5. DeeS.,OtakeS.,OliveiraS.,DeenJ.:Evidenceoflongdi-stanceairbornetransportofporcinereproductiveandre-spiratorysyndromevirusandMycoplasma hyopneumo­niae.Vet. Res.2009,40,39-45.

6. MaesD.,SegalesJ.,MeynsT.,SibilaM.,PietersM.,Ha-esebrouckF.:ControlofMycoplasma hyopneumoniaein-fectionsinpigs.Vet. Microbiol. 2008,126,297-309.

7. MadecF.:Theriskfactorsofrespiratorydiseasesonfat-tenersinintensivebreeding-finishingunits.Proceedings of the 8th IPVSCongress,Ghent,Belgium1984,349.

8. InamotoT.,TakahashiH.,YamamotoK.,NakaiY.,Ogimo-toK.:AntibioticsusceptibilityofMycoplasma hyopneumo­niaeisolatedfromswine.J.Vet.Med.Sci.1994,56,393-394.

9. ViccaJ.,StakenborgT.,MaesD.,ButayeP.,PeetersJ.,deKruifA.,HaesebrouckF.:In vitrosusceptibilitiesofMyco­plasma hyopneumoniaefieldisolates.Antimicrob. Agents Chemother.2004,48,4470-4472.

10. ViccaJ.:Virulence and antimicrobial susceptibility of My­coplasma hyopneumoniae isolates from pigs. PhDthesis,FacultyofVeterinaryMedicine,GhentUniversity,ISBN90-5864-086-8,2005,219.

11. MaesD.,DeluykerH.,VerdonckM.,CastryckF.,MiryC.,LeinA.,VrijensB.,deKruifA.:Effectofvaccinationaga-instMycplasma hyopneumoniaeinpigherdswitha conti-nuousproductionsystem. J. Vet. Med.B,1998,45,495-505.

12. MaesD.,DeluykerH.,VerdonckM.,CastryckF.,MiryC.,VrijensB.,VerbekeW.,ViaeneJ.,deKruifA.:EffectofvaccinationagainstMycoplasma hyopneumoniae inpigherdswithanall-in/all-outproductionsystem.Vac­cine1999,17,1024-1034.

13. MeynsT.,DewulfJ.,deKruifA.,CalusD.,HaesebrouckF.,MaesD.:ComparisonoftransmissionofMycoplasma hyopneumoniaeinvaccinatedandnon-vaccinatedpopu-lations.Vaccine 2006,24,7081-7086.

14. SibilaM.,NofrariasM.,López-SoriaS.,SegalesJ.,Vale-roO.,EspinalmA.,CalsamigliaM.:Chronologicalstudy

ofMycoplasma hyopneumoniae infection, seroconver-sionandassociatedlunglesionsinvaccinatedandnon-vaccinatedpigs.Vet. Microbiol.2007,122,97-207.

15. JensenD.,ErsbollA.,NielsenJ.:A meta-analysiscompa-ringtheeffectofvaccinesagainstMycoplasma hyopneu­umoniaeondailyweightgaininpigs.Prev. Vet. Med.2002,54,265-278.

16. BaccaroM.,HiroseF.,UmeharaO.,GonçalvesL.,DotoD.,PaixãoR.,ShinyaL.,MorenoA.:Comparativeeffica-cyoftwosingle-dosebacterinsinthecontrolofMyco­plasma hyopneumoniaeinswineraisedundercommer-cialconditionsinBrazil.Vet. J.2006,172,526-531.

17. BandrickM.,PietersM.,PijanoC.,MonitorT.:Cellularimmuneresponse inpiglets followingsowvaccinationwitMycoplasma hyopneumoniae.Proc. Allen D. Leman Swine Conference,vol.33Supplement.CollegeofVete-rinaryMedicine,UniversityofMinnesota,MinneapolisMN,USA,2006,11.

18. BargenL.:A systemresponsetoanoutbreakofenzooticpneumoniaingrow/finishpigs.Can. Vet. J.2004,45,856-859.

19. MurphyD.,VanAlstineW.,ClarkK.,AlbregtsS.,KnoxK.:AerosolvaccinationofpigsagainstMycoplasma hyo­pneumoniaeinfection.Am. J. Vet. Res.1993,54,1874-1880.

20. LinJ.,WengC.,LiaoC.,YehK.,PanM.:ProtectiveeffectsoforalmicroencapsulatedMycoplasma hyopneumoniaevaccinepreparedbyco-spraydryingmethod.J. Vet. Med. Sci.2003,65,69-74.

21. KingK.,FauldsD.,RoseyE.,YanceyR.:Characteriza-tionofthegeneencodingMhp1fromMycoplasma hyo­pneumoniaeandexaminationofMhp1’svaccinepoten-tial.Vaccine 1996,15,25-35.

22. ShimojiY.,OishiE.,MunetaY.,NosakaH.,MoriY.:Vac-cineefficacyoftheattenuatedErysipelothrix rhusiopa­thiaeYS-19expressinga recombinantproteinofMyco­plasma hyopneumoniaeP97adhesinagainstmycopla-smalpneumoniaofswine.Vaccine 2003,21,532-737.

23. OgawaY.,OishiE.,MunetaY.,SanoA.,HikonoH.,Shiba-haraT.,YagiY.,ShimojiY.:Oralvaccinationagainstmy-coplasmalpneumoniaofswineusinga liveErysiplothrix rhusiopathiaevaccinestrainasa vector.Vaccine 2009,27,4543-4550.

24. OkambaF.,MoreauE.,BouhC.,GagnonC.,MassieB.,ArellaM.:Immuneresponsesinducedbyreplication-de-fectiveandenovirusexpressingtheC-terminalportionofMycoplasma hyopneumoniae-P97adhesin.Clin. Vaccine Immunol.2007,14,767-774.

25. ChenA.,FryS.,DaggardG.,MukkurT.:Evaluationofim-muneresponsetorecombinantpotentialprotectiveanti-gensofMycoplasma hyopneumjoniae deliveredascock-tailDNAand/orrecombinantproteinvaccinesinmice.Vaccine2008,26,4372-4378.

26. VillarrealI.,MaesD.,MeynsT.,GebruersF.,CalusD.,Pa-smansF.,HaesebrouckF.:Infectionwitha lowvirulentMycplasma hyopneumoniaeisolatedoesnotprotectpi-gletsagainstsubsequentinfectionwitha highlyvirulentM. hyopneumoniaeisolate.Vaccine 2009,27,1875-1879.

27. MinionF.C.,LefkowitzE.J.,MadsenM.L.,ClearyB.J.,SwartzellS.M.,MahairasG.G.:ThegenomesequenceofMycoplasma hyopneumoniaestrain232,theagentofswi-nemycoplasmosis.J. Bacteriol.2004,186,7123-7133.

28. VasconcelosA.,FerreiraH.,BizarroC.V.:Swineandpo-ultrypathogens:thecompletegenomesequencesoftwostrainsofMycplasma hyopneumoniaeanda strainofMy­coplasma synoviae.J. Bacteriol.2005,187,5568-5577.

Prof. dr hab. Zygmunt Pejsak, Państwowy Instytut Wete-rynaryjny, al. Partyzantów 57, 24-100 Puławy, e-mail: zpejsak@piwet.pulawy.pl

Chorobytransmisyjnezwierzątstano-wiągrupęgroźnychchoróbzakaźnych

i pasożytniczychprzenoszonychprzezpa-sożytniczestawonogi,z którychtochoróbznacznączęść stanowiązoonozy (1,2).Chorobytransmisyjnedzieląsięna:obli-gatoryjnietransmisyjne,fakultatywnie/ob-ligatoryjnietransmisyjneorazfakultatyw-nietransmisyjne.Chorobyobligatoryjnietransmisyjnetotakie,któreprzenoszonesąwyłączniezapośrednictwemstawono-gów.PrzykłademtakiejchorobymożebyćprzenoszonaprzezkleszczehepatozoonozapowodowanaprzezinwazjępierwotniakówHepatozoon canis.Z koleidochoróbfakul-tatywnie/obligatoryjnie transmisyjnych

zaliczasiętakie,któreprzenoszonesąprzezpasożytniczewektory,jednakżeodnotowa-nopojedynczeprzypadki,w którychdo-chodziłodozakażeńbezudziałuwektora.Przykłademtakiejchorobymożebyćza-każeniewirusemśrodkowoeuropejskiegokleszczowegozapaleniamózgu.Chorobąfakultatywnietransmisyjnąnatomiastjesttaka,któramożebyćprzenoszonazapo-średnictwemwektora,jednakniejestonniezbędnyw zakażeniu i  równieczęstodochodzidozarażeńzapośrednictwemwektora,jaki bezniego.PrzykłademmożebyćtutajgorączkaQczyteżtularemia(3).Należyzdawaćsobiesprawę,żepodziałten jest sztuczny, jak równieżzmienny.

