Wroc³awskiego.

90 WSPOMNIENIE O PROFESORZE PIOTRZE S£ONIMSKIM

W roku 1947 dziêki pomocy stryja, poety AntoniegoS³onimskiego, wyjecha³ na sta³e do Francji i rozpo-cz¹³ pracê naukow¹, pocz¹tkowo w Instytucie BiologiiFizyko-Chemicznej w Pary¿u, a potem w Laborato-rium Genetyki Fizjologicznej CNRS w Gif-sur-Yvettepod Pary¿em i na Uniwersytecie Piotra i Marii Curiew Pary¿u. W o�rodkach tych przeszed³ wszystkieszczeble kariery naukowej i w roku 1952 otrzyma³stopieñ doktora nauk przyrodniczych, a w 1966 tytu³profesora Sorbony. W 1971 roku zosta³ dyrektoremCentrum Genetyki Molekularnej CNRS w Gif-sur-Yvette, a od 1992 roku pe³ni³ funkcjê honorowego dy-rektora tego Instytutu. Od 1972 roku by³ wiceprezy-dentem, a od 1984 roku pe³ni³ funkcjê prezydentaMiêdzynarodowych Konferencji Genetyki i BiologiiMolekularnej Dro¿d¿y. W latach 1992�1997 pe³ni³funkcje prezydenta i dyrektora generalnego KomitetuNaukowego Badañ Genomów Ministerstwa Naukii Przestrzeni we Francji. Od 1983 roku by³ korespon-dentem, a od 1985 roku cz³onkiem Francuskiej Aka-demii Nauk. Ponadto Piotr S³onimski by³ równie¿cz³onkiem zagranicznym Belgijskiej Królewskiej Aka-demii Nauk i Sztuk Piêknych, cz³onkiem NiemieckiejAkademii Nauk, cz³onkiem zagranicznym PolskiejAkademii Nauk, cz³onkiem Polskiej Akademii Umie-jêtno�ci, cz³onkiem zagranicznym Amerykañskiej Aka-demii Nauk i Umiejêtno�ci, cz³onkiem Akademii Euro-pejskiej, a tak¿e cz³onkiem licznych rad i komitetów,takich jak Rada EMBO, Komitet Biologii Molekular-nej i Delegatury Generalnej Badañ Naukowych i Tech-niki, Rada Naukowa Instytutu Narodowego Zdrowiai Badañ Medycznych, Rada Naukowa Ligi NarodowejPrzeciwko Rakowi, Rada Naukowa UniwersytetuPiotra i Marii Curie, Rada Naukowa Instytutu Pasteura,Rada Naukowa Centrum Narodowego Badañ Nauko-wych CNRS, Miêdzynarodowa Rada Baz DanychSekwencji Genomów. Pe³ni³ równie¿ etatow¹ funkcjêeksperta naukowego Komitetu Biotechnologicznegoprzy Unii Europejskiej w Brukseli.

Swoje zainteresowania naukowe Piotr S³onimskiwi¹za³ �ci�le z genetyk¹ mitochondrialn¹ i biochemi¹dro¿d¿y. W dorobku naukowym mia³ ponad 300 pu-blikacji w renomowanych czasopismach naukowych,takich jak Cell, Nature i EMBO Journal. Jako jedenz g³ównych naukowych ekspertów Unii Europejskiejkierowa³ programami badawczymi finansowanymiprzez UE. Obok profesora A. Goffeau z Belgii by³ jed-nym z g³ównych organizatorów Projektu Systematycz-nego Sekwencjonowania Genomu Dro¿d¿y. By³ te¿koordynatorem Miêdzynarodowego Programu UniiEuropejskiej EUROFAN dotycz¹cego analizy funk-cjonalnej genomu komórki dro¿d¿owej. Profesor PiotrS³onimski pracowa³ w komitetach redakcyjnych kilkuczasopism naukowych: Molecular and General Ge-netics, Methods in Molecular and Cellular Biology,

European Journal of Biochemistry, Biology of the Cell,Biochimie oraz Current Genetics. By³ organizatoremlicznych Miêdzynarodowych Konferencji i Kongre-sów Naukowych. Od 1962 do 2008 roku przeprowa-dzi³ ponad 200 wyk³adów i seminariów w o�rodkachnaukowych na ca³ym �wiecie. Za swoje wybitne osi¹g-niêcia naukowe kilkakrotnie by³ nominowany donagrody Nobla. Za zas³ugi dla Francji w 1984 rokuzosta³ kawalerem Francuskiej Legii Honorowej,w 1992 roku oficerem Francuskiego Orderu Zas³ugi,a w 1993 roku odznaczono Go Krzy¿em Komandor-skim z Gwiazd¹ Orderu Zas³ugi Rzeczpospolitej Pol-skiej. Otrzyma³ te¿ medal z³oty CNRS-u oraz medalz³oty i presti¿ow¹ nagrodê Hansena Duñskiej Aka-demii Nauk, nagrodê Charlesa Leopolda MayeraAkademii Nauk, nagrodê Marie Guido Triossi Aka-demii Nauk, nagrodê Fundacji Luis Rapkine, medalGrzegorza Mendla Towarzystwa Genetycznego Wiel-kiej Brytanii, nagrodê �Jurzykowskich Fundation�.Ponadto, by³ laureatem nagród im. Andrzeja Drawiczai Premiera Rzeczpospolitej Polskiej. Otrzyma³ tytu³doktora honoris causa Uniwersytetu Louvain-la-Neuvew Belgii, Uniwersytetu Bratys³awskiego i Uniwersy-tetu Warszawskiego (w 1992 roku). Po�miertnie od-znaczony zosta³ Krzy¿em Komandorskim z Gwiazd¹Polonia Restituta przez Prezydenta RzeczpospolitejPolskiej Lecha Kaczyñskiego.

Nale¿y podkre�liæ fakt, ¿e na wniosek prof. T.M.Lachowicza, pierwszego Dyrektora Instytutu Mikro-biologii Wydzia³u Nauk Przyrodniczych, UniwersytetWroc³awski jako pierwszy nada³ Piotrowi S³onimskie-mu, Profesorowi Sorbony, godno�æ doktora honoriscausa za jego zas³ugi na polu genetyki i wspó³pracynaukowej pomiêdzy Francj¹ i Polsk¹. Niestety, z przy-czyn politycznych zwi¹zanych z dzia³alno�ci¹ Jegostryja Antoniego S³onimskiego, który w tym czasieprotestowa³ przeciwko zmianom w konstytucji PRL,ca³a uroczysto�æ wrêczenia tego zaszczytnego tytu³unaszego Uniwersytetu zosta³a wyciszona i odby³a siê28 lutego 1976 roku bardzo skromnie, za zamkniêtymidrzwiami w Instytucie Antropologii (zdjêcie z Archi-wum Uniwersytetu w za³¹czeniu). Na wniosek m³od-szego ju¿ pokolenia pracowników Instytutu Genetykii Mikrobiologii, tych którzy przebywali na sta¿achnaukowych w Gif-sur-Yvette we Francji lub wspó³-pracowali z Profesorem, podjêto starania, aby nag³o�-niæ ten honorowy doktorat i okazaæ szacunek orazwdziêczno�æ Profesorowi. 1 pa�dziernika 1998 rokuw Auli Leopoldyñskiej Uniwersytetu Wroc³awskiego,podczas uroczystego Gaudeamus 1998/1999 z udzia-³em Premiera RP Jerzego Buzka, Profesor Piotr S³onim-ski zosta³ uhonorowany Z³otym Medalem za Zas³ugidla Uniwersytetu Wroc³awskiego.

Wspó³praca Profesora Piotra S³onimskiego z Ka-tedr¹ Mikrobiologii, a pó�niej z Instytutem Genetyki

91WSPOMNIENIE O PROFESORZE PIOTRZE S£ONIMSKIM

i Mikrobiologii Uniwersytetu Wroc³awskiego, datujesiê od 1960 roku. Dziêki niej Profesor wprowadzi³3 pokolenia pracowników naszego Instytutu w tema-tykê badañ in vitro i in silico w zakresie genetykidro¿d¿y. Wielokrotnie zaprasza³ do swojego o�rodkanaukowego w Gif-sur-Yvette pracowników nauko-wych i doktorantów Instytutu Mikrobiologii na krótkiei d³ugoterminowe sta¿e naukowe. Ponadto, aktywniepopiera³ uczestnictwo naszych pracowników i dok-torantów w miêdzynarodowych kursach, szkoleniachi konferencjach naukowych. Ta bezpo�rednia i bardzoowocna wspó³praca pomiêdzy obydwoma o�rodkaminaukowymi trwa³a bardzo d³ugo, czego dowodem s¹liczne wspólne publikacje.

Na szczególn¹ uwagê zas³uguje Jego �wiatowyautorytet naukowy, g³êboka wiedza i chêæ niesieniapomocy innym. Po og³oszeniu w Polsce stanu wojen-nego, Profesor S³onimski by³ organizatorem i prze-wodnicz¹cym francuskiego towarzystwa SolidariteFrance � Pologne wspomagaj¹cego naukê polsk¹i niepodleg³o�ciowy ruch zwi¹zkowy w Polsce. W cza-sie stanu wojennego i trudnych finansowo dla krajulatach, Profesor za po�rednictwem Komitetu Stypen-dialnego fundowa³ liczne stypendia naukowe dla m³o-dych pracowników naukowych, przewa¿nie dokto-rantów. Przekazywa³ aparaturê i finansowa³ zakupliteratury naukowej oraz odczynników chemicznych,zarówno do badañ, jak i do celów dydaktycznych.

Profesor Piotr S³onimski by³ gor¹cym patriot¹.Zawsze wykazywa³ bardzo ¿ywe zainteresowanie spra-wami naszego kraju, Uniwersytetu, Instytutu, pracow-ników i studentów. W minionych latach kilkakrotnieprzyje¿d¿a³ do Wroc³awia, wyg³asza³ wyk³ady i bra³udzia³ w seminariach oraz w konferencjach nauko-wych organizowanych przez Instytut Mikrobiologiii Polskie Towarzystwo Genetyczne. Dziêki Niemu,Zak³ad Genetyki Instytutu Mikrobiologii, obok Instytu-

tu Biochemii i Biofizyki PAN w Warszawie, bra³ czyn-ny udzia³ w miêdzynarodowym programie EUROFAN,zwi¹zanym z analiz¹ funkcjonaln¹ genów komórkidro¿d¿owej. Obok wymiernych korzy�ci materialnychwynikaj¹cych z tej wspó³pracy, pracownicy InstytutuGenetyki i Mikrobiologii osi¹gnêli równie¿ niewy-mierne korzy�ci nawi¹zuj¹c nowe kontakty miêdzy-narodowe i zdobywaj¹c cenne do�wiadczenie w pracynaukowej. Jego osoba przyczyni³a siê równie¿ do na-wi¹zania trwaj¹cej po dzieñ dzisiejszy �cis³ej orazowocnej wspó³pracy naukowej pomiêdzy IBB PANw Warszawie a naszym Instytutem. Profesor, pomimolicznych obowi¹zków i bardzo napiêtego programu,podczas ka¿dej wizyty zawsze znajdowa³ czas na bez-po�rednie dyskusje i omówienie wyników naszych ba-dañ. Na moje zaproszenie i propozycjê przyjazdu doWroc³awia w styczniu lub w lutym bie¿¹cego roku od-powiedzia³, ¿e ze wzglêdu na wiek nie lubi podró¿owaæw zimie. Niestety, zaplanowana wstêpnie na czerwiecJego wizyta w naszym Instytucie i wyk³ad w zakresiegenomiki teoretycznej ju¿ siê nie odbêd¹. Ale przecie¿mieli�my ogromne szczê�cie i zaszczyt, ¿e dane namby³o spotkaæ Go na swojej drodze ¿ycia.

Drogi Profesorze, smutny to obowi¹zek pisaæo Tobie w czasie przesz³ym, ale zapewniam, ¿e bê-dzie nam bardzo brakowa³o Twojej ¿yczliwo�ci,znakomitego humoru, cennych rad i wspólnychdyskusji na ró¿norodne tematy oraz zainteresowa-nia naszymi sprawami. Dziêkujê, ¿e przekaza³e�nam pasjê naukow¹ odkrywania tajemnicy ¿yciaprostej komórki eukariotycznej.

Bêdziemy o Tobie pamiêtaæ.

Stanis³aw U³aszewski

Za zgod¹ Przegl¹du Uniwersyteckiego (UniwersytetWroc³awski) Nr 5, 31�39, maj 2009.

92 WSPOMNIENIE O PROFESORZE PIOTRZE S£ONIMSKIM


1. Wstêp

Egzotoksyny s¹ wytwarzane przez wiele drobno-ustrojów patogennych, zarówno bakterie Gram-dodatniejak i Gram-ujemne i stanowi¹ istotne czynniki wirulen-cji. Zarówno nomenklatura jak i klasyfikacja egzotok-syn jest bardzo zagmatwana i czêsto niejednoznaczna.

Ogólnie akceptowalny podzia³ toksyn klasyfikujeje do trzech grup przyjmuj¹c jako kryterium mecha-nizm ich dzia³ania. Typ I to toksyny wi¹¿¹ce siê dopowierzchni komórek uk³adu immunologicznego. Nies¹ one internalizowane i wywo³uj¹ nadmiern¹ aktywa-cjê produkcji cytokin. Do tego typu toksyn zaliczamybia³ka o charakterze superantygenów. Typ II to toksynymodyfikuj¹ce strukturê os³on komórek eukariotycz-nych (fosfolipazy, toksyny wbudowuj¹ce siê w os³ony

komórek), co powoduje ich destabilizacjê. Typ III totoksyny AB sk³adaj¹ce siê z podjednostki wi¹¿¹cej siêz receptorem komórkowym (B) oraz podjednostkio aktywno�ci enzymatycznej (A) wnikaj¹ce do ko-mórek eukariotycznych (g³ównie na drodze endocyto-zy) i wp³ywaj¹ce na wiele szlaków sygnalizacyjnych.

Lawinowo narastaj¹ca liczba szczepów bakteryj-nych opornych na antybiotyki stosowane aktualniew leczeniu ludzkich chorób zaka�nych wymusza poszu-kiwania nowych strategii terapeutycznych. Sta³o siê tomo¿liwe dziêki poznaniu szczegó³ów mechanizmudzia³ania wielu toksyn, rozpoznawanych przez niereceptorów i ich celów dzia³ania oraz wyznaczeniustruktur trzeciorzêdowych wielu toksyn. Prezentowanapraca przedstawia nowe opracowywane strategie tera-peutyczne, które prawdopodobnie w nied³ugim czasie

NOWE STRATEGIE POSZUKIWANIALEKÓW PRZECIW-BAKTERYJNYCH

� LEKI PRZECIW-TOKSYNOWE

El¿bieta Katarzyna Jagusztyn-Krynicka*, Jakub Rybacki, Anna Maria £asica

Zak³ad Genetyki Bakterii, Instytut Mikrobiologii Uniwersytetu Warszawskiego02-096 Warszawa, ul. Miecznikowa 1

Wp³ynê³o w lutym 2009 r.

1. Wstêp. 2. Bacillus anthracis. 2.1. Charakterystyka patogenu. 2.2. Toksyna w¹glika � budowa oraz mechanizm dzia³ania.2.3. Terapie przeciw-toksynowe dla toksyn w¹glika. 2.3.1. Terapie blokuj¹ce wnikanie toksyny 2.3.1.1. Bierna immunizacja.2.3.1.2. Zastosowanie �wabików� (Decoy Based Technology). 2.3.1.3. Cisplastyna � terapia blokuj¹ca proces endocytozy.2.3.2. Terapie hamuj¹ce zdarzenia wewn¹trzkomórkowe. 2.3.2.1 $-cyklodekstryny i ich pochodne � strategia zablokowania procesutranslokacji czynników LF i EF do cytozolu. 2.3.2.2. Inhibitory aktywno�ci enzymatycznej podjednostki LF. 2.3.2.3. Celasterol� zahamowanie lizy komórek. 3. Clostridium botulinum. 3.1. Charakterystyka patogenu. 3.2. Budowa i mechanizm dzia³ania toksyny.3.3. Terapie. 3.3.1. Immunoterapia. 3.3.2. Nowe leki przeciw-botulinowe. 3.3.2.1. Potencjalne strategie blokuj¹ce wi¹zanie toksynyBoNT do komórek docelowych. 3.3.2.2. Blokowanie aktywno�ci metaloproteazowej. 4. Podsumowanie

Novel strategies for antibacterial drug discovery � antitoxin drugs

Abstract: Botulinum toxin and B. anthracis are classified by CDC and NIAD as �Category A selected agents and toxin�. So far, theonly used medical treatment against botulism and anthrax are antibiotics and immunotherapy. The development of effective BoNTand antrax toxin inhibitors must be based on the understanding of their action: interaction between specific receptors and toxins,protein translocation into eukaryotic cytosol, substrate binding and enzymatic specificities. This article presents data about anthraxtoxin and botulinum neurotoxin structure and mechanisms of their action. Moreover recent accomplishments in antitoxin drugsdesign, focusing mainly on drugs inhibiting toxin binding to target cells and drugs inhibiting toxin enzymatic activities are reviewed.

1. Introduction. 2. Bacillus anthracis. 2.1 Pathogen description. 2.2. Anthrax toxin � structure and mechanism of action. 2.3. Antitoxintherapies. 2.3.1. Antagonists of toxin binding to target cells. 2.3.1.1. Passive immunization. 2.3.1.2. Decoy Based Technology.2.3.1.3. Cisplastin � inhibition of endocytosis. 2.3.2. Inhibition of intracellular action of the anthrax toxin. 2.3.2.1 $-cyclodekstrinsand their derivatives � inhibition of LE and EF translocation process. 2.3.2.2. Inhibition of the LF anthrax toxin enzymatic acivity.2.3.2.3. Celasterol � inhibition of intoxicated cell lysis. 3. Clostridium botulinum. 3.1. Pathogen description. 3.2. Botulinumneurotoxin-structure and mechanism of action. 3.3 Therapies. 3.3.1 Immunotherapy. 3.3.2. Novel anti-botulinum neurotoxin drugs.3.3.2.1. Potential antagonists of BoNT in the process of binding to target cells. 3.3.2.2. Inhibition of the BoNT metalloproteaseactivity. 4. Summary

S³owa kluczowe: Bacillus anthracis, Clostridium botulinum, inhibitory, toksyna botulinowa, toksyna w¹glikowaKey words: anthrax toxin, Bacillus anthracis, botulinum neurotoxin, Clostridium botulinum, inhibitors

* Autor korespondencyjny: e-mail: [email protected]; tel.

94 EL¯BIETA KATARZYNA JAGUSZTYN-KRYNICKA, JAKUB RYBACKI, ANNA MARIA £ASICA

znajd¹ zastosowanie w leczeniu w¹glika i zatruæ tok-syn¹ botulinow¹ wydzielan¹ przez Clostridium botu-linum. Zainteresowanie tymi toksynami wynika z fak-tu mo¿liwo�ci ich u¿ycia w terapiach wielu chorób,w tym chorób nowotworowych. Jednocze�nie istniejepotencjalna mo¿liwo�æ u¿ycia przetrwalników Bacillusanthracis oraz toksyny botulinowej w atakach bio-terorystycznych. B. anthracis oraz toksyna botulinowazosta³y zaliczone do kategorii A czynników broni bio-logicznej � dane CDC (Center for Disease Control andPrevention) and NIAD (National Institue of Allergyand Infectious Diseases).

2. Bacillus anthracis

2.1. Charakterystyka patogenu

Bacillus anthracis jest Gram-dodatni¹, wytwarza-j¹c¹ przetrwalniki wzglêdnie tlenow¹ bakteri¹ wystê-puj¹c¹ w �rodowisku naturalnym do�æ powszechnie.Spory s¹ bardzo oporne na dzia³anie czynników �ro-dowiska a tak¿e up³yw czasu. Mog¹ w glebie prze-trwaæ przez lata. B. anthracis jest przede wszystkimpatogenem zwierz¹t, g³ównie byd³a i owiec. Do natu-ralnych infekcji ludzi dochodzi stosunkowo rzadko.Na zaka¿enie nara¿eni s¹ g³ównie ludzie z grup pod-wy¿szonego ryzyka, w tym wypadku weterynarze orazrolnicy. Dosyæ czêsto do zaka¿eñ dochodzi np. u osóbstrzyg¹cych owce, poniewa¿ spory w¹glika utrzymuj¹siê d³ugo w sier�ci zwierz¹t. U ludzi B. anthracis wy-wo³uje trzy rodzaje objawów chorobowych w zale¿-no�ci od drogi zaka¿enia: postaæ skórn¹, p³ucn¹ i gas-tryczn¹. W ka¿dym przypadku do zaka¿enia dochodzipoprzez wnikniêcie przetrwalników do ludzkiego orga-nizmu, infekcja formami wegetatywnymi patogenu niewywo³uje objawów chorobowych [35]. Ponad 90%odnotowywanych naturalnie wywo³anych przypad-ków chorobowych to postaci skórne w¹glika, które s¹uleczalne w wypadku szybkiego rozpoznania i zasto-sowania terapii antybiotykowej. Postaæ p³ucna charak-teryzuje siê wysok¹ �miertelno�ci¹. Po inhalacji prze-trwalniki wnikaj¹ do makrofagów komórek p³ucnych,które stanowi¹ �wehiku³� roznosz¹cy je po organiz-mie. Spory prze¿ywaj¹ proces fagocytozy. Wewn¹trzmakrofagów, g³ównie w wêz³ach ch³onnych, dochodzido kie³kowania przetrwalników, wytwarzania du¿ejliczby wegetatywnych komórek, produkuj¹cych czyn-niki wirulencji. Pierwsze objawy zaka¿enia, podobnedo objawów grypy, nie s¹ ³atwo rozpoznawalne,co utrudnia szybkie postawienie w³a�ciwej diagnozy.W stosunkowo nied³ugim czasie od zaka¿enia docho-dzi do wyst¹pienia objawów posocznicy, uszkodzeniawielu organów i �mierci. Nawet przy zastosowaniu in-tensywnej opieki lekarskiej i terapii antybiotykowej

�miertelno�æ w wypadku formy inhalacyjnej w¹glikasiêga ponad 50%. B. anthracis jest uznawany za naj-gro�niejsz¹ aktualnie broñ biologiczn¹ z mo¿liwo�ci¹u¿ycia w ataku bioterorystycznym. Bakteria ta zosta³azaklasyfikowana przez CDC i NIAD do kategorii Abroni biologicznej, do której zaliczane s¹ patogenywywo³uj¹ce �miertelne, ³atwo rozprzestrzeniaj¹ce siêchoroby. Kryteria brane pod uwagê przy klasyfikacjidrobnoustrojów i ich produktów jako broni biologicz-nej oraz ocenie ich potencjalnego zastosowania s¹ró¿norodne np. niska dawka infekcyjna, mo¿liwo�æprodukcji w formie aerozolu, niskie koszty produk-cji i magazynowania, stabilno�æ w �rodowisku, brakskutecznej szczepionki i/lub leku, brak przeszkolone-go personelu medycznego. Po ataku terrorystycznymz 11 wrze�nia 2001 roku odnotowano w USA 11 przy-padków zachorowañ (5 �miertelnych) [36].

2.2. Toksyna w¹glika � budowaoraz mechanizm dzia³ania

Bacillus anthracis zawiera dwa plazmidy pOX1oraz pOX2 o wielko�ci odpowiednio 182 oraz 96 kpz.Pierwszy z nich zawiera wyspê patogenno�ci, któraniesie informacjê genetyczn¹ dotycz¹c¹ syntezy tok-syny, drugi koduje bia³ka warunkuj¹ce syntezê otoczkizbudowanej z poly-(-D-glutaminianu. Otoczka chronipatogen przed dzia³aniem czynników komplementusurowicy krwi oraz przed fagocytoz¹. W testach labo-ratoryjnych wykazano, ¿e szczepy w¹glika pozbawioneobu plazmidów, pOX1 oraz pOX2, trac¹ wirulencjê.Najwa¿niejszym czynnikiem wirulencji w¹glika s¹toksyny nale¿¹ce do grupy toksyn AB. B. anthraciswytwarza dwie toksyny zawieraj¹ce t¹ sam¹ podjed-nostkê odpowiedzialn¹ za rozpoznanie receptorów(podjednostka B), ale ró¿ne podjednostki A. S¹ to:toksyna letalna LeTx (zawieraj¹ca czynnik LF � LethalFactor) oraz toksyna obrzêku EdTx (zawieraj¹ca czyn-nik EF � Edema Factor) [35]. Podjednostk¹ B, którama za zadanie rozpoznaæ receptor na powierzchni ko-mórki, jest polipeptyd PA zwany antygenem protek-cyjnym PA (Protective Antigen) [35]. Trzy podjed-nostki toksyn, zaopatrzone w sekwencje sygna³owe s¹niezale¿nie transportowane przez os³ony komórki bak-teryjnej do �rodowiska a proces sk³adania dojrza³ejtoksyny w¹glika ma miejsce na powierzchni komórkieukariotycznej (Rys. 1). Podjednostka PA ma masêcz¹steczkow¹ 83 kDa i w tej nieaktywnej formie ³¹czysiê z receptorami komórkowymi: TEM8 (Tumor Endo-thelial Marker 8) inaczej okre�lanym jako ANTRAX1oraz CMG2 (Capillary Morphogenesis Protein 2) na-zywany te¿ ANTRAX2. Obydwa eksprymowane s¹ napowierzchni wielu typów komórek w tym komórekuk³adu odporno�ciowego [23]. Choæ obydwa recepto-ry wi¹¿¹ PA poprzez 200 aminokwasowy, zewn¹trz-

95NOWE STRATEGIE POSZUKIWANIA LEKÓW PRZECIW-BAKTERYJNYCH � LEKI PRZECIW-TOKSYNOWE

komórkowy odcinek bia³ka � domenê VWA (van Wil-lebrand factor A) to domena VWA ANTRAX2 wyka-zuje 1000-krotnie wy¿sze powinowactwo do PA ni¿domena ANTRAX1. Prawdopodobnie receptor tenpe³ni g³ówn¹ rolê in vivo [48]. PA (83 kDa) po³¹czonyz receptorem podlega modyfikacji przez komórkow¹proteazê o aktywno�ci furyny do cz¹steczki o masie63 kDa, poprzez odciêcie 20 kDa N-koñcowego frag-mentu bia³ka [37]. Tak zaktywowana forma PA63pozostaj¹ca zwi¹zana z receptorem jest zdolna dooligomeryzacji. Asocjacja monomerów PA63 przebiegaspontanicznie. Podczas tego procesu dochodzi do od-dzia³ywañ pomiêdzy domenami 1 i 2 jednego mono-meru a domenami 2 i 3 przylegaj¹cego monomeru. Napowierzchni komórki docelowej tworzone s¹ hepta-mery PA (PA7mer) tzw. prepory. Struktura utworzonejprzez heptamer prepory przypomina struktury budo-wane w os³onach bakterii gramujemnych przez bia³kanale¿¹ce do rodziny autotransporterów [22]. Do tejstruktury przy³¹czaj¹ siê podjednostki A � EF i/lub LF.EF i LF wspó³zawodnicz¹ o miejsca wi¹zania. PA7meroddzia³ywuje z N-koñcowym (255 aminokwasów),homologicznym fragmentem obu bia³ek. Ka¿da pod-jednostka A ³¹czy siê z dimerem PA63, co w rezultaciedaje 3 podjednostki toksyny na preporê [35]. Dojrza³atoksyna podlega procesowi endocytozy w pêcherzy-kach okrytych klatryn¹. W procesie internalizacji tok-syny bior¹ udzia³ b³onowe tratwy lipidowe b³on komór-kowych. W pêcherzyku endosomalnym pod wp³ywemniskiego pH nastêpuje zmiana konformacji podjed-

nostek PA, które wbudowane w b³onê endosomu, two-rz¹ dojrza³¹ porê. Nastêpny etap intoksykacji komórkito translokacja LF i/lub EF do cytozolu. Uwolnionepodjednostki EF oraz LF przejawiaj¹ swoj¹ aktywno�æenzymatyczn¹, co prowadzi do �mierci komórki. Czyn-nik EF (89 kDa), bêd¹cy zale¿n¹ od kalmodulinycyklaz¹ adenylanow¹, powoduje podniesienie poziomucAMP w komórce, co doprowadza do rozregulowaniagospodarki wodnej w komórce. Dodatkowo ma miejsceusuniêcie kalmoduliny dostêpnej w komórce, wa¿negowtórnego przeka�nika informacji. Czynnik LF (90 kDa)jest zale¿n¹ od cynku metaloproteaz¹, której celemdzia³ania s¹ kinazy MAPK (MAPKK) odpowiedzialneza przekazywanie sygna³ów w komórce (Rys. 1) [2].

2.3. Terapie przeciw-toksynowedla toksyny w¹glikowej

Poznanie w ostatnich latach szczegó³ów dotycz¹-cych mechanizmu sk³adania dojrza³ej toksyny, mecha-nizmów dzia³ania podjednostek A, w szczególno�ciustalenie struktur trzeciorzêdowych wszystkich trzechpodjednostek [18, 38, 39] oraz zidentyfikowanie re-ceptorów toksyny [9, 46] zintensyfikowa³o badaniamaj¹ce na celu opracowanie nowych metod zwalczaniazaka¿eñ w¹glikiem. Skuteczne metody leczenia bêd¹z du¿ym prawdopodobieñstwem strategiami blokuj¹cy-mi proces sk³adania dojrza³ej toksyny, proces wnikaniatoksyny do komórek eukariotycznych, proces trans-lokacji podjednostek A do cytozolu lub blokuj¹cymi

Rys. 1. Mechanizm procesowania i dzia³ania toksyny Bacillus anthracis (szczegó³owe obja�nienia w tek�cie).MAPKK � kinaza kinaz aktywowanych przez miogeny, ATR � receptor dla antygenu ochronnego (antrax toxin receptor),EF � czynnik obrzêku (edema factor), LF � czynnik letalny (lethal factor), PA � antygen ochronny (protective antigen).

Za zgod¹ Wydawnictwa Naukowego PWN na wykorzystanie rysunku


ich aktywno�ci enzymatyczne. Badania skuteczno�cinowych terapii prowadzone s¹ z wykorzystaniem ró¿-nych linii komórkowych lub na modelach zwierzê-cych. Stosowane do badañ linie komórkowe to przedewszystkim makrofagopodobne linie mysie RAW 264.7oraz J774A.1. Toksyna dodawana jest do pod³o¿ahodowlanego. Czêsto stosowanym bia³kiem jest zmo-dyfikowana toksyna LeTx, której N-koniec jest po-³¹czony z katalityczn¹ domen¹ ³añcucha A toksynyb³oniczej (PA/LFN-DTA). Chimeryczne bia³ko jest tok-syczne dla komórek linii CHO-K1 (linia epitelialnychkomórek jajnika chomika chiñskiego) a jego mecha-nizm wnikania jest zale¿ny od aktywno�ci podjednost-ki PA toksyny w¹glika [47]. Przy analizie blokowaniaaktywno�ci enzymatycznej czynnika LF czêsto u¿y-wan¹ strategi¹ jest dodawanie do hodowli linii komór-kowych rekombinowanych, oczyszczonych bia³ek PAi LE w odpowiedniej proporcji. Najczê�ciej stosowa-ne w badaniach in vivo zwierzêta to szczury F344,myszy BALB/c jak równie¿ króliki. W przypadku mo-deli zwierzêcych do badañ in vivo toksyna lub endo-spory wstrzykiwane s¹ podskórnie lub do¿ylnie.

Bia³ko PA jest bardzo silnym immunogenem, prze-ciwcia³a przeciw-PA wykazuj¹ efekt ochronny. Jedyn¹dopuszczon¹ do u¿ycia szczepionk¹ przeciwko w¹gli-kowi jest szczepionka AVA (BioThrax), zawieraj¹caantygen protekcyjny otrzymany z nads¹czu hodowli.Jest to szczepionka bezpieczna i skuteczna, zarejestro-wana w Stanach Zjednoczonych oraz niektórych kra-jach Unii Europejskiej. Jednak wymaga ona bardzoskomplikowanego kalendarza szczepieñ (sze�æ dawekw okresie 18 miesiêcy).

2.3.1. Terapie blokuj¹ce wnikanie toksyny

2.3.1.1. Bierna immunizacjaBierna immunizacja polega g³ównie na podaniu

surowicy (najczê�ciej zwierzêcej, w rzadszych przy-padkach ludzkiej) zawieraj¹cej specyficzne skiero-wane przeciwko toksynie j immunoglobuliny g³ównieprzeciwcia³a przeciw-PA. Najpowa¿niejszym efektemubocznym tego typu terapii z zastosowaniem surowiczwierzêcych jest indukcja uk³adu immunologicznegopacjenta rozpoznaj¹cego przeciwcia³a specyficzne wo-bec toksyny jako bia³ka obcego organizmu. Tym reak-cjom ubocznym mo¿na zapobiegaæ podaj¹c surowicêkrwi osoby wcze�niej zaszczepionej, b¹d� stosuj¹cmonoklonalne ludzkie przeciwcia³a o zwiêkszonympowinowactwie wobec podjednostki LF oraz PA13.G³ównym celem tego typu terapii jest odpowied� naatak bioterrorystyczny, podczas którego dochodzi dozaka¿enia du¿ej liczby osób. Wobec ci¹gle niedosko-na³ych systemów wykrywania zagro¿enia materia³embiologicznym, istnieje realna potrzeba dora�nej maso-wej terapii dla osób zaka¿onych w¹glikiem. W bada-

niach przeprowadzonych przez A l b e r e c h t i wsp.analizowano dwa klony limfocytów B wykazuj¹cenajsilniejsze w³a�ciwo�ci neutralizuj¹ce podjednostkitoksyny: jeden przeciw-PA nazwany IQNPA orazdrugi przeciw-LF nazwany IQNLF. Wstêpne badaniain vitro na linii komórkowej J774A.1 udokumentowa³y,¿e dzia³aj¹ one niezale¿nie a ich w³a�ciwo�ci neutrali-zacyjne sumuj¹ siê. Eksperymenty in vivo wykonanona myszach A/J. Zwierzêtom przed podaniem dawki24 krotnie wy¿szej od LD50 (4,8×105 CFU), apliko-wano dootrzewnowo IQNPA lub IQNLF w dawce180 µg. Wszystkie zwierzêta by³y w 100% chronioneprzed dzia³aniem toksyny. W celu sprawdzenia jakd³ugo przeciwcia³a utrzymuj¹ siê w organizmie zwie-rzêcym, myszy zosta³y poddane kolejnej iniekcji prze-trwalnikami w¹glika (dawka 41 krotnie wy¿sza odLD50 � 8,3×105 CFU), 20 dni po pierwszym ekspery-mencie bez ponownej aplikacji przeciwcia³. Wynikiby³y identyczne jak w poprzednim eksperymencie.U zwierz¹t z grupy badanej zaobserwowano 100%prze¿ywalno�æ a po zakoñczeniu eksperymentu, pod-czas autopsji nie wykryto spor Bacillus anthracis w ichorganizmie (serce). W grupie kontrolnej �redni czasdo �mierci wynosi³ 69+/�18 godzin [4].

2.3.1.2. U¿ywanie �wabików�(Decoy Based Technology)

Jednym ze skutecznych sposobów neutralizacji tok-syny jest u¿ycie �wabika� � zwi¹zku usuwaj¹cego tok-synê z krwioobiegu. Takim �wabikiem� okaza³a siêrozpuszczalna domena receptora komórkowego dla PA� ANTHRX2 [47]. W badaniach stosowana jest do-mena VWA receptora. Ta strategia wydaje siê jedn¹z najskuteczniejszych metod walki z bioterrorystycz-nymi atakami z u¿yciem w¹glika, poniewa¿ aby zni-welowaæ dzia³anie sATR (soluble antrax toxin recep-tor) nale¿a³oby zmodyfikowaæ toksynê w¹glika przyzachowaniu jej powinowactwa do receptora na komór-kach, co jest raczej niemo¿liwe. Rozpuszczalne frag-menty receptorów � sATR otrzymywane s¹ z super-natantu ssaczych komórek linii FreeStyle 293. Badaniaprzeprowadzone in vitro wykaza³y, ¿e czynnik PA cha-rakteryzuje siê wy¿szym powinowactwem do recepto-ra sCMG2 (soluble capillary morphogenesis protein 2)ni¿ do TEM8 (tumor endothelial marker 8), co sk³oni-³o do prowadzenia dalszych badañ z u¿yciem sCMG2.Badania in vivo przeprowadzono na szczurach F344.Podawano im do¿ylnie LeTx razem z sCMG2 lubbez sCMG2 (kontrola) w ró¿nych proporcjach. Podob-ny test przeprowadzono dla sATR/TEM8. Otrzymanewyniki udokumentowa³y, ¿e do ca³kowitej ochronyprzed letalnym dzia³aniem toksyny konieczne jest u¿y-cie nadmiaru sCMG2 w stosunku do dawki toksyny(stosunek 2:1). ¯aden ze szczurów w grupie trakto-wanej LeTx oraz sATR/TEM8 nie prze¿y³ pomimo


wy¿szej proporcji �wabika� do toksyny ni¿ w ekspe-rymencie z u¿yciem sCMG2 [47].

Podobn¹ strategiê zastosowano w badaniach maj¹-cych na celu spotêgowanie efektu sATR. W tym celuwykorzystano wirus owadzi i jego zdolno�æ do pre-zentacji obcych polipeptydów na powierzchni kapsy-du. Jako platforma do tych eksperymentów pos³u¿y³wirus FHV (Flock House Virus) nale¿¹cy do rodzinyNodaviridae. W jego kapsyd mo¿na wbudowaæ dome-nê VWA CMG2 wi¹¿¹c¹ PA, nie powoduj¹c przy tymznacznych zmian strukturalnych cz¹stek wirusowych.Zmodyfikowane bia³ko powierzchniowe wirusa, zwbudowan¹ domen¹ VWA w pozycjach 207�208 lub265�267, by³o nadprodukowane w komórkach owa-dzich z u¿yciem zmodyfikowanego wirusa FHV jakowektora. Utworzono w ten sposób chimeryczne cz¹st-ki wirusopodobne (VLP � Viruse-Like Particles) [31].Testy in vitro wykonane z u¿yciem linii komórkowejCHO-K1 pozwoli³y stwierdziæ, ¿e skuteczno�æ dzia³a-nia VLP jest porównywalna do skuteczno�ci rekombi-nowanych sCMG2. Postanowiono, zatem przej�æ dofazy badañ in vivo. Jako modelu zwierzêcego u¿ytoszczurów F344, którym podawano do¿ylnie 5-krot-no�æ minimalnej dawki letalnej LeTx, a nastêpniesCMG2, VLP lub wt FHV (niezmodyfikowany wirus)dla grupy kontrolnej. Wykazano, ¿e podanie sCMG2oraz VLP skutkuje 100% ochron¹ przed intoksykacj¹oraz brakiem objawów chorobowych, przy stê¿eniachw stosunku 2 :1 (potencjalny lek:LeTx). Co wiêcejni¿sze o rz¹d wielko�ci dawki (0.2:1) znacznie wy-d³u¿a³y czas prze¿ycia zwierz¹t � by³ on d³u¿szy przyzastosowaniu VLP ni¿ sCMG2. Oznacza to, ¿e poli-walentne platformy prezentuj¹ce domeny receptorawi¹¿¹ce PA mog¹ mieæ wy¿sz¹ warto�æ terapeutyczn¹ni¿ monomery sCMG2 [31]. Jedna cz¹steczka VLPmo¿e przy³¹czaæ nawet do 120 jednostek/cz¹steczekheptamerów czy monomerów PA.

2.3.1.3. Cisplastyna � terapia blokuj¹ca wi¹zaniedo komórek docelowych

Inn¹ eksperymentaln¹ strategi¹ zastosowan¹ w celuochrony przed skutkami infekcji endosporami w¹glikajest zablokowanie oligomeryzacji podjednostek PA63.Takie dzia³anie wykazuje cisplastin, lek przeciw-nowotworowy. Jest on zwi¹zkiem alkiluj¹cym. Dzia³aon na zasadzie niekowalencyjnej modyfikacji cz¹ste-czek PA i powoduje g³ównie zablokowanie tworzeniaheptameru PA7mer, co zapobiega przy³¹czaniu siê cz¹s-teczek LF [32]. Badania przeprowadzono na myszachBALB/c, na szczurach F344 a wcze�niej na linii ko-mórkowej RAW 264.7 (makrofagopodobna mysia linia(myszy BALB/c) wyprowadzona z komórek p³ynuwodobrzusza myszy zainfekowanych wirusem leukemiiA-MuLV � Abselon leukemia wirus). W testach in vitrowykazano, ¿e podanie cisplastinu chroni komórki przed

dzia³aniem toksyny. W tych eksperymentach makro-fagi traktowano ró¿nymi stê¿eniami cisplastinu przez10 minut a nastêpnie poddawano je dzia³aniu LF. Przywy¿szych stê¿eniach cisplastin, choæ zachowywa³w³a�ciwo�ci ochronne wobec toksyny w¹glika, to wy-wo³ywa³ efekt letalny w stosunku do komórek eukario-tycznych. Testy in vivo na zwierzêtach pokaza³y, ¿epodskórna iniekcja cisplastinu 2 godziny przed oraz2 godziny po podaniu toksyny s¹ nieskuteczne. W gru-pie zwierz¹t, którym zaaplikowano toksynê po wcze�-niejszej jej preinkubacji z cisplastinem zaobserwowano100% efekt ochronny. Autorzy sugeruj¹, ¿e obserwo-wane wyniki do�wiadczeñ � brak efektu ochronnegoin vivo � jest zwi¹zane z w³a�ciwo�ci¹ cisplastinu,który silnie reaguje z grupami tiolowymi bia³ek [32].W rezultacie ilo�æ leku jest zbyt ma³a, aby wywo³aæskuteczne blokowanie tworzenia heptameru PA.

2.3.2. Terapie hamuj¹cezdarzenia wewn¹trzkomórkowe

2.3.2.1. $-cyklodekstryny i ich pochodne � strategiazablokowania procesu translokacjiczynników LF i EF do cytozolu

Jednym ze sposobów neutralizacji toksyny Bacillusanthracis jest zastosowanie $-cyklodekstryn � natural-nie wystêpuj¹cych cyklicznych zwi¹zków sk³adaj¹cychsiê z 7 jednostek glukozy po³¹czonych wi¹zaniem"-1,4-acetalowym. Pochodne tych zwi¹zków swoj¹ bu-dow¹ przestrzenn¹ �pasuj¹� do struktury przestrzennejtworzonego przez PA kana³u. Metoda polega na zablo-kowaniu kana³u jonowego tworzonego przez antygenochronny i w rezultacie zablokowaniu wnikniêcia pod-jednostek enzymatycznych toksyny do cytozolu po-przez dojrza³¹ porê uformowan¹ w b³onie endosomu.

Pierwsze badania opiera³y siê na wykorzystaniuaminoalkilowych pochodnych $-cyklodekstryn. Prze-prowadzono eksperymenty najpierw na stworzonychsztucznie b³onach lipidowych, nastêpnie na linii komór-kowej RAW 264.7 � mysich komórek makrofagopo-dobnych oraz ostatecznie na szczurach laboratoryjnychFischer F344. Wyniki eksperymentu na dwuwarstwo-wych b³onach lipidowych z odtworzonymi porami PApokaza³y, ¿e ju¿ przy stê¿eniach rzêdu 80 nM � 1,8 µMbardzo czêsto nastêpuje ca³kowite zablokowanie trans-portu podjednostek toksyny. Tak wysoka skuteczno�ædzia³ania badanych zwi¹zków jest spowodowana naj-prawdopodobniej �cis³ym oddzia³ywaniem pomiêdzydodatnio na³adowanymi resztami aminowymi pochod-nej $-cyklodekstryny oraz ujemnie na³adowanymi gru-pami ³añcuchów bocznych (wewn¹trz kana³u jonowe-go). Co wiêcej, eksperyment ten dowiód³ równie¿, ¿epochodna ta dzia³a zarówno po dodaniu do komórkiod strony wewnêtrznej kana³u jonowego (cis � do endo-somu), po drugiej stronie b³ony (trans � do cytozolu)


jak i dodana jednocze�nie do endosomu i cytozolu poobydwu stronach b³ony. Eksperyment przeprowadzo-ny na linii komórkowej RAW 264.7 wykaza³, i¿ przystê¿eniu proporcjonalnym do stê¿enia PA aminoalki-lowa pochodna $-cyklodekstryny (AmPr$CD) jestskuteczn¹ ochron¹ przeciwko toksycznemu efektowiLeTx B. anthracis. Ostatecznym dowodem by³ testna szczurach. W przypadku podania toksyny razemz badan¹ pochodn¹ prze¿ywalno�æ zwierz¹t wynosi³a100% oraz brak by³o objawów klinicznych zatrucia.Jednocze�nie drugiej grupie szczurów pochodn¹ cy-klodekstryny podano na 30 minut przed podaniem tok-syny. W tym przypadku jednak, pomimo 100% prze-¿ywalno�ci by³y zauwa¿alne objawy intoksykacji [26].

Ta sama grupa badawcza rozpoczê³a równie¿ pracênad dopracowaniem struktury pochodnej $-cyklodek-stryny. Wykorzystano szereg zmodyfikowanych aminoalkilowych $-cyklodekstryn ró¿ni¹cych siê d³ugo�ci¹³añcuchów bocznych oraz aminoalkilow¹ "-cyklodek-strynê, oraz guanidynoalkilowe jak i arylowe orazalkiloarylowe pochodne by sprawdziæ jak bardzo istot-ne jest �dopasowanie geometryczne� struktur lekui oligomeru PA. Oprócz zdolno�ci do inhibicji przeba-dano tak¿e cytotoksyczno�æ tych zwi¹zków. Podobniejak w poprzednich do�wiadczeniach do badañ in vitrou¿yto linii komórkowej RAW 264.7. Wyniki tych eks-perymentów wykaza³y, ¿e hamowanie translokacjipodjednostek toksyny jest �ci�le zwi¹zane z dok³ad-nym �dopasowaniem� leku do struktury pory � po-chodne "-dekstryny wykaza³y niewielk¹ zdolno�ædo blokowania omawianego procesu, natomiast bardzodobr¹ zdolno�æ do blokowania pory wykaza³a pochod-na aminoalkilowa z trójwêglowym ³añcuchem bocz-nym. Dodatkowo pochodna ta charakteryzowa³a siêwysok¹ efektywno�ci¹ oraz nisk¹ cytotoksyczno�ci¹.Sprawdzono równie¿ specyficzno�æ zmodyfikowanych$-cyklodekstryn odno�nie LeTx oraz EdTx. Wynikiprzeprowadzonych badañ in vitro pokaza³y, ¿e wybra-na we wcze�niejszych eksperymentach najskuteczniej-sza pochodna $-cyklodekstryn, poprzez swoje dzia-³anie polegaj¹ce na blokowaniu kana³u tworzonegoprzez PA, chroni komórki przed letalnym dzia³aniemobydwu tych toksyn, co rodzi nadzieje na wprowa-dzenie do u¿ycia skutecznego leku neutralizuj¹cegotoksynê w¹glika [27].

2.3.2.2. Inhibitory aktywno�cienzymatycznej podjednostki LF

Jedn¹ z najskuteczniejszych metod inaktywacjitoksyny mo¿e okazaæ siê zastosowanie inhibitora LF,leku zaplanowanego w oparciu o poznan¹ strukturêtrzeciorzêdow¹ LF. Inhibitorem LF (LFI) jest (2R)-2-[(4-fluoro-3-metylofenylo)-sulfonyloamino]-N-hydro-ksy-2-(tetrahydro-2H-4-piranylo) acetamid. Skutecz-no�æ tego zwi¹zku przebadano z u¿yciem linii makro-

fagów mysich J774A.1 i rekombinowanych bia³ek LForaz na modelach zwierzêcych (myszy i króliki),którym do¿ylnie podawano komórki szczepu B. an-thracis (Sterne) nie wytwarzaj¹ce otoczek oraz LFI.LFI wi¹¿e siê w miejscu centrum aktywnego enzymublokuj¹c jego aktywno�æ enzymatyczn¹, co wykazanow oparciu o analizy krystalograficzne [50]. Dodatkowoprzeanalizowano skuteczno�æ LFI w terapii ³¹czonejz ciprofloksacyn¹. Badania dotycz¹ce skuteczno�cidzia³ania LFI jako jedynego �rodka terapeutycznegosk³ada³o siê z dwóch typów eksperymentów. Pierwszyz nich mia³ na celu udokumentowanie skuteczno�ciLFI przy jednoczesnym zainfekowaniu królików endo-sporami, drugi zanalizowanie czy LFI jest skutecznypo 24 godzinach po zainfekowaniu sporami. Pierwszytyp eksperymentów wykaza³, ¿e terapia LFI wyd³u¿a³aniemal dwukrotnie czas ¿ycia królików oraz skutko-wa³a 66% prze¿ywalno�ci¹ zwierzat do�wiadczalnych(w porównaniu do 17% w grupie kontrolnej). Wynikidrugiego eksperymentu wykaza³y, ¿e nawet po podaniuinhibitora 24 godzin po infekcji czas ¿ycia jest wyd³u-¿ony dwukrotnie, jednak¿e prze¿ywalno�æ zwierz¹twynios³a tylko 20% (0% w grupie kontrolnej) [50].

