STRESZCZENIE Zofia Magier N - Postępy Biochemii · niem przez neurotransmitery znana jest jako...

456 www.postepybiochemii.pl

Zofia Magier

Robert Jarzyna

Zakad Regulacji Metabolizmu, Instytut Bio-chemii, Wydzia Biologii Uniwersytetu War-szawskiego, Warszawa

Zakad Regulacji Metabolizmu, Instytut Biochemii, Wydzia Biologii Uniwersytetu Warszawskiego, ul. Miecznikowa 1, 02-096 Warszawa; tel.: (22) 55 43 204, e-mail: [email protected]

Artyku otrzymano 15 wrzenia 2014 r.Artyku zaakceptowano 1 padziernika 2014 r.

Sowa kluczowe: receptory dla nukleotydw, receptory dla adenozyny, rdbonek, komrki mini gadkich naczy

Wykaz skrtw: CAMKK (ang. calcium/calmo-dulin-dependent protein kinase kinase) kinaza kinaz zalenych od Ca2+ i kalmoduliny; CGRP (ang. calcitonin gene-related peptide) peptyd zwizany z genem kodujcym kalcytonin; EC (ang. endothelial cells) komrki rdbon-ka; EDRF (ang. endothelium-derived relaxing factor) czynnik rozluniajcy pochodzenia rdbonkowego; EJPs (ang. excitatory junc-tion potentials) synaptyczne potencjay po-budzajce; fMLP N-formyl Met-Leu-Pro; GENC (ang. glomerular endothelial cells) kbuszkowe komrki rdbonka; NA nor--adrenalina; NFAT (ang. nuclear factor of activa-ted T cells) czynnik jdrowy aktywowanych limfocytw T; NO tlenek azotu; NOS syn-taza tlenku azotu; ORCC (ang. outwardly recti-fying chloride channel) kana usuwajcy jony chlorkowe z komrki; PDG peptydoglikan; PDGF (ang. platelet-derived growth factor) pytkopochodny czynnik wzrostu; PE (ang. phenylephrine) fenylefryna; SUR (ang. sulfo-nylurea receptor) receptor dla pochodnych sulfonylomocznika; Up4A (ang. uridine ade-nosine tetraphosphate) urydyno adenozyno czterofosforan; VNUT (ang. vesicular nucleotide transporter) pcherzykowy transporter nu-kleotydowy; VSMC (ang. vascular smooth mu-scle cells) komrki mini gadkich naczy krwiononych; ,-meATP ,-metyleno ATP

Podzikowania: Autorzy dzikuj pani Alek-sandrze Wrblewskiej za wykonanie rysunku.

Udzia receptorw nukleotydowych w regulacji funkcji naczy krwiononych

STRESZCZENIE

Niemal 50 lat temu zostaa opisana funkcja ATP jako czsteczki sygnaowej. W cigu tego czasu odkryto receptory, ktre mog by aktywowane przez ATP, UTP, ADP, UDP oraz adenozyn. Obecnie badany jest nie tylko mechanizm przekazywnia sygnau od receptorw, ale take bardzo zoona regulacja zmian ste nukleotydw na zewntrz komrki. W na-czyniach krwiononych przesyanie sygnau purynergicznego wykorzystywane jest przede wszystkim do utrzymania napicia mini gadkich i tym samym utrzymania prawidowego cinienia krwi. ATP uwalniane razem z noradrenalin z zakocze nerww wspczulnych powoduje skurcz naczy i tym samym wzrost cinienia, podczas gdy ATP znajdujce si w wietle naczynia stymuluje komrki rdbonka do produkcji czynnikw rozluniajcych minie naczynia. Nukleotydy i nukleozydy przyczyniaj si take do wzrostu i przebudo-wy naczy. W chorobach sercowo-naczyniowych, ktre s plag naszych czasw, obserwuje-my zaburzenia w przesyaniu sygnau purynergicznego, dlatego receptory dla nukleotydw wydaj si by dobrym celem terapii farmakologicznej.