Techniki laboratoryjne wykorzystywane w diagnostyce chorób transmisyjnych u zwierząt. Część I. Rozpoznawanie zakażeń i inwazji

Wojciech Zygner1, Olga Gójska-Zygner2, Anna Rodo3, Karol Sobków4

z Zakładu Parazytologii i Inwazjologii Katedry Nauk Przedklinicznych1 i Zakładu Patomorfologii Zwierząt Katedry Patologii i Diagnostyki Weterynaryjnej3 Wydziału Medycyny Weterynaryjnej w Warszawie oraz Centrum Zdrowia Małych Zwierząt – Kliniki Multiwet w Warszawie2 i Weterynaryjnego Laboratorium Diagnostycznego – Lab-Wet w Warszawie4

Laboratory methods in diagnostics of animal transmissible diseases. Part I. Identification of infections and invasions

Zygner W.1, Gójska-Zygner O.2, Rodo A.3, Sobków K.4, Division of Parasitology and Parasitic Diseases, Department of Preclinical Sciences1, Division of Animal Pathomorphology, Department of Pathology and Veterinary Diagnostics3 Faculty of Veterinary Medicine3, Warsaw University of Life Sciences-SGGW and Small Animals Health Center – Multiwet Clinic in Warsaw2 and Veterinary Diagnostic Laboratory – Lab-Wet in Warsaw4

Arthropod-borne diseases of animals are important for veterinary practitioners. Many of them are zoonoses and their course is often severe. Different transmissible dis-eases need different diagnostic methods. Some of them can be recognized with traditional bacteriological and cytological methods whereas others need serological or molecular biology techniques. Also additional tests like biochemical and hematological examinations and urinalysis may be necessary to establish the diagnosis. This review has been divided into 2 parts. In the Part I basic routine laboratory diagnostic methods available for arthropod-borne animal diseases with the examples of their use were presented. Part II has been dedicated to the other complementary laboratory techniques to-gether with examples of their application.

Keywords: arthropod-borne animal diseases, diag-nostic approach.

Prace poglądowe

19Życie Weterynaryjne • 2011 • 86(1)

Przykłademtakichzmianmożebyćbabe-szjozapsówpowodowanaprzezpierwot-niakiz rodzajuBabesiaczyteżhepatozo-onozapsówpowodowanaprzez inwazjęH. americanum.Okazujesię,iżbabeszjo-zapsówmożebyćprzenoszonaz matkinaszczeniętaprzezłożysko,jakrównieżdo-chodzićmożedozarażeniapsówpodczaswalkzwierząt(4,5).W przypadkuinwa-zjiH. americanumdoniedawnauważano,żejedynądrogązarażeniapsa,jestzjedze-nieprzezpsakleszczazawierającegowy-sporulowaneoocysty.Jaksięjednakoka-zuje,istniejerównieżinnadrogazarażeniatympasożytempoprzezzjedzeniezarażo-negogryzonia,w któregomięśniachszkie-letowychobecnesąmerontyzawierająceinwazyjnemerozoity(6).Wartorównieżdodać,iżpodziałtennieuwzględniaza-rażeń,doktórychmożedochodzićw wy-nikutransfuzjikrwiczyteżprzeszczepównarządówu ludzi.

Obecniew diagnostycechoróbtrans-misyjnychwykorzystywanych jestwieleróżnychtechniklaboratoryjnych.Docho-róbtychzaliczasięwywołaneprzezwi-rusy,bakterie,jakrównieżpierwotniaki,a nawetnicienie.W związkuz tymw roz-poznawaniutychchoróbwykorzystujesięzarównotradycyjnetechnikimikrobiolo-giczneczyparazytologiczne,jakrównieżnowszemetodyimmunologicznei meto-dybiologiimolekularnej.Ponadtow dia-gnostycechoróbtransmisyjnychużytecz-nesąrównieżdodatkowebadanialabora-toryjne,takiejakbadaniamorfologicznekrwi,biochemicznesurowicyorazogól-nebadaniemoczu.W tymartykulezo-stanąprzedstawioneróżnetechnikilabo-ratoryjneorazprzykładyichzastosowań

w  diagnostyce chorób transmisyjnychu zwierząt.

Badania mikroskopowe

Niektórezarazkiprzenoszoneprzezpaso-żytniczestawonogimogąbyćwykrywanebezpośredniow badaniachmikroskopo-wych.Materiałemdo tychbadań,zależ-nieodposzukiwanegozarazka,mogąbyć:krewpełna,płynmózgowo-rdzeniowy,maźstawowa,wysiękposkaryfikacjiskóry,kałorazaspiraty śledziony,wątroby, szpikukostnego lubwęzłówchłonnychpobra-nedrogąbiopsjiaspiracyjnejcienkoigło-wej.Zarazkówposzukiwaćmożnarównieżw preparatachodciskowychwycinkówna-rządówpobranychdobadańhistopatolo-gicznychorazw preparatachwykonanychz hodowliniektórychbakteriinaspecjal-nychpodłożach.

Mikroskopowe badania krwi

W diagnostycechoróbtransmisyjnychwy-korzystywanadobadańmikroskopowychkrewmożebyćużytadobadaniarozmazukrwibądźteżmożestanowićmateriałwy-korzystywanyw teścieKnotta.

Rozmazkrwidobadaniamożnawyko-naćz krwiżylnejpobranejdoprobówkiza-wierającejantykoagulantbądźteżz krwiwłośniczkowej(ryc. 1).Rozmazwykonywa-nyjestzapomocądwóchszkiełekpodsta-wowych.Najednymzeszkiełekumieszczasiękroplękrwi,a następniedrugieszkieł-koprzykładadokroplii jednympłynnymruchemciągnie się rozmazposzkiełku(ryc. 2).Następniewysuszonyi zabarwio-nyrozmaz (np.metodąGiemsy)ogląda

siępodmikroskopem,używając,zależnieodposzukiwanegopasożyta,obiektywówo powiększeniuod5do100razy.Badaniepreparatówwykonanychz krwiwłośnicz-kowejwykorzystywanejestw diagnostyceinwazjipierwotniakówz rodzajuBabesia,Theileria,Cytauxzoonorazmykoplazmhe-motropowych,takichjakMycoplasma hae­mofelis,M. haemocanisorazM. haemomi­nutum(7,8).Inwazjepowodowaneprzezwymienionepierwotniakiprzenoszonesąprzezkleszcze.Prowadząoneu zwie-rzątdorozwojugroźnychchorób,takichjakbabeszjoza,theileriozaczycytaukszo-onozaz  towarzyszącą imniedokrwisto-ściąi jejkonsekwencjami(7).Z koleimy-koplazmozyhemotropowesąchorobami,któreujawniają siędopierow przebieguinnychchoróbbądźw przypadkuobniże-niaodporności.Chorobomtymrównieżtowarzyszyniedokrwistość, jednakczę-stoichprzebiegzależnyjestwspółistnie-jącejpierwotnejchoroby.Wartorównieżwspomnieć,iżnegatywnywynikbadaniakrwiw kierunkumykoplazmhemotropo-wychniewykluczazakażenia,gdyżbakte-rietepojawiająsięwekrwicyklicznie(9).

Badaniepreparatówkrwiżylnej jestużytecznew diagnostycepiroplazmoz,se-tarioz,filarioz,trypanosomozczyhepato-zoonoz(7,10,11,12).Niezalecasięna-tomiastbadaniarozmazukrwiżylnejpo-branejdoprobówkiz antykoagulantemw kierunkumykoplazmozhemotropowych.Wynikatoz faktu,iżużywanyw probów-kachmorfologicznychantykoagulant–EDTA(werseniansodu),powodujeodkle-jeniezarazkaodpowierzchnibłonyczer-wonychkrwinek,utrudniającw tensposóbpostawienieprawidłowegorozpoznania(8).Z koleimikroskopowebadanie rozmazukrwiw kierunkuzakażeńriketsjamiz ro-dzajuAnaplasmabądźEhrlichiamabar-dzoniskączułośćzewzględunafaktcy-klicznegopojawianiasięmoruli(klastrówbakterii)w komórkachkrwi(13,14).