Kolejnym krokiem by³o wykorzystanie terapii ³¹-czonej: antybiotyku (ciprofloksacyna) wraz z LFI.Zwierzêta podzielono na grupê kontroln¹, grupê leczo-n¹ tylko antybiotykiem oraz grupê leczon¹ terapi¹ LFIoraz ciprofloksacyn¹. Podanie antybiotyku 66 godzinpo infekcji skutkowa³o 50% prze¿ywalno�ci¹ królików.W grupie terapii ³¹czonej stosowano taki sam schematpodawania antybiotyku jak w grupie monoterapii orazdodatkowo podawano 4 razy dziennie podskórnie LFI.Zwierzêta nieleczone umiera³y po 96 godzinach odmomentu infekcji, w grupie leczonej antybiotykiemzaobserwowano 50% prze¿ywalno�æ, a zgon pozosta-³ych mia³ miejsce �rednio po 144 godzinach. Grupêpoddan¹ terapii LFI oraz ciprofloksacyn¹ cechowa³a100% prze¿ywalno�æ oraz niewielkie b¹d� brak obja-wów chorobowych [50]. Warto nadmieniæ, ¿e w grupieleczonej tylko antybiotykiem, podobnie jak w grupiezwierz¹t poddanej terapii ³¹czonej, po zakoñczeniuterapii nie wykryto spor B. anthracis, które by³y obec-ne w organizmach zwierz¹t z grupy kontrolnej. Bada-nia te udokumentowa³y, ¿e terapia antybiotykowaw po³¹czeniu z inhibitorem LF pozwala na zapobieg-niêcie �miertelnym skutkom intoksykacji nawet w pó�-nych stadiach zara¿enia.

2.3.2.3. Celasterol � zahamowanie lizy komórekCelasterol, który we wcze�niejszych badaniach wy-

kazywa³ zdolno�æ do blokowania aktywno�ci protea-somu w linii komórek nowotworowych prostaty, zosta³przebadany z wykorzystaniem linii komórkowej RAW264.7 jako zwi¹zek hamuj¹cy cytolizê komórek wywo-³ywan¹ dzia³aniem LF (komórki poddawano dzia³aniu


rekombinowanych bia³ek PA i LF). Celasterol dodanydo hodowli komórek 5 godz. przed intoksykacj¹ pra-wie ca³kowicie hamowa³ ich lizê. Mechanizm dzia³a-nia tego zwi¹zku nie zosta³ ca³kowicie wyja�niony,choæ prawdopodobnie dzia³a na pó�nych etapach in-toksykacji. Udokumentowano brak zahamowania ak-tywno�ci enzymatycznej toksyny [12]. Podobnie jakw komórkach nowotworowych prostaty w komórkachmakrofagów mysich lek ten blokuje aktywno�æ protea-somu, doprowadzaj¹c do obni¿enia jego aktywno�cidegradacyjnej i interferuj¹c z procesem degradacjiubikwitynowanych bia³ek. Jednocze�nie jest on inhi-bitorem bia³ka chaperonowego � HSP90. Dodatkowocelasterol hamuje procesowanie Il-1$ przez inflam-masomy (kompleks bia³kowy obecny w makrofagachi neutrofilach aktywuj¹cy prozapaln¹ cytokinê Il-1$).Il-1$ jest bia³kiem syntetyzowanym w formie nieak-tywnej a formê aktywn¹ uzyskuje w wyniku ciêciaproteolitycznego przez kaspazê-1 bêd¹c¹ sk³adnikieminflammasomów. Niestety lek ten pomimo mo¿liwychzastosowañ w terapii przeciw-nowotworowej lub cho-rób neurodegradacyjnych nie ma jak dotychczas real-nego zastosowania w neutralizacji toksyny LeTx, gdy¿mechanizm jego dzia³ania jest nie do koñca poznany.

3. Clostridium botulinum

3.1. Charakterystyka patogenu

Clostridium botulinum to beztlenowa, wytwarza-j¹ca przetwalniki, gramdodatnia laseczka wystêpuj¹canaturalnie w naszym otoczeniu, g³ównie w ziemi orazw osadach zbiorników wodnych. Bakteria ta wytwa-rza siedem serotypów toksyn (Botulinum Neurotoxin� BoNT), oznaczonych literami od A do G ró¿ni¹cychsiê immunogenno�ci¹, rozpoznawanymi receptoramioraz celem dzia³ania. Przypadki zatruæ ludzi s¹ g³ów-nie wywo³ywane przez BoNT/A, B, E [1] i s¹ stosun-kowo rzadkie (w Polsce odnotowywanych jest rocz-nie kilkadziesi¹t przypadków, w USA oko³o 200).Botulizm nie jest zwi¹zany w wiêkszo�ci przypadkówz wnikniêciem patogenu do naszego organizmu. Dozatruæ ludzi dochodzi najczê�ciej poprzez spo¿ycieniew³a�ciwie przygotowanego jedzenia (konserwymiêsne lub warzywne) zawieraj¹cego BoNT. Objawychorobowe wystêpuj¹ 12�72 godz. od spo¿ycia po¿y-wienia zawieraj¹cego toksynê. Odnotowywane s¹ te¿przypadki tzw. dzieciêcego, gastrycznego botulizmu,gdy dochodzi do kolonizacji przewodu pokarmowegoprzez laseczki C. botulinum. U ma³ych dzieci fizjo-logiczna flora bakteryjna nie jest jeszcze ca³kowiciewykszta³cona, co umo¿liwia kolonizacjê tej niszy eko-logicznej przez patogenne drobnoustroje i wyst¹pie-nie objawów chorobowych. �ród³em przetrwalników

w wypadku botulizmu dziecieciêgo/niemowlêcego jestnajczê�ciej miód. C. botulinum mo¿e tak¿e koloni-zowaæ tkanki w g³êbokich zranieniach, gdzie panuj¹warunki beztlenowe (botulizm przyranny). Toksynybotulinowe s¹ jednymi z najbardziej niebezpiecznychzwi¹zków dla cz³owieka. Szacuje siê, ¿e wystarczaoko³o 0,15 µg czystej toksyny A podanej do¿ylniemê¿czy�nie wa¿¹cemu 70 kg aby wywo³aæ skutek�miertelny. Dawka ta wzrasta, gdy toksyna podawanajest doustnie (70 µg) czy te¿ na drodze inhalacji, po-przez uk³ad oddechowy (0,80�0,90 µg).

Zainteresowanie mechanizmem dzia³ania toksynybotulinowej wynika g³ównie z faktu jej potencjalnegozastosowania w terapiach wielu chorób w celu ate-nuacji przeka�nictwa sygna³ów zarówno w centralnymjak i obwodowym uk³adzie nerwowym [33] oraz mo¿-liwo�ci¹ u¿ycia jako broni biologicznej w ataku bio-terorystycznym. Jeden gram rozpylonej krystalicznejtoksyny botulinowej (botulizm inhalacyjny) mo¿e spo-wodowaæ �mieræ ponad miliona osób.

3.2. Budowa i mechanizm dzia³ania toksyny

Toksyny botulinowe (~150 kDa) s¹ syntetyzowanew postaci jedno³añcuchowego polipeptydu, który na-stêpnie ulega proteolitycznemu ciêciu na dwa polipep-tydy: ³añcuch ciê¿ki (HC � heavy chain) o masie cz¹-steczkowej oko³o 100 kDa i ³añcuch lekki (LC � lightchain) o masie cz¹steczkowej oko³o 50 kDa. Oba ³añ-cuchy po³¹czone s¹ wi¹zaniem disiarczkowym pomiê-dzy C-koñcem ³añcucha lekkiego i C-koñcem ³añcu-cha ciê¿kiego. W obrêbie wszystkich serotypów BoNTwyró¿niamy trzy domeny: domenê wi¹¿¹c¹ odpowie-dzialn¹ za rozpoznanie receptorów, domenê translo-kacyjn¹ warunkuj¹c¹ transport domeny o aktywno�cienzymatycznej przez b³onê endosomu do cytozolu ko-mórki eukariotycznej, oraz domenê o aktywno�ci endo-peptydazy, metaloproteazy cynko-zale¿nej. Domenawi¹¿¹ca oraz translokacyjna zlokalizowane s¹ w obrê-bie bia³kowego ³añcucha ciê¿kiego, domena o aktyw-no�ci enzymatycznej w obrêbie ³añcucha lekkiego.Struktury trzeciorzêdowe BoNT/A i BoNT/B zosta³yopracowane metod¹ krystalografii ju¿ 10 lat temu [28,52]. Proces intoksykacji komórek nerwowych przebie-ga w czterech etapach. W pierwszym etapie nastêpujerozpoznanie specyficznych receptorów na powierzchnikomórek nerwów obwodowych, co skutkuje internali-zacj¹ toksyny na drodze endocytozy. Niskie pH w endo-somie powoduje penetracjê b³ony endosomu przezdomenê translokacyjn¹ oraz ustawienie domeny enzy-matycznej na zewn¹trz endosomu � w cytozolu. Od-dzielenie ³añcucha lekkiego o aktywno�ci enzyma-tycznej od domeny translokacyjnej nastêpuje w skutekredukcji mostka disiarczkowego. Na terenie cytozoluujawnia siê aktywno�æ proteolityczna LC BoNT.


Dopiero stosunkowo niedawno zidentyfikowanoreceptory dla kilku serotypów BoNT. Proces wi¹zaniatoksyny do komórek nerwowych nie jest ca³kowiciewyja�niony. Zgodnie z dostêpnymi danymi ekspery-mentalnymi przebiega on w dwu etapach i wymagaobecno�ci ko-receptora, którym s¹ gangliozydy (gli-kofosfolipidy) GT1b. Gangliozydy obecne w du¿ejilo�ci na powierzchni komórek nerwowych i wykazu-j¹ce stosunkowo niskie powinowactwo do BoNT s³u¿¹raczej jako �pu³apka� wy³apuj¹ca cz¹steczki toksynyi dostarczaj¹ca je do odpowiednich, charakterystycz-nych dla ró¿nych serotypów receptorów bia³kowych.Wszystkie serotypy z wyj¹tkiem BoNT/D wymagaj¹obecno�ci GT1b dla zaj�cia procesu internalizacji,w wypadku zahamowania syntezy tych zwi¹zków tok-syna jest nieaktywna i pozostaje na zewn¹trz komórek[42, 54]. S t e n m a r k i wsp. otrzymali kryszta³yBoNT/A w powi¹zaniu z ko-receptorem, co pozwoli³ona dok³adne okre�lenie oddzia³ywañ pomiêdzy tymicz¹steczkami [51]. Synaptotagminê I i II zidentyfiko-wano jako bia³kowy receptor dla BoNT/B i BoNT/Ga bia³ko SV2 jako receptor dla BoNT/A [11, 16, 17, 25].Nie jest wykluczone, ¿e nastêpne bia³kowe receptoryBoNT zostan¹ jeszcze zidentyfikowane. Szczegó³y pro-cesu tanslokcji LC przez b³onê endosomu wymagaj¹nadal wyja�nienia. W �wietle danych przedstawionychw tym roku przez G a l l o u x i wsp. przebiega onodmiennie od procesów opisanych dla innch toksynnp. toksyny b³oniczej [21].

BoNT powoduje znaczne upo�ledzenie przewod-nictwa sygna³ów nerwowych do komórek miê�nio-wych. Celem dzia³ania BoNT s¹ specyficznie bia³kaSNARE (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factorattachment protein receptor) � odpowiedzialne zawytwarzanie pêcherzyków synaptycznych, ich fuzjêz b³on¹ komórkow¹ oraz wydzielanie neuroprze-ka�ników. Toksyny B,D,F oraz G tn¹ bia³ko VAMP(vesicle-associated membrane protein � synaptobre-winê) jednak¿e ka¿da z nich w innym miejscu ³añcu-cha bia³kowego [43, 44]. Celem dzialania BoTN/Aoraz BoTN/E jest bia³ko SNAP-25 (25 kDa synapto-somal associated protein) [13]. Typ BoNT/C powodujeproteolizê zarówno SNAP-25 jak i syntoksyny [20].

3.3. Terapie

Skuteczn¹ terapiê przeciw-botulinow¹ komplikujefakt braku szybkiego testu diagnostycznego zdolne-go do wykrycia toksyny w materiale pobranym odpacjenta. Jak dot¹d diagnostyka botulizmu opiera siêna obserwacji objawów chorobowych i potwierdza-na jest testem na modelu zwierzêcym (myszy). Jed-nak¿e, w ostatnich latach opracowano kilka szybkichi wiarygodnych nowych testów diagnostycznych,które prawdopodobnie w nied³ugim czasie trafi¹ do

klinik [7]. Omawianie tego zagadnienia wykracza pozaramy tego artyku³u.

Aktualnie nie ma dostêpnej na rynku szczepionkiprzeciw-botulinowej. Dopuszczalne s¹ szczepienia osóbz grup podwy¿szonego ryzyka piêciowa¿n¹ szcze-pionk¹ przeciw-C. botulinum (toksoid), bêd¹c¹ mie-szanin¹ piêciu serotypów BoNT unieczynnionychprzy u¿yciu 0,6% formaldehydu, zaadsorbowanej nasolach aluminium [5]. Wykazano, ¿e HCR BoNT (do-mena receptorowa ³añcucha ciê¿kiego) charakteryzu-je siê siln¹ immunogenno�ci¹. Uodparnianie myszyrekombinowanymi bia³kami otrzymanymi w komór-kach E. coli lub dro¿d¿y indukuje odpowied� hu-moraln¹ oraz wywiera efekt ochronny [8]. Inna eks-perymentalna strategia polega na wykorzystaniu ge-netycznie zmodyfikowanej holotoksyny (mutagenezaspecyficzna co do miejsca) pozbawionej aktywno�cienzymatycznej [40].

3.3.1. Immunoterapia

Bierna immunizacja jest jedyn¹ aktualnie dostêpn¹terapia przeciw-botulinow¹. Stosowane s¹ dwa rodza-je surowic zawieraj¹ce specyficzne immunoglobulinyneutralizuj¹ce toksynê: surowica koñska oraz surowicaludzka BIG (botulism immune globulin intravenous).Pierwsza otrzymywana jest przez uodparnianie zwie-rz¹t przy u¿yciu toksoidu. Surowica BIG, stosowanajedynie w wypadkach dzieciêcego botulizmu, otrzy-mana jest od ochotników � osób wcze�niej zaszcze-pionych toksoidem (personel medyczny, ¿o³nierze,oraz osoby pracuj¹ce z toksyn¹ w laboratorium). Bar-dzo istotne jest szybkie zastosowanie tej terapii: w ci¹-gu 24 godzin od wyst¹pienia objawów chorobowych.Po tym czasie toksyna, która uleg³a internalizacji stajesiê niedostêpna dla antytoksyny. Wymaga to sprawne-go dzia³ania s³u¿b medycznych i epidemiologicznych,co w wielu krajach jest niemo¿liwe do osi¹gniêcia.W USA pewne ilo�ci antytoksyny przechowywane s¹w odpowiednich warunkach na kilku lotniskach tak,aby nie d³u¿ej ni¿ po 12 godz. po przekazaniu do CDCinformacji o podejrzeniu botulizmu lek móg³ byæ za-aplikowany pacjentowi. Koñska antytoksyna produko-wana jest przez zaledwie kilka firm a cykl produkcjijest bardzo d³ugi (2 lata) [49]. Podanie surowicy koñ-skiej wywo³uje u 15�25% leczonych osób powa¿neskutki uboczne jak np. choroba posurowicza (ogólno-ustrojowy odczyn alergiczny � serum sickness).

Niewskazane jest stosowanie surowic zwierzêcychw przypadku intoksykacji dzieci, gdy¿ istnieje sporeryzyko zagro¿enia ¿ycia ma³ych pacjentów. Jak podanowy¿ej w terapiach dzieciêcych przypadków botulizmuwykorzystuje siê surowicê BIG. BIG to liofilizat suro-wicy, zawieraj¹cy o co najmniej 5% ludzkich im-munoglublin w tym 15 UI przeciwcia³ specyficznych


wobec toksyny BoNT/A oraz 4 UI specyficznych wo-bec toksyny BoNT/B w 50 mg proszku. Antytoksynajest podawana jednorazowo, do¿ylnie. Badania jejskuteczno�ci by³y prowadzone przez 5 lat w USA nagrupie dzieci z podejrzeniem zatrucia toksyn¹ botuli-now¹ [6]. Grupa kontrolna otrzymywa³a placebo, su-rowicê niezawieraj¹c¹ przeciwcia³ przeciw-BoTN.Przydzia³ pacjentów do grup by³ losowy. Wyniki badañwykaza³y wysok¹ skuteczno�æ terapii. �rednia d³ugo�æhospitalizacji zosta³a zmniejszona z 5.7 tygodnia do2.6. Równie¿ czas pobytu pacjentów na oddzia³achintensywnej terapii uleg³ skróceniu. Nie zaobserwo-wano ¿adnych powa¿nych skutków ubocznych (brakchoroby posurowiczej). Badania te dowiod³y skutecz-no�ci terapii z u¿yciem BIG, jej bezpieczeñstwa dlapacjenta oraz z ekonomicznego punktu widzenia, jejop³acalno�ci dla s³u¿by zdrowia.

3.3.2. Nowe leki przeciw-botulinowe

Teoretycznie nowe leki mog¹ hamowaæ aktywno�ætoksyny na ka¿dym etapie jej dzia³ania: blokowaæ wi¹-zanie z receptorami, proces internalizacji, translokacjilub aktywno�æ enzymatyczn¹. Ich opracowywanie sta-³o siê mo¿liwe dziêki poznaniu sposobów dzia³aniatoksyn oraz ich struktur trzeciorzêdowych i kom-pleksów z odpowiednimi receptorami. Bezsprzecznieo wiele ³atwiejsze jest zaplanowanie strategii neutrali-zacji toksyny zewn¹trzkomórkowej ni¿ metod neutra-lizacji bia³ka wewn¹trz komórki eukariotycznej. W tymdrugim przypadku konieczne jest tak¿e opracowaniei przetestowanie strategii dostarczania leku do cytozolukomórek, które uleg³y intoksykacji.

3.3.2.1. Potencjalne strategie blokuj¹ce wi¹zanietoksyny BoNT do komórek docelowych

Badania koncentruj¹ siê na poszukiwaniu cz¹ste-czek, które op³aszcza³yby cz¹steczki toksyny bloku-j¹c ich interakcjê z receptorami lub na identyfikacjicz¹steczek wysycaj¹cych receptory wspó³zawodnicz¹cz toksyn¹ w procesie wi¹zania do docelowych ko-mórek. Wykazano, ¿e immunoterapia (surowica BIG)jest skuteczn¹ metod¹ neutralizacji zewn¹trzkomórko-wej toksyny. Z drugiej strony dostêpno�æ tej surowicyjest ograniczona. Oba te fakty zainspirowa³y badaniamaj¹ce na celu opracowanie strategii produkcji ludz-kich mAb (monoclonal antibodies) skutecznie neutra-lizuj¹cych toksynê. Najskuteczniejsza w neutralizacjiBoNT okaza³a siê mieszanina trzech rodzajów prze-ciwcia³ rozpoznaj¹cych ró¿ne epitopy w obrêbie ³añcu-cha ciê¿kiego (HC). Prowadzone s¹ te¿ eksperymentyanalizuj¹ce skuteczno�æ mAb rozpoznaj¹cych epitopyw obrêbie ³añcucha lekkiego BoNT. Potencjalniepo opracowaniu strategii dostarczania ich do wnêtrzaneuronów tego typu preparat mo¿e znale�æ zastoso-

wanie jako lek dzia³aj¹cy w pó�niejszych etapach in-toksykacji komórek [3]. Kompetencyjnymi antagonis-tami wszystkich serotypów BoNT s¹ dwa typy lektynpochodzenia zwierzêcego i ro�linnego wykazuj¹ce po-winowactwo do kwasów sialowych [15]. Jednak ichzastosowanie w terapiach wydaje siê problematyczneze wzglêdu na powszechno�æ wystêpowania kwasówsialowych na powierzchni komórek eukariotycznych.Zidentyfikowanie nowych receptorów rozpoznawanychprzez toksynê BoNT i poznanie mechanizmu jej wi¹za-nia siê z receptorami bezsprzecznie przy�pieszy bada-nia nad blokowaniem tego procesu. Cel mo¿e zostaætak¿e osi¹gniêty przez wytworzenie rozpuszczalnychanalogów receptorów oraz zwi¹zków blokuj¹cych re-ceptory. Udokumentowano, ¿e fragmenty synaptotag-miny II blokuj¹ aktywno�æ BoNT/A i B oraz wykazuj¹efekt ochronny na modelu mysim [10].

3.3.2.2. Blokowanie aktywno�ci metaloproteazowejPoznanie struktury LC BoNT oraz ich celów dzia-

³ania umo¿liwi³o poszukiwanie leków blokuj¹cychaktywno�æ kilku serotypów toksyn. Wiêkszo�æ badañdotyczy dwu serotypów BoNT/A i B jako tych najczê�-ciej wywo³uj¹cych zatrucia u ludzi i potencjalnie sta-nowi¹cych czynnik ataku bioterorystycznego. Jedna zestrategii polega na syntetyzowaniu krótkich peptydówo sekwencji aminokwasowej odpowiadaj¹cej sekwen-cji aminokwasowej rozpoznawanej przez endopepty-dazê lub sekwencji aminokwasowych konserwowanychw�ród bia³ek SNARE [41, 44, 45]. Do poszukiwaniapeptydów hamuj¹cych aktywno�æ enzymatyczn¹ LCBoNT wykorzystywane s¹ te¿ biblioteki peptydowe,technika �phage display� lub �mRNA display� [29, 34,53]. Jednym z ograniczeñ tego typu terapii mo¿e byækrótki okres dzia³ania peptydów, stosunkowo szybkopodlegaj¹ one procesowi degradacji.

Firmy biotechnologiczne oraz laboratoria naukoweprowadz¹ce eksperymenty maj¹ce na celu wprowa-dzenie do klinik nowych leków dysponuj¹ biblioteka-mi ró¿nych zwi¹zków chemicznych (zwi¹zki o niskimciê¿arze cz¹steczkowym, ³atwo przenikaj¹ce przez os³o-ny komórkowe i nietoksyczne dla cz³owieka), w�ródktórych poszukiwane s¹ potencjalne inhibitory enzy-mów. Badania te wspomagane s¹ analizami prowa-dzonymi in silico, co jest mo¿liwe w wypadku bia³eko znanych strukturach trzeciorzêdowych. W celu za-hamowania aktywno�ci LC bêd¹cej zale¿n¹ od cyn-ku metaloproteaz¹ poszukiwano zwi¹zku � chelatoracynku. Jednym z pierwszych badanych zwi¹zków by³TPEN (N,N,N�,N�-Tetrakis(2-pirydylometylo)etyleno-diamina). Jego inhibitorowe dzia³anie nie jest jednakograniczone wy³¹cznie do toksyny botulinowej, couniemo¿liwia jego u¿ycie w terapiach. Ostatnio prze-prowadzono analizy in silico kilku milionów zwi¹zkówchemicznych w poszukiwaniu zwi¹zku blokuj¹cego


aktywno�æ endopeptydazow¹ LC BoNT/A. Jednymi zeskutecznych inhibitorów okaza³y siê pochodne kwasówhydroksamowych [15]. Wiele zwi¹zków jest aktualnieanalizowanych w testach in vitro oraz in vivo na mo-delach zwierzêcych [19].

Dynamicznie rozwijaj¹c¹ siê technologi¹ maj¹c¹zastosowanie w wielu ga³êziach medycyny, zarównow terapii jak i diagnostyce s¹ badania dotycz¹ce apta-merów. Nazwa tych cz¹steczek pochodzi od ³aciñskie-go s³owa �aptus�, co oznacza pasowaæ. Opisane po razpierwszy w ostatnim dziesiêcioleciu poprzedniegowieku niektóre ju¿ s¹ licencjonowanymi lekami. Ap-tamery to krótkie oligonukleotydy (RNA lub DNA)wykazuj¹ce wysokie powinowactwo do cz¹steczekdocelowych, g³ównie bia³ek. Niektórzy autorzy stosuj¹te¿ okre�lenie aptamery peptydowe w odniesieniu dokrótkich peptydów. Zarówno w diagnostyce jak i tera-piach aptamery mog¹ zast¹piæ w najbli¿szym czasieprzeciwcia³a. Charakteryzuj¹ siê bowiem wielomacechami takimi jak brak immunogenno�ci i toksycz-no�ci, brak wywo³ywania efektów ubocznych, niskiekoszty produkcji czy te¿ mo¿liwo�æ wprowadzaniamodyfikacji chemicznych daj¹cymi im aplikacyjn¹�przewagê� nad przeciwcia³ami. Ostatnio znalaz³y te¿one zastosowanie w medycynie jako nanobiosensory.Jedna ze strategii poszukiwania odpowiedniego dladanej terapii czy diagnostyki aptameru nosi nazwêSELEX (systemtic evolution of ligand by exponetialenrichment). Polega ona na przeszukiwaniu bibliotekichemicznie syntetyzowanych krótkich RNA lub DNAo ró¿nej sekwencji nukleotydowej i ró¿norodnej kon-formacji (1014�1015 cz¹steczek) przy u¿yciu docelowejcz¹steczki. Wyszukane aptamery s¹ powielane przyu¿yciu PCR lub z zastosowaniem odwrotnej transkryp-tazy a cykl �przeszukiwania� powtarzany jest kilkakrot-nie. Oko³o dziesiêciu cykli wystarcza przewa¿nie do�wy³owienia� aptameru o wysokim powinowactwie docelu dzia³ania. Opracowanie leku aptamerowego jeststosunkowo szybkie, przeciêtnie proces ten zajmujeoko³o 3�4 lat od momentu wyselekcjonowania odpo-wiedniego aptameru do wprowadzenia leku do klinik.W odniesieniu do BoNT leki aptamerowe mog¹ poten-cjalnie blokowaæ trzy domeny toksyny i dzia³aæ nawszystkich etapach intoksykacji neuronów [14, 24, 30].

4. Podsumowanie

Jednym z g³ównych czynników zintensyfikowaniapracy nad terapiami przeciw-toksynowymi by³y zda-rzenia z 11 wrze�nia 2001 r. oraz zagro¿enie, jakie sta-nowi broñ biologiczna w rêkach terrorystów. Jedyn¹stosowan¹ strategiê zapobiegania chorobom wywo³y-wanym przez B. anthracis i C. botulinum jest aktual-nie bierna immunizacja � podanie zwierzêcej lub ludz-

kiej surowicy zawieraj¹cej specyficzne przeciwcia³aneutralizuj¹ce toksynê. Poznanie struktur trzeciorzê-dowych zarówno toksyn jak i toksyn po³¹czonychz ich receptorami pozwoli³o na zaplanowanie wielunowych potencjalnych leków, dzia³aj¹cych zewn¹trz-jak i wewn¹trzkomórkowo. Odpowiednich zwi¹zkówposzukuje siê metodami przeszukiwania bibliotek pep-tydowych, bibliotek aptamerowych lub bibliotek �ma-³ych zwi¹zków chemicznych�. Wprowadzenie tycheksperymentalnych leków do powszechnego stosowa-nia wymaga jeszcze wielu badañ � udowodnienia ichbezwzglêdnej skuteczno�ci i braku wywo³ywaniaefektów ubocznych. Jak dot¹d wiêkszo�æ jest badanadopiero in vitro z wykorzystaniem linii komórkowychlub na modelach zwierzêcych. Sta³y rozwój biologiimolekularnej, udoskonalanie istniej¹cych oraz opra-cowywanie nowych technologii pozwoli z du¿ymprawdopodobieñstwem na znacz¹ce przy�pieszenieprocesów wprowadzenia nowych leków przeciw-tok-synowych na rynek.

Dodatkowo toksyna botulinowa znalaz³a ju¿ za-stosowanie w leczeniu wielu chorób cz³owieka orazkosmetologii, a postêp w zrozumieniu mechanizmówdzia³ania toksyny w¹glika pozwoli prawdopodobniew nied³ugim czasie na zastosowanie jej w leczeniuchorób nowotworowych. Ten fakt inspiruje wiele labo-ratoriów do prowadzenia badañ dotycz¹cych wyja�-niania molekularnych mechanizmów oddzia³ywañ obutoksyn z komórkami eukariotycznymi.

6. Pi�miennictwo

1. Aas J., Gessert C.E., Bakken J.S.: Recurrent Clostridiumdifficile colitis: case series involving 18 patients treated withdonor stool administered via a nasogastric tube. Clin. Infect.Dis. 36, 580�585 (2003)

2. Abrami L., Reig N., van der Goot F.G.: Anthrax toxin: thelong and winding road that leads to the kill. Trends Micro-biol. 13, 72�78 (2005)

3. Adekar S.P., Takahashi T., Jones R.M., Al-Saleem F.H.,Ancharski D.M., Root M.J., Kapadnis B.P., Simpson L.L.,Dessain S.K.: Neutralization of botulinum neurotoxin bya human monoclonal antibody specific for the catalytic lightchain. PLoS ONE, 3, e3023 (2008)

4. Albrecht M.T. i wsp.: Human monoclonal antibodies againstanthrax lethal factor and protective antigen act indepen-dently to protect against Bacillus anthracis infection andenhance endogenous immunity to anthrax. Infect. Immun. 75,5425�5433 (2007) (praca 12 autorów)

5. Arnon S.S.i wsp.: Botulinum toxin as a biological weapon:medical and public health management. JAMA, 285, 1059�1070(2001)

6. Arnon S.S., Schechter R., Maslanka S.E., Jewell N.P., Hathe-way C.L.: Human botulism immune globulin for the treatmentof infant botulism. N. Engl. J. Med. 354, 462�471 (2006)

7. Bagramyan K., Barash J.R., Arnon S.S., Kalkum M.: Attomo-lar detection of botulinum toxin type A in complex biologicalmatrices. PLoS ONE, 3, e2041 (2008)


8. Baldwin M.R., Tepp W.H., Przedpelski A., Pier C.L.,Bradshaw M., Johnson E.A., Barbieri J.T.: Subunit vaccineagainst the seven serotypes of botulism. Infect. Immun. 76,1314�1318 (2008)

9. Bradley K.A., Mogridge J., Mourez M., Collier R.J., YoungJ.A.: Identification of the cellular receptor for anthrax toxin.Nature, 414, 225�229 (2001)

10. Cai S., Singh B.R.: Strategies to design inhibitors of Clostri-dium botulinum neurotoxins. Infect. Disord. Drug Targets,7, 47�57 (2007)

11. Chai Q., Arndt J.W., Dong M., Tepp W.H., Johnson E.A.,Chapman E.R., Stevens R.C.: Structural basis of cell surfacereceptor recognition by botulinum neurotoxin B. Nature,444, 1096�1100 (2006)

12. Chapelsky S., Batty S., Frost M., Mogridge J.: Inhibition ofanthrax lethal toxin-induced cytolysis of RAW264.7 cells bycelastrol. PLoS ONE, 3, e1421 (2008)

13. Chen S., Barbieri J.T.: Unique substrate recognition by botu-linum neurotoxins serotypes A and E. J. Biol. Chem. 281,10906�10911 (2006)

14. Colas P.: The eleven-year switch of peptide aptamers. J. Biol.7, 2 (2008)

15. Dickerson T.J., Janda K.D.: The use of small molecules toinvestigate molecular mechanisms and therapeutic targetsfor treatment of botulinum neurotoxin A intoxication. ACSChem. Biol. 1, 359�369 (2006)

16. Dong M., Richards D.A., Goodnough M.C., Tepp W.H.,Johnson E.A., Chapman E.R.: Synaptotagmins I and II me-diate entry of botulinum neurotoxin B into cells. J. Cell Biol.162, 1293�1303 (2003)

17. Dong M., Yeh F., Tepp W.H., Dean C., Johnson E.A., Janz R.,Chapman E.R.: SV2 is the protein receptor for botulinumneurotoxin A. Science, 312, 592�596 (2006)

18. Drum C.L., Yan S.Z., Bard J., Shen Y.Q., Lu D., Soelaiman S.,Grabarek Z., Bohm A., Tang W.J.: Structural basis for theactivation of anthrax adenylyl cyclase exotoxin by calmo-dulin. Nature, 415, 396�402 (2002)

19. Eubanks L.M.i wsp.: An in vitro and in vivo disconnectuncovered through high-throughput identification of botuli-num neurotoxin A antagonists. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,104, 2602�2607 (2007) (praca 19 autorów)

20. Foran P., Lawrence G.W., Shone C.C., Foster K.A., Dolly J.O.:Botulinum neurotoxin C1 cleaves both syntaxin and SNAP-25in intact and permeabilized chromaffin cells: correlation withits blockade of catecholamine release. Biochemistry, 35,2630�2636 (1996)

21. Galloux M., Vitrac H., Montagner C., Raffestin S., PopoffM.R., Chenal A., Forge V., Gillet D.: Membrane Interactionof Botulinum Neurotoxin A Translocation (T) Domain: thebelt region is a regulatory loop for membrane interaction.J. Biol. Chem. 283, 27668�27676 (2008)

22. Henderson I.R., Navarro-Garcia F., Desvaux M., Fernan-dez R.C., Ala�Aldeen D.: Type V protein secretion pathway:the autotransporter story. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68,692�744 (2004)

23. Hudson M.J. i wsp.: Bacillus anthracis: balancing innocentresearch with dual-use potential. Int. J. Med. Microbiol. 298,345�364 (2008) (praca 15 autorów)

24. Jayasena S.D.: Aptamers: an emerging class of molecules thatrival antibodies in diagnostics. Clin. Chem. 45, 1628�1650(1999)

25. Jin R., Rummel A., Binz T., Brunger A.T.: Botulinum neuro-toxin B recognizes its protein receptor with high affinity andspecificity. Nature, 444, 1092�1095 (2006)

26. Karginov V.A., Nestorovich E.M., Moayeri M., Leppla S.H.,Bezrukov S.M.: Blocking anthrax lethal toxin at the protec-tive antigen channel by using structure-inspired drug design.Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102, 15075�15080 (2005)

27. Karginov V.A., Nestorovich E.M., Yohannes A., RobinsonT.M., Fahmi N.E., Schmidtmann F., Hecht S.M., BezrukovS.M.: Search for cyclodextrin-based inhibitors of anthraxtoxins: synthesis, structural features, and relative activities.Antimicrob. Agents Chemother. 50, 3740�3753 (2006)

28. Lacy D.B., Tepp W., Cohen A.C., Das Gupta B.R.,Stevens R.C.: Crystal structure of botulinum neurotoxintype A and implications for toxicity. Nat. Struct. Biol. 5,898�902 (1998)

29. Laing T.D., Marenco A.J., Moore D.M., Moore G.J.,Mah D.C., Lee W.E.: Capillary electrophoresis laser-inducedfluorescence for screening combinatorial peptide libraries inassays of botulinum neurotoxin A. J. Chromatogr. B. Analyt.Technol. Biomed. Life. Sci. 843, 240�246 (2006)

30. Lee J.O., So H.M., Jeon E.K., Chang H., Won K.,Kim Y.H.: Aptamers as molecular recognition elementsfor electrical nanobiosensors. Anal. Bioanal. Chem. 390,1023�1032 (2008)

31. Manayani D.J.i wsp.: A viral nanoparticle with dual func-tion as an anthrax antitoxin and vaccine. PLoS Pathog. 3,1422�1431 (2007) (praca 13 autorów)

32. Moayeri M., Wiggins J.F., Lindeman R.E., Leppla S.H.:Cisplatin inhibition of anthrax lethal toxin. Antimicrob.Agents Chemother. 50, 2658�2665 (2006)

33. Montecucco C., Molgo J.: Botulinal neurotoxins: revival ofan old killer. Curr. Opin. Pharmacol. 5, 274�279 (2005)

34. Moore G.J., Moore D.M., Roy S.S., Hayden L.J., HamiltonM.G., Chan N.W., Lee W.E.: Hinge peptide combinatoriallibraries for inhibitors of botulinum neurotoxins and saxi-toxin: deconvolution strategy. Mol. Divers. 10, 9�16 (2006)

35. Mourez M.: Anthrax toxins. Rev. Physiol. Biochem. Phar-macol. 152, 135�164 (2004)

36. Mourez M., Lacy D.B., Cunningham K., Legmann R., Sell-man B.R., Mogridge J., Collier R.J.: 2001: a year of majoradvances in anthrax toxin research. Trends Microbiol. 10,287�293 (2002)

37. Neumeyer T., Tonello F., Dal Molin F., Schiffler B., Orlik F.,Benz R.: Anthrax lethal factor (LF) mediated block of theanthrax protective antigen (PA) ion channel: effect of ionicstrength and voltage. Biochemistry, 45, 3060�3068 (2006)

38. Pannifer A.D. i wsp.: Crystal structure of the anthrax lethalfactor. Nature, 414, 229�233 (2001) (praca 12 autorów)

39. Petosa C., Collier R.J., Klimpel K.R., Leppla S.H., Lidding-ton R.C.: Crystal structure of the anthrax toxin protectiveantigen. Nature, 385, 833�838 (1997)

40. Pier C.L., Tepp W.H., Bradshaw M., Johnson E.A., BarbieriJ.T., Baldwin M.R.: Recombinant holotoxoid vaccine againstbotulism. Infect. Immun. 76, 437�442 (2008)

41. Rossetto O., Schiavo G., Montecucco C., Poulain B., DeloyeF., Lozzi L., Shone C.C.: SNARE motif and neurotoxins.Nature, 372, 415�416 (1994)

42. Rummel A. i wsp.: Identification of the protein receptorbinding site of botulinum neurotoxins B and G proves thedouble-receptor concept. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104,359�364 (2007) (praca 11 autorów)

43. Schiavo G., Stenbeck G., Rothman J.E., Sollner T.H.: Bin-ding of the synaptic vesicle v-SNARE, synaptotagmin, to theplasma membrane t-SNARE, SNAP-25, can explain dockedvesicles at neurotoxin-treated synapses. Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 94, 997�1001 (1997)


44. Schmidt J.J., Stafford R.G.: Botulinum neurotoxin serotype F:identification of substrate recognition requirements and deve-lopment of inhibitors with low nanomolar affinity. Bio-chemistry, 44, 4067�4073 (2005)

45. Schmidt J.J., Stafford R.G., Millard C.B.: High-throughputassays for botulinum neurotoxin proteolytic activity: sero-types A, B, D, and F. Anal. Biochem. 296, 130�137 (2001)

46. Scobie H.M., Rainey G.J., Bradley K.A., Young J.A.: Humancapillary morphogenesis protein 2 functions as an anthraxtoxin receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 5170�5174(2003)

47. Scobie H.M., Thomas D., Marlett J.M., Destito G., Wigels-worth D.J., Collier R.J., Young J.A., Manchester M.: A so-luble receptor decoy protects rats against anthrax lethal toxinchallenge. J. Infect. Dis. 192, 1047�1051 (2005)

48. Scobie H.M., Wigelsworth D.J., Marlett J.M., Thomas D.,Rainey G.J., Lacy D.B., Manchester M., Collier R.J., YoungJ.A.: Anthrax toxin receptor 2-dependent lethal toxin killingin vivo. PLoS Pathog. 2, e111 (2006)

49. Shapiro R.L., Hatheway C., Becher J., Swerdlow D.L.: Botu-lism surveillance and emergency response. A public healthstrategy for a global challenge. JAMA, 278, 433�435 (1997)

50. Shoop W.L.i wsp.: Anthrax lethal factor inhibition. Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 102, 7958�7963 (2005) (praca 24 autorów)

51. Stenmark P., Dupuy J., Imamura A., Kiso M., Stevens R.C.:Crystal structure of botulinum neurotoxin type A in complexwith the cell surface co-receptor GT1b-insight into the toxin-neuron interaction. PLoS Pathog. 4, e1000129 (2008)

52. Swaminathan S., Eswaramoorthy S.: Structural analysis ofthe catalytic and binding sites of Clostridium botulinum neuro-toxin B. Nat. Struct. Biol. 7, 693�699 (2000)

53. Yiadom K.P., Muhie S., Yang D.C.: Peptide inhibitors of bo-tulinum neurotoxin by mRNA display. Biochem. Biophys.Res. Commun. 335, 1247�1253 (2005)

54. Yowler B.C., Kensinger R.D., Schengrund C.L.: Botulinumneurotoxin A activity is dependent upon the presence of spe-cific gangliosides in neuroblastoma cells expressing synapto-tagmin I. J. Biol. Chem. 277, 32815�32819 (2002)

1. Wprowadzenie

¯elazo (Fe) jest dominuj¹cym pierwiastkiem naszejPlanety, uwa¿a siê, ¿e stanowi 45% jej masy. Jest g³ów-nym sk³adnikiem (ok. 90%) j¹dra Ziemii, gdzie wystê-puje w stanie rodzimym. Natomiast w skorupie ziem-skiej, której grubo�æ wynosi 5�70 km (�rednio 45 km),zawarto�æ ¿elaza szacuje siê na ok. 5% i jest onoczwartym z kolei pierwiastkiem, po tlenie (O), krze-mie (Si) i glinie (Al). W skorupie ziemskiej ¿elazowystêpuje g³ównie na +2 lub +3 stopniu utlenieniaw postaci ró¿nych minera³ów (rud ¿elaza) przedsta-wionych w Tabeli I. ¯elazo wystêpuje równie¿ w nie-wielkich ilo�ciach na stopniu utlenienia 0, w stanie ro-dzimym w ska³ach magmowych oraz meteorytach¿elaznych. ¯elazo jest bardzo reaktywne i jego formaFe(II) � jon ¿elazawy w �rodowisku neutralnym i wa-runkach tlenowych ³atwo ulega utlenieniu do formyFe(III) � jon ¿elazowy [20]. ¯elazo (III) mo¿e ulegaæmikrobiologicznej redukcji do formy dwuwarto�cio-wej w wyniku dwóch procesów: (i) redukcji asymila-cyjnej zwi¹zanej z przyswajaniem ¿elaza i wbudowy-waniem go w enzymy, kofaktory [20] oraz (ii) redukcji

dysymilacyjnej zwi¹zanej z wykorzystaniem ¿elazaFe(III) jako ostatecznego akceptora elektronów w pro-cesie oddychania w warunkach beztlenowych. Takityp oddychania nazywany oddychaniem ¿elazowymlub oddychaniem Fe(III) (ferric ion respiration lubFe(III) respiration) co oznacza, ¿e ca³y proces zwi¹-zany jest z produkcj¹ energii (61). Nie ka¿dy proces


PROKARIOTY REDUKUJ¥CE Fe(III): KLASYFIKACJA,WYSTÊPOWANIE, MECHANIZMY REDUKCJI Fe(III),

ROLA EKOLOGICZNA I ZNACZENIE BIOTECHNOLOGICZNE

Anna Sikora1* i Mieczys³aw K. B³aszczyk2

1 Zak³ad Biologii Molekularnej, Instytut Biochemii i Biofizyki PAN, ul. Pawiñskiego 5a, 02-106 Warszawa2 Samodzielny Zak³ad Biologii Mikroorganizmów, Szko³a G³ówna Gospodarstwa Wiejskiego,

ul. Nowoursynowska 159, 02-776 Warszawa

Wp³ynê³o w styczniu 2009 r.

1. Wprowadzenie. 2. Charakterystyka fizjologiczno-biochemiczna grup mikroorganizów redukuj¹cych Fe(III). 3. Mechanizmy re-dukcji Fe(III). 4. Rola ekologiczna prokariotów redukuj¹cych Fe(III) w �rodowisku. 5. Znaczenie prokariotów redukuj¹cych Fe(III)w biotechnologii. 5.1. Mikrobiologiczne ogniwa paliwowe. 5.2. Bioremediacja. 6. Podsumowanie

Fe(III)-reducing prokaryotes:classification, distribution, mechanisms of Fe(III) reduction, ecological role and biotechnological significance

Abstract: FRM, ferric ion-respiring microorganisms, are a group of prokaryotes that use iron (III) and other metals as terminalelectron acceptors in the process of anaerobic respiration. The list of culturable species of FRM is relatively short and the speciesbelong to different phylogenetic groups. The article presents a physiological and biochemical characteristics of FRM, their eco-logical role and contribution to the circulation of elements in nature. Special attention is paid to the biotechnological significanceof FRM, because of their potential role in (i) bioremediation of anaerobic environments contaminated by organic compounds andtoxic heavy metals or radionuclides; (ii) electricity production in microbial fuel cells (MFC). The mechanisms of Fe(III) reductionare also described.

1. Introduction. 2. Physiological and biochemical characteristics of ferric respiring microorganisms. 3. Mechanisms of Fe(III) reduc-tion. 4. Ecological role of FRM. 5. Biotechnological significance of FRM. 5.1. Microbial fuel cells. 5.2. Bioremediation. 6. Summary

S³owa kluczowe: prokarioty redukuj¹ce Fe(III), mechanizmy redukcji Fe(III), mikrobiologiczne ogniwa paliwowe, bioremediacjaKey words: Fe(III)-respiring microorganisms (FRM), mechanisms of Fe(III) reduction, microbial fuel cells, bioremediation

* Autor do korespondencji: tel. (22) 592 3337, e-mail:[email protected]

Magnetyt Fe3O

4 lub FeO×Fe

2O

3

Hematyt Fe2O

3

Limonit Fe2O

3 × nH

2O lub FeOOH

Syderyt FeCO3

Getyt Fe2O

3 × H

2O

Ilmenit FeO × TiO2

Wiwianit [Fe3(PO

4) × 8H

2O]

Piryt (markasyt) FeS2

Pirotyn FenS

n+1 (n=5�6)

Arsenopiryt FeAsS

Tabela IMinera³y (rudy) ¿elaza wystêpuj¹ce w skorupie ziemskiej

[20, 61, 62]

Ruda ¿elaza Wzór chemiczny

106 ANNA SIKORA I MIECZYS£AW K. B£ASZCZYK

Acidobacteria Geothrix G. fermentans

Actinobacteria Acidimicrobium Am. ferrooxidans

Aquificae Sulfurihydrogenibium S. azorense, S. subterraneum

DeferribacteresDeferribacter D. abyssi, D. thermophilus

Geovibrio G. ferrireducens

Deinococcus-ThermusDeinococcus D. geothermalis

Thermus T. scotoductus

Alkaliphilus A. metalliredigens

Anaerobranca A. californensis, A. gottschalkii, A. horicoshi

Bacillus B. infernus, B. subterraneus

Carboxydothermus C. ferrireducens

Firmicutes Sulfobacillus S. acidophilus, S. thermosulfidooxidans

Thermoanaerobacter T. acetoethylicus, T. brokii, T. siderophilus, T. sulfurophilus, T. wiegelii

Thermolithobacter T. ferrireducens, T. carboxydivorans

Termoterrabacterium T. ferrireducens

Thermosinus T. carboxydovorans

Thermovenabulum T. ferrioganovorum

Nitrospira Magnetobacterium M. magnetitacticum

"-Proteobacteria Acidophilium A. cryptum

Ferribacter F. limneticum, F. thermoautotrophicum

$-Proteobacteria Ferribacterium F. limneticum

Rhodoferax R. ferrireducens

Acidithiobacillus A. ferrooxidans

Aeromonas A. hydrophila

(-Proteobacteria Ferrimonas F. balearica

Pantoea P. agglomerans

Shewanella S. alga, S. baltica, S. frigidimarina, S. oneidensis, S. olleyana,S. paeleana, S. potomacii, S. putrefaciens, S. saccharophila

Anaeromyxobacter A. dehalogenans

Desulfobulbus D. propionicus

Desulfotomaculum D. reducens

Desulfitobacterium D. frappieri, D. hafniense, D. metallireducens

Desulfuromonas D. acetexigenes, D. acetoxidans, D. chloroethenica, D. michiganensis,D. palmitatis, D. thiophila, D. svalbardensis

Desulfuromusa D. bakii, D. kysingii, D. ferrireducens, D. succinoxidans

Geoalkalibacter G. ferrihydriticus

*-Proteobacteria Geobacter G. bemidjiensis, G. bremensis, G. chapelleii, G. grbiciae,G. humireducens, G. hydrogenophilus, G. metallireducens,G. pelophilus, G. psychrophilus, G. pickeringii, G. sulfurreducens,G. thiogenes, G. uraniireducens

Geopsychrobacter G. electrodiphilus, G. multivorans

Geothermobacter G. ehrlichii

Malonomonas M. rubra

Pelobacter P. acetylenicus, P. acidigalici, P. carbinolicus, P. massiliensis,P. propionicus, P. venetianus

g-Proteobacteria Sulfurispirillum S. barnessi

ThermodesulfobacteriaGeothermobacterium G. ferrireducens

Thermodesulfobacterium T. commune

Thermotoga Thermotoga T. lettingae, T. maritima, T. subterranea

T a b e l a I ILista mikroorganizmów redukuj¹cych ¿elazo (III) z domeny Bacteria zdolnych do oddychania ¿elazowego [5, 8, 9, 13, 15, 16, 20,

24, 3, 34, 35, 37, 38, 45, 48, 61, 62, 66, 67, 82, 83, 91, 95, 98, 100]

Typ/klasa RodzajGatunki przyk³adowe

107PROKARIOTY REDUKUJ¥CE FE(III): KLASYFIKACJA, WYSTÊPOWANIE, MECHANIZMY REDUKCJI FE(III)...

dysymilacyjnej redukcji ¿elaza zwi¹zany jest z wytwa-rzaniem energii. Ma to miejsce wtedy, gdy redukcja¿elaza towarzyszy innym typom oddychania np. fer-mentacji, czy redukcji siarczanów a ¿elazo Fe(III) sta-nowi dodatkowy akceptor elektronów. Uwa¿a siê, ¿ejest to sposób na pozbycie siê nadmiaru elektronówi protonów z komórki (si³a redukcyjna), przy niedo-statku zasadniczego akceptora [20, 62].