TestKnotta jestbadaniemwykorzy-stywanymw diagnostycefilarioz, takichjakinwazjeDirofilaria immitis,D. repensorazDipetalonema reconditum.Dopro-bówkiz 3,8%cytrynianemsodupobie-rasię2mlkrwiżylnej.Następniepróbkajesthemolizowanaprzezdodanie10ml2%Ryc. 1. Pobranie krwi do badań mikroskopowych. A – pobranie krwi włośniczkowej. B – pobranie krwi żylnej

A B

Ryc. 2. Technika wykonania rozmazu krwi

Prace poglądowe

20 Życie Weterynaryjne • 2011 • 86(1)

formaliny.Kolejnymetapemjestwirowa-nieprzez5 minutz prędkością2500ob-rotównaminutę.Następniesupernatantzlewanyjestnaszkiełkoi barwionykroplą0,1%błękitumetylenowego.Takwykona-nypreparatoglądanyjestpodmikrosko-pem,przyużyciuobiektywówo powięk-szeniu5i 10 razy(15).Wartotutajrównieżwspomnieć,iżobecniew Polscestwierdzo-nowystępowanieD. repens,nicienia,któ-rypowodujeinwazjenietylkou psów,alerównieżu ludzi(16,17,18).

Badania cytologiczne

W diagnostycechoróbtransmisyjnychwy-korzystujesięrównieżbadaniacytologicz-ne.Materiałemdobadańmogąbyćaspira-tyśledziony,wątroby,szpikukostnegolubwęzłówchłonnychpobranedrogąbiopsjiaspiracyjnejcienkoigłowej.Ponadtowyko-nujesięrównieżbadaniapreparatówodci-skowychwycinkównarządówpobranychdobadańhistopatologicznych.Utrwalonenaszkiełkupodstawowympreparatybar-wisięnajczęściejmetodamiGiemsy,Wri-ghtabądźDiff-Quick.Tegotypubadaniawykorzystujesięgłówniew diagnostycele-iszmaniozy,groźnejchorobyludzii zwie-rzątpowodowanejprzezprzenoszoneprzezćmiankipierwotniakiz rodzajuLeishma­nia (19).Ponadtometodycytologicznestosowanesąrównieżw rozpoznawaniucytaukszoonozyu kotów. Istniejemożli-wośćrozpoznania inwazjipowodowanejprzezCytauxzoon felisnapodstawieba-daniamikroskopowegorozmazukrwi,jed-nakżew cyklurozwojowymtegopasożytawystępujestadiumprzederytrocytarnena-zywaneschizontami,a zasiedlającymima-krofagi.W fazietej,nazywanejschizogonią,niewystępujeparazytemia(obecnośćpa-sożytawekrwi),a cozatymidziebadaniakrwidadząwyniknegatywny.Natymeta-pierozwojuchoroby,podobniejakw przy-padku inwazjipierwotniakówz  rodzajuLeishmania,użytecznesąbadaniacytolo-giczneaspiratówśledziony,wątroby,szpi-kukostnegolubwęzłówchłonnych(20).

Pozawymienionymimetodamibarwie-niazarazkiw badanychpreparatachcyto-logicznychmogąbyćrównieżwykrywanezapomocątechnikiimmunohistochemii.Metodatapoleganapołączeniubadaniamikroskopowegoz reakcjąimmunoenzy-matycznąbądź immunofluorescencyjną.W tejmetodziewykorzystywanesąpoli-klonalnelubmonoklonalneprzeciwciałaskierowaneprzeciwkokonkretnemuan-tygenowiwyznakowaneodpowiednioflu-oresceinąbądźenzymem,któryz dodanymsubstratemspowoduje reakcjębarwną.Przeciwciałapołączonez poszukiwanymantygenem(np.antygenpierwotniakówz  rodzajuLeishmaniaw  formiebezwi-ciowej)powodują świeceniewykrytego

antygenuw świetleUVlubteżzabarwie-nieposzukiwanegopatogenuw wynikureakcjibarwnejenzymuz  jegosubstra-tem(21,22).Wartorównieżdodać,iżzapomocąmetody immunohistochemicz-nejwykryćmożnaprzenoszoneprzezsta-wonogipatogenyw preparatachhistopa-tologicznych.Przykłademmożebyćtutajpośmiertnewykrywaniewirusachorobyskokowej,wirusaśrodkowoeuropejskiegokleszczowegozapaleniamózgulubteżwi-rusaZachodniegoNiluw mózguzwierząt(2,23,24,25).PonadtowirusaZachodnie-goNiluwykrywanozapomocąbadańim-munohistochemicznychw nerkach,nad-nerczachi mięśniusercowymzakażonychpsów(23).Wartorównieżdodać,żebada-niemetodąimmunohistochemiipodką-temobecnościwirusachorobyskokowejdawaćmożewynikifałszywienegatywne.W tymwypadkustosowanejestzarażeniedomózgowe3-tygodniowychmyszyho-mogenatemuzyskanymz mózgupadłychzwierząt(25).Czułość,a takżespecyficz-nośćtestówimmunohistochemicznychza-leżyodużytychprzeciwciał (poliklonal-nebądźmonoklonalne).Użycieprzeciw-ciałmonoklonalnychpowodujezarównozwiększenieczułości (stosunekwynikówprawdziwiepozytywnychdosumywyni-kówprawdziwiepozytywnychi fałszywienegatywnych), jak i  specyficzności testu(stosunekwynikówprawdziwienegatyw-nychdosumywynikówprawdziwienega-tywnychi fałszywiepozytywnych).Wiążesiętojednakrównieżzewzrostemkosz-tówtakichbadań(22).

Badania mikrobiologiczne

Hodowlebakteriinaspecjalnychpodło-żachstosowanesąw  tradycyjnychme-todachmikrobiologiidowykrywaniapa-togennychbakterii.W przypadkuzaraz-kówprzenoszonychprzezpasożytniczestawonogihodowlemogąbyćprowadzo-new kierunkukrętkówz rodzajuBorrelia,jakrównieżpałeczek,takichjak:Francisel­la tularensis,Coxiella burnetii,Yersinia pe­stisorazRickettsiaspp.(2,26,27,28,29).

W diagnostyceboreliozymateriałemdobadań,zależnieodobjawów i  lokali-zacjizmianpatologicznych,są:płynmó-zgowo-rdzeniowy,maźstawowa,wycinkiskóryorazpobieranepośmiertniewycinkinarządówwewnętrznychoraztorebkista-wowej(26,30).Uzyskanymateriałposie-wasięnapodłożeKellegolubjegomody-fikację,podłożeBSK-H(podłożeBarbour-Stoenner-Kellegoz dodatkiemneomycyny,amfoteromycynyi krwikońskiej).Bakterieinkubowanesąw warunkachmikroaero-filnych,w  temperaturze28–33°Cprzez7 dni.Wzrostbakteriiocenianyjestmakro-i mikroskopowoprzyużyciumikroskopuz ciemnympolem.Charakterystycznyjest

braktypowychkoloniibakteryjnych.Kręt-kinapodłożutworzątzw.nalotpełzający(26).Identyfikacjabakteriiprowadzonajestw oparciuo ichwłaściwościbiochemicz-neorazewentualnąreplikację i  sekwen-cjonowanieuzyskanegoz bakteriiDNA(30).W przypadkupałeczekF. tularensis,czynnikaetiologicznegotularemii,mate-riałemdobadańsąaspiratybądźwycin-kiwątroby,śledzionyi węzłówchłonnych.Uzyskanymateriałposiewanyjestnapod-łożeagarz krwiąorazpodłożei inkubowa-nyw warunkachtlenowych,w temperatu-rze37°Cprzez7dni.HodowlanapodłożuMacConkeyadajewyniknegatywny,gdyżpałeczkitularemiinierosnąnatympod-łożu,natomiastnaagarzez krwiątworządrobnekolonie,którez czasemzlewająsięzesobą.Podobniejakw przypadkuiden-tyfikacjikrętkówchorobyz Lymeidenty-fikacjabakteriiprowadzonajestw oparciuo ichwłaściwościbiochemiczneorazwynikłańcuchowejreakcjipolimerazy(27).Ho-dowlapałeczekC. burnetii(czynniketio-logicznygorączkiQ)orazw szczególno-ściY. pestis(pałeczkadżumy)prowadzo-na jestwyłączniew wyspecjalizowanychlaboratoriachzewzględunaznacznysto-pieńpatogennościi zakaźnościtychzaraz-kówdlaludzii zwierząt(27,29).Przypo-dejrzeniuzakażeniajednąz tychpałeczekmateriałemwysyłanymdo laboratoriumsąw przypadkuC. burnetiifragmentyło-żyska,wydzielinapochwyorazzawartośćżołądkaporonionychpłodów,natomiastw przypadkupałeczkidżumy–krew,ropa,plwocina,płynmózgowo-rdzeniowyorazaspiratywęzłówchłonnychw przypadkudymieniczejpostacichoroby(27,29,31).W przypadkuriketsjiz rodzajówRickett­sia,Ehrlichia,Anaplasmai Cowdria,po-dobniejakw przypadkuczynnikówetiolo-gicznychgorączkiQoraztularemii,w prak-tycediagnostycznejw ogólenieprowadzisięhodowli.Hodowleprowadzonesąnazarodkachkurzychbądźhodowlachtkan-kowychwyłączniew specjalistycznychla-boratoriach.W rozpoznawaniuzakażeńriketsjami stosowanesąmetodyserolo-giczneorazmetodybiologiimolekularnej(28).Obecnie,zewzględunaczasochłon-nośćoraztrudnościw izolacjibakterii,jakrównieżzwiązanez tymniebezpieczeństwozakażeń,hodowlebakteryjnewypieranesąprzeznowetechnikibiologiimolekularnejorazmetodyimmunologiczne.

Badania parazytologiczne

W diagnostyceniektórychpasożytówprze-noszonychprzezstawonogizastosowanieznajdująrównieżtradycyjnemikroskopo-wemetodyparazytologiczne.W przypadkuinwazjiu konii bydłapowodowanychprzezprzenoszoneprzezmeszkilubkuczmanynicieniez rodzajuOnchocerca,dobadań

Prace poglądowe

21Życie Weterynaryjne • 2011 • 86(1)

pobierasięwysiękuzyskanyprzezskary-fikacjęskóryw miejscachpredylekcyjnych(wzdłużkresybiałej).Kroplęwysiękuob-serwujesiępodmikroskopem,używającobiektywówo powiększeniu5 i 10razy,bezpośredniopopobraniu.W prepara-ciemożnazaobserwowaćporuszającesiępoliniisinusoidymikrofilarie(12).Z koleiinwazjau konispowodowanaprzezprze-noszoneprzezmuchynicieniez  rodza-jówDraschia lubHabronemamożebyćzdiagnozowananapodstawiemikrosko-powegobadaniakałumetodąflotacjilubjednąz metodlarwoskopowych.Jednak-żew przypadkutychinwazjimetodyko-proskopowemająbardzoniskączułość

i częstodająwynikifałszywienegatywne.Alternatywądlatychbadańw przypadkuskórnejpostacihabronemozyspowodo-wanej inwazjąH. microstomamożebyćbezpośredniepobraniedobadańmikro-skopowychwysiękuz wrzodówpojawia-jącychsięw miejscuziarniniakówzawie-rającegolarwypasożyta(12).

Badania serologiczne

Zewzględunaczasochłonność,czasemniskączułośći swoistośćbądźkosztyorazw niektórychprzypadkachryzykozaka-żeń,tradycyjnemetodymikroskopoweco-razczęściejzastępowanesąprzezbadania

serologiczne.Donajczęściejwykonywa-nychbadańw diagnostycechoróbtrans-misyjnychu zwierzątnależą:testagluty-nacjilateksowej,testyimmunofluorecen-cji,ELISAorazWesternblot.

Test aglutynacji lateksowej

Testyaglutynacji są jednymiz najprost-szych testówserologicznych.Wykorzy-stywanew nichjestzlepianieantygenówpodwpływemswoistychprzeciwciał.W te-ścieaglutynacji lateksowejcząstki latek-suopłaszczoneantygenemzlepiająsięzesobą,tworząckłaczki,jeżeliw badanejsu-rowicyobecnesąprzeciwciałaskierowaneprzeciwkowykorzystanemuw teścieanty-genowi.Test lateksowejaglutynacjizna-lazłzastosowaniew diagnostyceleiszma-niozyu ludzi.W teścietymcząstkilatek-suopłaszczonebyłyprzeciwciałami IgGskierowanymiprzeciwkopierwotniakomz rodzajuLeishmania.Testtenwykorzy-stanybyłdobadańprzesiewowychw dia-gnostyceleiszmaniozyu ludziw Sudaniei wykazałwysokączułośći specyficzność.W teścietymwykrywanoantygenpasoży-taw moczubadanychludzi(32).Zewzglę-dunafakt,iżtesttenwykrywałw moczuantygen,możnaspodziewaćsię, iżznaj-dzieonrównieżzastosowaniew diagno-styceleiszmaniozyu zwierząt.

Testy immunofluorescencji

W testach immunofluorescencjiwyko-rzystywanesąprzeciwciałaznakowanebarwnikamifluorescencyjnymi,np. izo-tiocyjanianemfluoresceiny(FITC),którypowzbudzeniuemitujekolorzielonyczyizotiocyjanianemtetrametylorodaminy(TRITC),którypowzbudzeniuemitujeko-lorczerwony.Rozróżniasię2typytestówimmunofluorescencji:bezpośredni i po-średni(32).Testyteznajdująwykorzysta-niew diagnostycewieluchoróbtransmi-syjnychm.in.leiszmaniozy,anaplazmozygranulocytarnej,ehrlichiozymonocytar-nejczybartonelozy(14,32,33,34).W te-ście immunofluorescencjibezpośredniejpopołączeniusięantygenuz przeciwcia-łem,podwpływempromieniultrafiole-towychdochodzidoświeceniabarwni-kafluorescencyjnego(ryc. 3).Wyniktakiejreakcjiobserwowanyjestprzyużyciumi-kroskopuzeświatłemUVjakoświecenieposzukiwanegoantygenu.Z koleitestim-munofluorescencjipośredniejjesttestemo wyższejczułości.Przeprowadzanyjestonw 2 etapach.W etapiepierwszymdochodzidopołączeniaantygenuz poszukiwanymprzeciwciałem,natomiastw etapiedru-gimpowstałekompleksyimmunologicz-newykrywanesązapośrednictwemprze-ciwciałdrugorzędowychwyznakowanychbarwnikiemfluorescencyjnym(ryc. 4;32).

Ag

FITC

FITC

FITC

FITC

FITC

FITC

FITC

FITC

Ab Ag

UV

Ab

FITC

FITC

FITC

FITC

FITC

FITC

FITC

FITC

AntyAb

AntyAb

AbAgAbAg

AbAgAb

Etap I

Etap II

Ag

UV

Ryc. 3. Zasada testu immunofluorescencji bezpośredniej (Ag – antygen, Ab – przeciwciało, FITC – izotiocyja-nian fluoresceiny, UV – światło ultrafioletowe)

Ryc. 4. Zasada testu immunofluorescencji pośredniej (Ag – antygen, Ab – przeciwciało, Anty Ab – przeciwciało drugorzędowe, FITC – izotiocyjanian fluoresceiny, UV – światło ultrafioletowe)

Prace poglądowe

22 Życie Weterynaryjne • 2011 • 86(1)

ELISA

Kolejnymtestemwykorzystywanymw dia-gnostyceserologicznejchorób transmi-syjnych jestELISA(enzyme-linked im-munoabsorbentassay). Jest to test im-munoenzymatyczny,w którymobecnew badanejsurowicyprzeciwciała,popołą-czeniuz ufiksowanymnaplastikowejpłytceantygenem,wykrywanesąprzezprzeciw-ciaładrugorzędowewyznakowaneenzy-mem(najczęściejperoksydaząchrzano-wą),którypopołączeniuz dodanymsub-stratempowodujereakcjęw postacizmianyzabarwienia(ryc. 5).Natężeniezabarwieniajestproporcjonalnedostężeniawykrytychimmunoglobulin,jednakżedokładnywy-nikjestodczytywanyzapomocąspecjal-nychczytnikówdoELISA.Najczęściejko-mercyjnezestawydoELISAmająpostaćplastikowychpłytek,naktórychobecnychjest96dołków.W każdymz tychdołkówprzeprowadzanajestoddzielnareakcja.Takdużaliczbadołkównajednejpłytcewyni-kaz faktu,iżELISAjesttestemczęstowy-korzystywanymw badaniachprzesiewo-wych.Testimmunoenzymatycznyznalazłzastosowaniew rozpoznawanium.in.ehr-lichiozymonocytarnej(chorobypowodo-wanejprzezEhrlichia canis)czyteżinwa-zjipowodowanychprzeznicienieDirofila­ria immitis(32).

Western blot

Innymznajdującymszerokiezastosowa-nietestemw diagnostyce,w tymrównieżw  diagnostyce chorób transmisyjnych,jestWesternblot.Test tenprzeprowa-dzanyjestw dwóchetapach.Etappierw-szyokreślany jest terminemSDS-PAGE(sodiumdodecylsulfate–poliacrylamidegelelectrophoresis).Jesttotypelektrofo-rezyw żelupoliakrylamidowymprzepro-wadzanejw warunkachdenaturujących,służącejrozdzieleniuwieluróżnychczą-steczekbiałkowych.Białkaposiadającałągamękształtów i  rozmiarówdetermino-wanychstrukturą II-, III- i  IV-rzędową.Zapomocąanionowegodetergentudo-decylosiarczanusodu (SDS),wiążącegosięz białkaminiekowalencyjnie,białkasądenaturowanei oddzielaneodsiebie.Po-nadtozapomocąmerkaptoetanoluzo-stająprzerwanewiązaniadwusiarczkowebiałek.ZastosowanieSDSi merkaptoeta-noluumożliwiauzyskanieliniowejstruk-turybiałeko ładunkuujemnym,coumoż-liwiaichrozdziałwzględemwielkościzapomocąelektroforezyw żelupoliakryla-midowym.Wędrującew żelupolipepty-dyprzemieszczająsięw kierunkuujem-nejelektrody.Dłuższepolipeptydyprze-mieszczająsięwolniej,natomiastkrótszeszybciej.W tensposóbuzyskujesięroz-dzielonewzględemmasymolekularnej

białkanażelupoliakrylamidowymw po-staciprążków(32,35).