2. Charakterystyka fizjologiczno-biochemicznagrup mikroorganizmów redukuj¹cych Fe(III)

Dla okre�lenia prokariotów wykorzystuj¹cych Fe(III)jako ostateczny akceptor elektronów w oddychaniubeztlenowym stosuje siê skrót FRM (Fe(III)-respiringmicroorganisms). Oprócz Fe(III) redukuj¹ one Mn(IV)do Mn(II) oraz kwasy humusowe a tak¿e inne metale,pierwiastki promieniotwórcze, np. U(VI) i zwi¹zki jakazotany, fumaran czy siarkê S0. FRM zdolne do oddy-chania Fe(III) nie tworz¹ specyficznej filogenetycznejgrupy. Nale¿¹ one do obu domen prokariotów: Bacte-ria i Archaea. Obecnie znanych jest znacznie ponad100 gatunków FRM. Ponad po³owa gatunków stale re-zyduje w �rodowiskach psychro-mezofilnych (choæ nies¹ psychrofilami, ale mog¹ byæ psychrotolerantami),reszta zajmuje �rodowiska termofilne i hypertermofil-ne (�ród³a gor¹ce, wody geotermalne, kominy hydro-termalne). Jedna grupa FRM ca³kowicie utlenianiamateriê organiczn¹ do dwutlenku wêgla, druga nie-kompletnie, zwykle do octanu. Liczne FRM, zw³asz-cza hypertermofilne, wykorzystuj¹ wodór jako �ród³oelektronów do redukcji Fe(III). W naturalnych �rodo-wiskach prokarioty FRM w warunkach beztlenowychutleniaj¹ produkty rozk³adu materii organicznej, g³ów-nie produkty fermentacji glikolitycznych i nieglikoli-tycznych. W zwi¹zku z tym, ¿e wodór i octan s¹ dwo-ma g³ównymi po�rednimi produktami fermentacjimaterii organicznej to uwa¿a siê, ¿e w naturalnych �ro-dowiskach o pH obojêtnym bogatych w zwi¹zki Fe(III)czy Mn(IV) stanowi¹ one istotne �ród³o elektronóww procesach redukcji metali. Dlatego przy charakterys-tyce FRM w badaniach laboratoryjnych zawsze okre�lasiê ich zdolno�æ do utleniania octanu i wodoru. Octanstosuje siê jako �ród³o wêgla i energii do selekcji pro-kariotów redukuj¹cych Fe(III). Utlenianie octanu prze-biega zgodnie z reakcj¹ 1, a wodoru zgodnie z reak-cj¹ 2 [61, 62, 67, 95]:

CH3COO� (octan) + 8Fe(III) ++ 4H2O → 2HCO3

� + 8Fe(II) + 9H+ (reakcja 1)H2 + 2Fe(III) → 2H+ + 2Fe(II) (reakcja 2)

Tabela II pokazuje listê prokariotów FRM z dome-ny Bacteria a tabela III z domeny Archaea zdolnychdo dysymilacyjnej redukcji ¿elaza, z wytworzeniem

energii w procesie oddychania ¿elazowego. Najlepiejznanymi i zbadanymi z FRM [5, 20, 34, 35, 38, 48,61, 62, 66, 67, 91, 98] jest rodzina Geobacteraceaeoraz rodzina Desulfuromonadaceae, obie z klasy *-Pro-teobacteria, typu Proteobacteria. Wg Bergey Manual[5] do Geobacteraceae nale¿y rodzaj Geobacter, któryjest jak dotychczas stosunkowo dobrze zbadany. Pierw-sz¹ odkryt¹ bakteri¹ z rodzaju Geobacter by³ G. metalli-reducens (pocz¹tkowo oznaczony jako szczep GS-15),wyizolowany z osadu rzeki Potomac w USA w 1987 ro-ku. Do Geobacteraceae nale¿¹ gatunki bakterii mezo-filnych, rosn¹ce w zakresie temperatur 25�40°C a tak¿epsychrotolerancyjny Geopsychrobacter electrodiphilus,rosn¹cy w zakresie temperatur 4�30°C oraz termofilnyGeothermobacter ehrlichii, wyizolowany z hydroter-malnego �ród³a, rosn¹cy w temperaturach 35�65°Cprzy optimum 55°C. W�ród Geobacteraceae s¹ te¿inne bakterie ekstremofilne, np. Geoalkalibacter ferri-hydriticus, bakteria alkalofilna o optymalnym pH = 8,6.Bakterie z rodziny Geobacteraceae wystêpuj¹ w po-wierzchniowych warstwach osadów dennych ró¿no-rodnych zbiorników wodnych p³ytkich i g³êbokich,zw³aszcza piaszczystych, bogatych w zwi¹zki Fe(III).Bakterie te wystêpuj¹ szczególnie licznie w miejscachska¿onych rop¹ naftow¹. Izolacja chromosomalnegoDNA i amplifikacja na jego matrycy genów koduj¹-cych 16SrRNA wykaza³a, ¿e w wymienionych �rodo-wiskach jest to dominuj¹ca grupa bakterii. Wg BergeyManual [5] do nastêpnej do�æ dobrze poznanej rodzinyDesulfuromonadaceae nale¿¹ gatunki z rodzaju Desul-furomonas, Desulfuromusa, Malonomonas i Pelo-bacter, wystêpuj¹ce w osadach morskich. PsychrofilnyDesulfuromonas svalbardensis i psychrotolerancyjnyDesulfuromusa ferrireducens by³y izolowane z mor-skich osadów dennych Arktyki, z optymaln¹ tempera-tur¹ wzrostu odpowiednio 14°C i 14�17°C i maksy-maln¹ 20°C i 23°C.

Archeoglobus A. fulgidus

FerroglobusF. indicus, F. placidus,

Euryarchaeota F. pacificus

Geoglobus G. ahangari

Pyrococcus P. furiosus

Thermococcus T. celer, T. sibiricus

Geogemma G. barosi, G. indica,G. pacifica

Crenarchaeota Hyperthermus H. butylicus

Pyrobaculum P. aerophilum, P. islandicum

Pyrodictium P. abyssi, P. occultum

Sulfolobus S. acidocaldarius, S. shibatae

T a b e l a I I ILista mikroorganizmów redukuj¹cych ¿elazo (III) z domenyArchaea zdolnych do oddychania ¿elazowego [5, 39, 40, 95]

Typ Rodzaj Gatunki przyk³adowe


Oprócz rodzaju Pelobacter, pozosta³e bakterie nale-¿¹ce do dwóch powy¿szych rodzin s¹ zdolne do ca³ko-witego utleniania octanu do dwutlenku wêgla z jedno-czesn¹ redukcj¹ Fe(III). Wiêkszo�æ z nich ca³kowicieutlenia kwasy organiczne, zwi¹zki aromatyczne (np.toluen, benzoesan, fenol, krezol), niektóre etanol, d³u-go³añcuchowe kwasy t³uszczowe, cukry oraz amino-kwasy. Du¿a czê�æ wykorzystuje wodór jako dawcêelektronów do procesów redukcji. Reakcje 3�6 przed-stawiaj¹ kolejno utlenianie benzoesanu, toluenu, fenolui krezolu z jednoczesn¹ redukcj¹ Fe(III):

C6H5COO� (benzoesan) + 30Fe(III) ++ 19H2O → 7HCO3

� + 30Fe(II) + 36H+ (reakcja 3)C6H5CH3 (toluen) + 36Fe(III) ++ 21H2O → 7HCO3

� + 36Fe(II) + 43H+ (reakcja 4)C6H5OH (fenol) + 28Fe(III) ++ 17H2O → 6HCO3

� + 28Fe(II) + 34H+ (reakcja 5)C7H8O (krezol) + 34Fe(III) ++ 20H2O → 7HCO3

� + 34Fe(II) + 41H+ (reakcja 6)

Przed odkryciem zdolno�ci do redukcji Fe(III) uwa-¿ano, ¿e bakterie z rodzaju Pelobacter uzyskuj¹ energiêwy³¹cznie w wyniku procesów fermentacji. Fermentuj¹one 2,3-butanediol, acetoinê, glikol etylenowy i poli-etylenowy, acetylen oraz kwas galusowy. RodzajDesulfuromusa oraz Malonomonas rubra prowadz¹fermentacjê jab³czanu i fumaranu. Czê�æ gatunków De-sulfuromonas, Desulfuromusa, Geoalkalibacter ferri-hydriticus, Pelobacter jest �ci�le beztlenowa, inne s¹zdolne tak¿e do oddychania tlenowego (Geobacter).Odkrycie, ¿e G. sulfurreducens prze¿ywa w warunkachatmosferycznych oraz jest zdolny do wzrostu przyobni¿onym stê¿eniu tlenu w stosunku do powietrzat³umaczy fakt, ¿e rodzaj Geobacter dominuje w �ro-dowiskach beztlenowych, które czasami mog¹ ulegaænatlenieniu. Rodzaje Desulfuromonas, Desulfuromusa,Malonomonas, Pelobacter oraz G. sulfurreducens mog¹redukowaæ tak¿e S0.

Kolejne FRM, które s¹ intensywnie badane i do�ædobrze poznane to gatunki z rodzaju Shewanella, z ro-dziny Shewanellaceae, klasy *-Proteobacteria, typuProteobacteria wyizolowane z osadów dennych i warstwpodpowierzchniowych ró¿norodnych zbiorników wod-nych oraz gleb. Nale¿¹ tu bakterie s³odkowodne i mor-skie. S¹ równie¿ szczepy patogenne. W �rodowiskachbeztlenowych, gdzie redukowane jest ¿elazo, stanowi¹one zaledwie do 2% ogólnej ilo�ci bakterii, a nawetnie wykrywa siê ich tam wcale. Prawdopodobn¹ przy-czyn¹ niewielkiej ilo�ci bakterii z rodzaju Shewanellaw ogólnej puli FRM jest prawdopodobnie niewielkailo�æ dostêpnych substratów w �rodowisku oraz fakt,¿e prowadz¹ one niepe³ne utlenianie bardziej z³o¿o-nych substratów. Jako �ród³o elektronów do redukcjiFe(III) bakterie te wykorzystuj¹ wodór oraz zwi¹zkiorganiczne jak kwasy organiczne (mleczan, pirogro-

nian, mrówczan) i wêglowodany (glukoza). S¹ to fakul-tatywne beztlenowce; ruchliwe Gram-ujemne pa³eczki,które posiadaj¹ wici [5, 61, 62, 67]. Utlenianie mlecza-nu, pirogronianu i mrówczanu z jednoczesn¹ redukcj¹Fe(III) przebiega odpowiednio wed³ug reakcji 7�9.

C2H4OHCOO� (mleczan) + 4Fe(III) ++ 2H2O → CH3COO� (octan) + HCO3

�

+ 4Fe(II) + 5H+ (reakcja 7)CH3COCOO� (pirogronian)+ 2Fe(III) + 2H2O → CH3COO� (octan)+ HCO3

� + 2Fe(II) + 3H+ (reakcja 8)HCOO� (mrówczan) + 2Fe(III)+ H2O → HCO3

� + 2Fe(II) + 2H+ (reakcja 9)

Fakultatywne beztlenowce z rodzaju Ferrimonasi Aeromonas to kolejne bakterie z klasy (-Proteobac-teria redukuj¹ce Fe(III) z jednoczesnym utlenianiemzwi¹zków organicznych [20, 83].

W�ród FRM zidentyfikowano pojedyncze gatunki,filogenetycznie odleg³e od siebie oraz od pozosta³ychznanych redukuj¹cych Fe(III). Geothrix fermentansto Gram-ujemna nieruchliwa pa³eczka, wyizolowanaze zbiornika wodnego zaneczyszczonego rop¹ naf-tow¹. Jest to �cis³y beztlenowiec zdolny do redukcjiFe(III) z jednoczesnym utlenianiem propionianu, mle-czanu, fumaranu, bursztynianu oraz d³ugo³añcucho-wych kwasów t³uszczowych jak kwas palmitynowy.Energiê mo¿e uzyskiwaæ tak¿e w wyniku fermentacjicytrynianu czy fumaranu. Jest gatunkiem nale¿¹cymdo typu Acidobacteria [8].

Geovibrio ferrireducens zosta³ wyizolowany z te-renów ska¿onych wêglowodorami. Jest to ruchli-wy Gram-ujemny przecinkowiec, bakteria mezofilna,�ci�le beztlenowa, niefermentuj¹ca. Elektrony do re-dukcji Fe(III) uzyskuje w wyniku utleniania octanu,wodoru, mleczanu, propionianu, bursztynianu, fumara-nu, pirogronianu oraz, co jest rzadkie, aminokwasów.Reakcja utleniania proliny w po³¹czeniu z redukcj¹¿elaza przebiega zgodnie z reakcj¹ 10:

C5H9O2N (prolina) + 8H2O + 22 [Fe3+]→ 5CO2 + NH4+ + 21H+ + 22 [Fe2+] (reakcja 10)

G. ferrireducens potrafi te¿ redukowaæ siarkê S0.Najwiêksze podobieñstwo wykazuje do halofilnej,beztlenowej, heterotroficznej pa³eczki Flexistipes sinus-arabici, z któr¹ tworzy odrêbn¹ grupê filogenetyczn¹w obrêbie domeny Bacteria [13].

Ferribacterium limneticum jest ruchliw¹ pa³ecz-k¹ nale¿¹c¹ do klasy $-Proteobacteria, wyizolowan¹z osadów dennych jeziora zanieczyszczonego odpada-mi kopalnianymi. Jest to bakteria �ci�le beztlenowa,redukuje Fe(III) utleniaj¹c octan i inne kwasy orga-niczne, niezdolna do fermentacji. Najbardziej spo-krewniona jest z bakteri¹ fotosyntetyzuj¹c¹ Rhodocyc-lus tenuis, która nie jest heterotrofem i nie jest zdolna


do redukcji Fe(III), ale F. limneticum nie jest bakteri¹fotosyntetyzuj¹c¹ [16].

Rhodoferax ferrireducens jest krótk¹ ruchliw¹Gram-ujemn¹ pa³eczk¹ z pojedyncz¹ wici¹, z klasy$-Proteobacteria, wyizolowan¹ z osadów dennychzatoki Oyster Bay w stanie Wirginia w USA, rosn¹c¹w temperaturze 4�30°C. Jest fakultatywnym beztle-nowcem wykazuj¹cym unikaln¹ zdolno�æ ca³kowitegoutleniania glukozy do dwutlenku wêgla z jednoczesn¹redukcj¹ Fe(III) zgodnie z reakcj¹ 11:

C6H12O6 (glukoza) + 6 H2O ++ 24 Fe(III) → 6 CO2 + 24 Fe(II) ++ 24 H+ (reakcja 11)

Ro�nie te¿ na pod³o¿u zawieraj¹cym octan, mle-czan, jab³czan, propionian, pirogronian, bursztynian,benzoesan. Mimo ¿e bakteria ta jest najbardziej spo-krewniona z rodzajem Rhodoferax to nie jest ani bak-teri¹ fotosyntetyzuj¹c¹ ani fermentuj¹c¹ jak inni znaniprzedstawiciele tego rodzaju. Podobnie nie wykryto¿adnej innej bakterii z rodzaju Rhodoferax zdolnej dopozyskiwania energii z utleniania zwi¹zków organicz-nych w po³¹czeniu z redukcj¹ Fe(III) [15].

Procesy redukcji Fe(III) zachodz¹ równie¿ w �ro-dowiskach kwa�nych. Wyizolowano bakteriê Acido-philium cryptum, z klasy "-Proteobacteria, z osadówkwa�nego jeziora pokopalnianego. Jest to Gram-ujem-na pa³eczka, bezwzglêdny beztlenowiec zdolny doutleniania cukrów, kwasów organicznych i wodoruw po³¹czeniu z redukcj¹ ¿elaza [45]. Ze �rodowiskkwa�nych izoluje siê tak¿e bakterie uwa¿ane za neutro-file. Jedna z nich to Desulfitobacterium metallireducensjedyny przedstawiciel rodzaju Desulfitobacterium,Gram-dodatni beztlenowiec zdolny do redukcji Fe(III),Mn(IV), U(VI), Co(III) oraz kwasów humusowych.Redukuje te¿ siarkê S0 i chlorozwi¹zki a utlenia kwa-sy organiczne i alkohole. Inna to Anaeromyxobacterdehalogenans z rzêdu Myxococcales z *-Proteobac-teria, Gram-ujemny fakultatywny beztlenowiec utle-niaj¹cy octan i redukuj¹cy Fe(III), azotany, fumarani zwi¹zki chlorofenolowe [82]. Bakterie autotroficznejak Acidithiobacillus thiooxidans, A. ferrooxidans czySulfolobus acidocaldarius te¿ mog¹ redukowaæ Fe(III)do Fe(II) w kwa�nym pH utleniaj¹c siarkê, co opisujereakcja 12. Proces ten zachodzi w warunkach tleno-wych lub beztlenowych i uwa¿a siê, ¿e nie s³u¿y onprodukcji energii [62].

S0 + 6Fe(III) + 4H2O → HSO4� +

+ 6Fe(II) + 7H+ (reakcja 12)

Oprócz alkalofilnych przedstawicieli rodziny Geo-bacteraceae znane s¹ tak¿e inne gatunki FRM izo-lowane ze �rodowisk o odczynie zasadowym. Nale¿¹tu Gram-dodatnie bezwzglêdne beztlenowce Alkali-philus metalliredigens, którego optymalne pH wzrostu

wynosi 9,5, redukuj¹cy Fe(III), Co(III), Cr(VI) orazkwasy humusowe czy Tindallia magadiensis, bakteriafermentuj¹ca aminokwasy o optymalnym pH wzros-tu 8,5 [100].

Kolejn¹ grup¹ FRM, choæ s³abo poznan¹, s¹ hyper-termofilne archeony ¿yj¹ce w �rodowiskach gdzie pa-nuj¹ temperatury 80�110°C i gdzie znajduje siê du¿ozwi¹zków Fe(III). Utleniaj¹ one wodór, octan, d³ugo-³añcuchowe kwasy t³uszczowe oraz zwi¹zki aromatycz-ne do dwutlenku wêgla. Redukuj¹ równie¿ inne metale,Mn(IV), Au(III), Cr(VI), Co(III), U(VI), Tc(VII). Nale-¿¹ tu przedstawiciele nastêpuj¹cych gatunków Archaea:Pyrobaculum aerophilum, P. islandicum, Pyrodictiumabyssi, Methanopyrus kandleri, Ferroglobus placidus,Geoglobus ahangari, Archeoglobus fulgidus, Pyrococ-cus furiosus, Geogemma barosii (szczep 121) rosn¹cyw temperaturze 121°C oraz bakterii: Thermotoga ma-ritima, Geothermobacterium ferrireducens, Thermo-anaerobacter siderophilus, Thermus sp., [5, 39, 40, 95].

Redukcjê ¿elaza jako proces uboczny towarzysz¹cyprocesowi fermentacji obserwowano dla nastepuj¹cychgatunków i rodzajów bakterii: Paenibacillus polymyxa,Bacillus circulans, B. megaterium, Escherichia coli,Enterobacter aerogenes, Clostridium beijerinckii, C. pas-teurianum, C. sporogenes, Lactobacillus lactis, Pseudo-monas spp., Vibrio sp., Citrobacter freundii [20, 62].W�ród bakterii fermentuj¹cych wykrywa siê te¿ takie,które równie¿ mog¹ pozyskiwaæ energiê w wyniku od-dychania ¿elazowego. Przyk³adem mo¿e byæ Pantoneaagglomerans nale¿¹ca do rodziny Enterobacteriaceae,która wystêpuje g³ównie w glebie oraz w zbiornikachwodnych. Jak wszystkie bakterie nale¿¹ce do tej ro-dziny jest fakultatywnym beztlenowcem i prowadziprocesy fermentacji. Ale wykazano, ¿e tak¿e oddychabeztlenowo redukuj¹c Fe(III) oraz Mn(IV), Cr(VI)i kwasy humusowe utleniaj¹c octan i wodór [24].

Redukcja rozpuszczalnych zwi¹zków Fe(III) orazkwasów humusowych i Cr(VI) jest te¿ procesem ubocz-nym towarzysz¹cym fermentacji, jako podstawowejformie zdobywania energii u �cis³ego beztlenowcaDeinococcus radiodurans. Bakteria ta jest najbardziejopornym organizmem na promieniowanie jonizuj¹cespo�ród dotychczas odkrytych. Prze¿ywa dawki pro-mieniowania o warto�ci do 1500 Gy (grej) [25].

Niektóre gatunki rodzaju Bacillus równie¿ mog¹pozyskiwaæ energiê w wyniku oddychania ¿elazo-wego. Nale¿¹ do nich B. infernus czy B. subterraneus.B. infernus zosta³ wyizolowany z niecki triasowejz g³êboko�ci 2.7 km. Jest to sci�le beztlenowa, termo-filna, halotolerancyjna, lekko alkalofilna bakteria,która fermentuje glukozê a tak¿e redukuje Fe(III),Mn(IV), azotany utleniaj¹c mrówczan i mleczan [9].B. subterraneus wyizolowano z odwiertu g³êbokichwód geotermalnych w basenie artezyjskim w Australii,jest to mezofilny fakultatywny beztlenowiec. Redukuje


Fe(III), Mn(IV), fumaran, azotany i azotyny utlenia-j¹c cukry, glicerol, etanol i mleczan [37].

Redukcja Fe(III) mo¿e towarzyszyæ utlenianiu siar-czanów przez bakterie redukuj¹ce siarczany. Jest toproces uboczny nie s³u¿¹cy produkcji energii obser-wowany u np. rodzaju Desulfovibrio, Desulfobac-terium autotrophicum czy Desulfobacter postgatei[61, 62]. Ale niektórzy przedstawiciele bakterii redu-kuj¹cych siarczany te¿ mog¹ oddychaæ przez reduk-cjê Fe(III), Mn(IV) czy kwasów humusowych. Nale¿¹tu Desulfobulbus propionicus z rodziny Desulfobul-baceae wystepuj¹cej w morskich osadach dennych czyDesulfotomaculum reducens [33, 34].

3. Mechanizmy redukcji Fe(III)

Rozwa¿aj¹c mechanizmy transferu elektronów miê-dzy komórk¹ bakterii a zwi¹zkiem Fe(III) w �rodowis-ku zewnêtrznym nale¿y wzi¹æ pod uwagê nastêpuj¹cezagadnienia: bezpo�redni kontakt mikroorganizmuz nierozpuszczalnym zwi¹zkiem Fe(III); udzia³ prze-no�ników elektronów, zw³aszcza kwasów humusowychznajduj¹cych siê w �rodowisku; produkcjê przeno�-ników elektronów oraz substancji rozpuszczaj¹cychnierozpuszczalne zwi¹zki Fe(III) przez komórkê;bezpo�redni kontakt mikroorganizmu z rozpuszczal-nym zwi¹zkiem Fe(III). W wiêkszo�ci naturalnych�rodowisk Fe(III) wystêpuje najczê�ciej w postacinierozpuszczalnych tlenków. Filogenetycznie odleg³ebakterie z grupy FRM wykszta³ci³y ró¿ne sposobyprzenoszenia elektronów na nierozpuszczalne zwi¹zki¿elaza Fe(III) [79].

Naturalnie w �rodowisku wystêpuj¹ przeno�nikielektronów oraz zwi¹zki chelatuj¹ce, które u³atwiaj¹procesy mikrobiologicznej redukcji zw³aszcza nieroz-puszczalnych zwi¹zków Fe(III). Przeno�nik elektronówwychwytuje elektrony produkowane przez komórkê,w wyniku czego sam ulega redukcji, a nastêpnie abio-tycznie redukuje Fe(III). W efekcie reakcji utlenienianastêpuje regeneracja przeno�nika (Rys. 1). Najlepiejpoznanymi przeno�nikami elektronów s¹ kwasy hu-musowe, które wchodz¹ w sk³ad próchnicy gleboweja tak¿e naturalnych wód. Zawieraj¹ one chinony, zwi¹z-ki o w³a�ciwo�ciach aromatycznych zawieraj¹ce dwiegrupy ketonowe (C = O), których atomy wêgla wcho-dz¹ w sk³ad pier�cienia aromatycznego. Pobranie przeznie elektronów powoduje powstanie wolnych rodnikówchinonowych. Kwasy humusowe mog¹ byæ koñcowymakceptorem elektronów w oddychaniu FRM tak samojak zwi¹zki Fe(III). W �rodowiskach bogatych w kwa-sy humusowe oraz zwi¹zki Fe(III) dochodzi do abio-tycznej redukcji tego ostatniego. Mikrobiologiczniezredukowane kwasy humusowe mog¹ abiotycznie redu-kowaæ zwi¹zki Fe(III) do Fe(II) i same ulegaæ utlenie-

niu w wyniku czego nastêpuje ich regeneracja. W tensposób te same kwasy mog¹ wielokrotnie ulegaæ pro-cesom redukcji i utleniania. Obecno�æ kwasów humu-sowych przyspiesza redukcjê ¿elaza a tak¿e utlenianiematerii organicznej [61, 69]. Oprócz kwasów humu-sowych tak¿e inne zwi¹zki maj¹ zdolno�æ przenosze-nia elektronów. Nale¿¹ do nich zwi¹zki fenolowe znaj-duj¹ce siê w li�ciach drzew np. klonu, dêbu, orzechaw³oskiego. Uwa¿a siê, ¿e substancje humusowe wy-stêpuj¹ce w naturalnych �rodowiskach posiadaj¹ te¿w³a�ciwo�ci chelatuj¹ce (chelacyjne), czyli odznacza-j¹ siê zdolno�ci¹ do chemicznego wi¹zania z metalamii minera³ami, przez co zwiêkszaj¹ ich rozpuszczal-no�æ. Pewne �rodowiska obftuj¹ w naturalne przeno�-niki elektronów oraz zwi¹zki chelatuj¹ce, w innychjest ich deficyt [79]. W badaniach laboratoryjnych dobadania mechanizmów redukcji Fe(III) przy udzialeprzeno�ników elektronów jako analogów kwasów hu-musowych stosuje siê chinony, najczê�ciej dwusiar-czan 2,6-antrachinonu (AQDS) [69].

Mechanizmy transferu elektronów z komórki bak-terii na zewn¹trzkomórkowe akceptory jakimi s¹zwi¹zki Fe(III) zosta³y do�æ dobrze poznane u G. sul-furreducens, poniewa¿ jego genom zosta³ ca³kowiciezsekwencjonowany. Ciekaw¹ cech¹ tej bakterii jestobecno�æ 111 genów koduj¹cych bia³ka uwa¿ane zacytochromy typu c na podstawie posiadanej charakte-rystycznej sekwencji CXXCH wi¹¿¹cej hem. Szacujesiê, ¿e 31 tych bia³ek zlokalizowanych jest w zew-nêtrznej b³onie komórkowej [75]. Mechanizmy reduk-cji nierozpuszczalnych i rozpuszczalnych zwi¹zków¿elaza czê�ciowo ró¿ni¹ siê. Schemat mechanizmu re-

Rys. 1. Mechanizm dzia³ania przeno�ników elektronóww procesie redukcji zwi¹zków ¿elaza (III) przez mikroorganizmy

redukuj¹ce ¿elazo


dukcji Fe(III) u G. sulfurreducens pokazuje rysunek 2A.Dawc¹ elektronów w komórce jest NADH. Dehydro-genaza NADH przekazuje elektrony na chinony w we-wnêtrznej b³onie komórkowej. Kluczow¹ rolê w prze-noszeniu elektronów miêdzy wewnêtrzn¹ a zewnêtrzn¹

b³on¹ komórkow¹ odgrywaj¹ peryplazmatyczne cyto-chromy typu c, MacA i PpcA. MacA jest bia³kiemo masie cz¹st. 36 kDa wi¹¿¹cym dwie grupy hemo-we. Bia³ko to odbiera elektrony ze zredukowanychchinonów i przekazuje je bia³ku PpcA. Mutant macA�

Rys. 2. Schemat mechanizmu redukcji Fe(III) przez G. sulfurreducens (A) i S. oneidensis MR-1 (B)


wykazuje znaczne ni¿sz¹ aktywno�æ redukcji Fe(III),gdy dostarczone jest ono w postaci rozpuszczalnegocytrynianu Fe(III) [12]. PpcA jest bia³kiem o masiecz¹st. 9,6 kDa wi¹¿¹cym trzy grupy hemowe. MutacjappcA obni¿a redukcjê cytrynianu Fe(III) o 60% w po-równaniu ze szczepem dzikim, gdy dawc¹ elektronówjest octan. Bia³ko to nie ma znaczenia, gdy �ród³oelektronów stanowi wodór, bo utlenianie wodoru ka-talizowane jest przez peryplazmatyczn¹ hydrogenazê.PpcA jest niezbêdne do procesów redukcji uranu (VI)oraz kwasów humusowych [50]. PpcA przenosi elek-trony na bia³ko OmcB, które jest cytochromem typu cwystêpuj¹cym w zewnêtrznej b³onie komórkowej.Wi¹¿e ono wiele grup hemowych i pe³ni bardzo istotn¹rolê w transporcie elektronów do zewnêtrznej b³onykomórkowej, do bia³ek OmcE i OmcS. Mutant omcB�

G. sulfurreducens jest niezdolny do wzrostu na pod³o-¿u zawieraj¹cym Fe(III) w postaci rozpuszczalnegocytrynianu. Bia³ko OmcB konieczne jest te¿ do reduk-cji nierozpuszczalnych tlenków Fe(III) oraz wymaga-ne jest, gdy dawc¹ elektronów jest zarówno octan jaki wodór. W komórce G. sulfurreducens wystêpuje jesz-cze bia³ko OmcC wykazuj¹ce a¿ 79% identyczno�cido OmcB, ale w mutancie omcC� proces redukcji ¿e-laza w postaci cytrynianu ¿elazowego przebiega po-dobnie jak w szczepie dzikim. Funkcja bia³ka OmCnie jest znana [46].

OmcS, bia³ko o masie cz¹st. 50 kDa wi¹¿¹ce sze�ægrup hemowych, i OmcE, bia³ko o masie cz¹st. 30 kDawi¹¿¹ce cztery grupy hemowe, to cytochromy typu czlokalizowane na powierzchni zewnêtrznej b³ony ko-mórkowej, które s¹ konieczne do wzrostu na pod³o¿uzawieraj¹cym nierozpuszczalny tlenek Fe(III) jako je-dyny akceptor elektronów. Zaobserwowano, ¿e mutantomcE� wykazywa³ niewielk¹ zdolno�æ do redukcjitlenków Fe(III) i Mn(IV), natomiast omcS� nie, cowskazuje na wa¿niejsz¹ rolê bia³ka OmcS w proce-sach redukcji nierozpuszczalnych zwi¹zków Fe(III) czyMn(IV). Mutanty omcE� i omcS� rosn¹ na pod³o¿uz cytrynianem Fe(III) jak szczep dziki. Uwa¿a siê, ¿erol¹ bia³ek OmcS i OmcE jest przekazywanie elektro-nów na geofimbrie (opis ni¿ej). Gen omcS prawdopo-dobnie tworzy operon z genem omcT koduj¹cym bia³-ko OmcT, które wykazuje 62.6% homologii do bia³kaOmcS. Jego funkcja jest nieznana [74].

Badania pokazuj¹, ¿e redukcja Fe(III) wymagawspó³dzia³ania wielu cytochromów typu c. Rol¹ jed-nych jest transfer elektronów, inne pe³ni¹ funkcje re-gulatorowe. Do tej drugiej grupy nale¿¹ bia³ka OmcF,OmcG i OmcH. Bia³ko OmcF wi¹¿¹ce tylko jedn¹ gru-pê hemow¹ jest najmniejszym z cytochromów typu cG. sulfurreducens, jego masa cz¹st. wynosi 9.4 kDa.Mutacja omcF powoduje znaczn¹ utratê zdolno�ci re-dukcji rozpuszczalnego cytrynianu Fe(III). W mutan-tach omcF� nie wykrywa siê mRNA dla bia³ek OmcB

i OmcC oraz obserwuje siê zmiany ilo�ciowe innychcytochromów typu c. Bia³ko OmcF jest uwa¿ane zaaktywator transkrypcji genów, g³ównie omcB, a tak¿eomcC i prawdopodobnie innych. Ciekawym zjawis-kiem jest fakt, ¿e mutacji omcF towarzyszy nadekspre-sja bia³ka OmcS, co umo¿liwia bakterii spowolnionywzrost na pod³o¿u z cytrynianem ¿elaza. Bia³ko OmcFwykrywa siê te¿ w zewnêtrznej b³onie komórkowejbakterii [42].

OmcG, bia³ko o masie cz¹st. 78.7 kDa, i OmcH,bia³ko o masie cz¹st. 103 kDa, to dwa homologicznecytochromy typu c wi¹¿¹ce wiele grup hemowych.Wykazuj¹ 84.4% identyczno�ci. Nie okre�lano ich lo-kalizacji w komórce. W mutantach omcG� i omcH� niewykrywa siê bia³ka OmcB, chocia¿ transkrypcja genuomcB zachodzi bez zak³óceñ. Ekspresja tylko jednegoz dwóch bia³ek OmcG lub OmcH z plazmidu znosiefekty podwójnej mutacji omcG omcH. Przypuszczal-n¹ rol¹ bia³ek OmcG i OmcH jest regulacja translacjilub/i stabilizacja bia³ka OmcB oraz ochrona przed de-gradacj¹ w przestrzeni peryplazmatycznej [41].

Ponadto przy deficycie ostatecznych akceptorówelektronów w pod³o¿u, ich rolê mog¹ przej�ciowo pe³-niæ cytochromy typu c, znajduj¹ce siê w periplazmiei zewnêtrznej b³onie komórkowej. Szacuje siê, ¿e takimechanizm dostarcza komórce G. sulfurreducens ener-gii wystarczaj¹cej do przetrwania przez 8 minut lubzapewnia ruch wici na pokonanie odleg³o�ci kilkusetd³ugo�ci komórki, aby przemie�ciæ siê do miejsca gdziewystêpuj¹ akceptory elektronów [22].

Do prawid³owego przebiegu procesów redukcjiFe(III) niezbêdnie konieczne s¹ równie¿ bia³ka zew-nêtrznej b³ony komórkowej nie bêd¹ce przeno�nikamielektronów. Nale¿¹ do nich bia³ka: OmpJ, OxpG, OmpB.Pe³ni¹ one rolê po�redni¹ w procesie transferu elektro-nów. OmpJ jest najobficiej wystêpuj¹cym bia³kiemw zewnêtrznej b³onie komórkowej. Jest to bia³ko spe-cyficzne dla rodziny Geobacteraceae. Nale¿y ono doporyn, grupy bia³ek b³onowych buduj¹cych kana³ydyfuzyjne (pory) w zewnêtrznej b³onie komórkowej.Poryny maj¹ strukturê $-harmonijki. Pory umo¿liwiaj¹biern¹ dyfuzjê ró¿nych roztworów wodnych. Obecno�æbia³ka OmpJ wymagana jest do redukcji rozpuszczalne-go cytrynianu Fe(III) oraz nierozpuszczalnych tlenkówFe(III) i Mn(IV), poniewa¿ odgrywa ono wa¿n¹ rolêw utrzymaniu fizycznej integralno�ci b³ony komórko-wej, zapewniaj¹c jednocze�nie jej prawid³owe funkcjo-nowanie. Integralno�æ b³ony komórkowej jest prawdo-podobnie niezbêdnym czynnikiem dojrzewania bia³ekprzenosz¹cych elektrony i ca³ego procesu przenoszeniaelektronów. W mutancie ompJ� G. sulfurreducens na-stêpuje ok. 50% obni¿enie ilo�ci bia³ek cytochromówtypu c w przestrzeni peryplazmatycznej oraz w ze-wnêtrznej b³onie komórkowej. Obserwuje siê równie¿powiêkszenie przestrzeni peryplazmatycznej [1].


OmpB, bia³ko o masie cz¹st. 139.6 kDa, jest praw-dopodobnie oksydaz¹ miedziow¹, gdy¿ posiada czterymiejsca wi¹zania jonów miedzi, dwa przy N-terminal-nym i dwa przy C-terminalnym koñcu. Wykazuje naj-wiêksze podobieñstwo do oksydazy manganowej MofALeptothrix discophora, bakterii utleniaj¹cej zwi¹zkiMn(II). Bia³ko OmpB ulega ekspresji na tym samympoziomie zarówno przy rozpuszczalnych jak i nieroz-puszczalnych zwi¹zkach Fe(III) jako ostatecznych ak-ceptorach elektronów. Jest to bia³ko wystêpuj¹ce napowierzchni zewnêtrznej b³ony komórkowej, wykry-wa siê go równie¿ w p³ynach zewn¹trzkomórkowych.Mutant ompB- G. sulfurreducens redukuje rozpusz-czalny cytrynian ¿elaza oraz fumaran jak szczep dziki,natomiast wykazuje znacznie obni¿on¹ redukcjê nie-rozpuszczalnych tlenków Fe(III) oraz Mn(IV). Niewiadomo czy bia³ko OmpB jest zaanga¿owane w re-dukcjê Fe(III) i Mn(IV) czy j¹ po�rednio u³atwia pe³-ni¹c funkcjê pomocnicz¹. Mimo ¿e bia³ko to jest uwa-¿ane za oksydazê miedziow¹, to posiada te¿ domenêodpowiedzialn¹ za wi¹zanie fibronektyny, charaktery-styczn¹ dla bakteryjnych hydrolaz, zw³aszcza celulazi chitynaz, odpowiedzialn¹ za adhezjê bia³ka do poli-sacharydu i za zachowanie prawid³owej konformacjicentrum aktywnego enzymu. W bia³ku OmpB wykry-to równie¿ sekwencjê, która mo¿e byæ potencjalnymmiejscem wi¹zania ¿elaza. Uwa¿a siê, ¿e domeny od-powiedzialne za wi¹zanie ¿elaza i fibronektyny odgry-waj¹ rolê w odzia³ywaniu miêdzy bia³kiem OmpBa tlenkami Fe(III) oraz Mn(IV). Za sekrecjê bia³kaOmpB odpowiada bia³ko OxpG, które jest pseudo-pilin¹, nale¿¹c¹ do bia³ek ogólnego systemu sekrecjitypu II. Pseudopiliny tworz¹ fimbriopodobne strukturyperyplazmatyczne, umo¿liwiaj¹ce sekrecjê bia³ek przeztworzenie kana³u dla wydzielanego bia³ka lub wy-pychanie go na zewn¹trz b³ony. Przypuszcza siê, ¿erol¹ bia³ka OxpG jest tak¿e sekrecja innych bia³ekodpowiedzialnych za redukcjê nierozpuszczalnychtlenków Fe(III) i Mn(IV). Mutant oxpG� nie jest zdol-ny do redukcji nierozpuszczalnych tlenków Fe(III)oraz Mn(IV). Natomiast redukcja rozpuszczalnegocytrynianu ¿elazowego zachodzi bez zmian, tak jaku szczepu dzikiego [73].

Pocz¹tkowo uwa¿ano, ¿e w redukcji Fe(III) bior¹udzia³ tylko cytochromy typu c. I tak jest, gdy akcep-torem elektronów s¹ rozpuszczalne zwi¹zki ¿elaza,które odbieraj¹ elektrony bezpo�rednio od bia³ek w ze-wnêtrznej b³onie komórkowej lub w przestrzeni pery-plazmatycznej. Jako ciekawostkê nale¿y tu podaæ, ¿eu bakterii z rodzaju Pelobacter nie wykryto cytochro-mów typu c [66]. Ostatnio u G. sulfurreducens wykrytofimbrie, nazwane geofimbriamii, które maj¹ zdolno�æprzenoszenia elektronów. Zbadano przewodnictwoelektryczne bia³ek fimbrii i innych bia³ek zewn¹trzko-mórkowych i wykazano, ¿e bia³ka geofimbrii s¹ do-

brymi przewodnikami elektronów i nazwano je �na-noprzewodami� (microbial nanowires). Geofimbrietworz¹ siê, gdy bakterie rosn¹ na pod³o¿u zawieraj¹-cym nierozpuszczalne lub s³abo rozpuszczalne zwi¹zkitrójwarto�ciowego ¿elaza, np. tlenki ¿elaza a tak¿eprzy innym ni¿ Fe(III) akceptorze elektronów, np.fumaranie w warunkach suboptymalnych. Przy roz-puszczalnym cytrynianie ¿elazowym nie stwierdzonoich obecno�ci. Przypomnijmy, ¿e w wiêkszo�ci �rodo-wisk dominuj¹ nierozpuszczalne tlenki Fe(III). Bia³ko,z którego zbudowane s¹ geofimbrie to produkt genupilA [84]. PilA jest bia³kiem strukturalnym fimbriitypu IV. Fimbrie typu IV odpowiedzialne s¹ za poru-szanie siê komórki niezale¿ne od wici, kolonizacjêi tworzenie biofilmów, zapewniaj¹ kontakt bakteriiz pod³o¿em. Najlepiej poznane s¹ one u bakterii pato-gennych, np. z rodzaju Neisseria czy Pseudomonas[72]. W przypadku G. sulfurreducens bia³ko PilA jestkrótsze ni¿ u innych bakterii, ale zawiera silnie kon-serwowan¹ N-terminaln¹ domenê fimbrii typu IV.Mutant pilA� Geobacter sulfurreducens nie rós³ napod³o¿u, gdzie jedynym akceptorem elektronów by³ynierozpuszczalne tlenki Fe(III). Natomiast, gdy dopod³o¿a dodano inny akceptor elektronów, np. fuma-ran, to zarówno szczep dziki jak i mutant pilA� wyka-zywa³y normalny wzrost. Na zdjêciach spod mikro-skopu elektronowego widaæ by³o, ¿e kryszta³y tlenku¿elaza otacza³y geofimbrie w przypadku dzikiegoszczepu a w mutancie pilA� tworzy³y skupiska przykomórkach. To wskazuje, ¿e funkcj¹ fimbrii nie jestzapewnienie fizycznego kontaktu z kryszta³ami zwi¹z-ku ¿elaza, ale bezpo�redni udzia³ w przenoszeniu elek-tronów. Dok³adny mechanizm tego zjawiska nie jestjeszcze poznany. Wprowadzenie plazmidu z dzikimgenem pilA na plazmidzie do mutanta pilA� powodo-wa³o zniesienie efektów mutacji i powstanie funkcjo-nalnych geofimbrii. Uwa¿a siê, ¿e geofimbrie odgry-waj¹ wa¿n¹ rolê w �rodowiskach, gdzie przewa¿aj¹nierozpuszczalne zwi¹zki ¿elaza trójwarto�ciowego[84]. Pokazano, ze fimbrie G. sulfurreducens s¹ ko-nieczne zarówno do tworzenia biofilmu jak i przeno-szenia elektronów na anodê w mikrobiologicznychogniwach paliwowych [85, 86].

Procesy redukcji Fe(III) zosta³y te¿ do�æ dobrze po-znane dla Shewanella oneidensis szczep MR-1 (daw-niej S. putrefaciens szczep MR-1) (rys. 2B), którejgenom równie¿ zosta³ zsekwencjonowany. GenomS. oneidensis zawiera 42 geny koduj¹ce bia³ka cyto-chromy typu c, 15 z nich zwi¹zanych jest z b³onami,w tym 5 z b³on¹ zewnetrzn¹ [31]. Podobnie jaku G. sulfurreducens bia³kowe przeno�niki elektronówodbieraj¹ je ze zredukowanych chinonów w wewnêtrz-nej b³onie komórkowej. Pierwszym jest CymA, bia³kob³ony cytoplazmatycznej o masie cz¹st. 20,8 kDa,które jest cytochromem typu c, wi¹¿¹cym cztery grupy


hemowe. Mutant cymA� jest defektywny w redukcjizwi¹zków Fe(III) i Mn(IV) a tak¿e azotanów i fuma-ranu [77]. Bia³ko Cym A przenosi elektrony na bia³koMtrA o masie cz¹st. 36 kDa, które jest cytochromemtypu c wi¹¿¹cym 10 grup hemowych zlokalizowanymw peryplazmie. Mutant mtrA� wykazuje brak zdol-no�ci redukcji Fe (III). Rol¹ bia³ka MtrA jest przeka-zanie elektronów cytochromom typu c zewnêtrznejb³ony komórkowej, bia³kom MtrC (OmcB) i OmcA.Byæ mo¿e ³añcuszek bia³ek przenosz¹cych elektronyjest d³u¿szy, ale nie zosta³y one jeszcze poznane. Masacz¹st. bia³ka MtrC wynosi 75 kDa, a bia³ka OmcA83 kDa, oba wi¹¿¹ 10 grup hemowych, s¹ lipopro-teinami i pe³ni¹ funkcjê reduktaz Fe(III). Tworz¹ sta-bilny kompleks bia³kowy, heterotrimer zbudowanyz dwóch cz¹steczek bia³ka OmcA i jednej cz¹steczkiMtrC. Pojedyncze mutanty mtrC� i omcA� zachowuj¹czê�ciow¹ zdolno�æ redukcji rozpuszczalnych i nieroz-puszczalnych zwi¹zków Fe (III) [3, 92].

Podobnie jak u G. sulfurreducens w komórkachS. oneidensis inne bia³ka ni¿ tylko cytochromy typu cuczestnicz¹ w procesie redukcji ¿elaza. W zewnêtrznejb³onie komórkowej znajduje siê bia³ko MtrB o masiecz¹st. 75 kDa, które posiada charakterystyczn¹ se-kwencjê CXXC wi¹¿ac¹ metale. Prawdopodobn¹ rol¹bia³ka MtrB jest wi¹zanie bakterii z jonem metaluw trakcie procesu redukcji zwi¹zków Fe(III) i Mn(IV).Bia³ko MtrB mo¿e te¿ odpowiadaæ za w³a�ciw¹ loka-lizacjê bia³ek MtrC i OmcA w b³onie zewnêtrznej.Mutant mtrB� jest niezdolny do redukcji Fe(III)i Mn(IV) [4, 93]. Innymi bia³kami s¹ bia³ka zewnêtrz-nej b³ony komórkowej nale¿¹ce do ogólnego systemusekrecji typu II: produkty genów ferE (gspE) orazgspD odpowiedzialne za translokacjê bia³ek MtrCi OmcA do i przez zewnêtrzn¹ b³onê komórkow¹. Mu-tanty ferE i gspD s¹ niezdolne do wzrostu na pod³o¿uzawieraj¹cym zwi¹zki Fe(III) i Mn(IV). Istnieje hipo-teza, ¿e ten system sekrecji bierze te¿ udzia³ w uwal-nianiu na zewn¹trz komórki substancji bêd¹cych prze-no�nikami elektronów oraz zwi¹zków chelatuj¹cych(patrz ni¿ej) [19, 93]. Kolejnym bia³kiem wp³ywaj¹cymna proces redukcji Fe (III) jest bia³ko z grupy poryn,Omp35, o masie cz¹st. 35 kDa wystêpuj¹ce w zewnêtrz-nej b³onie komórkowej. Mutanty omp35� wykazuj¹zaburzenia w procesie redukcji fumaranu, azotanówi zwi¹zków Fe(III) oraz Mn(IV), ale dok³adny mecha-nizm tego zjawiska nie zosta³ poznany [71].

U S. oneidensis wykryto te¿ fimbriopodobne, jakto okre�lili autorzy, struktury pe³ni¹ce funkcjê nano-drutów, ale nie okre�lono z jakich bia³ek s¹ one zbu-dowane. Stwierdzono, ¿e tworz¹ siê one w warunkachbeztlenowych lub przy ograniczonej ilo�ci tlenu w �ro-dowisku. Wykazano równie¿, ¿e przewodzenie elek-tronów przez nanodruty u S. oneidensis wymaga funk-cjonalnych cytochromów typu c MtrC i OmcA [28].

We wnêtrzu komórek S. oneidensis wykryto gra-nule zawieraj¹ce tlenki Fe(II) i Fe(III) oraz tlenkiMn(IV). Uwa¿a siê, ¿e bakterie te przechowuj¹ mine-ra³y zawieraj¹ce Fe(III) lub Mn(IV) w komórce jakozapas ostatecznych akceptorów elektronów, które s¹wykorzystywane w warunkach beztlenowych przybraku tych zwi¹zków w �rodowisku [26, 27].

U gatunków z rodzaju Shewanella oraz u Geothrixfermentans opisano strategiê umo¿liwiaj¹c¹ redukcjênierozpuszczalnych zwi¹zków Fe(III), bez bezpo�red-niego kontaktu miêdzy komórk¹ bakterii a akcepto-rem elektronów. Polega ona na uwalnianiu zwi¹zkówpe³ni¹cych funkcjê przeno�nika elektronów (flawinyi chinony) oraz zwi¹zków chelatuj¹cych (np. chinony).U rodzaju Shewanella zidentyfikowano przeno�nikielektronów, którymi s¹ flawiny, ryboflawina oraz mo-nonukleotyd flawinowy (FMN) [14]. Uwa¿a siê, ¿eprzeno�nikiem elektronów u G. fermentans jest roz-puszczalny w wodzie zwi¹zek z grupy chinonów o ma-sie cz¹st. mniejszej ni¿ 12 kDa, chocia¿ nie zosta³ onzidentyfikowany. Produkcja przeno�ników elektronówjest wydatkiem energetycznym dla komórki i op³acasiê, gdy bakterie ¿yj¹ w populacjach o du¿ych gês-to�ciach, przede wszystkim, gdy tworz¹ biofilm [79].W badaniach nad mechanizmami redukcji nierozpusz-czalnych zwi¹zków Fe(III) u S. oneidensis stwierdzo-no, ¿e substancje pe³ni¹ce funkcje przeno�ników elek-tronów wydzielane s¹ tylko do matriks biofilmuutworzonego przez te bakterie [47].

W obecno�ci azotanów czy fumaranu jako akcep-torów elektronów w pod³o¿u bakterie redukuj¹ce ¿e-lazo (G. metalireducens, G. sulfurreducens, G. fermen-tans i S. alga) redukuj¹ je, wykorzystuj¹c jako �ród³oelektronów zredukowane kwasy humusowe a tak¿ezredukowane zwi¹zki Fe(II). Zjawisko wykorzystan-nia zredukowanych kwasów humusowych jako �ród³aelektronów do redukcji azotanów obserwuje siê te¿ dlabakterii denitryfikacyjnych [23, 68].

Redukcja Fe(III), która nie s³u¿y produkcji energii,u bakterii fermentuj¹cych jest wynikiem dzia³aniahydrogenaz. Dawc¹ elektronów do procesów redukcjijest wodór. Pokazano, ¿e w warunkach beztlenowychE. coli mo¿e redukowaæ rozpuszczalne zwi¹zki tech-netu Tc(VII) do nierozpuszczalnych form ulegaj¹cychwytr¹caniu. Reakcja ta jest katalizowana przez hydro-genazê Hyc, która wchodzi w sk³ad kompleksu FHL,odpowiedzialn¹ za produkcjê wodoru z mrówczanuw fermentacji kwasów mieszanych (fermentacji kwasumrówkowego). Dawcê elektronów do redukcji Tc(VII)stanowi mrówczan lub wodór [52]. Okazuje siê rów-nie¿, ¿e hydrogenaza I Clostridium pasteurianum posia-da aktywno�æ reduktazy selenianu (IV) SeO3

2� → S0

a tak¿e zwi¹zków telluru (IV) TeO32�. Elektrony po-

chodz¹ z utleniania cz¹steczek wodoru, a po�rednikiemw ich przenoszeniu jest ferredoksyna [99]. Z kolei


u prokariotów redukuj¹cych siarczany rolê reduktazymetali pe³ni cytochrom c3 [65].