Kolejnymetapemtestu jestprzenie-sieniew tensposóbrozdzielonychw poluelektrycznymbiałeknamembranę,np.nitrocelulozową.Dziękitemuuzyskujesięreplikęcząsteczekobecnychw żelupolia-krylamidowymnabłonienitrocelulozowej.

Kolejnymetapemjestinkubacjaw 5%roz-tworzePBS(phosphatebufferedsaline–roztwórchlorkusodubuforowanyfosfo-ranami)z dodatkiemmlekaw proszku,któregobiałkazwiążąwszystkiemiejscaniezwiązane przez rozdzielone w  żelubiałka. Po zablokowaniu przez białkamlekaniezwiązanychmiejscnabłonie

1

Ag Ag Ag

2

Ag Ag Ag

Y Y Y

Y

Y Y

3

Ag

Y Y

Ag

Y Y

Ag

Y Y

4

Ag

Yo YoY Y

Ag

Yo YoY Y

Ag

Yo YoY Y

5

Ag

Yo YoY Y

Ag

Yo YoY Y

Ag

Yo YoY Y

Ryc. 5. Zasada ELISA. 1 – plastikowa płytka opłaszczona antygenem, 2 – zakroplenie na płytkę badanej  surowicy, 3 – połączenie swoistych przeciwciał z antygenem, 4 – dodanie koniugatu białka wiążącego się z przeciwciałem połączonego z enzymem, 5 – dodanie substratu dla enzymu – reakcja barwna

Prace poglądowe

23Życie Weterynaryjne • 2011 • 86(1)

nitrocelulozowej,domieszaniny,w któ-rejzanurzonajestbłona,dodajesiębada-nąsurowicę,którejprzeciwciała,w przy-padkuwynikupozytywnego,zwiążąsię

z odpowiednimprążkiembiałkanatejbło-nie.Następniepowypłukaniumembranyw czystymroztworzePBSdodawanesąprzeciwciaładrugorzędowewyznakowane

enzymem(bądźradioizotopem)wiążącesięz powstającyminabłoniekompleksamiimmunologicznymi.Dodaniesubstratudlaenzymuzwiązanegoz przeciwciałempo-woduje,iżzachodzireakcjabarwnai uwi-docznionezostajeumiejscowieniebiałekbadanejsurowicynamembranie(32,36).

MetodaWestern-blotznalazłazastoso-waniew diagnostycewieluchoróbtransmi-syjnych.Szczególnieprzydatnajestw wy-krywaniuprzeciwciałprzeciwkokrętkomchorobyz Lyme,gdyżwykorzystywanydobadańprzesiewowychtestELISAdajeczę-stowynikifałszywiedodatnie,jakrównieżnieodróżniaprzeciwciałposzczepiennychodprzeciwciałpojawiającychsięw su-rowicyw wynikuzakażenia (32).War-torównieżdodać,iżwykrycieu ludziczyzwierzątprzeciwciałprzeciwkokrętkomboreliozyniejestrównoznacznez rozpo-znaniemchoroby.Opisaniejednakżeca-łejdiagnostykitejchorobyi kryteriówjejrozpoznawaniajestdosyćobszernymte-matemnaoddzielnąpublikację.Diagno-stykętejchorobyorazproblemyzwiąza-nez jejrozpoznawaniemopisaliwcześniejAdaszeki wsp.(30)orazTylewska-Wierz-banowskai Chmielewski(37).

Techniki biologii molekularnej

Używane w  diagnostyce chorób trans-misyjnych techniki biologii molekular-nej wykorzystywane są do wykrywaniaDNAzarazkówlubw przypadkuniektó-rych wirusów ich RNA. Najpowszech-niejsząi coraztańsząmetodąjestłańcu-chowareakcjapolimerazy.Drugąz me-todmającychzastosowaniew diagnostycechoróbtransmisyjnychjesthybrydyzacjaDNA.Metodatajednakniejestjeszczestosowana komercyjnie w  diagnostyceweterynaryjnej.

Łańcuchowa reakcja polimerazy

Łańcuchowareakcjapolimerazy,nazywanapowszechniePCR(polymerasechainreac-tion)poleganawielokrotnympowielaniuokreślonegoodcinkaDNA(wybranejse-kwencjiDNA).Badanew tejreakcjiDNAuzyskiwaniejestprzezizolacjętegokwasuzapomocąkomercyjniedostępnychzesta-wówopartychnazdolnościDNAdowią-zaniazezłożamikrzemionkowymiw wy-sokichstężeniachsolichaotropowych.Ma-teriałemdoizolacjiDNAmożebyćkrewpełna,innepłynyustrojowebądźtkanki.PCRskładasięz 3wielokrotnie(najczę-ściejokoło30razy)powtarzanychetapów.EtapempierwszymjestdenaturacjaDNAprowadzonaw temperaturze94°Cpolega-jącanarozdzieleniupodwójnejniciDNAnadwiepojedynczenici.Kolejnymeta-pemjestprzyłączaniestarterów(krótkichodcinkówDNAkomplementarnychdo

A

B

C

A’

B’

C’

Kier

unek

ele

ktro

fore

zy

100 bp+

500 pz

1

13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

K (+) K (-)2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Ryc. 6. Schemat reakcji PCR. A – podwójna nić wyjściowego DNA; B – denaturacja DNA; C – przyłączanie a  następnie wydłużanie starterów; A’ – uzyskane po pierwszym cyklu dwie kopie podwójnej nici DNA, w których jedna nić ograniczona jest na jednym końcu sekwencją startera; B’ – denaturacja nowo powstałych podwójnych nici DNA oraz przyłączanie i wydłużanie starterów; C’ – uzyskane po drugim cyklu cztery kopie podwójnych nici DNA, z których dwie mają po jednej nici DNA ograniczonej na obu końcach sekwencjami starterów ( produkt PCR)

Ryc. 7. Wizualizacja produktów PCR w żelu agarozowym. Wynik reakcji łańcuchowej polimerazy w kierunku frag-mentu genu małej podjednostki rybosomu Babesia canis; DNA wyizolowano z krwi psów; 100 bp+ – marker masy molekularnej, K (+) – kontrola pozytywna, K (-) – kontrola negatywna, 500 pz – odcinek DNA długości 500 par zasad, 1–22 – badane próbki; wynik pozytywny w próbce nr 10 i 14

Prace poglądowe

24 Życie Weterynaryjne • 2011 • 86(1)

poszukiwanegofragmentuDNA).Tempe-raturaprzyłączaniastarterówzależnajestodichtemperaturytopnieniawynikającejz koleiz ichsekwencjinukleotydoweji naj-częściejmieścisięw przedziale45–70°C.

TrzecimetapemPCRjestwydłużaniestarterów.Etap ten jestprzeprowadzanyw temperaturze72°C.W tymetapieen-zympolimerazaDNA(pierwotnieuzyska-nyz termofilnychbakteriiThermus aqu­aticus)dobudowujedowolnychniciDNAkomplementarnenukleotydy.Wielokrotnenaprzemienneuzyskiwanieróżnychtem-peraturposzczególnychetapówodbywasięw urządzeniunazywanymtermocyklerem(32,38).SchematPCRprzedstawiononaryc. 6.CelemPCRjestreplikacjaokreślo-negoodcinkaDNAdotakdużejilości,iżbędziemożliweuwidocznieniegopood-powiednimwyznakowaniu.Wizualiza-cjaproduktuPCRodbywasięzapomocąelektroforezyDNAw żeluagarozowym.

PoprzeprowadzeniuPCRmieszaninęreakcyjnąz probówkiprzenosisiędospe-cjalnychdołkóww żeluagarozowymz do-datkiembromkuetydyny.Umieszczonew żeluDNAwędrujew poluelektrycznym.Podobnie jakw przypadkuelektroforezybiałekw żelupoliakrylamidowymkrótszeodcinkiDNAprzemieszczająsięszybciej,w związkuz czymprzemieszcząsiędalejw żelu,natomiastdłuższeodcinkiDNAwędrująwolniej,a cozatymidziepoko-nająznaczniemniejsząodległośćw żelu.Równocześniez badanymDNAw sąsied-nimdołkuumieszczanyjestwzorzecmasymolekularnej. Jest tomieszaninaróżnejdługościodcinkówDNA,przyczymdłu-gośćposzczególnychodcinkówjestznana.W związkuz tym,gdyposkończonejelek-troforezienapewnejwysokościw żeluwi-daćprążekDNA,możnaoszacowaćjegodługośćnapodstawiejegopołożeniawzglę-demwzorcamasymolekularnej,którypoelektroforezieprzybierawygląddrabiny,w którejkażdyszczebelodpowiadaod-cinkowiDNAo innej,znanejdługości.Je-żeliw badanymDNAobecnybędzieprą-żekodpowiadającydługościposzukiwa-negofragmentuDNA,totakiwynikPCRuznaćmożnazapozytywny(ryc. 7).DNAuwidacznianyjestw żeluzapomocąświa-tłaUV.Możliwetojestdziękidodanemudożelubromkowietydyny,którywiążesięz DNA,a w świetleultrafioletowymświe-cinapomarańczowo(32,38).

Zewzględunafakt,iżmożliwejestuzy-skanieodcinkanieswoistegoDNAo ocze-kiwanejdługościwynikPCRpowinienzo-staćzweryfikowany.Weryfikacjęproduk-tuPCRmożnaprzeprowadzić, stosującanalizę restrykcyjnąbądźsekwencjono-wanieproduktu.

Analizarestrykcyjnajesttocięcieuzy-skanegoproduktuPCRzapomocąenzy-muendonukleazy restrykcyjnej.Z kolei

endonukleazyrestrykcyjnesąenzymamirozpoznającymiokreślonesekwencje(np.enzymyrestrykcyjneklasy II rozpoznająsekwencjepalindromowe).RozcinająonenićDNAw miejscurozpoznanejsekwen-cjilubw pewnejokreślonejodległościodtej sekwencji.Przykłademmożebyćen-donukleazarestrykcyjnaEcoRIuzyskanaz bakteriiEscherichia coli,którarozcinase-kwencjępalindromowąpomiędzyguaninąa adeniną(ryc. 8).UwidocznionyzapomocąelektroforezyproduktPCRwycinanyjestz żelu.NastępniepowyizolowaniuDNAz żelu,zapomocądostępnychkomercyj-niezestawówprzeznaczonychspecjalnie

dotegocelu,inkubujesięgow probówcerazemz enzymemrestrykcyjnym.ZnającsekwencjęposzukiwanegofragmentuDNAwiadomo,w którymmiejscu(i w ilumiej-scach)enzymrestrykcyjnyprzetniepro-duktPCR.W związkuz tymwiadomo,ja-kiejdługościi ileodcinkówDNApowstaniepotrawieniurestrykcyjnym.Przykładana-lizypokazanonarycinie 9.Jeżelienzymprze-tniefragmentDNAw oczekiwanymmiej-scu,uznajesię,żejesttowynikpozytywny.Wynikanalizyrestrykcyjnejjestsprawdza-nyzapomocąelektroforezyw żeluaga-rozowymz dodatkiembromkuetydyny,a jegouwidocznienienastępujew świetle

Eco RI

Eco RI

3’

3’

G A A T T C

A A T T CC T T A A GG

C T T A A G 5’

3’3’ 5’

3’5’ 5’

5’

3’

5’

AB

C

Kier

unek

ele

ktro

fore

zy

750 pz

500 pz

250 pz

D

Kier

unek

ele

ktro

fore

zyRyc. 8. Miejsce cięcia sekwencji palindromowej w podwójnej nici DNA przez endonukleazę restrykcyjną EcoRI

Ryc. 9. Schemat analizy restrykcyjnej.  A – uwidocznienie produktu PCR w żelu agarozowym, B – izolacja DNA z żelu, C – trawienie enzymem restrykcyjnym wyizolowanego DNA, D – uwidocznienie produktów analizy  restrykcyjnej, 750 pz – odcinek DNA długości 750 par zasad, 500 pz – odcinek DNA o długości 500 par zasad, 250 pz – odcinek DNA o długości 250 par zasad

Prace poglądowe

25Życie Weterynaryjne • 2011 • 86(1)

ultrafioletowym.Istniejeznikomeprawdo-podobieństwo,żeproduktnieswoistyzo-staniepociętynaodcinkio tychsamychdługościachcowłaściwyprodukt(39,40).

InnąmetodąweryfikacjiproduktuPCRjestsekwencjonowanie.W reakcjisekwen-cjonowaniazapomocą jednegostarterapolimerazaDNAprzyłączaznakowanenukleotydy,powielając jednąnićDNA.Następnie sekwencjaodczytywana jestprzezkomputerpodłączonydoaparatudosekwencjonowaniaDNA(sekwenato-ra).Obecnie sekwencjonowaniemDNAzajmująsięwyspecjalizowanekomercyj-nelaboratoria,a kosztsekwencjonowania,podobniejakw przypadkuPCRznaczniesięobniżył(40).

NukleotydowąsekwencjęDNAuzy-skujesięjakowynikw wersjielektronicz-nej.W celuocenieniaczyjesttosekwen-cjaDNApodejrzewanegopatogenu,uzy-skanasekwencjękopiujesię,a następniewklejaw odpowiednieoknow dostępnymzadarmow InternecieprogramieBLAST(http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).Programtenporównujeprzedstawionąse-kwencjęz sekwencjamidostępnymiw ba-ziedanychGenBank®,a następniewyświe-tlaodpowiedźw postaciokreśleniastop-niapodobieństwapomiędzyprzedstawionąsekwencjąa sekwencjamiw baziedanych.W przypadkugdypodobieństwojestwy-sokie,dopodejrzewanegoo zakażeniepa-togenu,w przypadkutejpracypatogenuprzenoszonegoprzezstawonogi,wynikse-kwencjonowaniauznajesięzapozytywny,a więcpotwierdzonyzostajew tensposóbwynikPCR(41,42).ObecniemetodaPCRznajdujezastosowaniew diagnostycewięk-szościchoróbzakaźnych.Stosowanajestm.inw rozpoznawaniuzakażeńpowodo-wanychprzezA. phagocytophilum,Babe­siaspp.czyHepatozoonspp.Ograniczo-nemanatomiastzastosowaniew diagno-styceboreliozyzewzględunaprzejściowąspirochetemię(obecnośćkrętkówwekrwi)i potrzebęuzyskaniadoizolacjiDNAwy-cinkówzmienionychchorobowotkaneklubnarządów(7,10,14,43).

Hybrydyzacja DNA

HybrydyzacjaDNApolegana łączeniudwóchobcychniciDNAnapodstawiekomplementarnościzasad.W metodzietejużywanesąsondyDNA,czyliwyznako-wanefragmentyDNA,coumożliwiauwi-docznienieposzukiwanegoDNAzarazka.SondyDNAznakowanemogąbyćbioty-nąlubradioizotopem.Rozdzielonew żelufragmentyDNAsądenaturowane,a na-stępnieprzenoszonesąbłonęnitrocelulo-zową.Kolejnymetapemtestujestpołącze-niejednoniciowejsondyDNAz poszuki-wanymfragmentemDNA.ZdenaturowaneodcinkibadanegoDNAłącząsięz sondąna

zasadziekomplementarnościzasad(adeni-nałączysięz tyminą,natomiastcytozynaz guaniną).Powypłukaniumembranęni-trocelulozowąnakładasięnabłonęfotogra-ficznąbądźteż,w przypadkuwyznakowa-niasondybiotyną,dodajesięprzeciwciałaprzeciwkobiotyniewyznakowaneenzy-mem.Pododaniusubstratudlaenzymureakcjabarwnaw odpowiednimmiejscunanitrocelulozie(lubteżpojawieniesięza-ciemnienianabłoniefotograficznej)świad-czyo pozytywnymwynikutestu.W ostat-nich latachcorazczęściej stosowana jestmodyfikacja tejmetody, tzw.hybrydyza-cjain situ.W metodzietejskrawkitkaneklubrozmazycytologicznezawierająDNAzdolnedohybrydyzacji.W tymprzypad-kusondyDNAnajczęściejznakowanesąbarwnikiemfluorescencyjnym,a wynikre-akcjiobserwowanyjestpodmikroskopemfluorescencyjnym.W przypadkustosowa-niasondznakowanychbarwnikiemfluore-scencyjnymmetodahybrydyzacjiuzyskałanowąnazwę,a mianowicieFISH(fluore-scence insituhybrydization).Metodatajestbardzoczuła,aleniestetykosztownai pracochłonna,coograniczajejwykorzy-staniew komercyjnejdiagnostycewetery-naryjnej(32,39).Obecniew diagnostycechoróbtransmisyjnychhybrydyzacjaDNAwykorzystywanajestdowykrywaniainwa-zjipowodowanychprzezzarodźcemalariiu ludzi(44,45).HybrydyzacjaDNAjestjed-nąz bardzoobiecującychmetoddiagno-stycznych.Obecniew dobieminiaturyza-cjipojawiająsięnowetechnikibadawcze,takiejakmikromacierzeDNA.Mikroma-cierzeDNAsąodmianąhybrydyzacjiDNAużywanądookreślaniarównocześnieeks-presjiwielugenóww danychtkankach.NaszkiełkopodstawowenaniesionesątysiącesondDNA,naktórenastępnienakładasiębadaneDNA.Wyniktegobadaniaodczy-tywanyjestprzyużyciumikroskopukon-fokalnego i analizowanyprzezprogramkomputerowy(46,47).Możliwejestrów-nieżprzygotowanietakichmikromacierzy,w którychkażdasonda(bądźgrupasond)odpowiadaćbędzie innemuczynnikowizakaźnemu,i dziękitemuw jednymteściemożnabywykonaćrównocześniewieleba-dańw kierunkuzakażeniabądźzarażeniawielomazarazkami,określającrównocze-śnieichszczep,zjadliwośćczylekoopor-ność.Niestetyobecniezastosowaniemi-kromacierzyDNAw praktyceweterynaryj-nejograniczonejestprzezbardzowysokiekosztytychbadań.