Fe(III) mo¿e byæ te¿ redukowane do Fe(II) abiotycz-nie, np. w reakcji z siarkowodorem produkowanymprzez prokarioty redukuj¹ce siarczany zgodnie z reak-cjami 13�15 [20]:

2Fe3+ + H2S → 2Fe2+ + 2H+ + S0 (reakcja 13)Fe2+ + H2S → FeS + 2H+ (reakcja 14)2Fe3+ + 2H2S → FeS2 + Fe2+ + 4H+ (reakcja 15)

Podobn¹ redukcjê Fe(III) do Fe(II) obserwuje siêw reakcji z innym metabolitem jakim jest kwas mrów-kowy zgodnie z reakcj¹ 16 [62]:

CH3COO� + 8Fe(III) + 4H2O V 2HCO3� +

+ 8Fe(II) + 9H+ (reakcja 16)

4. Rola ekologiczna prokariotówredukuj¹cych Fe(III) w �rodowisku

Redukcja Fe(III) uwa¿ana jest za jedn¹ z pierwot-nych, obok redukcji S0, a nawet wrêcz najbardziejpierwotn¹ form¹ oddychania mikroorganizmów. Uwa-¿a siê, ¿e pierwsze organizmy ¿ywe to przedstawicieleFRM. Prawdopodobnie utlenianie wodoru po³¹czonez redukcj¹ Fe(III) by³o prametabolizmem, który da³pocz¹tek ewolucji ¿ycia na Ziemi. Warunki �rodowi-skowe wczesnego okresu pocz¹tków ¿ycia na Ziemi,3�5 miliardów lat temu, czyli wysoka temperatura,du¿a ilo�æ wodoru oraz zwi¹zków ¿elaza pocho-dz¹cych z wnêtrza Ziemi a wystêpuj¹cych na jejpowierzchni w formie utlenionej Fe(III), g³ównie naskutek intensywnego dzia³ania promieniowania UV,sprzyja³a produkcji energii w wyniku utleniania wo-doru i redukcji zwi¹zków Fe(III). Istnieje wiele dowo-dów na to, ¿e z³o¿a magnetytu z okresu wczesnegoprekambru s¹ pochodzenia mikrobiologicznego a do-k³adnie wynikiem aktywno�ci ¿yj¹cych ówcze�niehypertermofilnych FRM. Metod¹ badania stosunkuzawarto�ci dwóch izotopów wêgla 12C do 13C stwier-dzono, ¿e wiek materii organicznej towarzysz¹cejprekambryjskim z³o¿om magnetytu jest �ci�le sko-relowany z wiekiem utlenionej materii organicznejz tamtego okresu. Jak dotychczas nie zosta³ poznany¿aden abiotyczny proces zwi¹zany z jednoczesnymutlenianiem materii organicznej i redukcj¹ Fe(III) domagnetytu [61, 62].

Uwa¿a siê, ¿e analogiczne procesy mikrobiologicz-nej redukcji Fe(III) w po³¹czeniu z utlenianiem wo-doru jakie mia³y miejsce w okresie pocz¹tków ¿y-cia na Ziemi obecnie odbywaj¹ siê w �rodowiskach,w których panuj¹ wysokie temperatury (80�110°C),np. w gor¹cych �ród³ach. Gor¹ce �ród³a obfituj¹ w du¿eilo�ci Fe(II), które ulega utlenieniu do formy Fe(III)

w zetkniêciu siê z powietrzem. Wokó³ �róde³ gro-madz¹ siê osady bogate w zwi¹zki Fe(III). Z gor¹-cych �róde³ wydobywaja siê te¿ du¿e ilo�ci wodoru.Wszystko to sprawia, ¿e tworz¹ siê idealne warunkido rozwoju termofilnych i hypertermofilnych beztle-nowych mikroorganizmów redukuj¹cych Fe(III), dlaktórych �ród³em elektronów jest utlenianie wodoru.Oprócz wodoru wspó³czesne termofilne i hypertermo-filne FRM prawdopodobnie utleniaj¹ równie¿ zwi¹zkiorganiczne jak octan, zwi¹zki aromatyczne czy d³ugo-³añcuchowe kwasy t³uszczowe. Dowodem na aktyw-no�æ tych mikroorganizmów w gor¹cych �rodowiskachjest wykrywany tam magnetyt w postaci ziarnistychstruktur [39, 61, 62, 95]. Równie¿ meteoryty pocho-dz¹ce z Marsa zawieraj¹ ziarniste struktury magnety-tu. Istnieje przypuszczenie, ¿e powsta³y one w wynikuaktywo�ci FRM na Marsie [61]. Jak wiadomo badanianad magnetytem pozwoli³y na odkrycie zasad mag-netyzmu i elektryczno�ci. Jako ciekawostkê warto tudodaæ, ¿e pad³o nawet stwierdzenie, ¿e gdyby nieG. metallireducens (GS-15) i inne FRM nie mieli-by�my dzi� radia i telewizji [61].

Innymi minera³ami powsta³ymi w wyniku aktyw-no�ci bakterii redukuj¹cych Fe(III) i Mn(IV) s¹ syde-ryt (FeCO3), wiwianit [Fe3(PO4) × 8H2O] czy rodo-chrosyt (MnCO3). FRM mog¹ te¿ redukowaæ zwi¹zkiuranu U(VI), w wyniku czego powstaj¹ z³o¿a U(IV)w postaci uraninitu (UO2) [61].

Analogiczne procesy mikrobiologicznej redukcjiU(VI) do tych zachodz¹cych w warunkach mezo-filnych maj¹ te¿ miejsce w �rodowiskach termo-i hypertermofilnych. Pokazano, ¿e hypertermofilnyarcheon Pyrobaculum islandicum jest zdolny do re-dukcji U(VI) do U(IV) w temperaturze 100°C, w wy-niku czego powstaje nierozpuszczalny uraninit. Re-dukcja U(VI) wymaga obecno�ci wodoru jako dawcyelektronów [40].

Z mikrobiologiczn¹ redukcj¹ Fe(III) w glebachzwi¹zane jest zjawisko powstawania gleb glejowych.Polega ono na tym, ¿e gleba staje siê kleista i przyj-muje szar¹ lub zielonkawo-niebiesk¹ barwê. Jest towynik powstania zwi¹zku Fe3(OH)8 zawieraj¹cego¿elazo na stopniu utlenienia +2 i +3 w wyniku reakcji17 i 18 [20]:

Fe(OH)3 + 3H+ + e � Fe2+ + 3H2O (reakcja 17)2 Fe(OH)3 + Fe2+ ++ 2OH� → Fe3(OH)8 (reakcja 18)

Innym zjawiskiem jest lateryzacja gleby w wilgot-nych i gor¹cych klimatach. W wyniku intensywnejaktywno�ci prokariotów redukuj¹cych Fe(III) cz¹stkiorganiczne ulegaj¹ prawie ca³kowitej mineralizacjii jednocze�nie tworz¹ siê du¿e ilo�ci tlenków Fe(II),które ulegaj¹ wytr¹caniu i powoduj¹ jakby cemento-wanie cz¹steczek gleby. W efekcie tworzy siê twardy


czerwony lub ciemnobr¹zowy lateryt. Jego sk³adnikiems¹ tak¿e tlenki glinu [20].

Redukcja Fe(III) oraz Mn(IV) przez bakterie wp³y-wa na stan wód, g³ównie wód gruntowych. W wyni-ku reakcji redukcji niektóre nierozpuszczalne tlenkiFe(III) i Mn(IV) ulegaj¹ przekszta³ceniu do rozpusz-czalnych zwi¹zków Fe(II) i Mn(II). W takiej formiedostaj¹ siê do wód gruntowych, gdzie w wyniku ze-tkniêcia siê z powietrzem ulegaj¹ utlenieniu do nie-rozpuszczalnych tlenków Fe(III) i Mn(IV). Powodujeto z³¹ jako�æ wody pitnej, jej nieodpowiedni smaki kolor, problemy typu zatykanie siê rur wodno-kana-lizacyjnych, itp. Ponadto wraz z rozpuszczalnymi zre-dukowanymi zwi¹zkami Fe(II) i Mn(II) do wód grun-towych mog¹ przedostaæ siê fosforany i �ladowe ilo�citoksycznych metali, które zwykle adsorbuj¹ siê na nie-rozpuszczalnych tlenkach Fe(III) i Mn(IV). W efekcietych procesów nastêpuje wzrost si³y jonowej, wzroststê¿enia kationów, tak¿e wzrost pH i ska¿enie wódmetalami toksycznymi. To wszystko z kolei ma nie-korzystny wp³yw na wzrost ro�lin [61, 62].

Jak ju¿ wspomniano przy omawianiu mechaniz-mów redukcji Fe(III) koñcowym akceptorem elektro-nów w oddychaniu FRM mog¹ byæ kwasy humusowe.Zredukowane kwasy humusowe w �rodowisku mo-g¹ stanowiæ �ród³o elektronów do innych procesówmikrobiologicznej redukcji np. azotanów, selenianów,arsenianów [61].

Utlenianie materii organicznej z jednoczesn¹ re-dukcj¹ Fe(III) lub Mn(IV) stanowi wa¿ny elementw obiegu wêgla w beztlenowych osadach dennychs³odkowodnych zbiorników wodnych, w osadach mor-skich, na terenach podmok³ych, w podmok³ych glebach,np. pola ry¿owe, w p³ytkich zbiornikach wodnych za-nieczyszczonych zwi¹zkami organicznymi. Niezbêd-nym warunkiem jest dostêpno�æ zwi¹zków Fe(III) orazMn(IV) i ³atwo�æ utleniania ich form zredukowanych[61]. Oddychanie przez redukcjê Fe(III) oraz Mn(IV)odgrywa istotn¹ rolê w �rodowiskach ubogich w azota-ny i siarczany, gdzie nie zachodzi metanogeneza [20].

Jednocze�nie mikrobiologiczna redukcja siarczanówjak i procesy metanogenezy s¹ zahamowane w �rodo-wiskach bogatych w Fe(III). Dodanie tlenków Fe(III)lub Mn(IV) do �rodowisk, gdzie intensywnie zachodz¹procesy redukcji siarczanów oraz procesy metanoge-nezy, powoduje ich wyra�ne spowolnienie. Nie wynikato z toksyczno�ci zwi¹zków ¿elaza, tylko ze zmianysk³adu mikroflory i zdominowania jej przez organizmyFRM. Podobny efekt obserwuje siê po wprowadzeniudo pod³o¿a wodoru i/lub octanów. Zjawisko to jestwynikiem wspó³zawodnictwa miêdzy poszczególnymigrupami mikroorganizmów o substraty organiczne bê-d¹ce donorami elektronów. Decyduje o tym potencja³oksydoredukcyjny reakcji redukcji zwi¹zków nieor-ganicznych i utleniania materii organicznej [89]. Jakwidaæ z danych w Tabeli IV prokarioty redukuj¹ceFe(III) i Mn(IV) ¿yj¹ na pograniczu dodatniego i ujem-nego potencja³u oksydoredukcyjnego, uzyskuj¹c przytym dwukrotnie wiêcej energii przy utlenieniu molasubstratu organicznego ni¿ prokarioty redukuj¹ce siar-czany (PRS) oraz archeony metanogenne. FRM s¹ wiêcbardziej istotne ekologicznie.

Ogromne znaczenie dla �rodowiska ma usuwaniezanieczyszczeñ organicznych z terenów ska¿onych rop¹naftow¹ czy wysypisk �mieci przez FRM (rozdz. 5.2).

Mikrobiologiczna transformacja form ¿elaza Fe(II)i Fe(III) pe³ni wa¿n¹ rolê w obiegu ¿elaza w przyro-dzie. Do procesów mikrobiologicznych wp³ywaj¹cychna kr¹¿enie ¿elaza oprócz oddychania Fe(III) i innychform dysymilacyjnej redukcji ¿elaza nale¿¹ oddzia³y-wanie koñcowych produktów metabolizmu bakterii naminera³y zawierajace ¿elazo oraz procesy mikrobiolo-gicznego utleniania jonu ¿elazawego do jonu ¿elazo-wego [20]. FRM maj¹ te¿ istotne znaczenie w kr¹¿e-niu manganu w przyrodzie. Uwa¿a siê, ¿e ilo�æzwi¹zków manganu w �rodowisku stanowi 10% ilo�cizwi¹zków ¿elaza, ale za to Mn(IV) jest chêtniej wyko-rzystwany jako akceptor elektronów ni¿ Fe(III), corównie¿ spowodowane jest potecja³em redoks reakcjiredukcji Fe(III) i Mn(IV) (Tabela IV) [61, 89].

Redukcja tlenu: O2 + 4H+ + 4e� � 2H

2O 0,812 �29,9

Redukcja jonów azotanowych: NO3

� + 6H+ + 6e_ � N2 + 3H

2O 0,747 �28,4

Redukcja jonów Mn+4 do Mn2+: MnO2 + 4H+ + 2e� � Mn2+ + 2H

2O 0,526 �23,3

Redukcja jonów Fe3+ do Fe2+: Fe(OH)3 + 3H+ + e� � Fe2+ + 3H

2O �0,047 �10,1

Redukcja jonów SO4

2� do H2S: SO

42� + 10H+ + 8e� � H

2S + 4H

2O �0,221 �5,9

Redukcja CO2 do CH

4: CO

2 + 8H+ + 8e� � CH

4 + 2H

2O �0,244 �5,6

T a b e l a I VWarto�ci termodynamiczne redukcji nieorganicznych akceptorów elektronów

w obecno�ci materii organicznej [89]

ReakcjaWarto�ci Eh

(V))G

(kcal/mol)


5. Znaczenie prokariotów redukuj¹cych Fe(III)w biotechnologii

Biotechnologiê okre�la siê jako integracjê naukprzyrodniczych i in¿ynieryjnych w celu zastosowaniaczynników biologicznych (organizmów, komórek, en-zymów) do pozyskania dóbr i us³ug. W�ród czynni-ków biologicznych wykorzystywanych w biotechno-logii dominuj¹c¹ rolê odgrywaj¹ bakterie. Prokariotyredukuj¹ce Fe(III) oraz inne metale stanowi¹ bardzociekaw¹ grupê drobnoustrojów z punktu widzeniabiotechnologii. Wyizolowane i zidentyfikowane nie-dawno, w przysz³o�ci mog¹ odegraæ du¿¹ rolê w pro-cesach bioremediacji oraz znale�æ zastosowanie w mi-krobiologicznych ogniwach paliwowych do produkcjipr¹du z jednoczesnym usuwaniem ró¿norodnych od-padów organicznych.

5.1. Mikrobiologiczne ogniwa paliwowe

Mikrobiologiczne ogniwa paliwowe (MFC, micro-bial fuel cell) to uk³ady w których wykorzystuje siêmikroorganizmy beztlenowe do produkcji energiielektrycznej. W wyniku oddychania komórkowegonastêpuje przekszta³cenie energii chemicznej ukrytejw wi¹zaniach chemicznych w zwi¹zkach organicznych

w energiê elektryczn¹. MFC dzia³aj¹ na zasadzie che-micznych ogniw paliwowych. W tych ostatnich pro-dukcja energii elektrycznej nastêpuje w wyniku elek-trochemicznej reakcji spalania paliwa (wodoru lubprostego zwi¹zku chemicznego bogatego w wodór, jaknp. metanol czy lekkie wêglowodory) doprowadza-nego do anody w utleniaczu, np. tlenie z powietrzadoprowadzanym do katody. Mikrobiologiczne ogniwopaliwowe sk³ada siê z przedzia³ów anodowego i kato-dowego oddzielonych od siebie membran¹ jonoselek-tywn¹ przepuszczaj¹c¹ jony, zwykle protony. W prze-dziale anodowym maj¹ miejsce reakcje utleniania.Protony przenoszone s¹ z przedzia³u anodowego doprzedzia³u katodowego przez membranê. Elektronyprzenoszone s¹ na katodê przez zewnêtrzny obwódelektryczny, w którym wydziela siê energia elektrycz-na. W przedziale katodowym nastêpuj¹ reakcje reduk-cji. Jak do tej pory zaproponowano kilka typów MFC[11, 55, 94]. Jedna z koncepcji zak³ada, ¿e w przedzialeanodowym MFC hodowane s¹ bakterie redukuj¹ceFe(III), które tworz¹ biofilm na anodzie. W wynikuutleniania przez te bakterie zwi¹zków organicznychw procesie oddychania powstaj¹ elektrony, które prze-noszone s¹ bezpo�rednio na anodê MFC zamiast nanaturalne akceptory znajduj¹ce siê w �rodowiskuzewn¹trzkomórkowym. W efekcie tego procesu pro-dukowana jest energia elektryczna (rys. 3). Bakterie

Rys. 3. Schemat mikrobiologicznego ogni-wa paliwowego z udzia³em bakterii redu-kuj¹cych ¿elazo (III).Na zdjêciach pokazano anodê MFC w po-staci tkaniny wêglowej poro�niêtej bakte-riami z hodowli selekcjonuj¹cej bakterieredukuj¹ce ¿elazo (badania w³asne).


zdolne do produkcji energii w wyniku bezpo�redniegotransferu elektronów pochodz¹cych z utleniania materiiorganicznej na anodê mikrobiologicznego ogniwa pa-liwowego zosta³y nazwane przez jednych autorówelektricigenami (electricigens) [57�60] a przez innychegzoelektrogenami (exoelectrogens) [55]. Do tej poryopisano dzia³anie MFC z udzia³em czystych kulturnastêpuj¹cych gatunków bakterii: Rhodoferax ferrire-ducens [15], Geothrix fermentans [8], Desulfobulbuspropionicus [33], Aeromonas hydrophila [83], Clostri-dium butyricum szczep EG3 [81], Geopsychrobacterelectrodiphilus [35], Geobacter sulfurreducens [6],G. metallireducens, Desulfuromonas acetoxidans [7],S. putrefaciens szczep MR-1 [43]. Najczê�ciej stoso-wanym materia³em, z którego wykonuje siê anodyw tego typu ogniwach jest grafit. W eksperymentachz Geobacter sulfurreducens pokazano, ¿e bardzodobrym materia³em anodowym mo¿e byæ z³oto. Toodkrycie jest wa¿ne dla zastosowañ MFC z udzia³embakterii redukuj¹cych ¿elazo na mikroskalê [88].

Buduje siê równie¿ osadowe mikrobiologiczneogniwa paliwowe (SMFC, sediment MFC). Anoda tegotypu ogniwa umieszczana jest bezpo�rednio w beztle-nowych osadach dennych zbiorników wodnych a ka-toda w miejscach, do których dociera tlen. Osi¹ganagêsto�æ mocy produkowanego pr¹du wynosi od kilkudo kilkudziesiêciu mW/m2. Takie uk³ady zwane te¿BUGs (Benthic Unattened Generators) mog¹ mieæ za-stosowanie jako systemy przeznaczone do zasilaniaurz¹dzeñ elektrycznych w odleg³ych miejscach jakg³êbiny oceanu, gdzie wymiana baterii jest technicz-nie trudna i kosztowna. Osadowe MFC mo¿na te¿ zbu-dowaæ w warunkach laboratoryjnych umieszczaj¹canodê ogniwa w próbkach osadów dennych. Analizybiofilmów pokrywaj¹cych anody osadowych MFCpokaza³y, ¿e ich dominuj¹cym sk³adnikiem s¹ bakte-rie z rodziny Geobacteraceae, rodzaj Desulfuromonasw przypadku s³onych osadów morskich i rodzajGeobacter w przypadku osadów s³odkowodnych.W ró¿nych warunkach znacz¹cy udzia³ maj¹ te¿ innebakterie, np. z rodziny Desulfobulbaceace czy rodzajGeothrix [7, 17, 33, 55, 56, 57, 97]. Osadowe mikro-biologiczne ogniwa paliwowe pozwalaj¹ na odkrywa-nie i izolacjê nowych elektrochemicznie aktywnychgatunków i szczepów bakterii [35, 81, 83].

Obecnie rozwa¿a siê trzy kierunki rozwoju i zasto-sowañ MFC z udzia³em elektricigenów. Pierwszy tousuwanie odpadów organicznych z jednoczesn¹ pro-dukcj¹ energii elektrycznej. Substratami mia³yby tubyæ �cieki pochodz¹ce z gospodarstw domowych czyodpady z produkcji rolnej. Rozwa¿a siê stworze-nie uk³adów, odpowiedników systemów BUGs, którepokrywa³yby czê�ciowo zapotrzebowanie na energiê,zw³aszcza na du¿ych obszarach rolnych oraz w krajachrozwijaj¹cych siê. Drugi kierunek to samowystarczalne

roboty pobieraj¹ce substraty organiczne z otoczenia.Trzeci kierunek to zastosowania na wspomnian¹ ju¿mikroskalê, g³ównie biosensory, czyli systemy, którewykorzystuj¹ reakcje biologiczne do wykrywania ró¿-nych zwi¹zków. Obecno�æ danego zwi¹zku w prze-dziale anodowym uruchamia przep³yw pr¹du, co re-jestrowane jest metodami elektronicznymi [6, 44]. Tepotencjalne zastosowania wymagaj¹ zwiêkszenia wy-dajno�ci i optymalizacji MFC. Konieczne jest wiêcdog³êbne poznanie mechanizmów transferu elektronówna anodê bioogniwa przez znane ju¿ mikroorganizmyzwane elektricigenami, ich fizjologii, ekologii orazposzukiwanie nowych gatunków. Narzêdzi ku temudostarcza obecny burzliwy rozwój genomiki i ró¿no-rodnych metod biologii molekularnej. Szuka siê spo-sobu zwiêkszenia aktywno�ci oddechowej bakteriipokrywajacych anodê. Rozwa¿ana jest koncepcja mo-dyfikacji genetycznych bakterii w kierunku konstruk-cji mutantów np. nadprodukuj¹cych bia³ka, odpowie-dzialnych za kontakt z powierzchni¹ anody [56�59].

Wydaje siê, ¿e nie by³o i nie istnieje ¿adna presjaewolucyjna w kierunku produkcji energii przez elek-tricigeny w naturalnych �rodowiskach. Nie wiadomoczy bia³ka odpowiedzialne za przenoszenie elektro-nów na akceptory znajduj¹ce siê na zewn¹trz komórkiw naturalnym �rodowisku i w warunkach laboratoryj-nych dzia³aj¹ równie wydajnie, gdy bakteria ro�nie namateriale, z którego zbudowana jest anoda MFC [59].Stosuj¹c technikê mikroczipów DNA oraz hybrydy-zacjê northern porównywano ekspresjê genów G. sul-furreducens rosn¹cych na pod³o¿u z cytrynianem ¿e-laza oraz na anodzie grafitowej w mikrobiologicznymogniwie paliwowym. Stwierdzono zmienion¹ ekspre-sjê 474 genów, gdy elektroda by³a jedynym akcepto-rem elektronów. 197 genów by³o transkrybowanychsilniej a 277 s³abiej. Najwieksz¹ ró¿nicê, bo a¿ 19-krot-ny wzrost ekspresji, obserwowano dla genu koduj¹-cego bia³ko OmcS, cytochrom typu c w zewnêtrznejb³onie komórkowej. Co wiêcej, mutant z delecj¹ omcSnie by³ zdolny do produkcji energii. Podwy¿szonejekspresji podlega³y te¿ geny omcE i omcT. Przypom-nijmy, ¿e bia³ka OmcS i OmcE s¹ odpowiedzialne zaredukcjê nierozpuszczalnego tlenku ¿elazowego. ¯ad-nych ró¿nic nie obserwowano natomiast dla transkryp-tów omcB, ompB, ompJ oraz piliny buduj¹cej nanodru-ty. Ponadto mutacje w genach omcB i pilA nie zmieni³yprodukcji energii elektrycznej. Cytochromy typu c zlo-kalizowane w zewnêtrznej b³onie komórkowej prawdo-podobnie odgrywaj¹ istotn¹ rolê w kontaktach komórkibakterii z elektrod¹ [36].

Wyniki innych badañ sugeruj¹, ¿e równie¿ innebia³ka mog¹ byæ istotne w transferze elektronów nanaturalne akceptory w �rodowisku ni¿ na anodêmikrobiologicznego ogniwa paliwowego. Otrzyma-no mutanty S. oneidensis MR-1, które produkowa³y


pr¹d w MFC, ale nie by³y w stanie redukowaæ tlenkuFe(III) [10]. Z kolei inna bakteria z rodziny Geobac-teraceae, Pelobacter carbinolicus jest zdolna do re-dukcji ¿elaza (III), ale w MFC z jej udzia³em nie by³produkowany pr¹d [87].

5.2. Bioremediacja

Terminem bioremediacja okre�la siê technologiêleczenia �rodowiska naturalnego ze ska¿eñ, g³ówniepowodowanych przez metale ciê¿kie, produkty ropynaftowej i pierwiastki radioaktywne, za pomoc¹ ¿y-wych mikroorganizmów w celu ich rozk³adu lub prze-prowadzenia w formy mniej szkodliwe. Bioremediacjain situ w³¹cza procesy degradacji, detoksyfikacji orazimmobilizacji zanieczyszczeñ przez mikroorganizmy,które naturalnie ¿yj¹ w strefach ska¿onych [60].

FRM mog¹ znale�æ zastosowanie w procesach bio-remediacji na dwa sposoby. Pierwszy to utlenianie dodwutlenku wêgla w warunkach beztlenowych zwi¹z-ków organicznych, jak np. wêglowodory aromatycznew miejscach ska¿onych rop¹ naftow¹, po³¹czone z re-dukcj¹ ¿elaza. Tereny ska¿one przez ropê naftow¹ obfi-tuj¹ w FRM, g³ównie rodzaj Geobacter. Istnieje pomys³zastosowania uk³adów opartych na mikrobiologicz-nych ogniwach paliwowych do oczyszczania terenówska¿onych ropopochodnymi zwi¹zkami organicznymi.W wyniku utleniania tych zwi¹zków przez bakteriez grupy FRM produkowana by³aby energia elektryczna[76]. Dodanie substancji chelatuj¹cych nierozpuszczal-ne tlenki Fe(III) do próbek osadów zanieczyszczonychrop¹ naftow¹ powodowa³o przyspieszenie procesuutleniania ropopochodnych zwi¹zków aromatycznychi procesów redukcji Fe(III). Mo¿e to byæ strategi¹ sto-sowan¹ w bioremediacji terenów ska¿onych rop¹ naf-tow¹ przy udziale bakterii z grupy FRM [70].

Drugi sposób zastosowania bakterii redukuj¹cych¿elazo w procesach bioremediacji to wykorzystanieich zdolno�ci do redukcji innych metali ni¿ Fe(III) czyMn (IV), zw³aszcza tych, które s¹ toksyczne i nie-bezpieczne dla cz³owieka i �rodowiska. Wiêkszo�æpierwiastków mo¿e wystêpowaæ na ró¿nym stopniuutlenienia w ró¿nych zwi¹zkach chemicznych. Stopieñutlenienia, na którym znajduje siê dany pierwiastekwp³ywa na w³asno�ci fizyko-chemiczne (np. rozpusz-czalno�æ w wodzie) zwi¹zków, które tworzy. Szcze-gólne znaczenie z punktu widzenia bioremediacji maj¹procesy (czêsto s¹ to procesy redukcji) przeprowadza-nia form toksycznych pierwiastków rozpuszczalnychw wodzie w formy nierozpuszczalne, które ulegaj¹wytr¹caniu i w ten sposób ³atwo je usun¹æ z miejscska¿onych.

FRM mog¹ byæ skutecznym narzêdziem do bio-remediacji terenów ska¿onych uranem pochodz¹cymz odpadów radioaktywnych. Okres pó³trwania uranu

w zale¿no�ci od izotopu wynosi od 247 tysiêcy do4.5 miliardów lat. Zwi¹zki uranu (VI) s¹ rozpuszczal-ne w wodzie, st¹d bardzo trudne do usuniêcia ze �ro-dowiska. Natomiast uran (IV) tworzy nierozpuszczal-ne tlenki � uraninit, które ³atwo ulegaj¹ wytr¹ceniu.Zatem mikrobiologiczna redukcja U (VI) do U (IV)mo¿e przyczyniæ siê do usuwania uranu ze �rodo-wiska, zw³aszcza ze ska¿onych wód [2, 63, 64, 96].Czyste kultury bakterii z grupy FRM (rodzaj Geobac-ter, Shewanella) redukuj¹ U(VI) do U(IV) i w ten spo-sób pozyskuj¹ energiê niezbêdn¹ do procesów ¿ycio-wych. Reakcje 19 i 20 opisuj¹ redukcjê U(VI) doU(IV) przy udziale elektronów pochodz¹cych z utle-niania odpowiednio octanu i wodoru.

CH3COO� (octan) + 4U(VI) ++ 4H2O → 2HCO3

� + 4U(IV) + 9H+ + (reakcja 19)H2 + U(VI) → 2H+ + U(IV) (reakcja 20)

Do redukcji uranu (VI) zdolne te¿ s¹ prokariotyredukuj¹ce siarczany, jednak proces ten nie s³u¿y po-zyskiwaniu energii. Dotychczas stwierdzono, ¿e zdol-no�æ redukcji uranu (VI) do uranu (IV) posiadaj¹ bak-terie z rodziny Desufovibrionaceae, np. Desulfovibriodesulfuricans, a tak¿e nieliczni przedstawiciele z ro-dziny Peptococcaceae, np. rodzaj Desulfotomaculum.Filogenetyczna analiza populacji bakterii w próbkachpobranych z osadów ska¿onych uranem pokazuje, ¿edominuj¹ tam przedstawiciele rodzin Geobacteraceaei Desufovibrionaceae [96].

W badaniach laboratoryjnych pokazano, ¿e prost¹metod¹ zwiêkszania procesów redukcji uranu (VI)w ska¿onych próbkach pobranych z naturalnych �ro-dowisk wodnych jest dodanie octanu jako dawcy elek-tronów. W takich warunkach nastêpuje silny rozwójFRM, g³ównie z rodziny Geobacteraceae, które sta-nowi¹ nawet do 40% ca³ego zespo³u mikroorgani-zmów (microbial community) [32]. Tak¹ sam¹ strate-giê (wzbogacanie w octan) zastosowano w badaniachin situ w zbiorniku wodnym zanieczyszczonym zwi¹z-kami uranu. Do�wiadczenie trwa³o 3 miesi¹ce. Pocz¹t-kowo równie¿ obserwowano rozwój bakterii z rodzi-ny Geobacteraceae i wzmo¿one wytr¹canie uraninitu.Stwierdzono 70% obni¿enie zawarto�ci U(VI). Jednakpo pewnym czasie dominuj¹c¹ grup¹ sta³y siê bakterieredukuj¹ce siarczany, które utlenia³y octan. Spowo-dowane to by³o g³ównie wyczerpaniem siê zwi¹zków¿elaza Fe(III). W efekcie nast¹pi³ wzrost ilo�ci uranu(VI) w badanym �rodowisku. Bakterie redukuj¹cesiarczany równie¿ redukowa³y uran (VI) do U(IV), aleznacznie mniej efektywnie w porównaniu do stanu, gdyw badanym �rodowisku dominowa³a rodzina Geobac-teraceae [2]. W trzecim miesi¹cu opisanego ekspery-mentu pobrano próbkê osadu dennego i wyizolowanoz niej nowy gatunek nale¿¹cy do rodzaju Geobacter� Geobacter uraniireducens [91].


W obecno�ci azotanów nie obserwuje siê reduk-cji U(VI) do U(IV) zarówno w badaniach in situ jaki w warunkach laboratoryjnych w czystych hodowlachG. metallireducens oraz w próbkach pobranych z ró¿-nych miejsc ska¿onych uranem. We wszystkich tychuk³adach redukowany jest jon azotanowy [21, 23, 90].Istnieje kilka przyczyn tego zjawiska. Po pierwsze, re-akcja redukcji jonu azotanowego jest bardziej korzyst-na termodynamicznie dla bakterii redukuj¹cych ¿ela-zo zdolnych te¿ do redukcji NO3

� ni¿ reakcja redukcjiuranu (VI). Po drugie, w naturalnych �rodowiskachredukcja metali jest energetycznie mniej korzystn¹ for-m¹ oddychania beztlenowego w porównaniu z reduk-cj¹ azotanów i konkurencjê wygrywaj¹ bakterie deni-tryfikacyjne. Po trzecie, zredukowane formy U(IV)podobnie jak Fe(II) mog¹ byæ utleniane w obecno�ciazotanów przez bakterie denitryfikacyjne, a nawet przezsame FRM. Poza tym utlenianie zarówno U (IV) oraz¿elaza Fe(II) mo¿e zachodziæ abiotycznie [23].

Bardzo wa¿nym odkryciem z punktu widzenia za-stosowania rodzaju Geobacter do bioremediacji tere-nów ska¿onych uranem (VI) by³o wykazanie, ¿e dawc¹elektronów do procesów redukcji prowadzonych przezte bakterie mo¿e byæ grafitowa elektroda [29]. Takieelektrody pokryte biofilmem bakteryjnym umieszczanow miejscach ska¿onych uranem (VI). Stanowi³y one�ród³o elektronów do mikrobiologicznej reakcji re-dukcji U(VI) do U(IV). Takie rozwi¹zanie znacznieu³atwia usuwanie wytr¹conego uraninitu ze �rodowiska,gdy¿ osadza siê on na powierzchni elektrod [30].

Produktem rozszczepienia uranu jest technet 99Tc.Wystêpuje w du¿ych ilo�ciach w miejscach testowaniabroni j¹drowej oraz tam, gdzie sk³adowane s¹ odpadyradioaktywne. Okres pó³trwania technetu 99Tc jest bar-dzo d³ugi i wynosi 213 tysiêcy lat. W �rodowisku Tcwystêpuje na +7 stopniu utlenienia w postaci jonuTcO4

�, który mo¿e byæ w³¹czany w ³añcuch pokar-mowy jako analog siarczanów. Technet Tc(VII) mo¿eulegaæ mikrobiologicznej redukcji, w wyniku czegopowstaje nierozpuszczalny tlenek TcO2, w którym tech-net wystêpuje na +4 stopniu utlenienia. W takiej posta-ci technet mo¿e byæ stosunkowo ³atwo usuniêty ze �ro-dowiska. Pokazano dwa mechanizmy redukcji Tc(VII)do Tc(IV) dla G. sulfurreducens. W pierwszym technetredukowany jest enzymatycznie przy jednoczesnymutlenianiu wodoru. Uwa¿a siê, ¿e funkcj¹ reduktazyTc(VII) pe³ni hydrogenaza. Drugi mechanizm zak³a-da, ¿e Tc(VII) mo¿e ulegaæ redukcji do Tc(IV) po�red-nio w sposób abiotyczny przez zredukowane kwasyhumusowe oraz magnetyt. Wytr¹cony TcO2 osadza siêna powierzchni kryszta³ów magnetytu. Do redukcjitechnetu oprócz G. sulfurreducens zdolny jest tak¿eG. metallireducens i inny przedstawiciel grupy FRM,S. putrefaciens [51], a tak¿e E. coli (mechanizm reduk-cji opisany w rozdz. 3) [52, 53] czy D. desulfuricans.

W przypadku tej ostatniej, gdy donorem elektronówby³ wodór lub mrówczan, a akceptorem elektronówjon TcO4

� zamiast siarczanu w warunkach beztleno-wych, nastêpowa³o utlenienie wodoru lub mrówczanuz jednoczesn¹ redukcj¹ TcO4

� do nierozpuszczalnegosiarczku Tc. Wynik ten wskazywa³ na enzymatyczn¹redukcjê Tc(VII), któr¹ przeprowadza peryplazma-tyczna hydrogenaza. Oprócz tego jon TcO4

� mo¿e byæredukowany abiotycznie do siarczku technetu w reak-cji z siarkowodorem, powsta³ym w wyniku aktywno�cibakterii redukuj¹cych siarczany [53, 54].

Cz³onkowie rodzin Geobacteraceae oraz Shewa-nellaceae s¹ modelowymi organizmami w badaniachnad zastosowaniem bakterii redukuj¹cych ¿elazo dobioremediacji terenów ska¿onych uranem czy metala-mi ciê¿kimi. Jak wiadomo bakterie z rodzin Geobac-teraceae oraz Shewanellacae s¹ neutrofilami. Podda-no zatem analizie konsorcja redukuj¹ce ¿elazo i uran,z podpowierzchniowych osadów z terenów ska¿onychuranem i azotanami, o niskim pH. Metod¹ analizysekwencji genu koduj¹cego 16S rRNA z DNA po-chodz¹cego z pobranych próbek osadów wykazanoznaczny udzia³ fakultatywnych beztlenowców zdol-nych do redukcji ¿elaza nale¿¹cych do rodzaju Anaero-myxobacter [82].

Wykazano równie¿, ¿e przedstawiciel rodziny Geo-bacteraceae, G. metallireducens, jest zdolny do pozys-kania energii w wyniku utleniania materii organicznejw po³¹czeniu z redukcj¹ wanadu V(V) do V(IV). Wa-nad jest naturalnie wystêpuj¹cym metalem skorupyziemskiej w ilo�ciach podobnych do cynku. Do �rodo-wiska dostaje siê równie¿, w ilo�ciach powoduj¹cychjego ska¿enie, wraz z odpadami z przemys³u wydobyw-czego, metalurgicznego, farmaceutycznego oraz nowo-czesnych technologii. Wanad mo¿e wystêpowaæ w �ro-dowisku na +3, +4 i +5 stopniu utlenienia. Najbardziejtoksyczn¹ form¹ jest V(V). Zwi¹zki V(V) s¹ rozpusz-czalne w wodzie. Wanad na stopniu utlenienie +4 jestnierozpuszczalny w wodzie. Wystêpuje w postaci ka-tionów VO2+, które ulegaj¹ adsorpcji na cz¹steczkachkwasów humusowych i tworz¹ z nimi trwa³e kom-pleksy. Zatem przekszta³cenie formy V(V) do V(IV)mo¿e stanowiæ metodê immobilizacji wanadu a na-stêpnie usuwanie go ze ska¿onych terenów [80].

Bakterie z rodzaju Geobacter oraz bakterie ekstre-mofilne jak Pyrobaculum islandicum mog¹ te¿ redu-kowaæ Hg(II) do Hg(0), Cr(VI) do Cr(III), czy Co(III)do Co(II) [49, 64].

Redukcja metali niezwi¹zana z pozyskiwaniemenergii niezbêdnej do ¿ycia jest do�æ szeroko roz-powszechniona w�ród bakterii i odgrywa du¿¹ rolêw kr¹¿eniu ró¿nych metali w przyrodzie. Procesy temaj¹ szczególnie istotne znaczenie dla �rodowiskaz powodu przekszta³cania ró¿nych toksycznych metaliw formy mniej toksyczne, ³atwe do usuniêcia. Do


takich metali nale¿¹: selen [redukcja Se(VI), Se(IV),Se(0) przez ró¿ne gatunki Clostridium, Citrobacter,Flavobacterium, Pseudomonas], chrom [redukcjaCr(VI) do Cr (III) przez ró¿ne gatunki Pseudomonas,Bacillus oraz Aeromonas dechromatica, Achromobac-ter eurydice, Micrococcus roseus, Escherichia coli,Enterobacter cloacae, Desulfovibrio desulfuricans],rtêæ [redukcja Hg(II) do Hg(0)], technet [redukcjaTc(VII) do Tc(IV) przez rodzaj Moraxella i Planococ-cus], wanad [redukcja V(V) do V(IV) przez gatunkiPseudomonas], molibden [redukcja Mo(V) do Mo(IV)przez Pseudomonas guillermondii, Micrococcus sp.,Acidithiobacillus ferrooxidans, gatunki Sulfolobus],mied� [redukcja Cu(II) do Cu(I) przez A. ferrooxidans],palad [redukcja Pd(II) do Pd(0) przez Desulfovibriodesulfuricans] [64].

Zdolno�æ mikroorganizmów do redukcji metali za-równo maj¹cej na celu produkcjê energii (G. metalli-reducens) jak i bêd¹cej procesem ubocznym (E. coli,D. desulfuricans, B. subtilis, P. aeruginosa) mo¿nate¿ wykorzystaæ do otrzymywania cennych kruszcówjakimi s¹ z³oto i srebro. W wyniku redukcji rozpusz-czalnych form Au(III) lub Au(I) powstaje z³oto meta-liczne, a Ag(I) metaliczne srebro [18, 64].

6. Podsumowanie

Wyniki dotychczasowych badañ nad FRM wska-zuj¹, ¿e energia pozyskiwana do wzrostu i rozwojuz dysymilacyjnej redukcji Fe(III) oraz Mn(IV) i innychmetali wp³ywa istotnie na cykle biogeochemicznew �rodowiskach beztlenowych. FRM tworz¹ �super-rodzinê�, do której nale¿¹ ró¿norodne taksony z do-meny Bacteria jak i domeny Archaea. FRM s¹ tak¿ewa¿nym czynnikiem w procesie bioremediacji za-równo zanieczyszczeñ organicznych oraz metalamiciê¿kimi i pierwiastkami promieniotwórczymi w bez-tlenowych warstwach �rodowisk mezofilnych jak i psy-chrofilnych, termofilnych i hypertermofilnych. FRMznalaz³y równie¿ zastosowanie w MFC jako czynnikprodukuj¹cy energiê elektryczn¹. FRM wykszta³ci³yszereg mechanizmów umo¿liwiaj¹cych redukcjê roz-puszczalnych i nierozpuszczalnych zwi¹zków Fe(III),Mn(IV) i innych metali.

7. Pi�miennictwo

1. Afkar E., Reguera G., Schiffer M., Lovley D.R.: A novelGeobacteraceae-specific outer membrane protein J (OmpJ) isessential for electron transport to Fe(III) and Mn(IV) oxidesin Geobacter sulfurreducens. BMC Microbiol. 5, 41 (2005)

2. Anderson R.T., Lovley D.R. i wsp.: Stimulating the in situactivity of Geobacter species to remove uranium fromthe groundwater of a uranium-contaminated aquifer. Appl.

Environ. Microbiol. 69, 5884�5891 (2003) (wy¿ej cytowanapraca jest dzie³em 13 autorów)

3. Beliaev A.S., Saffarini D.A., McLaughlin J.M., Hunnicut D.:MtrC, an outer membrane decahaem c cytochrome requiredfor metal reduction in Shewanella putrefaciens MR-1. Mol.Microbiol. 39, 722�730 (2001)

4. Beliaev A.S., Saffarini D.A.: Shewanella putrefaciens mtrBencodes an outer membrane protein required for Fe(III) andMn(IV) reduction. J. Bacteriol. 180, 6292�6297 (1998)

5. Bergey�s Manual of Systematic Bacteriology, 2nd Edition,Springer, New York 2001/2005

6. Bond D.R., Lovley D.R.: Electricity production by Geobac-ter sulfurreducens attached to electrodes. Appl. Environ.Microbiol. 69, 1548�1555 (2003)

7. Bond D.R., Holmes D.E., Tender L.M., Lovley D.R.: Elec-trode-reducing microorganisms that harvest energy frommarine sediments. Science, 295, 483�485 (2002)

8. Bond D.R., Lovley D.R.: Evidence for involvement of anelectron shuttle in electricity generation by Geothrix fermen-tas. Appl. Environ. Microbiol. 71, 2186�2189 (2005)

9. Boone D.R., Liu Y., Zhao Z.J., Balkwill D.L., Drake G.R.,Stevens T.O., Aldrich H.C.: Bacillus infernus sp. nov.,an Fe(III)- and Mn(IV)-reducing anaerobe from the deep ter-restrial subsurface. Int. J. System. Bacteriol. 45, 441�448(1995)

10. Bretschger O., K.H. Nealson i wsp.: Current production andmetal oxide reduction by Shewanella oneidensis MR-1 wildtype and mutants. Appl. Environ. Microbiol. 73, 7003�7011(2007) (wy¿ej cytowana praca jest dzie³em 18 autorów)

11. Bullen R.A., Arnot T.C., Lakeman J.B., Walsh F.C.: Bio-fuel cells and their development. Biosens. Bioelectron. 21,2015�2045 (2006)

12. Butler J.E., Kaufmann F., Coppi M.V., Nunez C., Lovley D.R.:MacA, A diheme c-type cytochrome involved in Fe(III)reduction by Geobacter sulfurreducens. J. Bacteriol. 186,4042�4045 (2004)

13. Caccavo F., Coates J.D., Rossello-Mora R.A., Ludwig W.,Schleifer K.H., Lovley D.R., McInerney M.J.: Geovibrio ferri-reducens, a phylogenetically distinct dissimilatory Fe(III)-re-ducing bacterium. Arch. Microbiol. 165, 370�376 (1996)

14. von Canstein H., Ogawa J., Shimizu S., Lloyd J.R.: Secretionof flavins by Shewanella species and their role in extracellularelectron transfer. Appl. Environ. Microbiol. 74, 615�623(2008)

15. Chaudhuri S.K., Lovley D.R.: Electricity generation by directoxidation of glucose in mediatorless microbial fuel cells.Nature Biotechnol. 21, 1229�1232 (2003)

16. Cummings D.E., Caccavo F., Spring S., Rosenzweig R.F.:Ferribacterium limneticum, gen. nov., sp. nov., an Fe(III)-reducing microorganism isolated from mining-impactedfreshwater lake sediments. Arch. Microbiol. 171, 183�188(1999)

17. DeLong E.F., Chandler P.: Power from the deep. Nature Bio-technol. 20, 788�789 (2002)

18. Deplanche K., Macaskie L.E.: Biorecovery of gold by Esche-richia coli and Desulfovibrio desulfuricans. Biotechnol.Bioeng. 99, 1055�1064 (2008)

19. DiChristina T.J., Moore C.M., Haller C.A.: DissimilatoryFe(III) and Mn(IV) reduction by Shewanella putrefaciensrequires ferA, a homolog of the pulE (gspE) type II proteinsecretion gene. J. Bacteriol. 184, 142�151 (2002)

20. Ehrlich H.L., Geomicrobiology of iron (w) Geomicrobio-logy, red. H.L. Ehrlich, Marcel Dekker, Inc. New York, Basel,2002, s. 345.


21. Elias D.A., Krumholz L.R., Wong D., Long P.E., Suflita J.M.:Characterization of microbial activities and U reduction ina shallow aquifer contaminated by uranium mill tailings.Microb. Ecol. 46, 83�91 (2003)

22. Esteve-Nunez A., Sosnik J, Visconti P., Lovley D.R.:Fluorescent properties of c-type cytochromes reveal theirpotential role as an extracytoplasmic electron sink in Geo-bacter sulfurreducens. Environ. Microbiol. 10, 497�505(2008)

23. Finneran K.T., Housewright M.E., Lovley D.R.: Multipleinfluences of nitrate on uranium solubility during bioreme-diation of uranium-contaminated subsurface sediments. Env.Microbiol. 4, 510�516 (2002)

24. Francis C.A., Obraztsova A.Y., Tebo B.M.: Dissimilatorymetal reduction by the facultative anaerobe Pantoea agglo-merans SP1. Appl. Environ. Microbiol. 66, 543�548 (2000)

25. Fredrickson J.K., Kostandarithes H.M., Li S.W., Plymale A.E.,Daly M.J.: Reduction of Fe(III), Cr(VI), U(VI), and Tc(VII)by Deinococcus radiodurans R1. Appl. Environ. Microbiol.66, 2006�2011 (2000)

26. Glasauer S., Langley S., Boyanov M., Lai B., Kemner K.,Beveridge T.J.: Mixed-valence cytoplasmic iron granules arelinked to anaerobic respiration. Appl. Environ. Microbiol. 73,993�996 (2007)

27. Glasauer S., Langley S., Beveridge T.J.: Intracellular man-ganese granules formed by a subsurface bacterium. Environ.Microbiol. 6, 1042�1048 (2004)

28. Gorby Y.A., Fredrickson J.K. i wsp.: Electrically conductivebacterial nanowires produced by Shewanella oneidensisstrain MR-1 and other microorganisms. Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 103, 11358�11363 (2006) (wy¿ej cytowana praca jestdzie³em 24 autorów)

29. Gregory K.B., Bond D.R., Lovley D.R.: Graphite electrodesas electron donors for anaerobic respiration. Environ. Micro-biol. 6, 596�604 (2004)

30. Gregory K.B., Lovley D.R.: Remediation and recovery ofuranium from contaminated subsurface environments withelectrodes. Environ. Sci. Technol. 39, 8943�8947 (2005)

31. Heidelberg J.F. C.M. Fraser i wsp.: Genome sequence ofthe dissimilatory metal iron-reducing bacterium Shewanellaoneidensis. Nature Biotechnol. 20, 1118�1123 (2002) (wy¿ejcytowana praca jest dzie³em 43 autorów)

32. Holmes D.E., Finneran K.T., O�Neil R.A., Lovley D.R.:Enrichment of Geobacteraceae associated with stimulationof dissimilatory metal reduction in uranium-contaminatedaquifer sediments. Appl. Environ. Microbiol. 68, 2300�2306(2002)

33. Holmes D.E., Bond D.R., Lovley D.R.: Electron transfer byDesulfobulbus propionicus to Fe(III) and graphite electrodes.Appl. Environ. Microbiol. 70, 1234�1237 (2004)

34. Holmes D.E., Bond D.R., O�Neil R.A., Reimers C.E., Ten-der L.R., Lovley D.R.: Microbial communities associatedwith electrodes harvesting electricity from a variety of aquaticsediments. Microb. Ecol. 48, 178�190 (2004)

35. Holmes D.E., Nicoll J.S., Bond D.R., Lovley D.R.: Potentialrole of a novel psychrotolerant member of the family Geobac-teraceae, Geopsychrobacter electrodiphilus gen. nov., sp.nov., in electricity production by a marine sediment fuel cell.Appl. Environ. Microbiol. 70, 6023�6030 (2004)

36. Holmes D.E., Chaudhuri S.K., Nevin K.P., Mehta T.,Methe B.A., Liu A., Ward J.E., Woodard T.L., Webster J.,Lovley D.R.: Microarray and genetic analysis of electrontransfer to electrodes in Geobacter sulfurreducens. Environ.Microbiol. 8, 1805�1815 (2006)

37. Kanso S., Greene A.C., Patel B.K.C.: Bacillus subterraneussp. nov., an iron- and manganese-reducing bacterium froma deep subsurface Australian thermal aquifer. Int. J. System.Evol. Microbiol. 52, 869�874 (2002)

38. Kashefi K., Holmes D.E., Baross J.A., Lovley D.R.: Ther-mophily in the Geobacteraceae: Geothermobacter ehrlichiigen. nov., sp. nov., a novel thermophilic member of theGeobacteraceae from the �Bag City� hydrothermal vent.Appl. Environ. Microbiol. 69, 2985�2993 (2003)

39. Kashefi K., Holmes D.E., Lovley D.R., Tor J.M.: Potentialimportance of dissimilatory Fe(III)-reducing microorganismsin hot sedimentary environments (w) The Subseafloor Bio-sphere at Mid-Ocean Ridges, Geophysical Monograph Series144, 2004, str. 199.

40. Kashefi K., Moskowitz B.M., Lovley D.R.: Characterizationof extracellular minerals produced during dissimilatoryFe(III) and U(VI) reduction at 100ºC by Pyrobaculum islan-dicum. Geobiology, 6, 147�154 (2008)

41. Kim B.H., Qian X., Leang C., Coppi M.V., Lovley D.R.: Twoputative c-type multiheme cytochromes required for theexpression of OmcB, an outer membrane protein essentialfor optimal Fe(III) reduction in Geobacter sulfurreducens.J. Bacteriol. 188, 3138�3142 (2006)

42. Kim B.H., Leang C., Ding Y.-H. R., Glaven R.H., Coppi M.V.,Lovley D.R.: OmcF, a putative c-type monoheme outer mem-brane cytochrome required for the expression of outer mem-brane cytochromes in Geobacter sulfurreducens. J. Bacteriol.187, 4505�4513 (2005)

43. Kim H.J, Park H.S., Hyun M.S., Chang I.S., Kim M.,Kim B.H.: A mediator-less microbial fuel cell using a metalreducing bacterium, Shewanella putrefaciens. Enzyme Microb.Technol. 30, 145�152 (2002)

44. Kim H.J, Hyun M.S., Chang I.S., Kim B.H.: A MicrobialFuel Cell Type Lactate Biosensor Using a Metal-ReducingBacterium, Shewanella putrefaciens. J. Microbiol. Biotechnol.9, 365�367 (1998)

45. Kusel K., Dorsch T., Acker G., Stackebrandt E.: Microbialreduction of Fe(III) in acidic sediments: isolation of Acidi-philum cryptum JF-5 capable of coupling the reduction ofFe(III) to the oxidation of glucose. Appl. Environ. Microbiol.65, 3633�3640 (1999)

46. Leang C, Coppi M.V., Lovley D.R.: OmcB, a c-type poly-heme cytochrome, involved in Fe(III) reduction in Geobactersulfurreducens. J. Bacteriol. 185, 2096�2103 (2003)

47. Lies D.P., Hernandez M.E., Kappler A., Mielke R.E.,Gralnick J.A., Newman D.K.: Shewanella oneidensis MR-1uses overlapping pathways for iron reduction at a distanceand by direct contact under conditions relevant for biofilms.Appl. Environ. Microbiol. 71, 4414�4426 (2005)

48. Lin W.C., Coppi M.V., Lovley D.R.: Geobacter sulfur-reducens can grow with oxygen as a terminal electron accep-tor. Appl. Environ. Microbiol. 70, 2525�2528 (2004)

49. Lloyd J.R., Lovley D.R.: Microbial detoxification of metalsand radionuclides. Curr. Opin. Biotechnol. 12, 248�253(2001)

50. Lloyd J.R., Leang C., Hodges-Myerson A.L., Coppi M.V.,Cuifo S., Methe B., Sandler S.J., Lovley D.R.: Biochemicaland genetic characterization of PPcA, a periplasmic c-typecytochrome in Geobacter sulfurreducens. Biochem. J. 369,153�161 (2003)

51. Lloyd J.R., Sole V.A., van Praagh C.V.G., Lovley D.R.:Direct and Fe(II)-mediated reduction of technetium byFe(III)-reducing bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 66,3743�3749 (2000)


52. Lloyd J.R., Cole J.A., Macaskie L.E.: Reduction and removalof heptavalent technetium from solution by Escherichia coli.J. Bacteriol. 179, 2014�2021 (1997)

53. Lloyd J.R., Thomas G.H., Finlay J.A., Cole J.A., MacaskieL.E.: Microbial reduction of technetium by Escherichia coliand Desulfovibrio desulfuricans: Enhancement via the useof high-activity strains and effect of process parameters. Bio-technol. Bioeng. 66, 122�130 (1999)

54. Lloyd J.R., Nolting H.-F., Sole V.A., Bosecker K., MacaskieL.E.: Technetium reduction and precipitation by sulfate-reducing bacteria. Geomicrobiol. J. 15, 45�58 (1998)

55. Logan B.E.: Microbial fuel cells, red. B.E. Logan, John Wiley& Sons, Hoboken, New Jersey, USA, 2008.

56. Lovley D.R.: Microbial energizers:fuel cells that keep ongoing. Microbe, 1, 323�329 (2006)

57. Lovley D.R.: Bug juice: harvesting electricity with micro-organisms. Nat. Rev. Microbiol. 4, 497�508 (2006)

58. Lovley D.R.: Microbial fuel cells: novel microbial physio-logies and engineering approaches. Curr Opin. Biotechnol. 17,327�332 (2006)

59. Lovley D.R.: Taming electricigens. The Scientist, July 2006,46

60. Lovley D.R.: Anaerobes to the rescue. Science, 293, 1444�1446(2001)

61. Lovley D.R., Fe(III) and Mn(IV) reduction (w) Environmen-tal Microbe-Metal Interactions, red. D.R. Lovley. ASM PressWashington, D.C., 2000, s. 3.

62. Lovley D.R.: Dissimilatory Fe(III) and Mn(IV) reduction.Microbiol. Rev. 55, 259�287 (1991)

63. Lovley D.R.: Dissimilatory reduction of iron and uranium(w) Trends in Microbial Ecology, red. R. Guerrero i C. Pe-dros-Alio. Spanish Society for Microbiology Barcelona,1993, s. 71.

64. Lovley D.R.: Dissimilatory metal reduction. Annu. Rev.Microbiol. 47, 263�290 (1993)

65. Lovley D.R., Philips E.P.: Reduction of chromate by Desulfo-vibrio vulgaris and its c

3 cytochrome. Appl. Environ. Micro-

biol. 60, 726�728 (1994)66. Lovley D.R., Philips E.J.P., Lonergan D.J., Widman P.K.:

Fe(III) and S0 reduction by Pelobacter carbinolicus. Appl.Environ. Microbiol. 61, 2132�2138 (1995)

67. Lovley D.R., Holmes D.E., Nevin K.P.: Dissimilatory Fe(III)and Mn(IV) reduction. Adv. Microbiol. Physiol. 49, 219�286(2004)

68. Lovley D.R., Fraga J.L., Coates J.D., Blunt-Harris E.L.:Humics as an electron donor for anaerobic respiration. Envi-ron. Microbiol. 1, 89�98 (1999)

69. Lovley D.R., Fraga J.L., Blunt-Harris E.L., Hayes L.A.,Phillips E.J., Coates D.J.: Humic substances as a mediatorfor microbially catalyzed metal reduction. Acta Hydrochim.Hydrobiol. 26, 152�157 (1998)

70. Lovley D.R., Woodward J.C., Chapelle F.H.: Rapid anaerobicbenzene oxidation with a variety of chelated Fe(III) forms.Appl. Environ. Microbiol. 62, 288�291 (1996)

71. Maier T.M., Myers C.R.: The outer membrane proteinOmp35 affects the reduction of Fe(III), nitrate, and fumarateby Shewanella oneidensis MR-I. BMC Microbiol. 4, 23 (2004)

72. Mattick J.S.: Type IV pili and twiching motility. Annu. Rev.Microbiol. 56, 289�314 (2002)

73. Mehta T., Childers S.E., Glaven R., Lovley D.R., Mester T.:A putative multicopper protein secreted by an atypical typeII secretion system involved in the reduction of insolubleelectron acceptors in Geobacter sulfurreducens. Micro-biology, 152, 2257�2264 (2006)

74. Mehta T., Coppi M.V., Childers S.E., Lovley D.R.: Outermembrane c-type cytochromes required for Fe(III) andMn(IV) oxide reduction in Geobacter sulfurreducens. Appl.Environ. Microbiol. 71, 8634�8641 (2005)

75. Methe B.A., C.M. Fraser I wsp.: Genom of Geobacter sul-furreducens: metal reduction in subsurface environments.Science, 302, 1967�1969 (2003) (wy¿ej cytowana praca jestdzie³em 34 autorów)

76. Morris J.M., Jin S.: Feasibility of using microbial fuel celltechnology for bioremediation of hydrocarbons in ground-water. J. Env. Sci. Health, 43, 18�23 (2008)

77. Myers C.R., Myers J.: Cloning and sequence of cymA, a geneencoding a tetraheme cytochrome c required for reduction ofiron (III), fumarate and nitrate by Shewanella putrefaciensMR-1. J. Bacteriol. 179, 1143�1152 (1997)

78. Nevin K.P., Lovley D.R.: Mechanisms for accessing insolubleFe(III) oxide during dissimilatory Fe(III) reduction by Geothrixfermentas. Appl. Environ. Microbiol. 68, 2294�2299 (2002)

79. Nevin K.P., Lovley D.R.: Mechanisms for Fe(III) oxidereduction in sedimentary environments. Geomicrobiol. J. 19,141�159 (2002)

80. Ortiz-Bernard I., Anderson R.T., Vrionis H.A., Lovley D.R.:Vanadium respiration by Geobacter metallireducens: novelstrategy for in situ removal of vanadium from groundwater.Appl. Environ. Microbiol. 70, 3091�3095 (2004)

81. Park H.S., Kim B.H., Kim H.S., Kim H.J., Kim G.T.,Kim M., Ch I.S., Park Y.K., Chang H.I.: A novel electro-chemically active and Fe(III)-reducing bacterium phylo-genetically related to Clostridium butyricum isolated froma microbial fuel cell. Anaerobe, 7, 297�306 (2001)

82. Petrie L., North N.N., Dollhopf S.L., Balkwill D.L., KostkaJ.E.: Enumeration and characterization of iron(III)-reducingmicrobial communities from acidic subsurface sedimentscontaminated with uranium. Appl. Environ. Microbiol. 69,7467�7479 (2003)

83. Pham C.A., Jung S.J., Phung N.T., Lee J., Chang I.S.,Kim B.H., Yi H., Chun J.: A novel electrochemically activeand Fe(III)-reducing bacterium phylogenetically related toAeromonas hydrophila, isolated from a microbial fuel cell.FEMS Microbiol. Lett. 223, 129�134 (2003)

84. Reguera G., McCarthy K.D., Mehta T., Nicoll J.S., Tuomi-nen M.T., Lovley D.R.: Extracellular electron transfer viamicrobial nanowires. Nature, 435, 1098�1101 (2005)

85. Reguera G., Nevin K.P., Nicoll J.S., Covalla S.F., WoodardT.L., Lovley D.R.: Biofilm and nanowire production leads toincreased current in Geobacter sulfurreducens fuel cells.Appl. Environ. Microbiol. 72, 7345�7348 (2006)

86. Reguera G., Pollina R.B., Nicoll J.S., Lovley D.R.: Possiblenonconductive role of Geobacter sulfurreducens pilus nano-wires in biofilm formation. J. Bacteriol. 189, 2125�2127 (2007)

87. Richter H., Lanthier M., Nevin K.P., Lovley D.R.: Lack ofelectricity production by Pelobacter carbinolicus indicatesthat the capacity for Fe(III) oxide reduction does not neces-sarily confer electron transfer ability to fuel cell anodes. Appl.Environ. Microbiol. 73, 5347�5353 (2007)

88. Richter H., McCarthy K., Nevin K.P., Johnson J.P., RotelloV.M., Lovley D.R.: Electricity generation by Geobacter sul-furreducens attached to gold electrodes. Langmuir, 24,4376�4379 (2008)

89. Schlesinger W.H.: Biogeochemistry: an analysis of globalchange. Academic Press, San Diego, 1997

90. Senko J.M., Istok J.D., Suflita J.M., Krumholz L.R.: In-situevidence for uranium immobilization and remobilization.Environ. Sci. Technol. 36, 1491�1496 (2002)


91. Shelobolina E.S., Vrionis H.A., Findlay R.H., Lovley D.R.:Geobacter uraniireducens sp. nov., isolated from subsurfacesediment undergoing uranium bioremediation. Int. J. Syst.Evol. Microbiol. 58, 1075�1078 (2008)

92. Shi L, T.C. Squier i wsp.: Isolation of a high-affinity functio-nal protein complex between OmcA and MtrC: two outermembrane decaheme c-type cytochromes of S. oneidensisMR-1. J. Bacteriol. 188, 4705�4714 (2006) (wy¿ej cytowa-na praca jest dzie³em 17 autorów)

93. Shi L., Squier T.C., Zachara J.M., Fredrickson J.K.: Respira-tion of metal (hydr)oxides by Shewanella and Geobacter:a key role for multihaem c-type cytochromes. Mol. Micro-biol. 65, 12�20 (2007)

94. Sikora A., Sikora R.: Mikrobiologiczne ogniwa paliwowe(Microbial fuel cells). Biotechnologia Monografie, 2(2),68�77 (2005)

95. Slobodkin A.I.: Thermophilic microbial metal reduction.Microbiology, 74, 501�514 (2005)

96. Suzuki Y., Kelly S.D., Kemner K.M., Banfield J.F.: Directmicrobial reduction and subsequent preservation of uraniumin natural near-surface sediment. Appl. Environ. Microbiol.71, 1790�1797 (2005)

97. Tender L.M., Reimers C.E., Stecher H.A., Holmes D.E.,Bond D.R., Lowy D.A., Pilobello K., Fertig S.J., LovleyD.R.: Harnessing microbially generated power on theseafloor. Nature Biotechnol. 20, 821�825 (2002)

98. Vandieken V., Muâmann M., Niemann H., Jorgensen B.B.:Desulfuromonas svalbardensis sp. Nov. And Desulfuromusaferrireducens sp. Nov., psychrophilic, Fe(III)-reducing bac-teria isolated from Arctic sediments, Svalbard. Int. J. Sys-tem. Evol. Microbiol. 56, 1133�1139 (2006)

99. Yanke L.J., Bryant R.D., Laishley E.J.: Hydrogenase I ofClostridium pasteurianum functions as a novel selenitereductase. Anaerobe, 1, 61�67 (1995)

100. Ye Q., Roh Y., Carroll S.L., Blair B., Zhou J., Zhang C.L.,Fields M.W.: Alkaline anaerobic respiration: isolationand characterization of a novel alkaliphilic and metal-redu-cing bacterium. Appl. Environ. Microbiol. 70, 5595�5602(2004)

Praca powsta³a w ramach grantu Ministerstwa Nauki i Szkol-nictwa Wy¿szego nr 2P04B00429


1. Wstêp

W�ród setek publikacji z ostatnich lat, dotycz¹cychgrzybów z rodzaju Geotrichum, zdecydowanie domi-nuje tematyka biotechnologiczna. Informacje na tematroli tych grzybów jako patogenów cz³owieka, s¹ nie-liczne. Dodatkowo, po reklasyfikacji takich gatun-ków, jak Geotrichum clavatum (obecnie Saprochaeteclavata) i G. capitatum (obecnie Magnusiomyces ca-pitatus), wydawaæ by siê mog³o, ¿e pozosta³e gatunki,w tym najpowszechniej wystêpuj¹cy Geotrichum can-didum, nie odgrywaj¹ w patologii wiêkszej roli. Tym-czasem lekarze praktycy spotykaj¹ siê z problememinterpretacji wyników badañ mykologicznych w wy-padkach izolacji G. candidum. Czy zawsze uznawaæten gatunek za sk³adnik flory fizjologicznej, czy zakontaminacjê, czy jednak za gatunek patogenny? Tre�-ci¹ artyku³u jest przedstawienie stanu wiedzy na tematchorobotwórczo�ci tych grzybów oraz zwiêz³a charak-terystyka ich w³a�ciwo�ci.

2. Taksonomia

Rodzaj Geotrichum znany jest od prawie 200 lat.W 1809 roku H. F. L i n k na ³amach Magazin derGesellschaft Naturforschenden Freunde u¿y³ nazwyG. candidum (geo = ziemia i trichus = w³osy, candi-dum = czysto bia³y) do opisania izolowanych z ziemigrzybów, które scharakteryzowa³: Sporidia magna,extremitatibus truncatis genus designant (w wolnymt³umaczeniu: wielkie zarodniki, ze �ciêtymi koñcami s¹charakterystyczne dla rodzaju). Od tego czasu opisanoszereg gatunków w wielu rodzajach wykazuj¹cych po-dobieñstwo morfologiczne do Geotrichum. Powsta³ow ten sposób oko³o setki synonimowych opisów,z których najczêstszym jest podany przez F r e s e n i u sw 1950 r. Oidium lactis.

Klasyfikacja grzybów dro¿d¿opodobnych wytwa-rzaj¹cych artrokonidia przez d³ugi czas pozostawa³aproblematyczna. Szczepy p¹czkuj¹ce wytwarzaj¹cepseudogrzybniê i grzybniê z artrokonidiami by³y

GRZYBY Z RODZAJU GEOTRICHUMJAKO OPORTUNISTYCZNY PATOGEN CZ£OWIEKA

Magdalena Skóra*, Jadwiga Witalis, Pawe³ Krzy�ciak, Anna B. Macura

Zak³ad Mykologii Katedry Mikrobiologii Collegium Medicum Uniwersytetu Jagielloñskiego


1. Wstêp. 2. Taksonomia. 3. Wystêpowanie. 4. Morfologia. 5. Fizjologiczne i biochemiczne w³a�ciwo�ci. 6. Chorobotwórczo�æ.7. Wra¿liwo�æ na leki i leczenie. 8. Podsumowanie

Fungal genus Geotrichum: an opportunistic pathogen of humans

Abstract: Fungi belonging to Getrichum genus are widespread in nature. They have been used in food industry and biotechnologicalresearch for many years. However, a lack of definite answer to the question concerning their position in taxonomy is intriguing, as wellas their role in the pathogenesis of diseases in humans. Even morphology of these fungi is of interest because they are located on theborderline between typical yeast-like fungi and moulds.

Our overview of literature is focused mainly on the medical aspect because the fungi deserve thorough attention as opportunistichuman pathogens, even though their low pathogenicity has been reported.

Geotrichum sp. is a causative agent of geotrichosis. The foci of infection are localized mainly in lungs and bronchi, however theyalso may appear in the skin and gastrointestinal tract. Cases of septicemia and disseminated infections were also reported. G. candidumis the species most often identified as the cause of geotrichosis. The disease most often develops in immunocompromised persons:patients with haemopoietic system malignancies under chemotherapy, under long lasting antibiotic and steroid therapy and in dia-betics. In vitro investigations gave evidence that G. candidum in susceptible to amphotericin B, clotrimazole, 5-fluorocytosine andmiconazole, however, some strains are highly resistant to azoles as well as to amphotericin B and nystatin. Now that there are noguidelines concerning the treatment of Geotrichum infections, the choice of a proper treatment should be based on the drug suscep-tibility of the fungal strain isolated and on clinical condition of the patient.

1. Introduction. 2. Taxonomy. 3. Occurrence. 4. Morphology. 5. Physiology and biochemical properties. 6. Pathogenicity. 7. Drugssusceptibility and treatment. 8. Summary

S³owa kluczowe: geotrichoza, Geotrichum, Geotrichum candidum, grzybice oportunistyczneKey words: geotrichosis, Geotrichum, Geotrichum candidum, opportunistic mycoses

* Autor do korespondencji: Zak³ad Mykologii Katedry Mikrobiologii Collegium Medicum Uniwersytetu Jagielloñskiego,ul. Czysta 18, 31-212 Kraków; tel.: 012 633 08 77 wewn. 231, fax: 012 423 39 24, e-mail: [email protected]

126 MAGDALENA SKÓRA, JADWIGA WITALIS, PAWE£ KRZY�CIAK, ANNA B. MACURA

w³¹czone w rodzaj Trichosporon, a niep¹czkuj¹cei bez pseudogrzybni w rodzaj Geotrichum [11, 28].W badaniach wykazano pokrewieñstwo Trichosporonz podstawczakami ze wzglêdu na sk³ad �ciany ko-mórkowej grzybów tego rodzaju. Na tej podstawieW e i j m a n zasugerowa³ podzia³ gatunków grzybówwytwarzaj¹cych artrokonidia na podstawczaki i wor-kowce klasyfikuj¹c je odpowiednio jako Trichosporoni Geotrichum [61]. Mimo, ¿e p¹czkowanie okaza³osiê nieistotn¹ taksonomicznie cech¹, w 1984 rokuw The Yeast, a taxonomic study workowce i podstaw-czaki pozosta³y w rodzaju Trichosporon [21]. Taki stanrzeczy budzi³ w¹tpliwo�ci naukowców. D e H o o gzaakceptowa³ zaproponowany przez W e i j m a n po-dzia³ i dokona³ pierwszej rewizji taksonomicznejwszystkich gatunków workowców wytwarzaj¹cych ar-trokonidia [8]. Od tego czasu powsta³o szereg pracanalizuj¹cych relacje filogenetyczne w obrêbie tejgrupy grzybów. Badania oparte by³y i s¹ o cechy mor-fologiczne, fizjologiczne i ekologiczne grzybów,charakterystykê hodowli oraz badania molekularne:reasocjacji j¹drowego DNA, zawarto�ci molowo-pro-centowej zasad G+C DNA genomowego, krzyw¹termicznej denaturacji DNA i krzyw¹ topnienia DNA;obecnie wykorzystuje siê równie¿ metody ogólnie zwa-ne PCR-fingerprinting, czy wieloogniskow¹ elektro-forezê enzymów.

W 2000 roku ukaza³a siê praca analizuj¹ca relacjew obrêbie rodzaju Geotrichum w oparciu o porówna-nie sekwencji ca³ego genomu [51].

Stwierdzono jednoznacznie, ¿e Geotrichum, Ga-lactomyces i Dipodascus s¹ zwi¹zane z dro¿d¿amiworkowcowymi i powinny byæ umieszczone w rzêdzieSaccharomycetales. Analiza genów rDNA dla du¿ejpodjednostki (26S) [24], a tak¿e dla ma³ej podjednostki18S [56] wykaza³y podzia³ w�ród tych gatunków nawyra�ne 2 klady, które jednak nie znajduj¹ odzwier-ciedlenia w zró¿nicowaniu w cechach morfologicznychi ekologii tych mikroorganizmów. Nie odpowiadaj¹ te¿podzia³owi Dipodascus / Galactomyces.

W 2004 roku d e H o o g i S m i t h w pracydokonuj¹cej rewizji rodzaju Geotrichum wymieniali6 gatunków (formy anamorficzne i teleomorficzneuznano jako jeden gatunek) w kladzie Galactomyces(dla G. europaneum teleomorf nie jest znany), 9 w kla-dzie Dipodascus oraz 17 w do³¹czonym kladzieMagnusiomyces (do którego nale¿y m.in. Blastoschizo-myces capitatus, wcze�niej Geotrichum capitatum, prze-klasyfikowany jako Magnusiomyces capitatus z form¹anamorficzn¹ Saprochaete capitata) [8]. W tabeli Iprzedstawiono relacje anamorf/teleomorf.

Od tego czasu opisano 5 nowych gatunków Geo-trichum (g³ównie z przewodu pokarmowego owadów),a tak¿e teleomorfy Galactomyces britannicum i Dipo-dascus tetrasporeus [25, 34, 42, 52, 62].

Analizuj¹c taksonomiê i pokrewieñstwa filogene-tyczne w rodzaju Geotrichum nale¿y mieæ �wiadomo�æ,¿e badania definiuj¹ce nowe gatunki oraz porównuj¹cepokrewieñstwo miêdzygatunkowe i miêdzyrodzajoweoparte s¹ na ograniczonej liczbie szczepów oraz publi-kowanych sekwencji genetycznych. Dlatego te¿ praw-dopodobnym jest, ¿e kolejne odkrycia mog¹ zmieniæobecn¹ systematykê nie tylko na poziomie rodzaju, aletak¿e rodziny, czy rzêdów. Wszak jeszcze 30 lat temu³¹czono ze sob¹ w obrêbie rodzaju Trichosporon gatun-ki nale¿¹ce obecnie do dwóch typów grzybów (Asco-mycetes i Basidiomycetes), a wiêc taksonów bardzo od-leg³ych w kryteriach systematyki organizmów ¿ywych.

3. Wystêpowanie

Gatunek G. candidum, najpowszechniejszy z rodza-ju Geotrichum, jest izolowany z ró¿nych materia³ówi �rodowisk. Grzyby te znale�æ mo¿na w powietrzu [2]oraz w glebie, szczególnie zanieczyszczonej �ciekamimiejskimi [1], jak równie¿ w wodzie rzecznej [50].W organizmach ludzi stanowi¹ naturalny sk³adnik floryprzewodu pokarmowego, choæ s¹ rzadziej izolowaneni¿ grzyby z rodzajów Candida, Rhodotorula i Tricho-sporon [58]. Wystêpuj¹ te¿ w organizmach zwierz¹t[29], w ro�linach, w paszy kiszonej [38] i artyku³ach¿ywno�ciowych [5, 33, 27, 57]. Na przyk³ad w bada-niach cytowanych przez B o u t r o u, grzyby tego ga-tunku znaleziono w 17�40% próbek surowego mleka,ale w stosunkowo niedu¿ych ilo�ciach, bo tylko w 6%próbek by³y wykryte w ilo�ci wiêkszej od 102 cfu/ml(colony forming unit/ml � jednostka tworz¹ca kolo-niê/ml), niezale¿nie od pochodzenia: w krowim, kozimi owczym mleku [5]. Je�li s¹ obecne w surowym mleku,wystêpuj¹ te¿ w surowych twarogach, rzadko w paste-ryzowanych � wtedy jako kontaminacja, której �ród³emjest g³ównie powietrze. Jednak w produktach mlecz-nych wystêpuj¹ nie tylko jako naturalny sk³adnik. WeFrancji na przyk³ad od oko³o 30 lat dodawane s¹ celo-wo do mleka przy produkcji serów jako czynnik przys-pieszaj¹cy dojrzewanie (�ripening agent�) [32]. Takiekomercyjne szczepy G. candidum znalaz³y zastosowa-nie w procesach technologicznych przy produkcjimiêkkich serów, typu Camembert oraz serów pó³twar-dych kozich i owczych. S¹ istotnym komponentem ichmikroflory � przez wydzielanie lipolityczych i proteo-litycznych enzymów, maj¹ udzia³ w dojrzewaniu serówi tworzeniu ich smaku oraz zapachu [5]. Choæ uwa¿asiê, ¿e w stanach obni¿onej odporno�ci G. candidummo¿e powodowaæ oportunistyczne zaka¿enia, co szcze-gó³owo omówiono w czê�ci dotycz¹cej chorobotwór-czo�ci, to retrospektywnie nie stwierdzono chorób po-chodzenia pokarmowego zwi¹zanych z konsumpcj¹produktów zawieraj¹cych G. candidum [44].

127GRZYBY Z RODZAJU GEOTRICHUM JAKO OPORTUNISTYCZNY PATOGEN CZ£OWIEKA

4. Morfologia

Szczepy G. candidum wykazuj¹ morfologiczny po-limorfizm, stoj¹c na granicy pomiêdzy typowymi grzy-bami dro¿d¿opodobnymi i ple�niami, co ma odbicie

w okre�leniach typu: nitkowaty grzyb dro¿d¿opodobny(filamentous yaest-like fungus) [5, 44]. Opisywane s¹dwa zró¿nicowane morfotypy. Jeden charakteryzuje siêtworzeniem kolonii dro¿d¿opodobnych o kremowejbarwie, które produkuj¹ obficie artrospory i generalnie

Galactomyces 1 Galactomyces geotrichum nienazwany Geotrichum sp. Endomyces geotrichum, Dipodascus geotrichum

2 Galactomyces reessii nienazwany Geotrichum sp. Endomyces reessii, Galactomces reessii,Dipodascus reessii

3 Galactomyces citriaurantii Geotrichum citri-aurantii �4 n/n Geotrichum europaeum �

5 Galactomyces Geotrichum

pseudocandidus pseudocandidus �6 Galctomyces candidus Geotrichum candidum Geotrichum candidum, Botrytis geotricha,

Oidium lactis, Endomyces lactis

Dipodascus 1 Dipodascus albidus nienazwany Geotrichum sp. �2 Dipodascus australiensis nienazwany Geotrichum sp. �3 Dipodascus aggregatus nienazwany Geotrichum sp. �

4 Dipodascus geniculatus brak �5 n/n Geotrichum fermentas Trichosporon fermentas, Fermentotrichon

fermentas

6 Dipodascus armillariae Geotrichum decipiens �7 n/n Geotrichum restrictum �8 n/n Geotrichum klebahnii Trichosporon klebahnii, Endomyces lactis,

Trichosporon penicillatum,Geotrichum pennicilatum

9 Dipodascus macrosporus brak �

Magnusiomyces 1 Magnusiomyces starmeri nienazwany Saprochaete sp. �2 Magnusiomyces ovetensis Saprochaete sericea Endomyces ovetensis, Dipodascus ambrosiae,

Trichosporon sericeum, Geotrichum sericeum

3 Magnusiomyces tetrasperma brak Endomyces tetrasperma, Dipodascus tetrasperma

4 Magnusiomyces magnusii Saprochaete ludwigii Endomyces magnusii, Dipodascus magnusii,Oidium ludwigii

5 Magnusiomyces spicifer nienazwany Saprochaete sp. Dipodascus spicifer

6 Magnusiomyces capitatus Saprochaete capitata Dipodascus capitatus, Trichosporon capitatum,Geotrichum capitatum, Blastoschizomycescapitatus, Geotrichum linkii

7 n/n Saprochaete suaveolens Oidium suaveolens, Geotrichum suaveolens,Endomyces lactis

8 n/n Saprochaete gigas Oospora gigas, Geotrichum gigas,G. magnum, G. rectangulatum

9 n/n Saprochaete chiloensis Schizoblastosporion chiloense

10 n/n Saprochaete clavata Geotrichum clavatum

11 n/n Saprochaete saccharophila �

12 Magnusiomyces ingens Saprochaete ingens Dipodascus ingens

13 n/n Saprochaete quercus �

14 n/n Saprochaete japonica �

15 n/n Saprochaete fungicola �

16 n/n Saprochaete psychrophila �

17 n/n Saprochaete ingens Candida ingens, Geotrichum ingens,Pichia humboldtii

T a b e l a IRelacje anamorf/teleomorf (de Hoog 2004) [9]

Klad Lp. Teleomorf Anamorf Wa¿niejsze synonimy i bazonimy

n/n � nieznanyBazonim � nazwa podstawowa (bazowa) � nazwa pod któr¹ grzyb zosta³ po raz pierwszy opisany


wykazuj¹ s³aby wzrost i aktywno�æ proteolityczn¹,a optymalna temperatura ich wzrostu to 22�25°C. Po-nadto te szczepy zakwaszaj¹ pod³o¿e. Drugi morfo-typ tworzy podobne do ple�ni bia³e filcowate kolonie,w których dominuj¹ wegetatywne strzêpki, z nielicz-nymi artrosporami. Ta postaæ ma wysok¹ aktywno�æproteolityczn¹, cechuje siê szybkim wzrostem w op-tymalnej temperaturze 25�30°C i alkalizuje pod³o¿e.Pomiêdzy opisanymi dwoma granicznymi morfotypamio cechach form dro¿d¿opodobnych i ple�ni s¹ te¿szczepy o cechach po�rednich [44].

W opisie morfologicznym G. candidum K u r n a -t o w s k a i K w a � n i e w s k a wyró¿niaj¹ opróczartrospor tak¿e blastospory i endospory. Wg tychautorek komórki wegetatywne czasem tworz¹ pseudo-strzêpki (pseudomycelium) i blastospory, zawsze wy-twarzaj¹ strzêpki w³a�ciwe (mycelium) i z ich rozpaduartrospory, mog¹ te¿ formowaæ w strzêpkach zarodnikiwewnêtrzne � endospory. Grzybnia zbudowana jestze strzêpek z³o¿onych z d³ugich komórek, rozga³êzia-j¹cych siê na koñcach dychotomicznie, o wymiarach8�12 × 30�100 µm, rozpadaj¹cych siê na artrospory,które s¹ wielok¹tne lub cylindryczne, o wymiarach3�7 × 5�8 µm [23] (rys. 1).

Stadium doskona³e, rozmna¿aj¹ce siê p³ciowo, wy-twarza worki o wymiarach 6�9 × 7�9 µm. Zarodniki

workowe s¹ ¿ó³tawo-br¹zowe, okr¹g³e lub elipsoidal-ne, o wymiarach 6�9 × 7�10 µm, z kolczast¹ �cian¹ we-wnêtrzn¹ i nieregularn¹ zewnêtrzn¹, czêsto ze szklisty-mi równikowymi bruzdami [23].

5. Fizjologiczne i biochemiczne w³a�ciwo�ci

G. candidum cechuje krótki czas generacji (podwo-jenia biomasy), tj. 1,1 godz. w 30°C w p³ynnej po¿yw-ce, natomiast d³uga jest faza spoczynkowa lag, którawynosi oko³o 10 godzin [5]. Mo¿e wzrastaæ w szero-kim zakresie pH od 3 do 11 wg G a r r i s o n i H o l d e r[14], a optymalne pH to wg L e c o c q 6,0�7,0 [5],a wg W y d e r 5,0�5,5 [5]. W warunkach hodowliin vitro wzrasta szybko w temperaturze 25°C i s³abow temp. 37°C, nie ro�nie w temp. 40°C [23], natomiastw procesie technologicznym produkcji serów mo¿ewzrastaæ na ich powierzchni w granicach temperatury5�38°C, z optimum ok. 25°C [5].

G. candidum fermentuje glukozê, asymiluje gluko-zê, galaktozê, D-ksylozê, glicerol i kwas bursztynowy.Wiêkszo�æ szczepów przyswaja te¿ sorbitol i te samecukry, które fermentuje oraz glicerol i L-arabinozê, nie-które szczepy przyswajaj¹ te¿ sorbitol. �ciana komór-kowa tych grzybów nie zawiera ksylozy i fruktozy [23].

Porównuj¹c wra¿liwo�æ G. candidum na naturalne�rodki grzybobójcze, M e h r a b i a n i wsp. [30] zba-dali barwniki ro�linne, u¿ywane w przemy�le tekstyl-nym i przy produkcji dywanów (jako ¿e grzyby, któredostaj¹ siê do tych materia³ów z powietrza, mog¹ mieæpotencjalnie dzia³anie alergizuj¹ce). Okaza³o siê, ¿ew stosunku do G. candidum dzia³anie grzybobójczemia³ wyci¹g z krokosza barwierskiego Carthamus tinc-torius, brak takiego dzia³ania stwierdzono w wypadkuekstraktów z orzecha w³oskiego Juglands regia i ma-rzanny barwierskiej Rubia tinctorum.

G. candidum, ze wzglêdu na mo¿liwo�æ wykorzys-tania w biotechnologii, jest � poza wspomnianym ju¿serowowarstwem � przedmiotem zainteresowania w za-stosowaniach miêdzy innymi: w produkcji biomasy[37], w biodegradacji plam ropy naftowej [3], w roz-k³adzie celulozy [26, 46], w procesach s³odowania[41], w produkcji mlecznych napojów fermentowa-nych [53], w przemy�le farmaceutycznym [15, 39]oraz jako �ród³o enzymów, np. lipazy [31].

6. Chorobotwórczo�æ

Grzyby z rodzaju Geotrichum cechuj¹ siê nisk¹chorobotwórczo�ci¹. W opisanych przypadkach zaka-¿eñ, gatunkami najczê�ciej izolowanymi z materia³ówklinicznych jako czynnik etiologiczny, by³y G. candi-dum oraz G. capitatum (dawniej B. capitatus, obecnie

Rys. 1. Obraz mikroskopowy Geotrichum sp. (pow. 1000x).Widoczne prostok¹tne artrospory. (Autor: Pawe³ Krzy�ciak)


Magnusiomyces capitatus / Saprochaete capitata).W niniejszej pracy, z powodu rewizji i reklasyfikacjirodzaju Geotrichum w 2004 roku przez zespó³d e H o o g, ograniczyli�my siê do przedstawieniachorobotwórczo�ci wy³¹cznie gatunku G. candidum.

G. candidum nale¿y do fizjologicznej mikrofloryskóry i przewodu pokarmowego ludzi. Nie zosta³ w³¹-czony w Polsce do wykazu szkodliwych czynnikówbiologicznych i nie jest uznawany jako potencjalnypatogen spo¿ywczy czy �ród³o mikotoksyn w produk-tach spo¿ywczych [12, 44]. Pomimo, ¿e wiele osób,zw³aszcza pracowników przemys³u mleczarskiego,jest nara¿onych na kontakt ze sporami G. candidum,do dnia dzisiejszego nie odnotowano choroby zawo-dowej zwi¹zanej z tym gatunkiem [44]. Zaka¿eniaG. candidum s¹ bardzo rzadkie. P o t t i e r i wsp. po-daj¹, i¿ w okresie od 1842 roku do 2006 roku stwier-dzono mniej ni¿ 100 przypadków infekcji tym gatun-kiem [44]. Badacze ci sugeruj¹, i¿ liczba opisanychprzypadków zaka¿eñ G. candidum mo¿e byæ zawy¿o-na z powodu nieprawid³owej identyfikacji patogenu(zw³aszcza w starszych publikacjach) oraz problemówzwi¹zanych z interpretacj¹ wyników badañ mikro-biologicznych, gdy zaka¿eniom G. candidum towa-rzyszy³y inne grzyby, bakterie lub wirusy [44]. Dopotwierdzenia zaka¿enia gatunkiem G. candidum nie-zbêdna jest kilkukrotna izolacja grzyba z miejscazmienionego chorobowo, zw³aszcza w przypadku ma-teria³ów, w których grzyb ten wystêpuje naturalnie.

G. candidum jest mikroorganizmem oportunistycz-nym. G³ównym czynnikiem predysponuj¹cym do zaka-¿eñ jest stan odporno�ci organizmu. Infekcje dotycz¹przede wszystkim pacjentów z chorobami nowotwo-rowymi uk³adu krwiotwórczego, poddawanych che-mioterapii, zaka¿onych HIV, stosuj¹cych antybiotykio szerokim spektrum dzia³ania, d³ugotrwale przyjmu-j¹cych kortykosteroidy oraz chorych na cukrzycê [44,48]. W obliczu narastaj¹cej liczby osób z defektamiimmunologicznymi, rola G. candidum w zaka¿eniachgrzybiczych mo¿e nabieraæ coraz wiêkszego znacze-nia, podobnie jak w przypadku innych mikroorganiz-mów oportunistycznych takich jak: Rhodotorula sp.,Fusarium sp. czy Scopulariopsis sp. [4, 13, 22].

G. candidum powoduje u ludzi geotrichozê � zaka-¿enie miejscowe, obejmuj¹ce ró¿ne tkanki i narz¹dy,lub zaka¿enie rozsiane. Do infekcji mo¿e doj�æ na dro-dze pokarmowej, a tak¿e poprzez inhalacjê zarodni-ków oraz urazy tkanek [44, 48].

G. candidum najczê�ciej atakuje oskrzela i p³uca[44, 45, 47, 60]. Najwiêcej doniesieñ o przypadkachgeotrichozy oskrzelowo-p³ucnej pochodzi z AmerykiPo³udniowej, przy czym zaka¿enia te odnotowywanorównie¿ w Ameryce Pó³nocnej, Skandynawii, Francjii Wielkiej Brytanii [47]. Objawy geotrichozy oskrze-lowo-p³ucnej s¹ niepatognomiczne i mog¹ przypomi-

naæ przewlek³e zapalenie oskrzeli, gru�licê p³uc lubropieñ p³uc. Odkrztuszanie charakterystycznej, jasnozabarwionej, �luzowatej plwociny, zawieraj¹cej szara-we plamy, mo¿e sugerowaæ zaka¿enie G. candidum[47, 60]. Forma oskrzelowa jest czêstsza i cechuje siêsta³ym kaszlem. Ogólny stan zdrowia jest dobry,a temperatura, puls i oddechy rzadko podwy¿szone.W badaniu fizykalnym mog¹ byæ s³yszalne rzê¿eniagrubobañkowe. Geotrichozie p³ucnej z regu³y towa-rzysz¹ gor¹czka, szybki puls i oddechy oraz leukocyto-za. Plwocina mo¿e byæ podbarwiona krwi¹, natomiastkrwioplucie pojawia siê rzadko. Mog¹ wyst¹piæ: st³u-mione odg³osy opukowe, zmienione odg³osy odde-chowe oraz �wisty powy¿ej miejsca objêtego zmian¹chorobow¹. Rentgenogramy klatki piersiowej w obuprzypadkach nie s¹ charakterystyczne. Geotrichozêoskrzelowo-p³ucn¹ nale¿y ró¿nicowaæ z: kandydoz¹,kryptokokoz¹, kokcidioidomykoz¹, histoplazmoz¹, no-kardioz¹, bakteryjnym zapaleniem p³uc, atypowym za-paleniem p³uc, zw³óknieniem p³ucnym, brucelloz¹p³ucn¹ i gru�lic¹ [60]. Stwierdzano przypadki zaka¿eñuk³adu oddechowego, w których gatunkowi G. candi-dum towarzyszy³y inne mikroorganizmy m.in. Myco-bacterium tuberculosis oraz wirusy Herpes simplex[10, 43]. R o s s i wsp. opisali ostre zapalenie oskrzelii astmê wywo³ane G. candidum u 46-letniej ogólniezdrowej kobiety [47].

Zmiany patologiczne bêd¹ce wynikiem zaka¿eniaG. candidum mog¹ dotyczyæ uk³adu pokarmowego� jamy ustnej, ¿o³¹dka i jelit [44, 48]. H e i n i c i wsp.stwierdzili ustn¹ geotrichozê u pacjenta zara¿onegoHIV [16], natomiast Va s e i i I m a n i e h opisaliinwazjê dwunasticy przez G. candidum u pacjentaz niskim surowiczym poziomem przeciwcia³ w klasachIgA i IgM [58]. G. candidum by³ przyczyn¹ izolowane-go wrzodu prze³yku u pacjenta chorego na AIDS [54]oraz zapalenia jelita cienkiego i okrê¿nicy [35], a tak¿ekoñcowego odcinka krêtnicy [18]. Stwierdzono przy-padki ropnia mózgu (brain abscess) [19], zapaleniarogówki (keratitis) [40] oraz pourazowego zapaleniastawów na skutek infekcji G. candidum [17]. U pa-cjentów z upo�ledzonym uk³adem immunologicznymgatunek ten powodowa³ posocznicê i infekcje rozsia-ne obejmuj¹ce wiele narz¹dów i tkanek: serce, p³uca,w¹trobê, �ledzionê, oko³otrzustkow¹ tkankê miêkk¹,wnêkowe i zaotrzewnowe wêz³y ch³onne, szpik kostny,nerki [20, 48, 49, 60].

Rola G. candidum w zaka¿eniach powierzchnio-wych nie jest do koñca jasna. S f a k i a n a k i s i wsp.opisali przypadek inwazyjnej infekcji skórnej wywo-³anej przez G. candidum u 80 letniego pacjenta z cu-krzyc¹. Zmiany obejmowa³y dystalny paliczek palca�rodkowego prawej d³oni i szerzy³y siê na praw¹ d³oñ[48]. B u s l a u i wsp. zaobserwowali, i¿ czêsto�æ wy-stêpowania G. candidum w przewodzie pokarmowym


pacjentów z ³uszczyc¹ i pacjentów z atopowym zapa-leniem skóry jest wy¿sza ni¿ u pacjentów zdrowych.Badacze izolowali ten gatunek z ka³u u 22% pacjen-tów z ³uszczyc¹, 10% z atopowym zapaleniem skóryi u 3% zdrowych osób [6].

7. Wra¿liwo�æ na leki i leczenie

Dane dotycz¹ce wra¿liwo�ci G. candidum na lekiprzeciwgrzybicze s¹ nieliczne. W badaniach in vitrowykazano, i¿ amfoterycyna B, klotrimazol, 5-fluoro-cytozyna i mikonazol s¹ aktywne w stosunku doG. candidum [45]. Niektóre szczepy s¹ wysoce opornena leki z grupy azoli, zw³aszcza flukonazol i itrakona-zol, a tak¿e amfoterycynê B i nystatynê [44]. Dostêp-ne w pracach naukowych dane o minimalnych stê¿e-niach leków hamuj¹cych wzrost G. candidum (MIC)przedstawiono w tabeli II.

Nie istniej¹ schematy leczenia geotrichozy. W za-ka¿eniu jamy ustnej grzybami z rodzaju Geotrichumzalecano miejscow¹ aplikacjê 2% roztworu fioletu gen-cjany (fioletu goryczkowego), p³ukanie jamy ustnej nad-boranem sodu oraz za¿ywanie witamin z grupy B [60].

W leczeniu geotrichozy oskrzelowo-p³ucnej po-wszechnie stosowano jodki � do¿ylnie jodek sodu orazdoustnie nasycony roztwór jodku potasu, oraz nysta-tynê � doustnie lub w inhalacjach [44, 60]. Wyko-rzystywano równie¿ radioterapiê promieniami X [60].R o s s i wsp. u pacjentki z oskrzelowo-p³ucn¹ geotri-choz¹ i astm¹ zastosowali odczulanie seri¹ roztworówo rosn¹cym stê¿eniu ekstraktu G. candidum oraz te-rapiê prednizolonem i kolistyn¹ � domiê�niowo orazw inhalacjach [47].

U pacjenta z inwazyjn¹ infekcj¹ skórn¹ G. candi-dum zastosowano 4-tygodniow¹ terapiê liposomaln¹amfoterycyn¹ B (w ostatnich dwóch tygodniach w³¹-czono 5-fluorocytozynê), nastêpnie 6-tygodniow¹ do-ustn¹ terapiê worikonazolem i drugi cykl liposomal-nej amfoterycyny B podawanej do¿ylnie [48].

P a r e n t i n i wsp. u 3-letniego dziecka cierpi¹ce-go na zapalenie rogówki w wyniku inwazji Candidaparapsilosis, Candida lusitanieae i Geotrichum can-

didum zastosowali skuteczn¹ terapiê miejscow¹ i ogól-n¹ flukonazolem [40].

Geotrichoza, w przypadku braku g³êbokiej im-munosupresji, nie jest chorob¹ �mierteln¹, prognozajest dobra i choroba mo¿e ust¹piæ nawet bez stoso-wania terapii przeciwgrzybiczej [60]. G. candidumz regu³y wykazuje wra¿liwo�æ na systemowe leki prze-ciwgrzybicze, jednak¿e dobór odpowiedniego lekupowinien zawsze opieraæ siê na wynikach testów leko-oporno�ci oraz ocenie stanu klinicznego pacjenta.Mimo i¿ terapia amfoterycyn¹ B jest powszechnaw ciê¿kich zaka¿eniach grzybiczych, równie¿ w geo-trichozie, stosowanie tego leku jest ograniczone, zewzglêdu na sposób podania oraz wysok¹ nefrotok-syczno�æ [48].

8. Podsumowanie

Grzyby z rodzaju Geotrichum znalaz³y zastosowa-nie w przemy�le spo¿ywczym i s¹ równie¿ czêstymprzedmiotem badañ biotechnologów. Wywo³uj¹ u lu-dzi geotrichozê � zaka¿enie miejscowe lub rozsiane,którego najczêstszym czynnikiem etiologicznym jestgatunek G. candidum. Do tej pory nie zbadano deter-minant patogenno�ci tego gatunku w testach in vitroi na modelach zwierzêcych, jednak¿e grzyb ten jestuznawany jako ma³o chorobotwórczy, o czym �wiad-czy niska czêsto�æ wystêpowania geotrichozy. Zaka-¿enia dotycz¹ przede wszystkim pacjentów z obni-¿on¹ sprawno�ci¹ uk³adu odporno�ciowego. W dobiepowszechnie stosowanej antybiotykoterapii i kortyko-steroidoterapii, coraz czê�ciej wykonywanych zabie-gów chirurgicznych, wczesnej diagnostyki choróbnowotworowych i ich skutecznego leczenia, a w kon-sekwencji � zwiêkszaj¹cej siê populacji ludzi z upo-�ledzon¹ funkcj¹ uk³adu immunologicznego � nienale¿y lekcewa¿yæ mikroorganizmów oportunistycz-nych, w tym równie¿ rodzaju Geotrichum. Nale¿y pa-miêtaæ, i¿ wa¿nym aspektem w epidemiologii zaka¿eñtym grzybem, podobnie jak w przypadku zaka¿eñ in-nymi drobnoustrojami, stanowi w³a�ciwa diagnostykado poziomu gatunku. Znajomo�æ czynnika etiologicz-

0,2�1,6 � 0,01�6,3 � 0,2�3,1 0,1�0,8 � d e H o o g i wsp. [7]

1 <0,03 0,03 1 0,03 <0,008 1 R o s s i wsp. [47] � � � 0,25�2 � � � N e n o f f i wsp. [36]

2,5 � � � � � � Va s e i i I m a n i e h [58]

T a b e l a I IMinimalne stê¿enia leków przeciwgrzybiczych hamuj¹ce wzrost G. candidum

MIC poszczególnych leków [µg/ml]Pi�miennictwo

AMB 5FC ITR FLU KTZ VCZ CSP

AMB � amfoterycyna B, 5FC � 5-fluorocytozyna, ITR � itrakonazol, FLU � flukonazol, KTZ � ketokonazol,VCZ � worikonazol, CSP � kaspofungina


nego choroby umo¿liwia opracowanie metod zapobie-gania zaka¿eniom w oparciu o w³a�ciwo�ci danego pa-togenu oraz u³atwia wdro¿enie celowanego leczenia.