Podsumowanie

Znajomośćwykonywanychprzez labo-ratoria testów jest istotnadlapraktyku-jącychw  lecznicach lekarzyweterynarii,gdyżtoonizlecająbadaniai decydująjakimateriałnależypobraćdobadań(a jestto

częstozależneodwykonywanegotestu).Praktykującylekarzweterynarii,zlecającbadaniedecyduje,którątechnikąmaonozostaćwykonane,mającświadomośćwadi zaletdanegobadaniaorazjegokosztów.Ponadtobadaniawykonywanew kierunkudiagnostykichoróbtransmisyjnychnajczę-ściejwykonywanesąw dalszejkolejności,gdynajczęstszeprzyczynychorobyzosta-nąjużwykluczone.Wiążesiętoz koszta-mi,którewłaścicielzwierzęciajużponiósłnawcześniejszebadaniai w takiejsytuacjinależyprzekonaćgodowykonaniakolej-nychbadań,w czymmożepomócrzeczowewytłumaczenienaczymtobadaniepolega.Ponadtow opiniiautorówwartorównieżpoznawaćnowoczesne technikidiagno-styczneniemające jeszczezastosowaniaw diagnostycekomercyjnejzewzględunawysokiekoszty (np.FISHczymikroma-cierzeDNA),gdyżmożnaprzypuszczać,iżw przyszłości techniki tepotaniejąnatyle,żezostanąrównieżwprowadzonedodiagnostykikomercyjnej,podobniejaktosięstałoz niedostępnąjeszczeniedawnow praktyceweterynaryjnejmetodąPCR.

Pozatestamiukierunkowanyminawy-krywaniezarazków,w diagnostycelabora-toryjnejchoróbtransmisyjnychzastosowa-nieznajdująrównieżbadaniadodatkowenieprowadzącebezpośredniodowykryciapatogenu,jednakżewskazującenauszko-dzeniaróżnychnarządóworazułatwiającepostawieniepodejrzeniachorobytransmi-syjnej.Dobadańtychzaliczyćmożnaba-daniemorfologicznekrwi,badaniabio-chemicznesurowicyorazbadanieogólnemoczu.Technikitychbadańzostanąopi-sanew drugiejczęściartykułupoświęco-nej laboratoryjnymbadaniomdodatko-wymstosowanymw diagnostycechoróbtransmisyjnych.

Piśmiennictwo

1. ShawS.,DayM.:Introduction.W:ShawS.E.,DayM.J.:Arthropod­borne Infectious Diseases of the Dog and Cat.MansonPublishing,London2005,9-10.

2. ShawS.:Otherarthropod-borneinfectionsofdogsandcats.W:ShawS.E.,DayM.J.:Arthropod­borne Infectious Diseases of the Dog and Cat.MansonPublishing,Lon-don2005,138-142.

3. SiudaK.:Stawonogia chorobytransmisyjne.W:Dery-łoA.:Parazytologia i akaroentomologia medyczna.Wy-dawnictwoNaukowePWN,Warszawa2002,423-444.

4. FukumotoS,SuzukiH,IgarashiI,XuanX.:Fatalexperi-mentaltransplacentalBabesia gibsoniinfectionsindogs.Int. J. Parasitol.2005,35,1031-1035.

5. IrwinP.J.:Caninebabesiosis:frommoleculartaxonomytocontrol.Parasit. Vectors2009,2(Suppl1):S4.

6. JohnsonE.M.,AllenK.E.,PancieraR.J.,LittleS.E.,EwingS.A.:InfectivityofHepatozoon americanum cystozoitesfora dog.Vet. Parasitol.2008,154,148-150.

7. IrwinP.:Babesiosisandcytauxzoonosis.W:ShawS.E.,DayM.J.:Arthropod­borne Infectious Diseases of the Dog and Cat.MansonPublishing,London2005,63-77.

8. TaskerS.:Felineinfectiousanaemia.W:ChandlerE.A.,GaskellC.J.,GaskellR.M.:Feline Medicine and Therapeu­tics.BlackwellPublishing,BSAVA,3rded.Oxford2004,669-678.

9. HarveyJ.W.:Hemotrophicmycoplasmosis(hemobarto-nellosis).W:GreeneC.E.:Infectious Diseases of the Dog and Cat.SaundersElsevier,St.Louis2006,252-260.

Prace poglądowe

26 Życie Weterynaryjne • 2011 • 86(1)

10. BanethG.,Vincent-JohnsosnN.:Hepatozoonosis.W:ShawS.E.,DayM.J.:Arthropod­Borne Infectious Diseases of the Dog and Cat.MansonPublishing,London2005,78-88.

11. FerasinL.,KnightD.:Filarialinfections.W:ShawS.E.,DayM.J.:Arthropod­Borne Infectious Diseases of the Dog and Cat.MansonPublishing,London2005,51-61.

12. TaylorM.A.,CoopR.L.,WallR.L.:Veterinary Parasito­logy.3rded.BlackwellPublishing,Oxford2007.

13. GreigB.,ArmstrongP.J.:Caninegranulocytotropicana-plasmosis (A. phagocytophilum infection).W:GreeneC.E.:Infectious Diseases of the Dog and Cat.SaundersEl-sevier,St.Louis2006,219-224.

14. HarrusS.,WanerT.,BjoersdorfA.,ShawS.:Ehrlichiosisandanaplasmosis.W:ShawS.E.,DayM.J.:Arthropod­bor­ne Infectious Diseases of the Dog and Cat.MansonPubli-shing,London2005,120-133.

15. ArandaC.,PanyellaO.,EritjaR.,CastellaJ.:Caninefi-lariasis importanceand transmission in theBaixLlo-bregatarea,Barcelona(Spain).Vet. Parasitol.1998,77,267-275.

16. CieleckaD.,SzymańskaK.,SalamatinR.,TomaszewskaA.:PrzypadekinwazjiDirofilaria repens(Leidy,1856)(Ne-matoda:Filarioidea:Onchocercidae)u pacjentaw War-szawie.Wiad. Parazyt.2007,53 (suplement),165.

17. WesołowskaM.,SzalińskiM.,ZielińskiM.,OkulewiczA.,KiszaK.,Misiuk-HojłoM.:Dirofilaria repens–pierwszyprzypadekdirofilariozypodspojówkowejw Polsce.Prze­wodnik Lekarza2009,12,65.

18. DemiaszkiewiczA.W.,PolanczykG.,PyzielA.M.,Ku-ligowska I.,Lachowicz J.:Pierwszeogniskadirofilario-zypsówwywołanejprzezDirofilaria repensRaillietetHenry,1911w centralnejPolsce.Wiad. Parazyt.2009,55,367-370.

19. SapierzyńskiR.,WojtczakM.,SapierzyńskaE.:Leiszma-niozau psów.Życie Wet.2008,83,113-117.

20. GreeneC.E.,MeinkothJ.,KocanA.A.Cytauxzoonosis.W:GreeneC.E.:Infectious Diseases of the Dog and Cat.SaundersElsevier,St.Louis,2006,716-722.

21. OsbornM.:Immunofluorescencemicroscopyofcultu-redcells.W:CelisJ.E.:Cell Biology, A Laboratory Hand­book,VolumeI.3rded.ElsevierAcademicPress,London2006,549-555.

22. Dolka I.: Immunohistochemia w  diagnostyceweterynaryjnej–szerokiespektrumzastosowań.Medy­cyna Wet.2009,65,752-757.

23. LichtensteigerC.A.GreeneC.E.:WestNilevirusinfec-tion.W:GreeneC.E.:Infectious Diseases of the Dog and Cat. SaundersElsevier,St.Louis2006,192-195.