Pi�miennictwo

1. Ali-Shtayeh M.S., Jamous R.M., Abu-Ghdeib S.I.: Ecologyof cycloheximide-resistant fungi in field soils receiving rawcity wastewater or normal irrigation water. Mycopathologia,144, 39�54 (1999)

2. Awad A.H.A.: Vegetation: A source of air fungal bio-conta-minant. Aerobiologia, 21, 53�61 (2005)

3. Benka-Coker M.O., Ekundayo J.A.: Applicability of evalu-ating the ability of microbes isolated from an oil spill site todegrade oil. Environ. Monit. Assess. 45, 259�272 (1997)

4. Bochenek M., Witalis J., Macura A.B.: Wystêpowanie i cho-robotwórczo�æ grzybów z rodzaju Scopulariopsis. Mikol.Lek. 15, 104�108 (2008)

5. Boutrou R., Guéguen M.: Interests in Geotrichum candidumfor cheese technology. Int. J. Food Microbiol. 102, 1�20 (2005)

6. Buslau M., Menzel I., Holzmann H.: Fungal flora of humanfaeces in psoriasis and atopic dermatitis. Mycoses, 33, 90�94(1990)

7. de Hoog G.S., Guarro J., Gene J., Figueras M.J.: Atlas ofClinical Fungi, Centraalbureau voor Schimmelcultures, Uni-versitat Rovira i Virgili, Reus, Hiszpania, 2000, s. 227�233

8. de Hoog G. S., Smith M. T., Gueho E.: A revision of thegenus Geotrichum and its teleomorphs. Stud. Mycol. 29,1�131 (1986)

9. de Hoog G.S., Smith M.T.: Ribosomal gene phylogeny andspecies delimitation in Geotrichum and its teleomorphs.Stud. Mycol. 50, 489�515 (2004)

10. Depagne C., Louerat C., Nesme P.: Herpes simplex andGeotrichum candidum pneumonia in a patient with moderaterenal failure. Rev. Pneumol. Clin. 59, 297�300 (2003)

11. do Carmo-Sousa L.: The genus Trichosporon Behrend (w)The Yeasts, a taxonomic study, red. J. Lodder, North-Holland,Amsterdam, 1970, s. 1309�1352

12. Dziennik Ustaw 05.81.716 � Rozporz¹dzenie Ministra Zdro-wia z dnia 22 kwietnia 2005 r. w sprawie szkodliwych czyn-ników biologicznych dla zdrowia w �rodowisku pracy orazochrony zdrowia pracowników zawodowo nara¿onych na teczynniki

13. Garczewska B., Patogeny grzybicze zaka¿eñ szpitalnych (w)Patogeny zaka¿eñ szpitalnych, red. D. Dzier¿anowska, "-me-dica press, Bielsko-Bia³a, 2007, s.140�143.

14. Garrison E. R., Holdar M. A.: Variation in cultures of G. can-didum isolated from cream. J. Dairy Sci. 44, 972 (1961)

15. Hamada H., Miura T., Kumobayashi H., Matsuda T., HaradaT., Nakamura K.: Asymmetric synthesis of (R)-2-chloro-1-(m-chlorophenyl)ethanol using acetone powder of Geotri-chum candidum. Biotechnol. Lett. 23, 1603�1606 (2001)

16. Heinic G.S., Greenspan D., MacPhail L.A., Greenspan J.S.:Oral Geotrichum candidum infection associated with HIVinfection. A case report. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol.73, 726�728 (1992)

17. Hrdy D.B., Nassar N.N., Rinaldi M.G.: Traumatic jointinfection due to Geotrichum candidum. Clin. Infect. Dis. 20,468�469 (1995)

18. Jagirdar J., Geller S.A., Bottone E.J.: Geotrichum candi-dum as a tissue invasive human pathogen. Hum. Pathol. 12,668�671 (1981)

19. Kasantikul V., Chamsuwan A.: Brain abscesses due to Geo-trichum candidum. Southeast Asian J. Trop. Med. PublicHealth, 26, 805�807 (1995)

20. Kassamali H., Anaissie E., Ro J., Rolston K., Kantarjian H.,Fainstein V., Bodey G.P.: Disseminated Geotrichum candi-dum infection. J. Clin. Microbiol. 25, 1782�1783 (1987)

21. Kreger-van Rij N.J.W.: Trichosporon Behrend (w) The Yeasts,a taxonomic study, red. N.J.W. Kreger-van Rij, Elsevier,Amsterdam, 1984, s. 933�962

22. Krzy�ciak P., Halska A., Macura A.B.: Wystêpowanie i cho-robotwórczo�æ grzybów Rhodotorula spp. Post. Mikrobiol.46, 291�300 (2007)

23. Kurnatowska A., Kwa�niewska J. (w) Zarys Mikologii Lekar-skiej, red. E. Baran, Volumed, Wroc³aw, 1998, s. 277�279

24. Kurtzman C.P., Robnett C.J.: Identification and phylo-geny of ascomycetous yeasts from analysis of nuclear largesubunit (26S) ribosomal DNA partial sequences. Antonie vanLeeuwenhoek, 73, 331�371 (1998)

25. Kwasna H., Bateman G.: A new species of Galactomyces andfirst reports of four fungi on wheat roots in the United King-dom. Sydowia, 60, 69�92 (2007)

26. Lapin V.V., Rodionova N.A., Zagustina N.A., KapanchanA.T., Dubovaya N.V., Bezborodov A.M.: The use of cellocan-din, an enzymatic preparation from Geotrichum candidum3C�106, for defibring waste paper and desiccation of cellulo-se suspension. Appl. Biochem. Microbiol. 38, 390�391 (2002)

27. Larpin S., Mondoloni C., Goerges S., Vernoux J.P., GuéguenM., Desmasures N.: Geotrichum candidum dominates inyeast population dynamics in Livarot, a French red-smearcheese. FEMS Yeast Res. 6, 1243�1253 (2006)

28. Lodder J., Kreger-van Rij N. J. W.: The yeasts, a taxonomicstudy. North-Holland, Amsterdam, 1967

29. Mancianti F., Nardoni S., Ceccherelli R.: Occurrence ofyeasts in psittacines droppings from captive birds in Italy.Mycopathologia, 153, 121�124 (2002)

30. Mehrabian S., Majd A., Majd I.: Antimicrobial effects ofthree plants (rubia tinctorum, carthamus tinctorius and juglansregia) on some airborne microorganisms. Aerobiologia, 16,455�458 (2000)

31. Mendieta-Taboada O., Kamimura E.S., Maugeri F.: Modellingand simulation of the adsorption of the lipase from Geotri-chum sp. on hydrophobic interaction columns. Biotechnol.Lett. 23, 781�786 (2001)

32. Mogensen G., Bianchi Salvadori B. i wsp.: Health benefitsand safety evaluation of certain food components. Bull.Intern. Dairy Fed. 377, 4�9 (2002)

33. Montagna M.T., Santacroce M.P., Spilotros G., Napoli C.,Minervini F., Papa A., Dragoni I.: Investigation of fungalcontamination in sheep and goat cheeses in southern Italy.Mycopathologia, 158, 245�249 (2004)

34. Nagahama T., Abdel-Wahab M.A., Nogi Y., Miyazaki M.,Uematsu K., Hamamoto M., Horikoshi K.: Dipodascustetrasporeus sp. nov., an ascosporogenous yeast isolated fromdeep-sea sediments in the Japan Trench. Int. J. Syst. Evol.Microbiol. 58, 1040�1046 (2008)

35. Neagoe G., Neagoe M.: Enterocolitis due to Geotrichumcandidum following treatment with glutamic acid. Dtsch.Z. Verdau. Stoffwechselkr. 27, 205�208 (1967)

36. Nenoff P., Oswald U., Haustein U.F.: In vitro susceptibilityof yeasts for fluconazole and itraconazole. Evaluation ofa microdilution test. Mycoses, 42, 629�639 (1999)

37. Nigam J. N.: Cultivation of Candida langeronii in sugar canebagasse hemicellulosic hydrolyzate for the production of singlecell protein. World J. Microbiol. Biotechnol. 16, 367�372 (2000)


38. O�Brien M., O�Kiely P., Forristal P.D., Fuller H.T.: Fungi iso-lated from contaminated baled grass silage on farms in theIrish Midlands. FEMS Microbiol. Lett. 247, 131�135 (2005)

39. Pahwa S., Roy N.: Cloning and characterization of Geotri-chum candidum histidinol dehydrogenase: a new antifungaltarget. Intern. J. Integrative Biol. 3, 1�8 (2008)

40. Parentin F., Liberali T., Perissutti P.: Polymicrobial kerato-mycosis in a three-year-old child. Ocul. Immunol. Inflamm.14, 129�131 (2006)

41. Piegza M., Stempniewicz R., Witkowska D.: Wp³yw meta-bolitów Geotrichum candidum na wzrost Fusarium. ¯ywno�æ.Nauka. Technologia. Jako�æ 3 Supl., 175�183 (2004)

42. Pimenta R.S., Alves P.D.D., Correa Jr A., Lachance M.A.,Prasad G.S. , Rajaram, B.R.R.P. Sinha, Rosa C.A.: Geotri-chum silvicola sp. nov., a novel asexual arthroconidial yeastspecies related to the genus Galactomyces. Int. J. Syst. Evol.Microbiol. 55, 497�501 (2005)

43. Popescu L., Verescu O., Criºan E., Vlãdescu A.: Secondaryactive-evolutive cavitary pulmonary tuberculosis of theapicodorsal segment of the left upper lobe associated withbronchial tuberculosis and bronchial geotrichosis. Pneumo-ftiziologia, 46, 127�130 (1997)

44. Pottier I., Gente S., Vernoux J. P., Guéguen M.: Safetyassessment of dairy microorganisms: Geotrichum candidum.Int. J. Food Microbiol. 126, 327�332 (2008)

45. Ramani R., Rao P.V., Kumari G.R., Shivananda P.G.: Pulmo-nary geotrichosis. Postgrad. Med. J. 68, 150�150 (1992)

46. Rodionova N.A., Dubovaia N.V., Martinovich L.I., Bez-borodov A.M.: Formation of an extracellular system ofenzymes during growth of Geotrichum candidum 3C on cellwalls isolated from cereal grain capsules. Prikl. Biokhim.Mikrobiol. 37, 562�565 (2001)

47. Ross J.D., Reid K.D., Speirs C.F.: Bronchopulmonary geotri-chosis with severe asthma. Br. Med. J. 1, 1400�1402 (1966)

48. Sfakianakis A., Krasagakis K., Stefanidou M., Maraki S.,Koutsopoulos A., Kofteridis D., Samonis G., Tosca A.:Invasive cutaneous infection with Geotrichum candidum:sequential treatment with amphotericin B and voriconazole.Med. Mycol. 45, 81�84 (2007)

49. Sheehy T.W., Honeycutt B.K., Spencer J.T.: Geotrichum sep-ticemia. JAMA, 235, 1035�1037 (1976)

50. Sláviková E., Vadkertiová R.: Seasonal occurrence of yeastsand yeast-like organisms in the river Danube. Antonie VanLeeuwenhoek, 72, 77�80 (1997)

51. Smith M.T., Poot G.A., de Cock A.W.A.M.: Re-examinationof some species of the genus Geotrichum Link: Fr. Antonievan Leeuwenhoek, 77, 71�81 (2000)

52. Suh S.O., Blackwell M.: Three new asexual arthroconidialyeasts, Geotrichum carabidarum sp. nov., Geotrichum histe-ridarum sp. nov., and Geotrichum cucujoidarum sp. nov., iso-lated from the gut of insects. Mycol. Res. 110, 220�228 (2006)

53. Teniola O.D., Odunfa S.A.: Microbial assessment and qualityevaluation of ogi during spoilage. World J. Microbiol. Bio-technol. 18, 731�737 (2002)

54. Tricerri R., Oppezzi M., Dodero M., Piersantelli N., Guida B.,Cassola G.: Esophageal ulcer caused by Geotrichum candi-dum in a case of AIDS. Pathologica, 82, 187�191 (1990)

55. Trinci A.J.P.: Culture turbidity as a mesure of mold growth.Trans. Brit. Mycol. Soc. 58, 467� 473 (1972)

56. Ueda-Nishimura K., Mikata K.: Two distinct 18S rRNAsecondary structures in dipodascus (Hemiascomycetes).Microbiology, Reading, 146, 1045�1051 (2000)

57. Vasdinyei R., Deák T.: Characterization of yeast isolatesoriginating from Hungarian dairy products using traditionaland molecular identification techniques. Int. J. Food Micro-biol. 86, 123�130 (2003)

58. Vasei M., Imanieh M.H.: Duodenal colonization by Geotri-chum candidum in a child with transient low serum levels ofIgA and IgM. APMIS, 107, 681�684 (1999)

59. Watanabe M., Hiratani T., Uchida K., Ohtsuka K., Watabe H.,Inouye S., Kondo S., Takeuchi T., Yamaguchi H.: The in vitroactivity of an antifungal antibiotic benanomicin A in com-parison with amphotericin B. J. Antimicrob. Chemother. 38,1073�1077 (1996)

60. Webster B. H.: Bronchopulmonary geotrichosis: a reviewwith report of four cases. Dis. Chest. 35, 273�281 (1959)

61. Weijman A.C.M.: Carbohydrate composition and taxonomyof Geotrichum, Trichosporon and allied genera. Antonie vanLeeuwenhoek, 45, 119�127 (1979)

62. Wuczkowski M., Bond C., Prillinger H.: Geotrichum vulgaresp. nov., a novel asexual arthroconidial yeast. Int. J. Syst.Evol. Microbiol. 56, 301�303 (2006)


1. Wstêp

Bioró¿norodno�æ bakteryjnych patogenów ro�linjest efektem ich zmienno�ci spowodowanej zarównowarunkami �rodowiskowymi, prowadz¹cymi do nie-dziedzicznych zmian fenotypu, jak i zmienno�ci¹w materiale genetycznym, przekazywan¹ na kolejnepokolenia. Zmiany genotypu mog¹ prowadziæ dozmian patogeniczno�ci bakterii np. zmniejszenia lubwzrostu ich wirulencji, w tym uzyskania zdolno�cipora¿ania odmian czy gatunków ro�lin uprawnych do-tychczas odpornych na chorobê, której dana bakteriajest sprawc¹. Stanowi to g³ówn¹ przeszkodê w wyho-dowaniu odmian odpornych. Zmienno�æ patogenówmo¿e byæ równie¿ przyczyn¹ powstawania oporno�cina �rodki ochrony ro�lin, zw³aszcza antybiotyki.

Ocena genetycznego zró¿nicowania patogenówjest wa¿na w badaniach epidemiologicznych, m.in.nad ich rozprzestrzenianiem siê, w hodowli odporno�-

ciowej ro�lin na choroby, ochronie ro�lin i kwarantan-nie, w tym selekcji grup patogenów do oceny efek-tywno�ci ró¿nych czynników biologicznej ochronyro�lin przed chorobami. Dane pochodz¹ce z badañ nadgenetycznym zró¿nicowaniem mog¹ byæ wykorzysty-wane do monitorowania wystêpowania szczepów pa-togenicznych, wykrywania i identyfikacji mo¿liwych�róde³ infekcji pierwotnej, mapowania genów bakteriii ro�lin, identyfikacji poszczególnych szczepów w ba-daniach nad genetyk¹ populacji i studiach filoge-netycznych czy fizjografi¹ chorób. Techniki u¿ywanew badaniach nad genetycznym zró¿nicowaniem maj¹daæ informacje pomocne w rozró¿nianiu szczepów, jaki o ich pokrewieñstwie.

Rozwój technik molekularnych pozwoli³ na ujaw-nienie zmienno�ci w materiale genetycznym bakteriipatogenicznych dla ro�lin i to zarówno w ich chro-mosomalnym, jak plazmidowym DNA. Prowadzo-ne s¹ intensywne prace w tym zakresie nad Erwinia

BIORÓ¯NORODNO�Æ BAKTERII ERWINIA AMYLOVORA� SPRAWCY ZARAZY OGNIOWEJ

Joanna Pu³awska1*, Krzysztof Kielak2*, Piotr Sobiczewski1

1 Instytut Sadownictwa i Kwiaciarstwa, ul. Pomologiczna 18, 96-100 Skierniewice2 Ministerstwo Rolnictwa i Rozwoju Wsi, Departament Hodowli i Ochrony Ro�lin, ul. Wspólna 30, 00-930 Warszawa


1. Wstêp. 2. Analiza cech fenotypowych. 2.1 Ro�liny-gospodarze i wirulencja E. amylovora. 2.2. Biochemiczne i fizjologiczne w³a�ci-wo�ci E. amylovora. 2.3. Analiza kwasów t³uszczowych i bia³ek. 2.4. Oporno�æ na streptomycynê. 3. Analiza kwasów nukleinowych.3.1. Analiza plazmidowego DNA. 3.2. Analiza chromosomalnego DNA. 3.2.1.Analiza sekwencji powtarzalnych � Rep-PCR.3.2.2. Rybotypowanie. 3.2.3. Analiza restrykcyjna � RFLP. 3.2.4. Losowo wzmocnione polimorficzne DNA � RAPD. 3.2.5. Polimor-fizm d³ugo�ci amplifikowanych fragmentów � AFLP. 3.2.6. Elektroforeza w zmiennym polu elektrycznym � PFGE. 4. Podsumowanie

Biodiversity of Erwinia amylovora � the causal agent of fire blight

Abstract: Strains of Erwinia amylovora, the causal agent of fire blight of Rosaceae plants, form very homogenous species, regardingboth biochemical and genotypic characters. However, they show diversity of virulence. The differences in phenotype and genotypeof this bacterium have been observed only between strains originating from Rubus and those from Maloidae plants. In regions wherestreptomycin was used to control fire blight, the presence of streptomycin resistant strains was found. However strains highly andmoderately resistant to streptomycin can be distinguished depending on their mechanism of resistance. Strains originating fromNorth America, where fire blight was described for the first time, are generally more genetically heterogeneous than those fromEurope. It was found that E. amylovora isolates can differ in plasmid content. Moreover, some of plasmids, like pEI70 discovered inSpain, can posses genes essential for pathogenicity and different than presently known ones � responsible for synthesis of siderophores,exopolysaccharides and proteins eg. harpin.

1. Introduction. 2. Analysis of phenotypic properties. 2.1. Host-plants and virulence of E. amylovora. 2.2. Biochemical and physio-logical properties of E. amylovora. 2.3. Analysis of fatty acids and protein patterns. 2.4. Resistance to streptomycin. 3. Nucleic acidbased methods. 3.1. Analysis of plasmid DNA. 3.2. Analysis of chromosomal DNA. 3.2.1. Analysis of repetitive extragenic palindromicelements. 3.2.2. Ribotyping. 3.2.3. Restriction Fragment Length Polymorphism � RFLP. 3.2.4. Random Amplified Polymorphic DNA� RAPD. 3.2.5. Amplified Fragment Lenght Polymorphism � AFLP. 3.2.6. Pulsed-Field Gel Electrophoresis � PFGE. 4. Summary

S³owa kluczowe: DNA chromosomalny, DNA plazmidowy, Erwinia amylovora, wirulencja, zró¿nicowanie genetyczne i fenotypoweKey words: chromosomal DNA, plasmid DNA, Erwinia amylovora, genotypic and phenotypic diversity, virulence

* Autor korespondencyjny: 1) Instytut Sadownictwa i Kwiaciarstwa, ul. Pomologiczna 18, 96-100 Skierniewice; e-mail: [email protected]; 2) Ministerstwo Rolnictwa i Rozwoju Wsi, Departament Hodowli i Ochrony Ro�lin, ul. Wspólna 30, 00-930 Warszawa

134 JOANNA PU£AWSKA, KRZYSZTOF KIELAK, PIOTR SOBICZEWSKI

amylovora, patogenem powoduj¹cym straty o znacze-niu gospodarczym w wielu rejonach uprawy jab³onii grusz oraz innych ro�lin.

2. Analiza cech fenotypowych

2.1. Ro�liny-gospodarze i wirulencja E. amylovora

Bakteria E. amylovora jest patogenem ponad130 gatunków ro�lin, zaliczanych do 40 rodzajów,g³ównie z rodziny Rosaceae [75]. W Polsce, poza gru-sz¹ (Pyrus), jab³oni¹ (Malus) i pigw¹ (Cydonia) cho-robê stwierdzono dotychczas na g³ogu (Crataegus),jarz¹bie (Sorbus), irdze (Cotoneaster), �wido�liwie(Amelanchier) oraz ogniku (Pyracantha). Generalnieuwa¿a siê, ¿e E. amylovora jest gatunkiem jednorod-nym i nie wykazuje specjalizacji patogenicznej co ozna-cza, ¿e potencjalnie ka¿dy z izolatów tego patogena jestw stanie zakaziæ ka¿d¹ z dotychczas poznanych ro�lin-gospodarzy [53]. Jednak De L e y i wsp. [13] na pod-stawie badañ z zastosowaniem sztucznej inokulacjiro�lin udowodnili, ¿e poszczególne izolaty mog¹ wy-kazywaæ pewne ró¿nice w zakresie pora¿anych ro�lin.Na uwagê zas³uguj¹ izolaty wyosobnione z ro�lin ro-dzaju Rubus, niezdolne do pora¿ania jab³oni i gruszy[1, 13, 17, 62, 71]. Jednocze�nie wiêkszo�æ izolatówpochodz¹cych z drzew ziarnkowych okaza³a siê nie-patogeniczna w stosunku do maliny i je¿yny [13, 62].Jedynie E v a n s [17] donosi³ o udanej inokulacji pê-dów malin izolatem E. amylovora z jab³oni. Ze wzglê-du na wymienione ró¿nice S t a r r i wsp. [71] postu-lowali utworzenie dla izolatów pora¿aj¹cych krzewyz rodzaju Rubus, odrêbnego taksonu � Erwinia amy-lovora f.sp. rubi.

Poszczególne izolaty E. amylovora mog¹ natomiastró¿niæ siê znacznie miêdzy sob¹ wirulencj¹ w stosunkudo tego samego genotypu ro�liny [7, 26, 59, 67]. O pa-togeniczno�ci tej bakterii decyduje g³ównie jej zdolno�ædo biosyntezy egzopolisacharydu (EPS) oraz bia³ek,zw³aszcza harpiny. EPS jest zwi¹zkiem kompleksowymi mo¿e zawieraæ amyloworan, lewan i glukan [22]. Sta-nowi on g³ówny sk³adnik wycieku bakteryjnego, towa-rzysz¹cego czêsto nekrozom i zgorzelom na pora¿o-nych ro�linach. Wokó³ komórki bakteryjnej EPS tworzyotoczkê chroni¹c¹ j¹ przed niekorzystnym wp³ywemotoczenia, a tak¿e przed rozpoznaniem patogena przezsystem obronny zaatakowanej ro�liny. Utrata tej otocz-ki wp³ywa tak¿e na aktywno�æ harpiny � bia³ka zbudo-wanego g³ównie z glicyny, które jest induktorem reak-cji nadwra¿liwo�ci, a ponadto, co jest najwa¿niejsze,dzia³a jako cz¹steczka sygna³owa indukuj¹ca zapro-gramowan¹ �mieræ komórki ro�liny-gospodarza [24].

Badane przez N o r e l l e g o i wsp. [56] szcze-py E. amylovora wykazywa³y ró¿ne zdolno�ci cho-

robotwórcze wobec kilku odmian jab³oni. Z koleiS c h w a r t z i wsp. [68] wykazali, ¿e tylko niektóreizolaty tej bakterii hamowa³y wzrost komórek gruszyw po¿ywce agarowej, co wi¹za³o siê z ich zdolno�ci¹do wytwarzania toksycznej dla ro�lin dihydrofenylo-alaniny (DPH). Poszczególne izolaty mog¹ siê rów-nie¿ ró¿niæ patogeniczno�ci¹ na zawi¹zkach owocówgruszy oraz zdolno�ci¹ indukowania reakcji nadwra¿-liwo�ci na tytoniu. Jakkolwiek dla wiêkszo�ci z nichotrzymuje siê na ogó³ pozytywny wynik obu testów,w niektórych przypadkach uzyskiwano wynik nega-tywny jednego lub obu z nich [13, 77].

2.2. Biochemiczne i fizjologiczne w³a�ciwo�ciE. amylovora

Izolaty E. amylovora stanowi¹ do�æ jednorodn¹grupê pod wzglêdem w³a�ciwo�ci biochemicznychi fizjologicznych [15, 27, 50, 58]. Pewne ró¿nice mog¹jednak wystêpowaæ miêdzy poszczególnymi izolata-mi w zdolno�ci wykorzystania niektórych wêglowo-danów jako �ród³a wêgla. Analiza numeryczna profilimetabolicznych ró¿nych izolatów E. amylovora wy-konana w oparciu o system BIOLOG, umo¿liwiaj¹cyokre�lenie zdolno�ci utylizacji 95 organicznych zwi¹z-ków wêgla, pozwoli³a na odró¿nienie, tworz¹cychjednorodn¹ grupê izolatów wyosobnionych z ro�linnale¿¹cych do podrodziny Pomoideae, od izolatówpochodz¹cych z ro�lin nale¿¹cych do rodzaju Rubus.W�ród tych ostatnich wyró¿niono dwie podgrupy:Rubus I i Rubus II [33]. Nasze badania nad opracowa-niem charakterystyki fenotypowej polskich izolatówE. amylovora z zastosowaniem zestawów API 50CH,API ZYM i API 20NE wykaza³y, ¿e na 87 badanychcech, niektóre z testowanych izolatów ró¿ni³y siê tylkow zdolno�ci utylizacji melibiozy, celobiozy, sorbitolu,D-glukozy i L-arabinozy [59].

2.3. Analiza kwasów t³uszczowych i bia³ek

Komórki wiêkszo�ci izolatów E. amylovora, nie-zale¿nie od ich pochodzenia geograficznego i ro�liny-gospodarza, maj¹ podobn¹ procentow¹ zawarto�ækwasów t³uszczowych, reprezentuj¹cych poszczególneklasy. Jedynie izolaty wyosobnione z ro�lin rodzajuRubus posiadaj¹ nieznacznie wiêcej kwasów cyklo-propanowych. Natomiast izolaty oporne na streptomy-cynê maj¹ mniej tych kwasów, a wiêcej kwasów nasy-conych, ni¿ izolaty wra¿liwe na ten antybiotyk [76].Zdaniem ¯ a r n o w s k i e g o i wsp. [85] ró¿nice ob-serwowane w profilach kwasów t³uszczowych po-szczególnych izolatów E. amylovora s¹ wystarczaj¹cedo ich rozró¿niania, a G a r r e t t i wsp. [21] stwier-dzili nawet pewn¹ korelacjê miêdzy uzyskiwanymiprofilami, a wirulencj¹ badanych izolatów. Szersze

135BIORÓ¯NORODNO�Æ BAKTERII ERWINIA AMYLOVORA � SPRAWCY ZARAZY OGNIOWEJ

zastosowanie analizy kwasów t³uszczowych w bada-niach epidemiologicznych i taksonomicznych wymagajednak bardzo �cis³ego przestrzegania procedur, gdy¿na uzyskiwane profile mo¿e mieæ wp³yw miêdzy inny-mi wiek kolonii bakteryjnych oraz sk³ad po¿ywki, najakiej zosta³y wyhodowane [8]. Natomiast profile, uzys-kane w wyniku rozdzia³u bia³ek bakteryjnych w ¿elupoliakrylamidowym, wskazuj¹ na du¿¹ jednorodno�æeuropejskich izolatów E. amylovora, wyosobnionychz ro�lin nale¿¹cych do podrodziny Pomoideae. W�ródobserwowanych sporadycznie ró¿nic w�ród izolatównie stwierdzono korelacji z ich wirulencj¹, pochodze-niem geograficznym i ro�lin¹ gospodarzem [13, 77].

2.4. Oporno�æ na streptomycynê

Streptomycyna, zaledwie 8 lat po jej odkryciuprzez S c h a t z a i wsp. [65] w 1944 roku, zosta³aw USA zarejestrowana jako �rodek ochrony ro�lin. Jejskuteczno�æ w zwalczaniu zarazy ogniowej potwier-dzono w szeregu badaniach na ró¿nych kontynentach.Równie¿ w Polsce, w latach 2002�2004, zarejestro-wany by³ �rodek przeciwko zarazie ogniowej �rodeko nazwie Hortocyna 18 SP, bazuj¹cy na siarczaniestreptomycyny [70]. Szczepy E. amylovora, oporne nastreptomycynê wykryto po raz pierwszy w USA.Pierwsze doniesienie na ten temat pochodzi z Kaliforniz roku 1971 [51], nied³ugo pó�niej pojawi³y siê podob-ne informacje ze stanów Oregon i Waszyngton [12],a w kolejnych latach z innych rejonów USA, w którychrównie¿ stosowano streptomycynê, jako �rodek prze-ciw zarazie ogniowej. Ostatnio szczepy E. amylovoraoporne na ten antybiotyk odkryto równie¿ poza Ame-ryk¹ Pó³nocn¹ m.in. w Egipcie [16], Nowej Zelandii[73], Izraelu [45], Libanie [64]. W�ród szczepów opor-nych wyró¿niono dwa g³ówne fenotypy � o wysokieji o �redniej oporno�ci [11, 12, 47]. Szczepy o niskimpoziomie oporno�ci wystêpuj¹ w naturze bardzo rzad-ko [69]. Oporno�æ na streptomycynê u bakterii mo¿emieæ dwojakie pod³o¿e: jako wynik punktowej mutacjiw genie rpsL koduj¹cym rybosomalne bia³ko S12 lubte¿ poprzez nabycie genów zwi¹zanych z oporno�ci¹zlokalizowanych na mobilnych elementach genetycz-nych, jak np. na plazmidach lub transpozonach. Stwier-dzono, ¿e u E. amylovora o wysokiej oporno�ci nastreptomycynê wystêpuje mutacja chromosomalnaw genie rpsL uniemo¿liwiaj¹ca przy³¹czenie siê anty-biotyku do rybosomu, a co za tym idzie inhibicji synte-zy bia³ek. Natomiast u szczepów �rednio opornych ce-cha ta jest czêsto zwi¹zana z nabyciem genów strA-strBzlokalizowanych na plazmidach lub transpozonachumo¿liwiaj¹cych syntezê enzymów modyfikuj¹cychaminoglikozydy, które tak zmieniaj¹ strukturê strepto-mycyny, ¿e nie mo¿e ona blokowaæ miejsca przy³¹-czania antykodonu w tRNA do rybosomu, czyli nie

mo¿e hamowaæ syntezy bia³ek [9]. Geny strA-strB zna-leziono na plazmidzie RSF1010 wystêpuj¹cym u ró¿-nych bakterii, znalezionym w klinicznych szczepachbakterii Gram-ujemnych. Dalsze badania wykaza³y, ¿egeny te równie¿ znaleziono na transpozonie Tn5393zlokalizowanym na koniugacyjnym plazmidzie pEA34wystêpuj¹cym u bakterii E. amylovora [10]. Do ro-ku 1994, oporno�æ na streptomycynê zwi¹zana z gena-mi strA-strB by³a obserwowana w�ród szczepów izo-lowanych tylko w stanie Michigan w USA. Pó�niejznaleziono szczepy E. amylovora zawieraj¹ce plazmidpEa8.7 z tymi genami w Kaliforni [57].

3. Analiza kwasów nukleinowych

3.1. Analiza plazmidowego DNA

Zastosowanie technik molekularnych w badaniachnad zmienno�ci¹ E. amylovora pozwoli³o m.in. nawykazanie ró¿nej wielko�ci charakterystycznego dlagatunku plazmidu pEA29, która waha siê od ok. 27,6do ok. 34,9 kpz [46]. Analiza restrykcyjna tego plaz-midu ujawni³a natomiast do�æ du¿¹ jednorodno�æ izo-latów pochodz¹cych z drzew owocowych, umo¿liwia-j¹c jednocze�nie ³atwe ich odró¿nienie od izolatówz malin oraz izolatów Erwinia pyrifoliae � gatunku,do którego zaklasyfikowano bakterie powoduj¹ceobjawy podobne do zarazy ogniowej na azjatyckichodmianach gruszy [34]. Bakterie te ró¿ni¹ siê od typo-wych szczepów m.in. patogeniczno�ci¹ i zakresemro�lin-gospodarzy. Pierwotnie istnia³a w�ród badaczyzgodno�æ, co do tego, ¿e plazmid pEA29 jest obecnywe wszystkich izolatach E. amylovora [4, 18]. Brak ge-nów odpowiedzialnych za transfer i mobilizacjê w ob-rêbie sekwencji tego plazmidu w powi¹zaniu z jegowysok¹ stabilno�ci¹ wywo³a³o przekonanie, ¿e powi-nien on wystêpowaæ u wszystkich dzikich szczepówE. amylovora. W zwi¹zku z tym pierwsze próby za-stosowania analizy DNA do identyfikacji i wykrywa-nia patogena by³y oparte na analizie DNA plazmidupEA29 [4, 38, 48]. Jednak z czasem zaczê³o pojawiaæsiê przypuszczenie, ¿e bakterie E. amylovora mog¹³atwo zgubiæ pEA29 nie trac¹c przy tym patogenicz-no�ci [3]. B r o w n i wsp. [6] nie otrzymali ¿adnegoproduktu z 5 izolatami wyosobnionymi z maliny, gru-szy i jab³oni po przeprowadzeniu amplifikacji ze star-terami komplementarnymi do tego plazmidu, co ichzdaniem, �wiadczy³o o jego braku. Co wiêcej, jedenz pozyskanych Gram-dodatnich, niezidentyfikowa-nych izolatów tak¿e reagowa³ z tymi starterami, como¿e �wiadczyæ o wcze�niejszym pozyskaniu pEA29od bakterii E. amylovora. Natomiast w Hiszpanii,L l o p i wsp. [39] wyizolowali z g³ogu izolat E. amylo-vora pozbawiony plazmidu pEA29. Stwierdzili tak¿e,


wystêpowanie u tego izolatu innego plazmidu o wiel-ko�ci oko³o 70 kpz (pEI70) nie wykazuj¹cego ho-mologii z pEA29. Na podstawie analizy sk³aduplazmidowego europejskich szczepów E. amylovorastwierdzono, ¿e plazmid pEI70 wystêpuje do�æ po-wszechnie u E. amylovora na naszym kontynencie.W niektórych rejonach, np. w Polsce stwierdzono gou ok. 10% spo�ród ponad 100 badanych szczepów,a w innych np. w Belgii plazmid ten znaleziono wewszystkich testowanych izolatach. Przypuszcza siê,¿e plazmid pEA29 mo¿e nie�æ geny istotne dla wiru-lencji E. amylovora [40].

Spo�ród starterów komplementarnych do plazmi-dowego DNA najpowszechniej stosowane s¹ starteryA i B, zaprojektowane przez B e r e s w i l l a i wsp.[4], pozwalaj¹ce na amplifikacjê odcinka o d³ugo�ci0,9 kpz powsta³ego po trawieniu plazmidu pEA29restryktaz¹ PstI lub te¿ inne startery w obszarze tegofragmentu DNA [38, 48]. Niektórzy badacze otrzy-mywali jednak z niektórymi z tych starterów produk-ty o innej d³ugo�ci [6, 33, 37]. Poddanie produk-tów amplifikacji analizie restrykcyjnej wykaza³o, ¿ew omawianym fragmencie pojawia siê insercja wiel-ko�ci od 30 do 90 pz [37]. Sekwencjonuj¹c amplifi-kowany fragment, S c h n a b e l i J o n e s [66] orazK i m i G e i d e r [35] opisali równolegle o�mionukle-otydow¹, powtarzaj¹c¹ siê sekwencjê (Short SequenceRepeats � SSR), która mo¿e wystêpowaæ u ró¿nychizolatów w liczbie od 4 do 15 kopii. Opisywana cechaoceniona jednak zosta³a jako niestabilna, na przyk³adw warunkach stresowych [31]. W zwi¹zku z tym ana-liza SSR nie jest polecana w badaniach epidemiolo-gicznych i diagnostycznych [31, 35, 66]. Odmienneobserwacje zosta³y odnotowane przez R u p p i t s c h ai wsp. [63]. Analizowali oni 104 austriackie szczepyE. amylovora pod k¹tem stabilno�ci liczby powtórzeñwcze�niej opisanych o�mionukleotydowych sekwencji,w warunkach laboratoryjnych po wielokrotnym pasa-¿owaniu oraz w warunkach stresowych. W zdecydo-wanej wiêkszo�ci badañ liczba powtórzeñ badanychSSR by³a niezmienna. W zale¿no�ci od rejonu Austriiizolowano szczepy o ró¿nej liczbie SSR i na podsta-wie wyników wyci¹gniêto wnioski, ¿e zaraza ognio-wa nie rozprzestrzeni³a siê z jednego �ród³a, lecz naprzestrzeni kilku lat od pierwszego pojawienia siê tejchoroby w 1993 roku, nast¹pi³o wielokrotne wprowa-dzenie �ród³a infekcji do tego kraju.

Intensywne badania nad genomem E. amylovorawykaza³y obecno�æ równie¿ innych plazmidów w ko-mórkach niektórych izolatów tego gatunku. F o s t e ri wsp. [19] okre�lili sekwencjê nukleotydow¹ orazdystrybucjê plazmidów pEU30 wielko�ci 30,314 kpzi pEL60 wielko�ci 60,145 kpz. Obecno�æ plazmidupEU30 stwierdzono u izolatów pochodz¹cych z za-chodniej czê�ci USA, natomiast pEL60 u izolatów

z Libanu. Sekwencje plazmidów i rodzaj genów w nichzlokalizowanych sugeruj¹, ¿e mniejszy z nich jest po-dobny do innych plazmidów izolowanych z bakteriizwi¹zanych z ro�linami, natomiast wiêkszy � do plaz-midów wystêpuj¹cych u ludzkich bakterii jelitowych.

3.2. Analiza chromosomalnego DNA

3.2.1. Analiza sekwencji powtarzalnych � Rep-PCRJedna z pierwszych prób zastosowania analizy ge-

nomowego DNA w badaniach zmienno�ci genetycznejE. amylovora opiera³a siê na amplifikacji obszarówpo³o¿onych miêdzy sekwencjami powtarzalnymi typuREP (ang. Repetitive Extragenic Palindromic sequen-ces), ERIC � (Enterobacterial Repetitive IntergenicConsensus) oraz sekwencjami repetetywnymi BOX[49]. Technika ta jest wykorzystywana obecnie zarów-no w diagnostyce bakteriologicznej, jak i badaniachepidemiologicznych [41, 42, 74, 78]. Zastosowaniemetody na bazie sekwencji powtarzalnych pozwoli³oM c M a n u s i J o n e s [49] na ³atwe odró¿nienieizolatów pochodz¹cych z malin i je¿yn od izolatówpochodz¹cych z ro�lin nale¿¹cych do podrodziny Po-moideae. Te ostatnie okaza³y siê ma³o zró¿nicowane.Amplifikacja DNA ponad 170 izolatów, pochodz¹cychg³ównie z kontynentu pó³nocnoamerykañskiego, po-zwoli³a na uzyskanie jedynie od 2 do 3 profili, w zale¿-no�ci od zastosowanych starterów (najwiêksze zró¿ni-cowanie uzyskano stosuj¹c startery komplementarnedo sekwencji typu ERIC). Warto przy tym zaznaczyæ,¿e niezale¿nie od zastosowanych starterów, zawszejeden z otrzymanych profili by³ dominuj¹cy. Dla wiêk-szo�ci izolatów pochodz¹cych z ro�lin nale¿¹cych dorodzaju Rubus otrzymano inne profile ni¿ dla izolatówpochodz¹cych z drzew owocowych. Wyj¹tek stanowi³1 izolat, dla którego otrzymano profile typowe dlaizolatów wyosobnionych z drzew owocowych. R i c oi wsp. [60] równie¿ stwierdzili ma³¹ u¿yteczno�æ tech-niki rep-PCR do okre�lenia zwi¹zków filogenetycz-nych miêdzy szczepami E. amylovora. Zró¿nicowanieuzyskanych produktów amplifikacji by³o niewielkie,lecz nieliczne obserwowane produkty polimorficznepozwoli³y na opracowanie starterów amplifikuj¹cychmarkerowe fragmenty DNA. Mog¹ one pos³u¿yæ jakonarzêdzie w badaniach epidemiologicznych � np. do�ledzenia dróg rozprzestrzeniania siê patogena z okre�-lonego ogniska choroby.

3.2.2. RybotypowanieM a c M a n u s i J o n e s [49] amplifikowali rów-

nie¿ obszar DNA le¿¹cy w operonie rnn, pomiêdzygenami koduj¹cymi 16S rRNA i 23S rRNA (rybotypo-wanie � ribotyping) [25]. Amplifikacja obszaru miêdzygenami 16S rDNA i 23S rDNA izolatów E. amylovorapozwoli³a na ³atwe wyró¿nienie tworz¹cych jednolit¹


grupê izolatów wyosobnionych z ro�lin nale¿¹cych dorodzaju Rubus. Równie¿ izolaty pochodz¹ce z drzewowocowych okaza³y siê ma³o zró¿nicowane � ampli-fikacja DNA oko³o 170 izolatów umo¿liwi³a uzyska-nie jedynie 3 ró¿nych profili [49]. Podobne wynikirybotypowania uzyskali J e n g i wsp. [28] � izolatywyosobnione z krzewów z rodzaju Rubus, oraz izolatypochodz¹ce z ro�lin podrodziny Pomoideae tworzy³ydwie jednorodne grupy. M o m o l i wsp. [55] za-stosowali modyfikacjê rybotypowania, polegaj¹c¹ nadodatkowym trawieniu otrzymanych produktów za po-moc¹ enzymów restrykcyjnych � ARDREA (AmplifiedRibosomal DNA Restriction Enzyme Analysis). Umo¿-liwi³o to jedynie odró¿nienie izolatów pochodz¹cychz malin i je¿yn od izolatów wyosobnionych z innychro�lin-gospodarzy. Natomiast G a r b e v a i wsp.[20], stosuj¹c tê sam¹ technikê, wykazali zró¿nicowa-nie równie¿ w�ród izolatów z drzew owocowych. Od-mienne profile uzyskali jednak dla tylko 2 izolatów,spo�ród 14 badanych.

3.2.3. Analiza restrykcyjna � RFLPK i m i wsp. [33] trawili genomowy DNA wybra-

nych izolatów E. amylovora wykorzystuj¹c w tym celuenzym EcoRI, a nastêpnie przeprowadzili hybrydyza-cjê otrzymanych produktów z sond¹, obejmuj¹c¹ gru-pê genów hrp. Dla wszystkich izolatów pochodz¹cychz drzew owocowych otrzymali jeden profil, podczasgdy dla izolatów wyosobnionych z krzewów nale¿¹-cych do rodzaju Rubus otrzymali dwa odmienne pro-file. Technikê RFLP (Restriction Fragment LenthPolymorphism) stosowali równie¿ W a l e r o n i wsp.[81], amplifikuj¹c gen recA koduj¹cy rekombinazê Adziewiêciu izolatów E. amylovora, wyosobnionychz drzew owocowych w ró¿nych rejonach �wiata. Pro-dukty amplifikacji poddano nastêpnie trawieniu cztere-ma enzymami restrykcyjnymi. Dla wszystkich izolatówotrzymano jednak jednakowe profile. Podobne wynikiuzyskano stosuj¹c analizê RFLP recA i dodatkowo2 innych genów: gyrA i rpoS. Tylko jeden z siedmiuenzymów restrykcyjnych zastosowanych do trawieniafragmentu genu recA pozwoli³ na odró¿nienie 5 odpozosta³ych 12 testowanych szczepów E. amylovora.Wszystkie pozosta³e wzory restrykcyjne by³y iden-tyczne dla E. amylovora, ale umo¿liwia³y odró¿nienietego gatunku od bakterii Erwinia wyizolowanych z po-dobnych do zarazy ogniowej symptomów na gruszachw Japonii [80].

3.2.4. Losowo wzmocnione polimorficzne DNA � RAPDDo badania zmienno�ci genetycznej E. amylovora

M o m o l i wsp. [54] zastosowali technikê RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA) [43, 82]. Pro-file, uzyskane w wyniku amplifikacji DNA 16 izola-tów E. amylovora pochodz¹cych z ró¿nych rejonów

geograficznych, z sze�cioma przypadkowymi startera-mi pozwoli³y na odró¿nienie ka¿dego z izolatów. Jed-nocze�nie izolaty wyosobnione z ro�lin z rodzajuRubus i drzew z podrodziny Pomoideae tworzy³y dwiegrupy, przy czym podobieñstwo miêdzy nimi, okre�-lone metod¹ UPGMA i wyra¿one za pomoc¹ wspó³-czynnika Nei-Li wynosi³o oko³o 0,7 [54]. Te samestartery zastosowali B r e n n a n i wsp. [5] do badaniaizolatów pochodz¹cych g³ównie z Irlandii. Wprawdziepodobieñstwo wiêkszo�ci uzyskanych profili wynosi³opowy¿ej 0,9 (wspó³czynnik Nei-Li, metoda UPGMA),to jednak niektóre z nich znacznie ró¿ni³y siê od po-zosta³ych. Technika RAPD wykaza³a tak¿e wysok¹jednorodno�æ izolatów E. amylovora, pochodz¹cychz innych rejonów geograficznych [32, 44, 72].

Technikê RAPD zastosowano równie¿ do badaniazró¿nicowania izolatów E. amylovora pochodz¹cychz Polski. Badaniami objêto 64 izolaty, spo�ród których50 izolowano w latach 1983�2002 z odmiennych ro�lingospodarzy (jab³oñ, grusza, pigwa, ognik, g³óg i irga)z ró¿nych rejonów kraju. Pozosta³e 12 izolatów po-chodzi³o z innych krajów europejskich, w tym 2 z Bli-skiego Wschodu. We wstêpnych badaniach DNAwzorcowego izolatu 691 amplifikowano w reakcjachz 87 ró¿nymi starterami RAPD (OPERON). Do dal-szych badañ wybrano 3 startery: U19, W20 i AR03,które w wyniku reakcji amplifikacji pozwala³y nauzyskanie najwiêkszej liczby produktów. Dodatkowowykorzystano 2 startery CUGEA 1 i CUGEA 5, którezosta³y wcze�niej opisane przez innych autorów jakoumo¿liwiaj¹ce ró¿nicowanie izolatów E. amylovora.Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono, ¿eró¿nicowanie izolatów E. amylovora umo¿liwi³y jedy-nie startery AR03, CUGEA 1 i CUGEA 5, podczasgdy profile uzyskane w reakcji ze starterami W20i U19 by³y jednakowe dla wszystkich izolatów. Prze-prowadzone badania potwierdzi³y wysok¹ jednorod-no�æ testowanych izolatów E. amylovora, choæ czê�æz nich wykazywa³a znaczne ró¿nice w wirulencjibadanej zarówno na li�ciach jab³oni, jak i na pêdachjab³oni, gruszy i g³ogu. Nie znaleziono równie¿ kore-lacji miêdzy zró¿nicowaniem genetycznym izolatówa ich pochodzeniem geograficznym lub ro�lin¹, z którejzosta³y wyosobnione. Brak zró¿nicowania badanychszczepów stwierdzono równie¿ na podstawie analizyrestrykcyjnej fragmentu genu amsB (bior¹cego udzia³w produkcji specyficznego dla E. amylovora polisa-charydu � amyloworanu) o d³ugo�ci oko³o 1600 pzz u¿yciem gêsto tn¹cych enzymów BsuRI i HpaII, [59].

3.2.5. Polimorfizm d³ugo�ci amplifikowanychfragmentów � AFLP

W prowadzonych we W³oszech badaniach epidemio-logicznych pos³u¿ono siê technik¹ AFLP (AmplifiedFragment Length Polymorphism) [79]. Zastosowanie


tej techniki pozwoli³o na stwierdzenie, ¿e wyst¹pieniezarazy ogniowej w prowincjach Modena i Ferrara,by³o spowodowane jednym szczepem E. amylovora[52]. Podobnie, analiza austriackich i wêgierskich izo-latów tej bakterii, wykonana w oparciu o technikêAFLP, nie wykaza³a miêdzy nimi ¿adnych ró¿nic [32].

W Hiszpanii podjêto próbê rozró¿nienia izolatówE. amylovora pochodz¹cych z ró¿nych krajów zarów-no technikami tzw. odcisku palca (fingerprinting) zestarterami komplementarnymi do sekwencji powtarzal-nych (tzw. Rep-PCR): ERIC, BOX, IS50 i starteremM13 oraz technik¹ AFLP. Spo�ród 23 testowanychizolatów 18 nie by³o rozró¿nialnych z zastosowaniemrep-PCR. Na ich rozró¿nienie pozwoli³o natomiast za-stosowanie AFLP z 6 kombinacjami starterów posia-daj¹cych po 1 nukleotydzie ró¿nicuj¹cym. Dla wszyst-kich, oprócz 2 szczepów, otrzymano unikalne kom-binacje profili AFLP [61]. Poszerzone badania nadcharakterystyk¹ zarówno fenotypow¹, jak i genotypo-w¹ 63 szczepów wyizolowanych w ró¿nych rejonachHiszpanii potwierdzi³y, ¿e spo�ród wszystkich techniknajwiêksze rozró¿nienie uzyskano przy zastosowaniuAFLP. Technika ta pozwoli³a na rozró¿nienie bakteriiw zale¿no�ci od ich pochodzenia geograficznego.Uzyskane wyniki wskazuj¹, ¿e nowe ogniska zarazyogniowej w Hiszpanii s¹ efektem wielokrotnego wpro-wadzenia zaka¿onego materia³u ro�linnego lub innych�róde³ inokulum z ró¿nych pañstw Europy [14].

3.2.6. Elektroforeza w zmiennympolu elektrycznym � PFGE

Obiecuj¹ce wyniki uzyskano stosuj¹c technikê PFGE[36] (Pulsed Field Gel Electrophoresis) [2, 29, 83, 84],Technika ta pozwoli³a na wyró¿nienie w�ród europej-skich izolatów E. amylovora 6 typów i przedstawieniehipotetycznych dróg rozprzestrzeniania siê choroby:z Wysp Brytyjskich do Europy �rodkowej; z WyspBrytyjskich do Francji i dalej, na Pó³wysep Iberyjskioraz do pó³nocnych W³och, z zachodniej Francji dopó³nocno-wschodniej Hiszpanii, z Egiptu, przez BliskiWschód do Azji Mniejszej i na Ba³kany [2, 29, 83, 84].

W przeciwieñstwie do szczepów europejskich, pro-file PFGE szczepów pochodz¹cych z Ameryki Pó³-nocnej by³y du¿o bardziej zró¿nicowane. Europejskieizolaty mo¿na zaklasyfikowaæ do 6 ró¿nych grupna podstawie profili restrykcyjnych, natomiast w�ródpó³nocnoamerykañskich izolatów tylko czê�æ mia³aprofil identyczny, jak izolaty E. amylovora pochodz¹-ce z pó³nocy Hiszpanii, zachodniej Francji i Anglii.Inna grupa by³a identyczna jak izolaty z EuropyCentralnej, a pozosta³e charakteryzowa³y siê profila-mi o du¿ym stopniu zró¿nicowania, niespotykanymiw Europie. Ta obserwacja doprowadzi³a do hipotezy,¿e zaraza ogniowa rozprzestrzeni³a siê po �wiecie�uciekaj¹c� z Ameryki P³n. tylko kilka razy [29].Na jeszcze wiêksze rozró¿nienie bakterii pozwoli³obadanie liczby SSR plazmidu pEA29. Liczba tych

Odró¿nienie izolatów z ro�lin rodzaju Rubus od izolatów z rodziny Pomoidae [49]

Rep-PCRNieliczne produkty polimorficzne pos³u¿y³y do opracowania starterówamplifikuj¹cych markerowe fragmenty DNA

[60]

18 z 23 izolatów z Hiszapnii nie by³o rozró¿nialnych [61]

RybotypowanieOdró¿nienie izolatów z ro�lin rodzaju Rubus od izolatów z rodziny Pomoidae [25, 28, 55]

Niewielkie zró¿nicowanie w�ród izolatów z drzew owocowych [20]

RFLP genomu + hybrydyzacjaOdró¿nienie izolatów z ro�lin rodzaju Rubus od izolatów z rodziny Pomoidae.

z sond¹ komplementarn¹Jednorodne izolaty z drzew owocowych, natomiast z Rubus � 2 grupy [33]

do genów hrp

Wyró¿nienie w�ród europejskich izolatów E. amylovora 6 typów

RFLP genomu + PFGEi przedstawienie hipotetycznych dróg rozprzestrzeniania siê choroby [2, 29, 83, 84]do ró¿nych krajów

Du¿e zró¿nicowanie w�ród izolatów z Ameryki Pó³nocnej [29]

RFLP recA, gyr, rpoS 5 izolatów spo�ród 12 zosta³o odró¿nionych tylko na podstawie genu recA [80]

RFLP amsB Brak zró¿nicowania w�ród 14 izolatów pochodz¹cych z Polski [59]

Rozró¿nienie wszystkich spo�ród16 badanych izolatów. Odró¿nienie izolatów

RAPDz ro�lin rodzaju Rubus od izolatów z rodziny Pomoidae.

[54]

Du¿a jednorodno�æ w�ród badanych izolatów[5, 32, 44,

59, 72]

Brak rozró¿nienia w�ród izolatów pochodz¹cych z Modeny i Ferrary (W³ochy) [52]

AFLP Brak ró¿nic w�ród izolatów pochodz¹cych z Wêgier [32]

Rozró¿nienie izolatów, zale¿nie od ich pochodzenia geograficznego w Hiszapnii [14, 61]

T a b e l a IZró¿nicowanie izolatów E. amylovora na podstawie analizy ich DNA chromosomalnego

Metoda Wynik Pi�miennictwo


powtórzeñ by³a du¿o bardziej zró¿nicowana ni¿ profi-le PFGE lecz z nimi nie korelowa³a. Równie¿ analizasekwencji genu hrpN koduj¹cego harpinê, jak i se-kwencji aminokwasowej tego bia³ka wydedukowanejna podstawie sekwencji nukleotydów, potwierdzi³awiêksz¹ ró¿norodno�æ szczepów amerykañskich ni¿europejskich, których sekwencje tego genu by³y pra-wie identyczne [30]. Badania przeprowadzone przezG i o r g i i S c o r t i c h i n i [23] z izolatami euro-pejskimi, jak i pochodz¹cymi spoza Europy, równie¿potwierdzi³y wiêksze zró¿nicowanie genu hrpN u bak-terii wyizolowanych w Ameryce Pó³nocnej, gdzie za-raza ogniowa by³a wykryta i opisana po raz pierwszyna �wiecie. Zarówno w przypadku analizy genu hrpN,jak i rejonu genów dspA/E koduj¹cych czynniki wiru-lencji, obserwowano znaczne ró¿nice w profilachRFLP oraz sekwencjach miêdzy szczepami izolowa-nymi z ro�lin rodzajów Amelanchier i Rubus, a bak-teriami pochodz¹cymi z ro�lin nale¿¹cych do rodzi-ny Maloidae [23].

4. Podsumowanie

Szczepy bakterii Erwinia amylovora, chocia¿ zró¿-nicowane pod wzglêdem wirulencji, nale¿¹ do jedne-go z bardziej homogennych pod wzglêdem bioche-micznym i genetycznym gatunków. Wyra�ne ró¿nicezaobserwowano jedynie miêdzy izolatami pochodz¹-cymi z malin i je¿yn, a izolatami wyosobnionymiz jab³oni i grusz oraz innych ro�lin-gospodarzy (Ta-bela I). W rejonach, gdzie stosowano �rodki na baziestreptomycyny przeciwko zarazie ogniowej, u czê�ciszczepów zaobserwowano pojawienie siê oporno�cina ten antybiotyk. Zale¿nie od rodzaju mechanizmuodpowiedzialnego za oporno�æ, bakterie podzielonona szczepy o wysokiej i �redniej oporno�ci. Badanianad zró¿nicowaniem genetycznym E. amylovora wy-kaza³y wiêksz¹ ró¿norodno�æ w�ród szczepów pocho-dz¹cych z Ameryki Pó³nocnej, gdzie zarazê ogniow¹opisano po raz pierwszy, ni¿ w�ród szczepów euro-pejskich. Najnowsze badania wykazuj¹, ¿e bakterieE. amylovora mog¹ siê ró¿niæ zawarto�ci¹ DNA plaz-midowego. Co wiêcej, niektóre plazmidy, jak odkrytyw Hiszpanii pEI70, mog¹ nie�æ ze sob¹ geny istotnedla patogeniczno�ci bakterii inne ni¿ dotychczaspoznane odpowiedzialne za syntezê: egzopolisachary-dów, sideroforów, bia³ek np. harpiny. Pomimo znacz-nego postêpu w badaniach funkcji poszczególnychgenów ich ca³o�ciowe znaczenie nie zosta³o dotych-czas rozpoznane. Wykorzystywane coraz powszech-niej nowoczesne techniki, np. Real-time PCR, po-winny dostarczyæ wiêcej informacji na temat genówE. amylovora zwi¹zanych z patogeniczno�ci¹ i wi-rulencj¹ bakterii.

Pi�miennictwo

1. Asselin J.E., Yip K.N., Beer S.V.: eop1 differs in strains ofErwinia amylovora that differ in host specificity. Acta Hort.793, 213�214 (2008)

2. Bazzi C., Merighi M., Lopez M.M., Zhang Y., Jock S.,Geider K.: Differentiation of Erwinia amylovora strains iso-lated in southern Europe by PFGE analysis. Acta Hort. 489,197�200 (1999)

3. Bereswill S., Bugert P., Bruchmüller I., Geider K.: Identifi-cation of fire blight pathogen, Erwinia amylovora, by PCRassays with chromosomal DNA. Appl. Environ. Microbiol.61, 2636�2642 (1995)

4. Bereswill S., Pahl A., Bellemann P., Zeller W., Geider K.:Sensitive and species-specific detection of Erwinia amylo-vora by polymerase chain reaction analysis. Appl. Environ.Microbiol. 58, 3522�3526 (1992)

5. Brennan J.M., Doohan F.M., Egan D., Scanlan H., Hayes D.:Characterisation and differentiation of Irish Erwinia amylo-vora isolates. J. Phytopathology, 150, 414�422 (2002)

6. Brown E.W., Janisiewicz W., Van der Zwet T.: Preliminaryphenotypic and genetic differentiation of the fire blight bac-terium, Erwinia amylovora. Acta Hort. 411, 199�203 (1996)

7. Cabrefiga J., Montesinos E.: Analysis of aggressiveness ofErwinia amylovora using disease-dose and time relation-ships. Phythopath. 95, 1430�1437 (2005)

8. Casano F.J.: Effect of growth medium and physiological ageon the fatty acid analysis of Erwinia amylovora. Acta Hort.217, 41�42 (1986)

9. Chiou Ch-S., Jones A.L.: The analysis of plasmid-mediatedstreptomycin resistance in Erwinia amylovora. Phytopath.81, 710�714 (1991)

10. Chiou C.S., Jones A.L: Nucleotide sequence analysis ofa transposon (Tn5393) carrying streptomycin resistancegenes in Erwinia amylovora and other gram-negative bac-teria. J. Bacteriol. 175, 732�740 (1993)

11. Chiou C-S, Jones A.L.: Molecular analysis of high-levelstreptomycin resistance in Erwinia amylovora. Phytopath. 85,324�328 (1995)

12. Coyier D.L., Covey RP.: Tolerance of Erwinia amylovorato streptomycin sulphate in Oregon and Washington. PlantDisease Report, 59, 849�852 (1975)

13. De Lay J., Vantomme R., Swings J., Kersters K., Rijckaert C.,Goor M., Mergaert J., Green J.: Research report on Erwiniaamylovora. Acta Hort. 151, 241�248 (1984)

14. Donat V., Biosca E.G., Peñalver J., López M.M.: Exploringdiversity among Spanish strains of Erwinia amylovora andpossible infection sources. J Appl Microbiol. 103, 1639�1649(2007)

15. Dye D.W.: A numerical taxonomic study of the genus Erwi-nia. New Zealand J. Agric. Res. 24, 223�229 (1981)

16. El-Goorani M.A., El-Kasheir H.M.A., Shoeib A.A., Has-sanein F.M.: Distribution of Streptomycin Resistant Strainsof Erwinia amylovora in Egypt during 1988. J. Phytopath.127, 69�74 (1989)

17. Evans I.R.: Fire blight of raspberries in Alberta. Acta Hort.411, 69�72 (1996)

18. Falkenstein H., Bellemann P., Walter S., Zeller W., Geider K.:Identification of Erwinia amylovora, the fireblight pathogen,by colony hybridisation with DNA from plasmid pEA29.Appl. Env. Microbiol. 54, 2798�2802 (1988)

19. Foster G.C., McGhee G.C., Jones A.L., Sundin G.W.: Nucleo-tide sequences, genetic organization, and distribution of pEU30and pEL60 from Erwinia amylovora. Appl. Environ. Micro-biol. 70, 7539�7544 (2004)


20. Garbeva P., Crepel C., Maes M.: Genomic variation withinthe Erwinia amylovora species. Med. Fac. Landbouww. Univ.Gent. 62/3b, 937�942 (1997)

21. Garrett C.M.E., Blake P.S., Fletcher D.A., Austin D.J.: Preli-minary discrimination of Erwinia amylovora strains by fattyacid profiling. Acta Hort. 217, 63�69 (1987)

22. Geider K.: Exopolysaccharides of Erwinia amylovora: struc-tures, biosynthesis, regulation, role in pathogenicity of amylo-voran and levan (w) Fire blight. The disease and its causativeagent, Erwinia amylovora red. Vanneste J.L. CABI Publ.,Wallingford, U.K., 2000, s. 141�162

23. Giorgi S., Scortichini M.: Molecular characterization ofErwinia amylovora strains from different host plants throughRFLP analysis and sequencing of hrpN and dspA/E genes.Plant Pathol. 54, 789�798 (2005)

24. Greenberg J.T.: Programmed cell death: a way of life forplants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 12094�12097 (1996)

25. Gürtler V., Stanisich V.A.: New approaches to typing andidentification of bacteria using the 16S-23S rDNA spacerregion. Microbiology, 142, 3�16 (1996)

26. Hevesi M., Papp J., Jámbor-Benczúr E., Kaszáné-Csizmár K.,Pozsgai I., Gazdag G., Balla I.: Testing the virulence of someHungarian Erwinia amylovora strains on in vitro culturedapple rootstocks. Int. J. Hort. Sci. 6, 52�55 (2000)

27. Holt J.G., Krieg N.R., Sneath P.H.A., Stanley J.T., WilliamsS.T.: Bergey�s Manual of Determinative Bacteriology. NinthEdition. Williams & Wilkins, Baltimore, Maryland, USA1994, s. 787

28. Jeng R.S., Belivera L., Hubbes M., Svircev A.M., Myers A.L.:The use of 16S and 16S-23S rRNA internal transcribedspacers to detect and differentiate Erwinia amylovora. ActaHort. 489, 49�54 (1999)

29. Jock S, Donat V, López MM, Bazzi C, Geider K.: Followingspread of fire blight in Western, Central and Southern Europeby molecular differentiation of Erwinia amylovora strainswith PFGE analysis. Environ. Microbiol. 4, 106�114 (2002)

30. Jock S, Geider K.: Molecular differentiation of Erwinia amy-lovora strains from North America and of two Asian pearpathogens by analyses of PFGE patterns and hrpN genes.Environ. Microbiol. 6(5), 480�490 (2004)

31. Jock S., Jacob T., Kim W.-S., Hildebrand M., Vosberg H.-P.,Geider K.: Instability of short-sequence DNA repeats of pearpathogenic Erwinia strains from Japan and Erwinia amylo-vora fruit tree and raspberry strains. Mol. Gen. Genomics,268, 739�749 (2003).

32. Keck M., Hevesi M., Ruppitsch W., Strõger A., Richrer S.:Spread of fire blight in Austria and Hungary � variabilityof Erwinia amylovora strains. Plant Prot. Sci. 38, SpecialIssue, 1, 49�55 (2002)

33. Kim J.H., Beer S.V., Zumoff C.H., Laby H.L., Gustafson H.L.,Aldwinckle H.S.: Characterization of Erwinia amylovorastrains from different hosts and geographical areas. Acta Hort.411, 183�185 (1996)

34. Kim, W.S., Rhim, S.L., Völksch, B., Gardan, L., Paulin, J.P.,Jock, S., Geider, K.: Characterization of a new Erwinia spe-cies affecting Asian pear trees. Acta Hort. 489, 201�205(1999)

35. Kim W.S., Geider K.: Analysis of variable short-sequenceDNA repeats on the 29kb plasmid of Erwinia amylovora.Europ. J. Plant Path. 103, 703�713 (1999)

36. Kur J.: Podstawy in¿ynierii genetycznej. Teoria, æwiczenia,testy. Wyd. Politechniki Gdañskiej, Gdañsk, 1994, s. 227

37. Lecomte P., Manceau Ch., Paulin J-P., Keck M.: Identificationby PCR analysis on plasmid pEA29 of isolates of Erwinia

amylovora responsible of an outbreak in Central Europe.Europ. J. Plant. Path. 103, 91�98 (1997)

38. Llop P., Bonaterra A., Peñalver J., López M.M.: Develop-ment of a highly sensitive nested-PCR procedure using singleclosed tube for detection of Erwinia amylovora in asympto-matic plant material. Appl. Env. Microbiol. 66, 2071�2078(2000)

39. Llop P., Donat V., Rodríguez M., Cabrefiga J., Ruz L., Palo-mo J.L., Montesinos E., López M.M.: An indigenous virulentstrain of Erwinia amylovora lacking the ubiquitous plasmidpEA29. Phytopath. 96, 900�907 (2006)

40. Llop P., González R., Pulawska J., Bultreys A., Dreo T.,López M.M.: The new plasmid pEI70 is present in Erwiniaamylovora European strains. Acta Hort. 793, 131�136 (2008)

41. Louws F.J., Rademaker J.L.W., Bruijn F.J.: The three Dsof PCR-based genomic analysis of phytobacteria: Diversity,Detection, and Disease Diagnosis. Ann. Rev. Phytopath. 37,81�125 (1999)

42. Lupski J.R., Weinstock G.M.: Short, interspersed repetitiveDNA sequences in prokaryotic genomes. J. Bacteriol. 174,4525�4529 (1992)

43. £ojkowska E.: Diagnostyka molekularna ro�lin (w) Biotech-nologia Ro�lin, red. S. Malepszy, Wyd. Naukowe PWN, War-szawa, 2001, s. 462�485

44. Manulis S., Kleitman F., Dror O., Davis I., Zutra D.: Cha-racterisation of Erwinia amylovora population in Israel.Phytoparasitica, 26, 39�46 (1998)

45. Manulis S., Zutra D., Ga�ash D., Kleitman F., Dror O.,Elisha S., David I., Rav-David D., Zilberstaine M., Herzog Z.,Shabi E.: Streptomycin resistance of Erwinia amylovorain Israel and occurrence of blossom blight in the autumn.Phytoparasitica, 24, 161 (1996)

46. McGhee G.C., Jones A.L.: Complete nucleotide sequence ofubiquitous plasmid pEA29 from Erwinia amylovora strainea88: gene organisation and interspecies variation. Appl.Environ. Microbiol. 66, 4897�4907 (2000)

47. McManus P.S., Jones A.L.: Epidemiology and genetic analy-sis of streptomycin resistant Erwinia amylovora from Michi-gan and evaluation of oxytetracycline for control Phytopath.84, 627�633 (1994)

48. McManus P.S., Jones A.L.: Detection of Erwinia amylovoraby nested PCR, PCR-dot-blot and reverse-blot hybridisation.Phytopath. 85, 618�623 (1995)

49. McManus P.S., Jones A.L.: Genetic fingerprinting of Erwi-nia amylovora strains isolated from tree-fruit crops andRubus spp. Phytopath. 85, 1547�1553 (1995)

50. Mergaret J., Verdonock L., Kersters K., Swings J., BoeufgrasJ-M., de Lay J.: Numerical taxonomy of Erwinia amylovoraspecies using API systems. J. Gen. Microbiol. 130, 1893�1910(1984)

51. Miller T.D., Schroth M.N.: Monitoring the epiphytic popula-tion of Erwinia amylovora on pear with selective medium.Phytopath. 62, 1175�1182 (1972)

52. Minardi T.F., Stefani P., Mazzucchi U.: Erwinia amylovoraisolates associated with 1997 fireblight epidemic in the PoValey derivated from the same clone (w) Book of Abstracts9th Congress Europ. Foundation for Plant Pathology, �Biodiver-sity in Plant Pathology�, Taromina, 18 September 2000, s. 37

53. Momol M.T., Aldwinckle H.S.: Genetic diversity and hostrange of Erwinia amylovora (w) Fire blight. The disease, andit�s casual agent Erwinia amylovora. CABI Publ. WallingfordUK, 2000, s. 55�72.

54. Momol M.T., Momol E.A., Lamboy W.F., Norelli J.L.,Beer S.V. Aldwinckle H.S.: Characterisation of Erwinia


amylovora strains using random amplified polymorphic DNAfragments (RAPDs). J. Appl. Microbiol. 82, 339�398 (1997)

55. Momol E.A., Momol M.T., Norelli J.L., Beer S.V., Burr T.J.,Aldwinckle H.S.: Relatedness of Erwinia amylovora strainsbased on amplified 16S-23S ribosomal DNA restrictionenzyme analysis-ARDREA. Acta Hort. 489, 55�59 (1999)

56. Norelli J.L., Aldwinckle H.S., Beer S.V.: Differential suscep-tibility of Malus spp. Robusta 5, Novole, and Ottawa 523 toinfection by Erwinia amylovora. Plant Dis. 70, 1017�1019(1986)

57. Palmer E. L., Teviotdale B. L., Jones A. L.: A relative ofthe broad-host-hange plasmid RSF1010 Detected in Erwi-nia amylovora. Appl. Environ. Microbiol. 63, 4604�4607(1997)

58. Paulin J.P.: Erwinia amylovora: general characteristic (w) Fireblight. The disease, and it�s casual agent Erwinia amylovora.CABI Publ. Wallingford UK, 2000, s. 87�115.

59. Pu³awska J., Kielak K., Sobiczewski P.: Study of phenotypicand genetic diversity of selected Polish Erwinia amylovorastrains. Acta Hort. 704, 439�444 (2006)

60. Rico A., Fuhrer M.E., Ortiz-Barredo A., Murillo J.: Poly-merase Chain Reaction Fingerprinting of Erwinia amylovorahas a Limited Phylogenetic Value but Allows the Design ofHighly Specific Molecular Markers. Phytopath. 98, 260�269(2008)

61. Rico A, Ortiz-Barredo A, Ritter E, Murillo J.: Genetic cha-racterization of Erwinia amylovora strains by amplified frag-ment length polymorphism. J. Appl. Microbiol. 96, 302�210(2004)

62. Ries S.M., Otterbacher A.G.: Occurence of fire blight onthornless blackberry in Illinois. Plant Dis. Rep. 61, 232�235(1977)

63. Ruppittsch W., Stoeger A., Keck M.: Stability of short se-quence repeats and their application for the characterizationof Erwinia amylovora strains. FEMS Microbiol. Lett. 234,1�8 (2004)

64. Saad A.T., Hana L., Choueiri E.: Evaluation of streptomycinand oxytetracycline resistance of Erwinia amylovora popu-lations in Lebanon. Phytopath. 90, S68 (2000)

65. Schatz A., Bugie E., Waksman S.A.: Streptomycin, a sub-stance exhibiting antibiotic activity against Gram-positive andGram-negative bacteria. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 55, 66�69(1944)

66. Schnabel E.L., Jones A.L.: Instability of pEA29 marker inErwinia amylovora previously used for strain classification.Plant Dis. 82, 1334�1336 (1998)

67. Sholberg P.L., Bedford K.E., Haag P., Randall P.: Survey ofErwinia amylovora isolates from British Columbia for resis-tance to bactericides and its virulence on apple. Can. J. Pl.Path. 23, 60�67 (2001)

68. Schwartz T., Brenhard F., Theiler R., Geider K.: Diversity ofthe fire blight pathogen in production of dihydrophenyla-lanine, a virulence factor of some Erwinia amylovora strains.Phytopath. 81, 873�878 (1991)

69. Schroth M.N., Thomson S.V., Moller W.J.: Streptomycin resis-tance in Erwinia amylovora. Phytopath. 69, 565�568 (1979)

70. Sobiczewski P., Berczynski S., Streptomycin for control offire blight (Erwinia amylovora) in Poland. Phytopath. Pol.20, 171�174 (2000)

71. Starr M.P., Cardona C., Folsom D.: Bacterial fire blight ofraspberry. Phytopath. 41, 915�919 (1951)

72. Taylor R.K., Hale C.N.: Identification and characterisation ofisolates of Erwinia amylovora from cotoneaster in Australia.Austr. Biotechnol. 6, 353�356 (1998)

73. Thomson S.V., Gouk S.C., Vanneste J.L., Hale C.N., ClarkR.G.: The presence of streptomycin resistant strains of Erwiniaamylovora in New Zealand. Acta Hort. 338, 223�230 (1993)

74. Ugorski M., Chmielewski R.: Powtórzone sekwencje DNAtypu REP i ERIC u bakterii � znaczenie diagnostyczne. Post.Hig. Med. Do�. 54, 3�15 (2000)

75. Van der Zwet T., Keil H.L.: Fire blight � a bacterial diseaseof rosaceous plants. Agric. Handbook 510, U.S. Dept. ofAgriculture, Washington D.C., 1979, s. 200.

76. Van der Zwet T., Wells J.M.: Application of fatty acid classanalyses for the detection and identification of Erwinia amylo-vora. Acta Hort. 338, 233 (1993)

77. Vantomme R., Swings J., Goor M., Kersters K., De Ley J.:Phytopathological, serological, biochemical and protein elec-trophoresis characterisation of Erwinia amylovora strainsisolated in Belgium. Phytopath. Z. 103, 349�360 (1982)

78. Versalovoc J., Koeuth T., Lupski J.R.: Distribution of re-petitive DNA sequences in eubacteria and application tofingerprinting of bacterial genomes. Nucleic Acids Res. 19,6923�6831 (1991)

79. Vos P., Hogers R., Bleeker M., Reijans M., van de Lee T.,Hornes M., Frijters A., Pot J., Peleman J., Kuiper M., ZabeauM.: AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. NucleicAcids Res. 23, 4407�4414 (1995)

80. Waleron M., Waleron K., Geider K., £ojkowska E.: Applica-tion of RFLP analysis of recA, gyrA and rpoS gene fragmentsfor rapid differentiation of Erwinia amylovora from Erwiniastrains isolated in Korea and Japan. Eur. J.Plant Pathol. 121,161�172 (2008)

81. Waleron M., Waleron K., Podhajska A.J., £ojkowska E.:Molecular comparision of pathogenic bacteria from pear treesin Japan and the fire blight pathogen Erwinia amylovora.Microbiology 147, 2951�2959 (2002)

82. Williams J.G.K., Kubelik A.R., Livak K.J., Rafalski J.A.,Tingey S.V.: DNA polymorphism amplified by arbitrary pri-mers are useful as genetic markers. Nucleic Acid Res. 18,6531�6535 (1990)

83. Zhang Y., Geider K.: Differentiation of Erwinia amylovorastrains by pulsed-field gel electrophoresis. Appl. Environ.Microb. 63, 4421�4426 (1997)

84. Zhang Y., Merighi M., Bazzi C., Geeider K.: Genomic ana-lysis by pulsed-field gel electophoersis of Erwinia amylovorastrains from the Mediterranean region including Italy. J. PlantPath. 80, 225�232 (1998)

85. ¯arnowski R., Lewicka T., Ellis R.J.: Evaluation of naturaldiversity among Erwinia amylovora isolates on the basis oftotal cellular protein and fatty acid patterns. Acta Hort. 590,185�192 (2002)


1. Ogólna charakterystyka rodziny Reoviridae

Wirusy nale¿¹ce do rodziny Reoviridae s¹ szerokorozpowszechnione w populacjach wielu gatunkówzwierz¹t oraz u cz³owieka. Nazwa tej rodziny pochodziod angielskiego okre�lenia wirusów wystêpuj¹cychw uk³adzie oddechowym i pokarmowym (Respiratory,Enteric, Orphan) zwanych równie¿ wirusami sierocy-mi, gdy¿ pocz¹tkowo nie przypisywano im mo¿liwo�ciwywo³ywania chorób. Po raz pierwszy izolowano reo-wirusy w 1951 roku z wymazu odbytniczego pocho-dz¹cego od zdrowego dziecka [8, 32, 37]. W roku 1954reowirusy wyizolowano od kurcz¹t wykazuj¹cych ob-jawy ze strony uk³adu oddechowego [25]. W nastêp-nych latach wykryto je u wielu gatunków ptaków. Naj-czê�ciej wystêpowa³y one u kur i indyków, izolowanoje równie¿ od gêsi, kaczek, perliczek, przepiórek i go-³êbi, a tak¿e od ptaków dzikich i egzotycznych [38].

Wirusy zaliczone do rodziny Reoviridae, s¹ wiru-sami RNA, nie posiadaj¹ otoczki lipidowej, charakte-ryzuj¹ siê sferycznym kapsydem zawieraj¹cym genomw postaci 10�12 segmentów ds. RNA. W sk³ad rodziny

wchodzi 12 rodzajów, które mo¿na podzieliæ na dwieg³ówne grupy: tworz¹ce �wie¿yczki� (np. ortoreowi-rusy, aquareowirusy, cypowirusy) oraz nie tworz¹ce�wie¿yczek� (np. rotawirusy, orbiwirusy, phytoreowi-rusy). Wie¿yczki s¹ to wypustki kapsydu tworzonewzd³u¿ dwunastu piêciobocznych osi wirusa. Wie¿ycz-ki zbudowane s¹ z pentamerów tworzonych przez wiru-sowy enzym 8C tworz¹cy �czapeczki� oraz bia³ko FCodpowiedzialne za wi¹zanie receptora komórki. Orto-reowirusy mo¿na dalej podzieliæ na piêæ podgrup:reowirusy ssaków (MRV), reowirusy ptasie (ARV),reowirusy pawianów (BRV), wirus Nelson Bay (zaka-¿aj¹cy nietoperze z rodzaju Pteropus) oraz grupa izo-lowana od gadów [14, 36, 37, 41].

2. Morfologia

Wiriony reowirusów zawieraj¹ kapsyd, rdzeñ i kom-pleks nukleoproteidowy. Podczas cyklu ¿yciowegow fazie zewn¹trzkomórkowej wiriony trac¹ wewn¹trz-komórkow¹ os³onkê pochodz¹c¹ z retikulum endoplaz-matycznego. Wiriony mog¹ byæ oddzielone w kulistych

REOWIRUSY � BUDOWA ORAZCHOROBOTWÓRCZO�Æ DLA LUDZI I ZWIERZ¥T

Jowita Samanta Niczyporuk*, El¿bieta Samorel-Salmonowicz, Hanna Czekaj

Zak³ad Chorób Wirusowych Drobiu, Pañstwowy Instytut Weterynaryjny� Pañstwowy Instytut Badawczy, Al. Partyzantów 57, 24-100 Pu³awy

Wp³ynê³o w lipcu 2009 r.

1. Ogólna charakterystyka rodziny Reoviridae. 2. Morfologia. 2.1. Wirion. 2.2. Genom. 2.3. Bia³ka wirusowe (bia³ka strukturalne,bia³ka niestrukturalne). 3. W³a�ciwo�ci onkolityczne reowirusów. 4. Wystêpowanie zaka¿eñ u ludzi. 5. Zaka¿enia u trzody chlewnej.6. Reowirusy u drobiu. 7. Diagnostyka zaka¿eñ. 8. Immunoprofilaktyka. 9. Podsumowanie

Reoviruses � structure and pathogenicity for human and animals

Abstract: Avian reoviruses have icosahedral symmetry and a capsid with a diameter of 75�80 nm enclosing segmented double� stranded RNA and are non-enveloped. The members of the Orthoreovirus genus have been classified into mammalian and avianorigen groups. Both groups have a genome consisting of 10�12 segments encoding eight structural proteins and four non-structuralproteins separated into three size classes: large (8), medium (µ), and small (F). Avian reoviruses have failed to replicate in most ofthe mammalian cell lines tested.

Four of Reoviridae genera � Orthoreovirus, Coltivirus, Rotavirus, and Orbivirus are cause of human dieseases, in most casessymptomless. Human rotaviruses cause inflammation, mainly of the upper gastrointestinal tract, which affects usually children of 6to 24 months of age. Reoviruses carried by thick D. andersoni are frequently responsible for Colorado thick fever in USA.

Reoviruses of types 1 and 3, rotaviruses, and orbiviruses can infect porcine by respiratory or oral route. Most of the infectionsare symptomless or manifested by fever and diarrhea.

Avian reoviruses have been isolated from chickens without any clinical signs of disease, but also are associated with poultrydisease conditions such as tenosynovitis, gastrointestinal malabsorption syndrome, growth retardation, and sudden death. Theyinfect wild and farm-raised birds. Vaccination is most important to control reoviruses.

1. General characteristic of Reoviridae family. 2. Morphology. 2.1. Virion. 2.2. Genome. 2.3. Reowirus proteins (structural and non-structural proteins). 3. Oncolytic proteins. 4. Infections in humans. 5. Porcine infections. 6. Reoviruses in poultry. 7. Diagnostics ofreovirus infection. 8. Immunoprophylaxis. 9. Summary

S³owa kluczowe: budowa, chorobotwórczo�æ, ReowirusyKey words: pathogenicity, Reoviruses, structure

* Autor korespondencyjny: Adres autora: Al. Partyzantów 57, 24-100 Pu³awy; e-mail: [email protected]

144 JOWITA SAMANTA NICZYPORUK, EL¯BIETA SAMOREL-SALMONOWICZ, HANNA CZEKAJ

cia³ach wtrêtowych i najczê�ciej zawieraj¹ pojedynczynukleokapsyd. Wirus inicjuj¹cy zaka¿enie jest otoczo-ny przez krystaliczn¹ macierz bia³kow¹ o wielo�cien-nym kszta³cie, zawieraj¹c¹ najczê�ciej po kilka wirio-nów [3, 32, 41].

2.1. Wirion

Bezotoczkowy wirion ortoreowirusów ma �rednicêoko³o 850 Å, posiada podwójny kapsyd zbudowanyz dwóch koncentrycznych warstw bia³kowych os³ania-j¹cych genom. Na powierzchni wirionu wystêpuje600 wypustek u³o¿onych heksametrycznie wokó³ piê-cio�ciennych wierzcho³ków. W ten sposób pentame-tryczne wie¿yczki rdzenia uczestnicz¹ w tworzeniuzewnêtrznej powierzchni. Wirion pozbawiony zew-nêtrznej os³ony tworzy czàsteczki infekcyjne (ISVP� Infections SubViral Particle) o �rednicy 800 Å. Pousuniêciu zewnêtrznego kapsydu zostaje rdzeñ o guz-kowatej powierzchni wyró¿niaj¹cy siê wie¿yczkamiwystaj¹cymi z 12 piêciobocznych wierzcho³ków. Rdzeñsk³adaj¹cy siê z piêciu bia³ek i 10 fragmentów genomujest w stanie przeprowadzaæ transkrypcjê i produkowaæwirusowe mRNA w trakcie replikacji.

Zewnêtrzny kapsyd tworzony jest przez bia³ko FB.Jest to bia³ko o masie 41 kDa tworz¹ce wypustki po-�rednicz¹ce w kontakcie z zaka¿on¹ komórk¹. Poni¿ejzewnêtrznego kapsydu znajduje siê 200 trimerów bia³-ka µB o masie 76 kDa, oraz 12 trimerów bia³ka FC(49 kDa), odpowiadaj¹cego za wi¹zanie z receptoramikomórki gospodarza. W zewnêtrznej warstwie wyró¿-niæ mo¿na tak¿e trzy rodzaje kana³ów P1, P2 oraz P3.Kiedy rdzeñ jest pozbawiony zewnêtrznych os³on bia³-ko FC nie blokuje kana³ów P1. 60 kana³ów P2 jestutworzonych przez 4 jednostki FB, a 6 takich jednostekbia³ka tworzy 60 kana³ów P3. Mimo, ¿e bia³ka FBwystêpuj¹ w kana³ach jako osobne jednostki to przy-puszcza siê, ¿e jest mo¿liwe tworzenie pomiêdzy nimipo³¹czeñ. Wiêkszo�æ po³¹czeñ kapsydu utworzona jestprzez trimery bia³ka µB, z którymi ³¹cz¹ siê FBtworz¹c heteroheksameryczne struktury. Kana³y P1,P2 oraz P3 s³u¿¹ do transportu substratów oraz wydo-stawania siê nowych nici mRNA [3, 13, 32].

Podwójny bia³kowy kapsyd zapewnia reowirusomoporno�æ na dzia³anie czynników �rodowiskowych,rozpuszczalników t³uszczowych, kwa�nego pH i wielu�rodków odka¿aj¹cych [31].

Rdzeñ zbudowany jest z os³ony tworzonej przez120 kopii bia³ka 8A o masie 142 kDa, a tak¿e z 150monomerów bia³ka FA (47 kDa) oraz 12 pentamerów8C (144 kDa) bia³ka tworz¹cego wypustki. Pozosta³ebia³ka b³onowe, 8B � zale¿na od RNA polimeraza RNAoraz przypuszczalnie µA s¹ umieszczone wewn¹trzrdzenia pod wie¿yczkami 8C. Pentamery bia³ka 8Cwystaj¹ promieni�cie ponad powierzchni¹ kapsydu na

odleg³o�æ oko³o 80 Å wzd³u¿ jego osi symetrii. Poje-dyncze kopie bia³ka 8B (142 kDa) mieszcz¹ siê podpentametrami 8C, jednak nie s¹ u³o¿one w osi wie-¿yczki [3, 30, 36, 48, 44, 41]

2.2. Genom

Reowirusy posiadaj¹ segmentowany genom, którysk³ada siê z 10�12 odcinków dsRNA, stanowi on15�20% masy wirionu. Fragmenty te s¹ rozró¿nianena podstawie wielko�ci. Podzielono je na 3 segmentydu¿e (L1, L2, L3), 3 segmenty �rednie (M1, M2, M3)oraz 4 segmenty ma³e (S1, S2, S3, S4). Ka¿dy genomzawiera po jednej kopii ka¿dego z segmentów, a ka¿dyz nich ³¹czy siê z osobn¹ polimeraz¹ RNA zale¿n¹od RNA (bia³ko 8B). Sekwencjonowanie segmentówdsRNA wykaza³o, ¿e wszystkie zawieraj¹ po jednejotwartej ramce odczytu (ORF) z wyj¹tkiem segmentuS1, który ma ich trzy. Dodatnia niæ jest identycznaz kodowanym mRNA, i zawiera czapeczkê typu-1(type-1 cap, 5�-m7GpppAmG-), natomiast niæ ujemnama w analogicznym miejscu grupê pirofosfatow¹.U wszystkich ptasich reowirusów niæ dodatnia RNAzawiera na swym koñcu 5� sekwencjê GCUUUU na-tomiast na koñcu 3� sekwencjê UCAUC oraz brakogona poli-A. Sekwencje te prawdopodobnie zwi¹zanes¹ z procesami transkrypcji, replikacji lub kapsydacjigenomu. Tak jak w przypadku innych wirusów z ro-dziny Reoviridae w przypadku zaka¿enia komórki jed-nocze�nie przez dwa odmienne szczepy wirusa mo¿edochodziæ do powstania nowego szczepu zawieraj¹-cego segmenty losowo pochodz¹ce od obu zaka¿aj¹-cych szczepów [3, 22, 36, 41].

2.3. Bia³ka wirusowe

W trakcie ekspresji genomu reowirusów ptasich po-wstaje 12 g³ównych produktów bia³kowych, z których8 to bia³ka strukturalne, tworz¹ce w pó�niejszych eta-pach wiriony potomne, natomiast pozosta³e 4 bia³kas¹ niestrukturalne. Nazwy bia³ek reowirusów tworzo-ne s¹ przez po³¹czenie greckiej litery oznaczaj¹cejz której klasy segmentów genomu pochodzi dany trans-krypt (L-8, M-µ, S-F) oraz arabskiej litery oznaczaj¹cejmiejsce w czasie elektroforezy w odwrotnej kolejno�cido mobilno�ci segmentów (8A, 8B itd.), w odró¿nie-niu do reowirusów ssaków gdzie oznaczenia tworzysiê analogicznie przez po³¹czenie litery greckiej z cyf-r¹. Bia³ka strukturalne tworz¹ce kapsyd (8A, 8B, 8C,µA, µB, FA, FB, FC) powstaj¹ bezpo�rednio w czasietranslacji. Bia³ko µB mo¿e ulegaæ ciêciu potranslacyj-nemu i tworzyæ dwa kolejne bia³ka: µBN oraz µBC[3, 22, 30, 36]. Reowirusy tworz¹ tak¿e kilka bia³ekniestrukturalnych (µNS, µNSN, µNSC, p10, p17, FNS).Bia³ka µNS oraz FNS kodowane s¹ przez segmenty

145REOWIRUSY � BUDOWA ORAZ CHOROBOTWÓRCZO�Æ DLA LUDZI I ZWIERZ¥T

odpowiednio M3 oraz S4. Komórki ptaków po zaka¿e-niu reowirusami produkuj¹ tak¿e bia³ko µNSC, którejest modyfikowanym bia³kiem µNS. Bia³ko to powstajeprzez hydrolityczny rozk³ad µNS, a nie przez trans-krypcjê zaczynaj¹c¹ siê od wewnêtrznego kodonu AUGw segmencie M3. Bia³ka p10 i p17 bêd¹ce kolejnymibia³kami niestrukturalnymi s¹ kodowane przez dwapierwsze cistrony segmentu S1. Wykazano bliskie po-wi¹zania pomiêdzy rozmiarami wirusowych genówi rozmiarami kodowanych przez nie protein, za wyj¹t-kiem segmentu S1. Gen ten jest najwiêkszym genemz klasy S koduj¹cym najmniejsz¹ strukturaln¹ proteinêFC. Sekwencja tego genu posiada unikalny uk³ad cistro-nów zawieraj¹cy trzy przesuniête w fazie ORF, a FCjest kodowane przez cistron najbli¿szy koñcowi 3�.Zastosowanie specyficznych przeciwcia³ dla ka¿dejz protein kodowanych przez te cistrony dowiod³o, ¿egen S1 ptasich reowirusów koduje dwie niestruktu-ralne proteiny p10 i p17 oraz strukturaln¹ proteinê FCw zaka¿onych komórkach, a to �wiadczy, ¿e S1 funk-cjonalnie jest genem tricistronowym [12, 22, 36].

B i a ³ k a s t r u k t u r a l n e. Bia³ko 8A, kodowanejest przez gen L1, formuje wewnêtrzny rdzeñ os³onkizamykaj¹cej segmenty wirusowego genomu i wiruso-w¹ polimerazê RNA oraz jest podstaw¹ do pó�niej-szego budowania rdzenia wirusa. Proteina 8A bardzoszybko ³¹czy siê z centrami produkuj¹cymi wirionyw zaka¿onych komórkach. Jest rozproszona w cyto-plazmie gdy¿ tylko ona jest produkowana w komórce.W przypadku wspólnej ekspresji 8A z bia³kiem µNS³¹czy siê w postaci globularnych wtrêtów, co sugerujeaktywno�æ µNS we wprowadzaniu 8A do centrówprodukcji wirionów [30].

Kodowane przez segment L2 bia³ko 8B jest mniejlicznym sk³adnikiem wirusowego rdzenia. Jest jedyn¹reowirusow¹ protein¹, której sekwencja nie jest dodzisiaj poznana. Mimo ¿e nie ma eksperymentalnychdowodów na aktywno�æ polimerazy RNA u którego�z reowirusowych polipeptydów, wydaje siê, ¿e takasytuacja zachodzi w przypadku 8B, poniewa¿ jegowielko�æ i liczba kopii jest podobna do analogicznychpolimeraz RNA u reowirusów ssaczych [30].

Gen L3 koduje bia³ko 8C bêd¹ce wirusowym en-zymem modyfikuj¹cym mRNA przez dodatnie tzw.�czapeczki�. Bia³ko to jest wiêc jedyn¹ strukturaln¹protein¹ wirusa, która ³¹czy siê z GMP przez wi¹zaniefosfoamidowe i mo¿e przenosiæ je na akceptory GDPlub GTP tworz¹c czapeczki czyli metyloguanozydowezakoñczenia ochronne mRNA na ich koñcu 5� [3].Zdolno�æ t¹ posiada 42 aminokwasowa domena nakoñcu N bia³ka. Wydaje siê tak¿e, ¿e pozosta³y 100 ami-nokwasowy fragment jest ca³kowicie zbêdny dla tejaktywno�ci. Jednak¿e badania porównawcze sekwencji8C i jego odpowiedników u reowirusów ssaków i ryb

wykaza³y, ¿e fragment 100-aa bia³ka 8C prawdopo-dobnie posiada aktywno�æ metylazy tak jak jego od-powiedniki u innych rodzajów reowirusów [29, 30].

Bia³ko µA kodowane przez fragment M1 jest jed-nym z bia³ek tworz¹cych wewnêtrzny kapsyd. Nie prze-prowadzono jednak jak dot¹d szczegó³owych badañfunkcji i aktywno�ci tego polipeptydu. U reowirusówssaków, bia³ko µ2 wchodzi w interakcje z mikrotubula-mi oraz z bia³kiem µNS. Aktywno�ci te maj¹ prawdo-podobnie zwi¹zek z ³¹czeniem wirusowych �fabryk� domikrotubuli, st¹d wiêkszo�æ reowirusów ssaków two-rzy centra produkuj¹ce wiriony w uk³adzie liniowym.Reowirusy ptasie natomiast w uk³adzie globularnym nies¹ zwi¹zane z mikrotubulami, co sugeruje, ¿e µA niewykazuje aktywno�ci wi¹zania mikrotubuli [6, 30, 49].

Bia³ko µB (segment M2) jest modyfikowane nakoñcu N przez dodanie grupy mirystylowej. Wiêkszo�æprodukowanych w zaka¿onej komórce polipeptydówµB ulega rozpadowi w pobli¿u koñca N tworz¹c ma³ymirystylowany polipeptyd µBN oraz du¿y fragmentµBC. Wszystkie trzy bia³ka (prekursor i produkty) s¹sk³adnikami zewnêtrznego kapsydu. W procesie roz-padu µB na dwa produkty prawdopodobnie uczestni-czy dodatkowo inne bia³ko wirusowe na co wskazujefakt, ¿e bia³ko µB jest rozk³adane w komórce tylkow obecno�ci pozosta³ych bia³ek wirusa. Mimo, ¿e niezidentyfikowano jak dot¹d, które bia³ko uczestniczyw tym procesie, najprawdopodobniej jest to FB, two-rz¹ce kompleks z µB i µBC w cytoplazmie gospo-darza. Ponadto µBC uczestniczy we wprowadzeniuwirionu do wnêtrza komórki, ulega ono dwukrotniehydrolizie blisko koñca C tworz¹c dwa polipeptydy *i *�. Modyfikacja ta umo¿liwia prze³amanie przezwinion bariery lizosomu i wnikniêcie do cytoplazmykomórki [30, 47, 49].

Wewnêtrzna os³ona rdzenia jest tworzona przezbia³ko FA, kodowane przez gen S2. Wykazuje onoaktywno�æ wi¹zania dsRNA niezale¿nie od sekwencji,natomiast z du¿ym powinowactwem. FA ma zdolno�ærozk³adania trójfosfonukleotydów do mono- i difosfo-nukleotydów i reszty fosforanowej. Dziêki zdolno�cido hamowania aktywacji zale¿nej od dsRNA kinazybia³kowej PKR, FA jest w stanie ograniczaæ skuteczno�æinterferonu, a wiêc mo¿e graæ g³ówn¹ rolê w ochroniereowirusów przed jego dzia³aniem. Ponadto FA wspo-maga morfogenezê reowirusów przez stabilizacjê os³o-ny rdzenia budowanej przez 8A [1, 17, 20, 50].

Kodowane przez S3 bia³ko FB jest g³ównym sk³ad-nikiem zewnêtrznego kapsydu. Bardzo szybko ulegaspontanicznej asocjacji z µB i µBC w cytozolu zaka-¿onych komórek tworz¹c heterooligomeryczny kom-pleks zawieraj¹cy równe ilo�ci poszczególnych bia³ek,który w³¹czany jest do budowanego kapsydu [30, 50].

Bia³ko FC, kodowane przez cistron segmentu S1bliski koñcowi 3�, jest odpowiedzialne za przy³¹czanie


do zaka¿anej komórki. Jest to jedyne bia³ko reowiru-sów zdolne do wi¹zania siê do b³ony komórek [16].W stanie natywnym wystêpuje ono jako homotrimeri w takiej postaci wykazuje zdolno�æ do przy³¹czaniado struktur b³ony komórkowej. Koniec C bia³ka FCzawiera globularn¹ domenê wi¹¿¹c¹ receptor komór-kowy. Fragment ten jest bardzo podobny do swegoodpowiednika u reowirusów ssaków z dodatkowymidwoma powtórzeniami potrójnej spirali. Wykazanotak¿e, ¿e FC mo¿e indukowaæ apoptozê zaka¿onychkomórek jednak mechanizm tego procesu nie zosta³w pe³ni zbadany [5, 12, 21, 26, 27, 30, 50].

B i a ³ k a n i e s t r u k t u r a l n e. Na matrycy reo-wirusowego genu M3 powstaje 70 kDa niestrukturalnebia³ko µNS. Bia³ko to jest ciête przez komórkow¹ pro-teazê na dwa potomne polipeptydy µNSN i µNSC, jed-nak funkcja tej hydrolizy nie zosta³a poznana. Spo�ródwszystkich wirusowych bia³ek tylko µNS jest zdolnedo samodzielnego tworzenia cia³ inkluzyjnych, co ozna-cza prawdopodobnie, ¿e jest ono niezbêdne we wczes-nych etapach morfogenezy wirusa. Bia³ko to wspoma-ga w³¹czanie do cia³ inkluzyjnych bia³ek FNS oraz 8A[1, 30, 33, 49].

Pierwszy cistron fragmentu S1 koduje niestruktural-ne bia³ko p10, bêd¹ce bia³kiem transb³onowym typu 1,którego �rodkowa domena transmembranowa oddzie-la zewnêtrzn¹ i wewnêtrzn¹ domenê. Ekspresja p10w transfekowanych komórkach wykaza³a, ¿e bia³koto wp³ywa na fuzjê komórkow¹, wywo³ywan¹ przezreowirusy ptasie. Domena wewnêtrzna jest po³¹czonaz transmembranowym motywem dwucysteinowym,który jest palmitylowany, co jest niezbêdne do aktyw-no�ci fuzyjnej. Dla tej zdolno�ci bia³ka p10 istotna te¿jest hydrofobowa domena koñca N oraz motyw trój-glicynowy w domenie transmembranowej. Bia³ko p10ma w³a�ciwo�ci permeazy b³on bakteryjnych i euka-riotycznych [5, 12, 27, 30, 40, 50].