24. TipoldA.,VandeveldeM.:CentralEuropeantick-borneencephalitis.W:GreeneC.E.:Infectious Diseases of the Dog and Cat.SaundersElsevier,St.Louis,2006,195-196.

25. ReidH.W.:Louping-Ill.W:GreeneC.E.: Infectious Di­seases of the Dog and Cat.SaundersElsevier,St.Louis,2006,196-197.

26. BinekM.,RzewuskaM.:Badaniaukierunkowanew za-kresiekrętków.W:MalickiK.,BinekM.:Zarys klinicz­nej bakteriologii weterynaryjnej,TomII.WydawnictwoSGGW,Warszawa2004,23-43.

27. BinekM.:Wykrywanietlenowychgramujemnychpałe-czeki ziarniaków.W:MalickiK.,BinekM.:Zarys klinicz­nej bakteriologii weterynaryjnej, TomII.WydawnictwoSGGW,Warszawa2004,49-85.

28. BinekM.:Badaniaw zakresieriketsji.W:MalickiK.,Bi-nekM.:Zarys klinicznej bakteriologii weterynaryjnej,TomII.WydawnictwoSGGW,Warszawa2004,229-233.

29. JakubczakA.:Diagnostykalaboratoryjnadżumyi yersi-nioz.W:MalickiK.,BinekM.:Zarys klinicznej bakterio­logii weterynaryjnej,TomII.WydawnictwoSGGW,War-szawa2004,166-179.

30. AdaszekŁ.,KalinowskiM.,KutrzebaJ.,ZiętekJ.,Winiar-czykS.:Trudnościw diagnostyceboreliozyu psów.Życie Wet.2010,85,414-417.

31. GrygorczukS.,Hermanowska-SzpakowiczT.:PałeczkaYersinia pestis jakoniebezpiecznabrońbiologiczna.Me­dycyna Pracy2002,53,343-348.

32. KennyM.:Laboratorydiagnosisofarthropod-transmit-tedinfections.W:ShawS.E.,DayM.J.:Arthropod­borne Infectious Diseases of the Dog and Cat.MansonPubli-shing,London2005,41-50.

33. BirtlesR.:Bartonellosis.W:ShawS.E.,DayM.J.:Arthro­pod­borne Infectious Diseases of the Dog and Cat.Man-sonPublishing,London2005,110-119.

34. LaurentiM.D.,OrnA.,SinhoriniI.L.,CorbettC.E.P.:TheroleofcomplementintheearlyphaseofLeishmania (Le­ishmania)amazonensis infectioninBALB/cmice.Braz. J. Med. Biol. Res.2004,37,427-434.

35. WuZ.L.,EthenC.M.,LarsonS.,PratherB., JiangW:A versatilepolyacrylamidegelelectrophoresisbasedsul-fotransferaseassay.BMC Biotechnology2010,10,11(http://www.biomedcentral.com/1472-6750/10/11).

36. TowbinH.,StaehelinT.,GordonJ.:Electrophoretictrans-ferofproteinsfrompolyacrylamidegelstonitrocellulo-sesheets:Procedureandsomeapplications.Proc.Natl. Acad. Sci. USA1979,76,4350-4354.

37. Tylewska-WierzbanowskaS.,ChmielewskiT.Diagnosty-kaserologicznaboreliozyz Lyme,wytyczneeuropejskie.Post. Mikrobiol.2005,44,289-293.

38. GasserR.B.:PCR-basedtechnologyinveterinaryparasi-tology.Vet. Parasitol.1999,84,229-258.

39. Bartkowiak J.:Badaniamolekularnew rozpoznawaniui  różnicowaniuchoróbzakaźnych. Przegl. Epidemiol,2003,57,381-389.

40. TurnerP.C.,McLennanA.G.,BatesA.D.,WhiteM.R.H.:Biologia molekularna.WydawnictwoNaukowePWN,Warszawa1999.

41. AltschulS.F.,GishW,MillerW.,MyersE.W.,LipmanD.J.:Basiclocalalignmentsearchtool.J. Mol. Biol.1990,215,403-410.

42. HiggsP.G.,AttwoodT.K.:Bioinformatyka i ewolucja mole­kularna.WydawnictwoNaukowePWN,Warszawa2008.

43. HoviusK.E.:Borreliosis.W:ShawS.E.,DayM.J.Arthro­pod­borne Infectious Diseases of the Dog and Cat.Man-sonPublishing,London2005,100-109.

44. TangpukdeeN.,DuangdeeC.,WilairatanaP.,KrudsoodS.:Malariadiagnosis:A briefreview.Korean J. Parasitol,2009,47,93-102.

45. KimT.S.,KimH.H.,LeeS.S.,NaB.K.,LinK.,ChoS.H.,KangY.J.,KimD.K.,SohnY.,KimH.,LeeH.W.:PrevalenceofPlasmodium vivaxVK210andVK247subtypeinMyan-mar.Malar J.2010,9,195(doi:10.1186/1475-2875-9-195).

46. Kozak-CięszczykM.:Diagnostykamolekularnaw para-zytologii.Kosmos2005,54,49-60.

47. JarosS.,ZygnerW.,JarosD.:Zastosowanietechnikimi-kromacierzyw naukachmedycznych.Życie Wet.2006,81,42-49.

Dr Wojciech Zygner, Zakład Parazytologii i Inwazjologii, Katedra Nauk Przedklinicznych, Wydział Medycyny We-terynaryjnej SGGW, ul. Ciszewskiego 8, 02-786 Warszawa

Wiedzanatematwytwarzania,prze-mian i wydalaniamleczanówleży

u podstawzrozumieniawieluprocesówchorobowych,przebiegającychzewzro-stemstężeniamleczanówwekrwi(hiper-laktacydemią)i kwasicąmleczanową.Do-stępnenarynkuurządzeniadodiagnosty-kilaboratoryjnej,w tymprostew użyciuanalizatoryprzenośne(pointofcareana-lyzers),umożliwiają szybkieoznaczeniestężeniamleczanówwekrwiobwodo-wejpacjentów.Wyniktegobadaniamożebyć dobrym czynnikiem prognostycz-nymprzeżywalnościpsówz  rozszerze-niemi skrętemżołądka(1),babeszjozą(2,

3)czyidiopatycznąniedokrwistościąhe-molitycznątłaimmunologicznego–IMHA(4),znajdującychsięw stanachkrytycznych(5)i pourazach(6).Udowodnionorównieżjegoprzydatnośćw rozpoznawaniuwysię-kuseptycznegoi o charakterzenowotwo-rowymdojamybrzusznej(7,8,9),obecno-ścipłynuw workuosierdziowym(10)i za-toruaortyu psówi kotów(11).Ponadto,parametrtenz powodzeniemstosowanyjestdookreślaniastopniauogólnionejhi-poperfuzjiwewstrząsiehipowolemicznym,a zarównow medycynie,jaki w weteryna-riijegowartośćponiżej2mmol/lprzyjmo-wanajestjakojedenz celówresuscytacji

krążeniowo-oddechowej(12,13).W arty-kulezostaniedokonanyprzeglądpublikacjiweryfikującychdotychczasprzyjętei pro-ponującychnowesposobywykorzystaniaocenystężeniamleczanóww diagnostyceweterynaryjnej.

Dwie twarze kwasu mlekowego

Spośróddwóchizomerówprzestrzennychkwasumlekowego,formLi D,z punktuwi-dzenialekarzamałychzwierząt,przydat-ne jestoznaczenie stężeniaL-mleczanuwekrwii tow odniesieniudotegozwiąz-kuużywasięokreśleń:hiperlaktacydemiai kwasicamleczanowa.Obydwaizomerypowstająz pirogronianuw wynikubeztle-nowegometabolizmuglukozy,przyudzialespecyficznejdehydrogenazymleczanowej:dehydrogenazyL-mleczanowej (L-LDH)dlakwasuL-mlekowegoorazdehydroge-nazyD-mleczanowej(D-LDH)dlakwasuD-mlekowego.W komórkachssakówniewystępujedehydrogenazaD-mleczanowa,a zatemkwasD-mlekowymożeu nichpo-chodzićalboz przemianmetyloglioksa-lu,albomożebyćdostarczanyspozaor-ganizmu.NajczęściejkwasD-mlekowy

Przydatność badania stężenia mleczanów we krwi obwodowej i płynach z jam ciała małych zwierząt

Magdalena Kalwas, Anna Winnicka, Andrzej Degórski

z Zakładu Patofizjologii Zwierząt Katedry Patologii i Diagnostyki Weterynaryjnej Wydziału Medycyny Weterynaryjnej w Warszawie

Prace poglądowe

27Życie Weterynaryjne • 2011 • 86(1)