Druga otwarta ramka odczytu segmentu S1 kodujebia³ko p17, które nie wykazuje homologii z ¿adnyminnym bia³kiem wirusowym lub komórkowym. Bia³koto gromadzi siê w j¹drze komórkowym i tam s³u¿y jakopo�rednik pomiêdzy j¹drem a cytoplazm¹. Wykazanozwi¹zek pomiêdzy obecno�ci¹ p17 w j¹drze a aktyw-no�ci¹ transkrypcji w komórce, ponadto bia³ko toposiada zdolno�æ wi¹zania DNA, ci¹gle jednak niewykazano jak¹ rolê odgrywa w cyklu ¿yciowym reo-wirusów. Prawdopodobnie p17 wp³ywa na prolifera-cjê komórek przez aktywacjê bia³ka p53 i p21cip1/waf1

[5, 9, 12, 27, 28, 30, 50].Fragment genomu S4 koduje niestrukturalne bia³-

ko FNS, które wi¹¿e jednoniciowe RNA niezale¿nieod sekwencji i wystêpuje w du¿ych kompleksachrybonukleinowych w zaka¿onych komórkach. Pozba-wione RNA bia³ko FNS tworzy homodimery i homo-

trimery. Minimalna d³ugo�æ wi¹zanego odcinka RNAmie�ci siê pomiêdzy 10 a 20 nukleotydów. Sekwencjaaminokwasowa odpowiedzialna za wi¹zanie RNAjest rozproszona w ca³ej sekwencji bia³ka FNS, cowskazuje na zale¿no�æ wi¹zania od konformacyjnegoukszta³towania bia³ka. Jako niestrukturalne bia³ko wi¹-¿¹ce RNA kumuluj¹ce siê w wirusowych fabrykachspe³nia ono rolê przy pakowaniu RNA oraz replikacji,jednak hipoteza ta wymaga dalszych badañ [1, 3, 11,30, 33, 36, 44�46, 50].

3. W³a�ciwo�ci onkolityczne reowirusów

Badania przeprowadzone z wykorzystaniem reowi-rusów ludzkich jako czynnika antynowotworowegoda³y pozytywne rezultaty. Reowirusy bowiem zaka¿aj¹komórki z nadaktywnym szlakiem sygnalizacyjnym,w którym istotn¹ rolê odgrywa bia³ko c-RAS. Repli-kacje reowirusów w komórkach fizjologicznie zdro-wych hamuje kinaza bia³kowa [2] aktywowana przezds RNA. Natomiast aktywno�æ PKR jest os³abionaw komórkach z nadaktywnym szlakiem sygnalizacyj-nym c-RAS, dziêki czemu wirus przechodzi pe³ny cykllityczny. Istotnym jest fakt, ¿e u ponad 30% ludzkichnowotworów, mutacje zachodz¹ w genie c-RAS. Tespecyficzne i unikalne w³a�ciwo�ci reowirusów do tegotypu komórek, sta³y siê podstaw¹ dalszych testów nadwirusem jako czynnikiem onkolitycznym. Do�wiad-czalnie wykazano, ¿e reowirusy, oprócz szlaku sygna-lizacyjnego c-RAS potrzebuj¹ do przeprowadzaniareplikacji aktywno�ci RalGEF i p38. Wykazano zbie¿-no�æ aktywno�ci szlaków RalGEF i p38 oraz c-RASw wielu ludzkich nowotworach. S¹dzi siê, ¿e w³a�nieone mog¹ braæ znaczny udzia³ w terapii przeciw-nowotworowej. Proponowane jest zastosowanie reo-wirusów w terapii medulloblastomy (MB), nowotworutrzustki, jelita grubego, jajnika i piersi. Niezbêdne s¹jednak dalsze badania nad mechanizmami w³a�ciwo�cionkolitycznych tych wirusów [4, 15, 24, 35].

4. Wystêpowanie zaka¿eñ u ludzi

Spo�ród 9 rodzajów rodziny Reoviridae, czteryz nich � orthoreowirusy, coltiwirusy, rotawirusy orazorbiwirusy powoduj¹ zaka¿enia u ludzi. Wiêkszo�æz nich mo¿e przebiegaæ bezobjawowo, czego wynikiemjest powszechno�æ wystêpowania przeciwcia³ prze-ciwko reowirusom w surowicy u ludzi doros³ych.U dzieci wszystkie serotypy reowirusów stwierdzanow przebiegu infekcji górnych dróg oddechowych, sta-nach zapalnych jelit, biegunce, stanach gor¹czkowych,a tak¿e u dzieci zdrowych. Nie uda³o siê potwierdziæ�cis³ej relacji pomiêdzy wystêpowaniem objawów cho-roby a zaka¿eniem reowirusami [2, 23]


Czêstym schorzeniem wywo³ywanym przez reowi-rusy jest kleszczowa gor¹czka Kolorado, najczê�ciejnotowana na terenie USA. Choroba jest przenoszonaprzez kleszcza drzewnego D. andersoni. Replikacjawirusa przebiega w gruczo³ach limfoidalnych, �ledzio-nie, sercu i w¹trobie. Przebieg choroby jest zazwyczaj³agodny, czêsto nawet nie dochodzi do zdiagnozowa-nia jej przez lekarza lub jest mylona z innymi jednost-kami chorobowymi. Przypadki o ciê¿kim przebiegu s¹niezwykle rzadkie, natomiast do �mierci mo¿e doj�æjedynie w wyniku powik³añ [2, 23].

Ludzkie rotawirusy powoduj¹ g³ównie zapalenia¿o³¹dka i jelit u dzieci w wieku od 6 do 24 miesiêcy¿ycia. Wirus rozprzestrzenia siê drog¹ doustn¹ prowa-dz¹c do infekcji w górnych odcinkach przewodu po-karmowego. Po krótkim okresie inkubacji dochodzido szeregu zmian w fizjologicznym funkcjonowaniunarz¹dów. Rotawirusy zaka¿aj¹ przede wszystkim ko-mórki kosmków jelita cienkiego prowadz¹c do silnychbiegunek, natomiast nie stwierdza siê ich w b³onie �lu-zowej. Namna¿aj¹c siê w enterocytach zaburzaj¹ ichfunkcje transportowe. Wirus wydalany jest w kaleprzez okres 2�12 dni. Rekonwalescencja mo¿e trwaædo 8 tygodni. �miertelno�æ w przebiegu zaka¿eñ rota-wirusowych wynosi 10�20%. U osób doros³ych za-ka¿enie przebiega bardzo ³agodnie lub bezobjawowo.W celu zabezpieczenia przed zachorowaniem stoso-wane s¹ szczepienia profilaktyczne u dzieci w pierw-szych 24 tygodniach ¿ycia [2, 23].

5. Zaka¿enia u trzody chlewnej

U �wiñ zidentyfikowano reowirusy typu 1 oraztypu 3 jak równie¿ infekcje wywo³ane przez rotawirusyoraz orbiwirusy. Wirusy te by³y izolowane od zdrowychzwierz¹t jak i z objawami klinicznymi ze strony prze-wodu pokarmowego. Przeciwcia³a przeciwko reowiru-som przekazywane przez matkê swemu potomstwuchroni¹ je przez oko³o 11 tygodni, po czym zwierzêtastaj¹ siê wra¿liwe na zaka¿enie. Do zaka¿enia dochodzig³ównie przez przewód pokarmowy i oddechowy, s¹ tog³ówne miejsca replikacji tych wirusów. Próby wywo-³ania choroby w warunkach laboratoryjnych przez za-ka¿enie donosowe lub dootrzewnowe prosi¹t szczepa-mi reowiruów pochodz¹cymi od �wiñ lub cz³owiekanajczê�ciej powodowa³y jedynie krótkotrwa³¹ gor¹cz-kê bez innych objawów klinicznych. Wirusy wydalanes¹ z ka³em i z wydzielin¹ z jamy nosowej od 24 godzi-ny po zaka¿eniu. Siewstwo wirusa trwa przez oko³o2 tygodnie. Zaka¿enie przebiega najczê�ciej ³agodniez objawami gor¹czki oraz zaburzeniami ³aknienia po-woduje miejscow¹ atrofiê kosmków jelita krêtegoi czczego. Przy zaka¿eniu dróg oddechowych obserwu-je siê agregacjê limfocytów i makrofagów w pêcherzy-

kach p³ucnych oraz nacieki limfocytów w grudkachoko³ooskrzelikowych. Zaka¿enia reowirusami u �wiñnie stanowi¹ znacz¹cego problemu ekonomicznego, nieopracowano metod ich leczenia i zapobiegania [42].

6. Reowirusy u drobiu

U ptaków zaka¿enia wywo³ywane s¹ przez wirusynale¿¹ce do rodzaju Orthoreovirus. ARV posiadaj¹cechy morfologiczne i fizykochemiczne zbli¿one doreowirusów ssaków. Ró¿nice pomiêdzy nimi polegaj¹na braku zdolno�ci aglutynowania krwinek przez reo-wirusy ptasie oraz typie efektu cytopatycznego indu-kowanego w hodowlach komórkowych. ARV w od-ró¿nieniu od MRV wywo³uj¹ fuzjê komórek [32, 36,37, 39]. Brak aktywno�ci fuzogenicznej reowirusówssaków wynika z ró¿nic w segmencie S1. Reowirusyptasie zawieraj¹ w tym segmencie trzy otwarte ramkiodczytu koduj¹ce bia³ka p10, p17 oraz FC, natomiastMRV koduj¹ bia³ko F1 pe³ni¹ce podobn¹ funkcjê doFC, nie posiadaj¹ jednak genu dla bia³ka p10 wywo³u-j¹cego fuzjê komórek gospodarza [39, 40].

Zaka¿enia reowirusami wystêpuj¹ najczê�ciej u kur.U kurcz¹t s¹ przyczyn¹ zapalenia stawów, zapaleniaosierdzia i miê�nia sercowego, syndromu z³ego wch³a-niania, stanów zapalnych jelit, zapalenia w¹troby,atrofii bursy Fabrycjusza i grasicy, ostrych i chronicz-nych chorób uk³adu oddechowego. S¹ one immuno-supresorami. Obecno�æ reowirusów stwierdzono tak¿ew narz¹dach wewnêtrznych ptaków klinicznie zdro-wych [19, 25, 31].

Zaka¿enia ARV mog¹ rozprzestrzeniaæ siê na dro-dze poziomej i pionowej. Transmisja pozioma odbywasiê przez kontakt bezpo�redni z zaka¿onymi ptakamioraz po�redni poprzez zaka¿on¹ �ció³kê, wodê i paszê[43]. Do przenoszenia zaka¿eñ dochodzi równie¿ drog¹pionow¹ poprzez jaja wylêgowe je¿eli nioski zosta³yzaka¿one przed nie�no�ci¹ lub ju¿ w czasie jej trwania.Odsetek jaj zaka¿onych wynosi od kilku do kilkunastuprocent, ale wylê¿one pisklêta ju¿ w czasie klucia mog¹zaka¿aæ pisklêta zdrowe drog¹ poziom¹. Jest to istotnadroga rozprzestrzeniania wirusa, gdy¿ najbardziej wra¿-liwe na zaka¿enie s¹ pisklêta w pierwszych dniach ¿y-cia. Wra¿liwo�æ na zaka¿enie zmniejsza siê wraz z wie-kiem ptaków i rozwojem uk³adu immunologicznego,podobnie jest w przypadku wielu innych wirusów[31]. Przebieg zaka¿enia reowirusami u ptaków zale¿yod wielu czynników, do których mo¿na zaliczyæ: wiekptaków i ich wra¿liwo�æ, patogenno�æ szczepu zaka¿a-j¹cego, drogê zaka¿enia, obecno�æ swoistych przeciw-cia³, wystêpowanie innych zaka¿eñ oraz warunki utrzy-mania. Nab³onki jelit cienkich oraz bursy Fabrycjuszaodgrywaj¹ wa¿n¹ rolê w patogenezie zaka¿eñ. S¹ onemiejscem pierwotnej replikacji reowirusów, po czym


wirus rozprzestrzenia siê w ci¹gu 24�48 godzin do in-nych tkanek i narz¹dów, zaka¿enie ma charakter pan-tropowy [25, 31, 32].

Wirusowe zapalenie stawów i pochewek �ciêg-nowych u kur dotyczy g³ównie ptaków ras miêsnychw wieku 4�7 tygodni. Okres wylêgania choroby wy-nosi od kilku do kilkunastu dni, zale¿y on od drogizaka¿enia, wieku zainfekowanych ptaków jak równie¿patogenno�ci wirusa. W trakcie rozwoju choroby do-chodzi g³ównie do zapalenia w obrêbie stawu skoko-wego, zapalenia b³on maziowych manifestuj¹cego siêobecno�ci¹ p³ynu wysiêkowego z domieszk¹ krwi we-wn¹trz torebki stawowej oraz zgrubienia �ciêgien zezmianami nekrotycznymi. Mikroskopowo widocznemog¹ byæ zmiany w w¹trobie, �ledzionie, bursie Fabry-cjusza i miê�niu sercowym. G³ównym objawem jestjedno- lub dwustronna kulawizna. Ponadto widocznyjest obrzêk stawów i �ciêgien, tak¿e poduszek stóp. Nie-jednokrotnie dochodzi do rozerwania �ciêgna lub miê�-nia brzuchatego ³ydki. U ptaków wystêpuje wyra�nybrak apetytu, s¹ kar³owate i apatyczne. Zachorowalno�æptaków w stadzie mo¿e siêgaæ nawet do 100% przy kil-kunastoprocentowej �miertelno�ci [10]. W diagnostyceró¿nicowej nale¿y braæ pod uwagê zapalenia stawówwywo³ane przez Mycoplasma synoviae i Staphylococ-cus aureus. Mog¹ to byæ jednocze�nie patogeny wik³a-j¹ce zaka¿enie stawów na tle wirusowym [10, 25].

Kolejn¹ jednostk¹ chorobow¹ zwi¹zan¹ z zaka¿e-niem ARV jest syndrom z³ego wch³aniania (zaka�nezahamowanie wzrostu u brojlerów). Choroba dotyczykurcz¹t brojlerów w 1�3 tygodniach ¿ycia. Infekcjauk³adu pokarmowego prowadzi do zmian nie¿ytowych,uszkodzenia kosmków jelitowych, wype³nienia jelitniestrawionym pokarmem, a w konsekwencji s³abszewch³anianie i zmniejszenie przyrostów masy cia³a. Ob-jawami towarzysz¹cymi s¹ zapalenie miê�nia sercowe-go, atrofia bursy Fabrycjusza i trzustki, a tak¿e zmianyw g³ówce ko�ci udowej. U zaka¿onych ptaków widocz-ne s¹ ubytki w upierzeniu, zahamowanie wzrostu, trud-no�ci w poruszaniu siê, biegunka. We krwi chorychptaków stwierdza siê wysoki poziom karotenoidówi wzrost aktywno�ci fosfatazy alkalicznej [19, 25, 31].

W Polsce od koñca lat 90-tych XX w notowanow stadach kurcz¹t brojlerów liczne przypadki zaka-¿enia ARV o ostrym przebiegu po³¹czone ze znaczn¹�miertelno�ci¹ ptaków. Reowiroza ma najczê�ciejprzebieg gwa³towny u 6�14 dniowych kurcz¹t. Okresinkubacji choroby wynosi od kilku do kilkunastu dnii jest on krótszy u kurcz¹t zaka¿onych pionowo poprzezjaja wylêgowe. W pierwszym stadium choroby, tzw.fazie ostrej obserwuje siê apatiê, obni¿one ³aknienie,kulawiznê. Sekcyjnie stwierdza siê zmiany w w¹tro-bie i �ledzionie, które s¹ powiêkszone i przekrwionez ogniskami nekrotycznymi. Widoczne s¹ równie¿ wy-broczyny w sercu, atrofia bursy Fabrycjusza i grasicyoraz przekrwienie p³uc i nerek. Faza chroniczna wy-

stêpuje u ptaków, które prze¿y³y fazê ostr¹. Notowanewówczas s¹ objawy przypominaj¹ce wirusowe zapale-nie stawów jak: obrzêki stawów, zaburzenia motorycz-ne oraz zahamowanie wzrostu. Pogrubieniu ulega to-rebka w¹troby i worek osierdziowy. Notuje siê tak¿erozleg³¹ martwicê nerek, w¹troby i �ledziony. W gra-sicy i bursie Fabrycjusza zanikaj¹ komórki limfoidalne.W przebiegu reowirozy �miertelno�æ mo¿e wynosiænawet 80% ptaków w stadzie, przy czym ptaki padaj¹g³ównie w ostrej fazie choroby [25, 31, 32, 34].

ARV mog¹ powodowaæ u zaka¿onych ptakówznacznego stopnia immunosupresjê komórkow¹ jaki humoraln¹. Dzia³anie to jest zwi¹zane z miejscem ichpierwotnej replikacji odbywaj¹cej siê w bursie Fabry-cjusza. Upo�ledzeniu ulega produkcja limfocytów B,obni¿eniu ulega równie¿ odsetek subpopulacji limfo-cytów T we krwi obwodowej ptaków. Takie dzia³aniemo¿e byæ przyczyn¹ obni¿enia skuteczno�ci szczepieñprofilaktycznych stosowanych u ptaków [10, 38].

7. Diagnostyka zaka¿eñ

Obecno�æ zaka¿eñ reowirusami mo¿na wykazaæbezpo�rednio poprzez stwierdzenie obecno�ci wirusaw narz¹dach wewnêtrznych oraz p³ynach ustrojowychjak te¿ po�rednio poprzez wykrycie swoistych przeciw-cia³. Izolacjê wirusa wykonuje siê materia³em uzys-kanym od pad³ych lub chorych ptaków w hodowlachkomórkowych b¹d� w zarodkach kurzych. Obecno�æwirusa w tkankach zmienionych narz¹dów wewnêtrz-nych mo¿na stwierdziæ tak¿e metod¹ immunofluores-cencji (IF). Coraz powszechniej do wykrywania pa-togenów zarówno wirusowych jak i bakteryjnych s¹stosowane techniki biologii molekularnej pozwalaj¹-ce na stwierdzeniu obecno�ci materia³u genetycznegow tkankach pobranych od ptaków. Zastosowanie znalaz³test polimerazowej reakcji amplifikacji (RT-PCR) wy-krywaj¹cy najczê�ciej sekwencje segmentów S1 i S4.Bia³ko FC kodowane jest przez cistron segmentu S1i jest odpowiedzialne za przy³¹czanie do zaka¿anej ko-mórki natomiast bia³ko FNS kodowane przez segmentS4 spe³nia istotn¹ rolê w pakowaniu RNA oraz proce-sie replikacji wirusa. S¹ to najlepiej poznane bia³ka reo-wirusów pod wzglêdem ich sekwencji oraz funkcji [7].

Do wykrywania obecno�ci przeciwcia³ przeciwkoreowirusom w surowicy ptaków powszechnie stosujesiê test immunoenzymatyczny ELISA oraz odczyn im-munodyfuzji w ¿elu agarowym (AGID) [31].

8. Immunoprofilaktyka

Ze wzglêdu na powszechne wystêpowanie, ³atwo�ærozprzestrzeniania zaka¿eñ poprzez transmisjê pionow¹i poziom¹ reowirusów nie jest mo¿liwa pe³na ochrona


stad ptaków przed kontaktem z tym patogenem. Jedyn¹skuteczn¹ form¹ ograniczania i zapobiegania skutkomzaka¿eñ reowirusami s¹ szczepienia profilaktyczne.Swoista immunoprofilaktyka stad rodzicielskich orazkurcz¹t brojlerów stymuluje produkcjê swoistych prze-ciwcia³. Wysoki poziom przeciwcia³ przeciwko reowi-rusom w stadzie rodzicielskim przekazywany jest z mat-ki na potomstwo. Na rynku dostêpne s¹ szczepionki¿ywe oparte na szczepach atentowanych jak i inakty-wowane jedno lub wielo wa¿ne. Program szczepieñprofilaktycznych uzale¿niony jest od sytuacji epidemio-logicznej na danym terenie, obejmuje on szczepienieszczepionk¹ ¿yw¹ a nastêpnie szczepionk¹ inaktywo-wan¹ [18, 31].

9. Podsumowanie

Reowirusy po raz pierwszy zosta³y wyizolowanew 1951 roku. S¹ one bezotoczkowymi wirusami DNAcharakteryzuj¹ce siê sferycznym kapsydem o �rednicyok. 850 Å. Kapsyd jest zbudowany z dwóch koncen-trycznych warstw co zapewnia znaczn¹ odporno�æ wi-rusa na czynniki fizykochemiczne. Genom wystêpujew postaci 10�12 segmentów dsRNA. Segmenty po-dzielono na 3 klasy: S, M oraz L w zale¿no�ci od ichwielko�ci. Segmenty te zawieraj¹ po jednej otwartejramce odczytu oprócz segmentu S1, który zawiera ich3 lub 2 w zale¿no�ci od rodzaju reowirusów. Genomkoduje bia³ka strukturalne tworz¹ce kapsyd (8A, 8B,8C, µA, µB, FA, FB, FC), które powstaj¹ bezpo�redniow czasie translacji oraz bia³ka niestrukturalne: bia³kaµNS, FNS, p10 i p17.

Wykazano powinowactwo reowirusów do komóreknowotworowych. S¹dzi siê, ¿e mo¿liwe jest zastosowa-nie reowirusów w terapii nowotworowej medulloblas-tomy (MB), nowotworu trzustki, jelita grubego, jajnikai piersi. Niezbêdne s¹ jednak dalsze badania nad mecha-nizmami w³a�ciwo�ci onkolitycznych tych wirusów.

Cztery rodzaje reowirusów � Orthoreovirusy, Colti-virusy, Rotavirusy oraz Orbivirusy powoduj¹ zaka¿eniau ludzi, z których wiêkszo�æ przebiega bezobjawowo.Ludzkie rotawirusy powoduj¹ najczê�ciej zapalenia¿o³¹dka i jelit u dzieci od 6 do 24 miesiêcy przez in-fekcjê górnych odcinków przewodu pokarmowego.

�winie zaka¿ane s¹ przez reowirusy typu 1 i 3 orazrotawirusy i orbiwirusy. Infekcja przebiega g³ówniedrog¹ pokarmow¹ i wziewn¹. Zaka¿enia przebiegaj¹g³ównie bezobjawowo lub ³agodnie z krótkotrwa³¹ go-r¹czk¹ i biegunk¹.

Orthoreowirusy powoduj¹ zaka¿enia u ptaków.Najczê�ciej zaka¿enia reowirusami wystêpuj¹ u kurobjawiaj¹c siê zapaleniem stawów, osierdzia, miê�niasercowego, jelit i w¹troby. Powoduj¹ atrofiê bursyFabrycjusza i grasicy. Wywo³uj¹ syndrom z³ego wch³a-

niania, reowirozê kurcz¹t i wirusowe zapalenie sta-wów i pochewek �ciêgnowych.

Diagnostyka zaka¿eñ reowirusami oparta jest za-zwyczaj na izolacji wirusa, stwierdzeniu obecno�ciwirusa metodami immunofluorescencji, stwierdzeniuobecno�ci przeciwcia³ testem immunoenzymatycznymELISA. Ponadto stosuje siê reakcje ³añcuchowej am-plifikacji (RT-PCR).

Jedynym skutecznym sposobem walki z reowi-rusami jest immunoprofilaktyka oraz wdro¿enie i prze-strzeganie zasad bioasekuracji, dezynfekcja sprzêtui pomieszczeñ.

Pi�miennictwo

1. Becker M.M., Peters T.R., Dermody T.S.: Reovirus FNS andµNS Proteins Form Cytoplasmic Inclusion Structures in theAbsence of Viral Infection. J. Virol. 77, 5948�5963 (2003)

2. Becker Y., Hadar J.: Molecular Virology: Molecular andMedical Aspects of Disease-causing Viruses in Man andAnimals, Springer-Verlag, Heidelberg, 1983, s. 139�144

3. Benavente J., Martinez-Costas J.: Avian reovirus: Structureand biology. Virus Res. 123, 105�119 (2007)

4. B³a¿ejska P., Go�dzicka-Józefiak A.: Wirusowa terapia prze-ciwnowotworowa. Wspó³. Onkol. 9, 279�283 (2005)

5. Bodelon G., Labrada L., Martinez-Costas J., Benavente J.:The avian reovirus genome segment S1 is a functionallytricistronic gene that expresses one structural and two non-structural proteins in infected cells. Virol. 290, 181�191 (2001)

6. Brentano L., Noah D.L., Brown E. G., Sherry B.: The Reo-virus Protein µ2, Encoded by the M1 Gene, Is an RNA-Bin-ding Protein. J. Virol. 72, 1998 8354�8357 (1998)

7. Bruhn S., Bruckner L., Ottiger H. P. Application of RT-PCRfor the detection of avian reovirus contamination in avianviral vaccines. J. Virol. Methods, 123, 179�186 (2005)

8. Chua K.B., Wang L.-F. i wsp.: A previously unknown reo-virus of bat origin is associated with an acute respiratorydisease in humans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104, 11424�11429 (2007)

9. Costas C., Martýnez-Costas J., Bodelon G., Benavente J.:The second open reading frame of the avian reovirus S1 geneencodes a transcriptiondependent and CRM1-independentnucleocytoplasmic shuttling protein. J. Virol. 79, 2141�2150(2005)

10. Czekaj H., Samorek-Salamonowicz E., Kozdruñ W.: Charak-terystyka szczepu reowirusa wyizolowanego z przypadkureowirozy brojlerów. Med. Wet. 58, (2002)

11. Dawe S., Boutilier J., Duncan R.: Identification and Charac-terization of a Baboon Reovirus-Specific Nonstructural Pro-tein Encoded by the Bicistronic S4 Genome Segment. Virol.304, 44�52 (2002)

12. Day M.J., Pantin-Jackwood M.J., Spackman E.: Sequenceand phylogenetic analysis of the S1 genome segment of tur-key-origin reoviruses. Virus Genes. 35, 235�242 (2007)

13. Dryden K.A., Wang G., Yeager M., Nibert M.L., Coombs M.K.,Furlong D.B., Fields B.N., Baker T.S.: Early Steps in Reo-virus infection are associated with dramatic changes in supra-molecular structure and protein conformation: analysis ofvirions and subviral particles by cryoelectron microscopy andimage reconstruction. J. Cell. Biol. 122, 1023�1041 (1993)


14. Duncan R., Corcoran J., Shou J., Stoltz D.: Reptilian reovirus:a new fusogenic Orthoreovirus species. Virol. 319, 131�140(2004)

15. Etoh T., Himeno Y., Matsumoto T., Aramaki M., Kawano K.,Nishizono A., Kitano S.: Oncolytic viral therapy for humanpancreatic cancer cells by reovirus. Clin. Cancer Res. 9,1218�1223 (2003)

16. Forrest J.C., Dermody T.S.: Reovirus Receptors and Patho-genesis. J. Virol. 77, 9109�9115 (2003)

17. Gonzalez-Lopez C., Martýnez-Costas J., Esteban M., Bena-vente J.: 2003. Evidence that avian reovirus FA protein is aninhibitor of the double-stranded RNA-dependent proteinkinase. J. Gen. Virol. 84, 1629�1639 (2003)

18. Guo Z.Y., Giambrone J., Dormitorio A.T.V., Wu H.: Influ-ence of a reovirus-antibody complex vaccine on efficacy ofMarek�s disease vaccine administered in ovo. Avian Dis. 47,1362�1367 (2003)

19. Guy J.S.: Virus Infections of the Gastrointestinal Tract ofPoultry. Poultry Sci. 77, 1166�1175 (1998)

20. Hermo-Parrado X.L., Guardado-Calvo P., Llamas-Saiz A.L.,Fox G., Vazquez-Iglesias C., Martínez-Costas J., Benavente J.,Raaij M.J.: Crystallization of the avian reovirus double-stranded RNA-binding and core protein sigmaA. Acta Cryst.F63, 426�429 (2007)

21. Hsu C.J., Wang C.Y., Lee L.H., Shih W.L., Chang C.I.,Cheng H.L., Chulu J.L., Ji W.T., Liu H.J.: Development andcharacterization of monoclonal antibodies against avian reo-virus FC protein and their application in detection of avianreovirus isolates. Avian Pathol. 35, 320�326 (2006)

22. Hsu H.W., Su H.Y., Huang P.H. Sequence and phylogeneticAnalysis of P10- and P17-Encoding Genes of Avian Reo-virus. Avian Dis. 49, 36�42 (2005)

23. Kapikian A.Z.: Viral Infections of the Gastrointestinal Tract.Informa Health Care, 1994, s. 90�250

24. Kim M., Chung Y.H., Johnston R.N.: Reovirus and tumoroncolysis. J. Microbiol. 45, 187�92 (2007)

25. Kozdruñ W., Samorek-Salamonowicz E., Czekaj H.: Rolareowirusów w aviopatologii. Medycyna Wet. 62, 974�976(2006)

26. Liu H.J., Chen J.H., Liao M.H.,. Lin M.Y, Chang G.N.: Identi-fication of the FC encoded gene of avian reovirus by nestedPCR and restriction endonuclease analysis. J. Virol. Meth. 81,83�90 (1999)

27. Liu H.J., Lee L.H., Hsu H.W., Kuo L.C., Liao M.H.: Mole-cular evolution of avian reovirus: evidence for geneticdiversity and reassortment of the S-class genome segmentsand multiple cocirculating lineages. Virol. 314, 336�349(2003)

28. Liu H.-J., Lin P.-Y., Lee J.-W., Hsu H.-Y., Shih W.-L.: Re-tardation of cell growth by avian reovirus p17 through theactivation of p53 pathway. Bioch. Bioph. Res. Comm. 336,709�715 (2005)

29. Maginnis M.S., Forrest C., Kopecky-Bromberg S.A., Dicke-son K., Santoro S.A., Zutter M.M., Nemerow G.R., Bergel-son J.M., Dermody T.S.: Beta1 Integrin Mediates Internaliza-tion of Mammalian Reovirus. J. Virol. 80, 2760�2770 (2006)

30. Martinez-Costas J., Grande A., Varela R., Garcia-Martinez C.,J. Benzvente.: Protein architecture of avian reovirus S1133and identification of the cell attachment protein. J. Virol. 71,59�64 (1997)

31. Mazurkiewicz M.: Choroby drobiu. Wroc³aw, 2005, s. 402�40732. McNulty M.S.: Reovirus. Virus infections of birds. Ed. McFer-

ran, McNulty. Elsevier Sci. Publ. B.V. 1993 s. 181�195

33. Miller C.L., Broering T.J., Parker J.S.L., Arnold M.M.,Nibert M.L.: Reovirus FNS Protein Localizes to Inclusionsthrough an Association Requiring the FNS Amino Terminus.J. Virol. 77, 4566�4576 (2003)

34. Minta Z., Bugajak P., Daniel A., Mazurkiewicz M., Wielicz-ko A., Gawe³ A., Bartczak R., Kozaczyñski W., Wierciñski J.:Przypadki reowirozy u kurcz¹t brojlerów w Polsce. Mat. Konf.Nauk. �Rola reowirusów w patologii ptaków�, Wroc³aw,1998, s. 35�36

35. Norman K.L., Hirasawa K., An-Dao Yang, Shields M.A.,Lee. Reovirus P.W.K.: The Ras_RalGEF_p38 pathway dic-tates host cell permissiveness to reovirus infection. Proc.Natl. Acad. Sci. 27; 101(30): 11099�11104 (2004)

36. Patton J.T. Segmented Double-stranded RNA Viruses: Struc-ture and Molecular Biology. Caister Academic Press, Norfolk,2008, s. 3�25

37. Robertson M.D., Wilcox G.E.: Avian reovirus. Vet. Bull. 56,155�174 (1986)

38. Samorek-Salamonowicz E., Czekaj H., Kozdruñ W.: Reowi-rusy jako czynniki wik³aj¹ce inne zaka¿enia wirusowe u pta-ków. Konf. Nauk. �Rola reowirusów w patologii ptaków�,Wroc³aw, 1998, s. 17�22

39. Shmulevitz M., Salsman J., Duncan R.: Palmytoylation, mem-brane-proximal basic residues, and transmembrane glycineresidues in the reovirus p10 protein are essential for syn-cytium formation. J. Virol. 77, 9769�9779 (2003)

40. Shmulevitz M., Yameen Z., Dawe S., Shou J., O�Hara D.,Holmes I., Duncan R.: Sequential Partially OverlappingGene Arrangement in the Tricistronic S1 Genome Segmentsof Avian Reovirus and Nelson Bay Reovirus: Implicationsfor Translation Initiation J. Virol. 76, 609�618 (2002)

41. Spandidos D.A., Graham A.F.: Physical and chemical charac-terization of an avian reovirus. J. Virol. 19, 968�976 (1976)

42. Straw B.E., Zimmerman J.J., D�Allaire S., Taylor D.J.: Diese-ases of Swine. Blackwell Publishing, 2006, s. 447�448

43. Tamehiro C.Y., Fernandez-Alfieri A., Medici K.C., Alfieri A.A.:Segmented Double-stranded genomic RNA viruses in fecalsamples from broiler chicken. Braz. J. Microbiol. 34, 349�353(2003)

44. Touris-Otero F., Martinez-Costaz J., Vakharia V.N., Bena-vente J.: Characterization of the nucleic acid-binding activityof the avian reovirus non-structural protein FNS. J. Gen.Virol. 86, 1159�1169 (2005)

45. Wen L.S., Hsiao W.H., Ming H.L., Long H.L., Hung J.L.:Avian reovirus FC protein induces apoptosis in culturedcells. Virol. 321, 65�74 (2004)

46. Yin H.S., Lee L.H.: Identification and characterization ofRNA-binding activities of avian reovirus non-structural pro-tein FNS. J. Gen. Virol. 79, 1411�1413 (1998)

47. Zhang L., Chandran K., Nibert M.L., Harrison S.C.: Reo-virus µ1 Structural Rearrangements That Mediate MembranePenetration. J. Virol. 80, 12367�12376 (2006)

48. Zhang X., Tang J., Walker S.B.: Structure of Avian Ortho-reovirus Virion by Electron Cryomicroscopy and ImageReconstruction. Virol. 343, 25�35 (2005)

49. Zhang Y., Guo D., Geng H., Liu M., Hu Q., Wang J., Tong G.,Kong X., Liu N., Liu C.: Characterization of M-class genomesegments of muscovy duck reovirus S14. Virus Res. 125,42�53 (2007)

50. Zhang Y., Liu M., Qu L., Xiang W., Guo D., Yuan X., Ge M.,Zhang C.: Sequence and phylogenetic analysis of the S-classgenome segments of a duck orthoreovirus. Acta Virol. 51,239�247 (2007)

Ludwik Hirszfeld urodzi³ siê w Warszawie w spo-lonizowanej rodzinie ¿ydowskiej, bardzo silnie zwi¹-zanej z tradycjami polskiej walki podziemnej. W wieku18 lat wyjecha³ do Würzburga studiowaæ medycynê.W trakcie tych studiów zdecydowa³ siê po�wiêciæ pra-cy naukowej. W wieku 19 lat przeniós³ siê do Berlina,gdzie przez jeden semestr studiowa³ filozofiê. Opróczmedycyny interesowa³ siê bakteriologi¹ i serologi¹.Maj¹c 22 lata rozpocz¹³ przygotowanie pracy doktor-skiej, któr¹ ukoñczy³ w 1907 roku z ocen¹ eximia cumLaude. Po doktoracie zatrudni³ siê jako asystent w Za-k³adzie Badañ Raka w Heidelbergu. Po pewnym czasiewraz ze wspó³pracownikami rozpocz¹³ pracê z zakresuserologii i genetyki grup krwi u ludzi i zwierz¹t.

Po wyje�dzie do Zurichu Hirszfeld habilitowa³ siêna podstawie prac o zwi¹zku zjawisk odporno�ciowychi krzepliwo�ci krwi. W trakcie habilitacji wyg³osi³ pu-bliczny odczyt zatytu³owany �Zagadnienia dziedzicz-no�ci w �wietle nauki o odporno�ci�. Jako m³odydocent prowadzi³ wyk³ady o chorobach zaka�nych dlastudentów ró¿nych wydzia³ów oraz kurs serologii dlastudentów medycyny.

Na wiadomo�æ o wybuchu epidemii duru plamiste-go w czasie I wojny �wiatowej, Hirszfeld jako ochotnikwyje¿d¿a w 1915 roku do Serbii. Organizuje tam pra-cowniê bakteriologiczn¹, jednocze�nie kieruje akcjamizwalczania epidemii i prowadzi wyk³ady o chorobachzaka�nych. Wkrótce do Hirszfelda do³¹czy³a jego ¿onaHanna. �Poznawali�my tam choroby, których nie znaEuropa �rodkowa. Widzia³em tam po raz pierwszy za-

razki duru powrotnego, zimnicy podzwrotnikowej nie-znane nam objawy kliniczne� napisze pó�niej Hirszfeldw �Historii jednego ¿ycia�. Wraz z cofaj¹c¹ siê armi¹serbsk¹ Hirszfeldowie ewakuowani zostali do Albanii,nastêpnie trafili na Korfu, do W³och, Szwajcarii i doGrecji, gdzie nadal pracowali na rzecz Serbii. W tymczasie Hirszfeld zajmowa³ siê zwalczaniem epidemiiczerwonki oraz dzia³a³ na rzecz stosowania transfuzjikrwi. Za swoj¹ dzia³alno�æ wyró¿niony zosta³ przezkróla serbskiego honorowym obywatelstwem.

Po latach wojennej s³u¿by Hirszfeldowie w 1920 rokupowrócili do Polski. L. Hirszfeld w³¹czy³ siê w organi-zowanie s³u¿by epidemiologicznej oraz zwalczanie epi-demii chorób zaka�nych na terytorium Polski i w pracêKomisji Przeciwepidemicznej Ligi Narodów. W roku1918 powsta³ w Warszawie Zak³ad Higieny, któregopierwszym dyrektorem zosta³ dr Ludwik Raichman,a Hirszfeld zosta³ dyrektorem Dzia³u Bakteriologiii Medycyny Do�wiadczalnej, kierownikiem Oddzia³uKontroli Surowic i zastêpc¹ dyrektora Raichmana (by³nim do 1933 roku).

Równocze�nie z dzia³alno�ci¹ organizacyjn¹ i nau-kow¹ ówczesny docent Hirszfeld prowadzi³ wyk³adyz nauki o odporno�ci na Wolnej Wszechnicy Polskiej(od 1924 roku), w roku 1926 po uzyskaniu docentury(ponownej habilitacji) na Wydziale Lekarskim UWprowadzi³ wyk³ady z serologii dla lekarzy. W tym sa-mym roku na zaproszenie Wydzia³u FarmaceutycznegoUW L. Hirszfeld rozpocz¹³ prowadzenie zleconych wy-k³adów z bakteriologii dla studentów farmacji. Programtych zajêæ i ilo�æ godzin ca³kowicie zale¿a³a od wyk³a-dowcy, który móg³ jak pisze �wyk³adaæ ca³okszta³t bak-teriologii�. Zajêcia te Hirszfeld prowadzi³ do 1930 roku.

W okresie pracy Hirszfelda w PZH prowadzonobadania bakteriologiczne potrzebne w akcjach zwalcza-nia epidemii, ulepszano metody serodiagnostyki, przy-gotowywano odczynniki dla pracowni diagnostycznychi kontrolowano przebieg akcji szczepieñ. Równolegledo prac, jak to okre�la³ Hirszfeld �u¿ytkowych� kon-tynuowane by³y badania nad serologi¹ i genetyk¹ grupkrwi. W 1928 roku ukaza³a siê monografia Hirszfelda�Serologia konstytucjonalna�.

Ogromn¹ ilo�æ szczegó³owych informacji o swojeji swoich wspó³pracowników dzia³alno�ci naukowej,osi¹gniêciach, uczestnictwie w pracy miêdzynarodo-wych organizacji oraz o wydarzeniach zwi¹zanychz udzia³em w zjazdach naukowych w bardzo skonden-sowanej formie przedstawi³ Hirszfeld w kilku krótkichrozdzia³ach �Historii jednego ¿ycia�.

W latach okupacji niemieckiej Hirszfeld zosta³ po-zbawiony mo¿liwo�ci pracy w zarz¹dzanym przez

NAJNOWSZA HISTORIA POLSKIEJ MIKROBIOLOGI I

Profesor Ludwik Hirszfeld(5.08.1884 � 7.03.1954)

152 NAJNOWSZA HISTORIA POLSKIEJ MIKROBIOLOGII

Niemców Pañstwowym Zak³adzie Higieny, a w 1941roku zosta³ wraz z rodzin¹ przeniesiony do Getta. Tuwraz ze wspó³pracownikami dzia³a³ przy zwalczaniuepidemii duru plamistego wykorzystuj¹c szczepionkêWejgla, zorganizowa³ Radê Zdrowia. W ramach legal-nego Kursy Przysposobienia Sanitarnego do walkiz epidemiami prowadzi³ tajne nauczanie akademickie,w tym dla pierwszych dwóch lat studiów farmaceu-tycznych. W 1942 roku Hirszfeldowie opuszczaj¹Getto i ukrywaj¹ siê na terenie okupowanej Polskiw Kamiennej, Mi³o�nie, Lipce i Weso³ej. Prawdo-podobnie w tym czasie powstaje tekst wa¿nej ksi¹¿kiHirszfelda �Immunologia ogólne�.

Po tragicznym okresie wojny i okupacji ProfesorL. Hirszfeld jest jednym z organizatorów Uniwersytetuw Lublinie, którego prze pewien czas jest prorektorem.Jak sam pisze �do Warszawy nie mog³em i nie chcia³emwracaæ�. Mimo tego obj¹³ funkcje przewodnicz¹cegoRady Naukowej PZH. Dyrektorem PZH zosta³ wte-dy jeden z kolegów i wspó³pracowników Hirszfeldaprof. F. Przesmycki, pó�niejszy pierwszy kierownikKatedry i Zak³adu Mikrobiologii i Higieny Wydzia³uFarmaceutycznego AM w Warszawie.

W sierpni 1945 roku Ludwik Hirszfeld przyjecha³do Wroc³awia gdzie organizowa³ ¿ycie naukowe,m.in. by³ jednym z za³o¿ycieli Wydzia³u Lekarskiego,którego zosta³ dziekanem. W 1954 roku utworzonyzosta³ we Wroc³awiu Instytut Immunologii i TerapiiDo�wiadczalnej PAN nosz¹cy obecnie imiê LudwikaHirszfelda.

Profesor Ludwik Hirszfeld zmar³ 7 marce 1954 rokuwe Wroc³awiu i tam, na Cmentarzu �w. Wawrzyñcazosta³ pochowany.

Pi�miennictwo

1. Górski A.: Nec Soli Cedit (artyku³ po�wiêcony pamiêci prof.Ludwika Hirszfelda). http://www.iitd.pan.wroc.pl

2. Hirszfeld L.: Historia jednego ¿ycia, Czytelnik � Warszawa2000.

3. Pachecka J., Kowalski J. Tomaszewski P. (red.): Dzieje War-szawskiego Wydzia³u Farmaceutycznego 1926�2001, War-szawa 2001

Bohdan J. Staro�ciakZak³ad Mikrobiologii Farmaceutycznej

Warszawski Uniwersytet Medyczny

W bie¿¹cym roku minê³a 55 rocznica �mierci wybit-nego polskiego naukowca, lekarza, immunologa i mikro-biologa, prof. Ludwika Hirszfelda. Redakcja PostêpówMikrobiologii postanowi³a z tej okazji opublikowaæwyk³ad L. Hirszfelda zatytu³owany �Walka �wiata nie-widzialnego z pozawidzialnym�. Jest to tekst odczytuProfesora wyg³oszonego na I Dorocznym ZebraniuPublicznym Wroc³awskiego Towarzystwa Naukowegow dniu 7.03.1948 roku. Ukaza³ siê on drukiem w Spra-wozdaniach Wroc³awskiego Towarzystwa Naukowego(zesz. 3, 3�18, 1948) oraz jako osobna broszura.

L. Hirszfelda w swoim popularyzatorskim odczycieprzedstawia podstawowe informacje o gro�nych wi-rusach chorobotwórczych oraz po�wiêca du¿o miejscabakteriofagom � �virusom bakterii�. Pisze o wykorzys-taniu bakteriofagów w medycynie np.: o fagotypowa-niu Salmonella oraz o mo¿liwo�ciach wykorzystaniabakteriofagów w terapii fagowej. Jak¿e aktualne jestw tek�cie z 1948 stwierdzenie: �Odkrycia czystej na-uki mog¹ byæ obrócone dla dobra ludzko�ci. Z kon-fliktu miêdzy �wiatem niewidzialnym a poza widzial-nym mo¿emy ukuæ skuteczn¹ broñ dla ochrony zdrowiai ¿ycia cz³owieka�.

W tym miejscu nale¿y zwróciæ uwagê na niedoce-nian¹ na ogó³ rolê L. Hirszfelda we wprowadzeniuw Polsce badañ nad bakteriofagami i terapi¹ fagow¹,

które trwaj¹ do dnia dzisiejszego. Prace te by³y pro-wadzone w Pañstwowym Zak³adzie Higieny w czasie,gdy Dzia³em Bakteriologii i Medycyny Do�wiad-czalnej i ca³ym pionem naukowym instytutu kierowa³Hirszfeld. Profesor wspomina: �jedna z asystentek�og³osi³a warto�ciowe prace o bakteriofagach, drugazyska³a sobie imiê za granic¹ dziêki piêknym pracomo bakteriofagach�. Tak¿e z o�rodka Profesora Hirszfeldapochodzi³y gotowe preparaty fagowe u¿yte w KliniceChirurgii UJ w Krakowie w latach 1926�1927 w pierw-szym w Polsce udokumentowanym opisie terapii fago-wej. Bakteriofagi �zosta³y sprowadzone� przez Profe-sora Hirszfelda do Wroc³awia po II wojnie �wiatowej� badania nad nimi i terapi¹ fagow¹ kontynuowane s¹tam do dzisiaj. W tym czasie Hirszfeld by³ jednymz g³ównych organizatorów ¿ycia naukowego oraz nau-czania medycyny we Wroc³awiu.

Redakcja Postêpów Mikrobiologii

Przypominaj¹c postaæ Profesora L. Hirszfelda Od-dzia³ Warszawski Polskiego Towarzystwa Immuno-logii Do�wiadczalnej i Klinicznej zorganizowa³ w dniu17.03.2009 konferencjê �Profesor Ludwik Hirszfeld� wielki uczony, lekarz humanista i patriota � w 55 rocz-nicê �mierci�.

W 55 ROCZNICÊ �MIERCI PROFESORA LUDWIKA HIRSZFELDA

153NAJNOWSZA HISTORIA POLSKIEJ MIKROBIOLOGII

Spis tre�ci

Profesor Piotr S³onimski (9 XI 1922 � 25 IV 2009) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89E. K. J a g u s z t y n - K r y n i c k a, J. R y b a c k i, A. M. £ a s i c a � Nowe strategie

poszukiwania leków przeciw-bakteryjnych � leki przeciw-toksynowe . . . . . . . . . . . . 93A. S i k o r a, M. K. B ³ a s z c z y k � Prokarioty redukuj¹ceFe(III):

klasyfikacja, wystêpowanie, mechanizmy redukcji Fe(III), rola ekologicznai znaczenie biotechnologiczne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105

M. S k ó r a, J. W i t a l i s, P. K r z y � c i a k, A. B. M a c u r a � Grzyby z rodzajuGeotrichum jako oportunistyczny patogen cz³owieka . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125

J. P u ³ a w s k a, K. K i e l a k, P. S o b i c z e w s k i � Bioró¿norodno�æ bakteriiErwinia amylovora � sprawcy zarazy ogniowej . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133

J. S. N i c z y p o r u k, E. S a m o r e l - S a l m o n o w i c z, H. C z e k a j � Reowirusy� budowa oraz chorobotwórczo�æ dla ludzi i zwierz¹t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143

L. H i r s z f e l d � Walka �wiata niewidzialnego z pozawidzialnym . . . . . . . . . . . . . . . . . . 153

Contents

Professor Piotr S³onimski (9 XI 1922 � 25 IV 2009) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89E. K. J a g u s z t y n - K r y n i c k a, J. R y b a c k i, A. M. £ a s i c a � Novel strategies

for antibacterial drug discovery � antitoxin drugs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93A. S i k o r a, M. K. B ³ a s z c z y k � Fe(III)-reducing prokaryotes:

classification, distribution, mechanisms of Fe(III) reduction, ecological role andbiotechnological significance . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105

M. S k ó r a, J. W i t a l i s, P. K r z y � c i a k, A. B. M a c u r a � Fungal genusGeotrichum: an opportunistic pathogen of humans . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125

J. P u ³ a w s k a, K. K i e l a k, P. S o b i c z e w s k i � Biodiversity of Erwiniaamylovora � the causal agent of fire blight . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133

J. S. N i c z y p o r u k, E. S a m o r e l - S a l m o n o w i c z, H. C z e k a j � Reoviruses� structure and pathogenicity for human and animals . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143

L. H i r s z f e l d � Struggle between the visible and invisible world . . . . . . . . . . . . . . . . . . 153

POLITECHNIKA £ÓDZKAWYDZIA£ BIOTECHNOLOGII I NAUKI O ¯YWNO�CI

SERDECZNIE ZAPRASZA

w dniach 7�9 wrze�nia 2009 r.

na

V Miêdzynarodow¹ Konferencjê Naukow¹

Rozk³ad i Korozja Mikrobiologicznamateria³ów technicznych

W programie przewidziane s¹:referaty plenarne zaproszonych wybitnych specjalistów (w tym go�ci zagranicznych), se-sja posterowa, wystawy i prezentacje firm oraz V sesji referatowych:1. Rozk³ad mikrobiologiczny i korozja wzbudzana przez mikroorganizmy

materia³ów technicznych,2. Mikrobiologia zbiorów muzealnych i wyrobów artystycznych,3. Mikroorganizmy, a jako�æ ¿ycia,4. Ochrona materia³ów technicznych przed rozk³adem i korozj¹ wzbudzon¹

przez mikroorganizmy5. Metody badañ procesu biodeterioracji materialów

Op³ata konferencji wynosi800 z³ dla pracowników wy¿szych uczelni, instytucji naukowo-badawczych

oraz pracowników przemys³u, 1500 dla firm.Doktoranci i studenci � 400 z³

Szersze informacje na temat konferencji na stronie:

http://korozja.p.lodz.pl

Kontakt:

Dr in¿. Anna KozirógInstytut Technologii Fermentacji i Mikrobiologii,

Politechnika £ódzka90-924 £ód�, ul. Wólczñska 171/173,

tel. (0 42) 631 34 70, fax (0 42) 636 59 76,e-mail [email protected]

tom 48 zeszyt 2 rok 2009 - Polskie Towarzystwo Mikrobiologózjum Stefana Batorego, student medycyny...

Documents

Transcript of tom 48 zeszyt 2 rok 2009 - Polskie Towarzystwo Mikrobiologózjum Stefana Batorego, student medycyny...