WPROWADZENIE

W klasycznym ujciu adenozyno-3-fosforan (ATP) jest gwnym wymien-nikiem energii w komrce. Podczas utleniania makroczstek powstaych ze strawionego pokarmu w cyklu kwasu cytrynowego redukowane s nukleoty-dy NAD+ oraz FAD bdce donorami elektronw dla acucha oddechowego. Nastpnie elektrony transportowane s przez acuch oddechowy w szeregu reakcji redoks na tlen czsteczkowy, a sprzony z transportem elektronw transport protonw generuje gradient elektrochemiczny w poprzek wewntrz-nej bony mitochondrialnej. Wyrwnywanie si gradientu jest si napdzajc syntez ATP. Nukleotyd ten jest nastpnie transportowany do cytozolu, gdzie akumuluje si w steniach milimolowych [1]. Prawie 50 lat temu zostaa opi-sana zupenie nowa funkcja ATP jako zewntrzkomrkowej czsteczki sygnao-wej. Dalsze badania wykazay, e ATP moe by transportowany z wielu typw komrek i oddziaywa para- i/lub autokrynnie. W 1971 roku Burnstock uy po raz pierwszy okrelenia purynergiczne w odniesieniu do nerww autono-micznego ukadu nerwowego, ktre do przekazania sygnau uyway nie cz-steczek noradrenaliny czy acetylocholiny, ale wanie nukleotydu purynowego ATP. Od tego czasu zaobserwowano rwnie komunikacj midzy komrkami za pomoc nukleotydw pirymidynowych UTP i UDP, wic mechanizm ten i receptory obecnie nazywa si nukleotydowymi, cho w literaturze wci mona spotka okrelenie purynergiczne. Podczas gdy efekty jakie wywiera zewn-trzkomrkowy ATP na komrk zostay szeroko opisane, nadal nie do koca znany jest mechanizm zaangaowany w jego transport na zewntrz rnych typw komrek. Jest to spowodowane midzy innymi tym, e badanie przesy-ania sygnau nukleotydowego jest niezwykle trudne, poniewa mechanizmy regulujce rni si nie tylko midzy poszczeglnymi gatunkami, ale nawet midzy rnymi naczyniami penicymi specyficzne role fizjologiczne w jed-nym osobniku [2].

Czstym zjawiskiem w wikszoci naczy krwiononych jest podwjna kon-trola napicia cian, z jednej strony poprzez ATP wydzielane razem z noradre-nali (NA) przez nerwy ukadu wspczulnego, co prowadzi do skurczu naczy, z drugiej, poprzez ATP wydzielane przez komrki rdbonka, np. po zadziaa-niu wzmoonej siy cinajcej (ang. shear stress) powodujce rozlunienie cian naczy [2].

Przekazywanie sygnau przez nukleotydy nie ogranicza si jedynie do cian naczy krwiononych, jednak w tym miejscu jest szczeglnie wane. rdbonek wycielajcy naczynia ley na styku dwch rodowisk i znajduje si w cigym kontakcie z rnymi, nieustannie zmieniajcymi si czynnikami. W zwizku z tym, umiejtno szybkiej i precyzyjnej komunikacji midzy ssiednimi komr-

Postpy Biochemii 60 (4) 2014 457

kami jest niezwykle istotna. Zewntrzkomrkowe stenie nukleotydw jest kontrolowane przez 17 enzymw degra-dujcych, zgrupowanych w 4 rodziny oraz odbierane przez 19 receptorw z trzech grup: P1 (4 receptory), P2X (7 recep-torw) oraz P2Y (8 receptorw). Do tej pory nie zidentyfiko-wano reakcji zachodzcych na zewntrz komrki, ktre wy-magayby obecnoci ATP, wic prawdopodobnie jego rola w tym miejscu ogranicza si do przekazywania sygnau [3].

PODWJNA KONTROLA NAPICIA CIAN NACZY KRWIONONYCH PRZEZ NERWY PRZYWSPCZULNE I KOMRKI RDBONKA

Efekty sygnaw generowanych przez ATP zostay za-obserwowane w naczyniach krwiononych zarwno pod-czas warunkw fizjologicznych jak i patologicznych (m.in. podczas przekrwienia, rozszerzenia naczy krwiononych wywoanego niedotlenieniem, skurczu naczy wywoa-nych sygnaem od receptora -adrenergicznego, nadci-nienia, proliferacji mini gadkich naczy w miadycy i restenoz po angioplastyce ttnic). Poznanie i zrozumienie mechanizmw regulujcych uwalnianie nukleotydw, ich zewntrzkomrkow degradacj oraz cieki przekazywa-nia sygnaw jest kluczowe dla zgbienia wiedzy dotycz-cej stanw patofizjologicznych naczy krwiononych oraz opracowania nowych bd ulepszenia ju istniejcych le-kw [2].

Przez wiele lat wydawao si, e napicie naczyniowe jest kontrolowane jedynie przez dziaajce antagonistycznie wspczulne nerwy noradrenergiczne zwikszajce napi-cie cian naczy oraz przywspczulne nerwy cholinergicz-ne dziaajce rozluniajco. Jednak po zidentyfikowaniu i opisaniu czsteczek EDRF (ang. endothelium-derived rela-xing factor), rdbonkowych czynnikw rozluniajcych (minie gadkie naczy krwiononych), ktrych gwnym skadnikiem wydaje si by obecnie tlenek azotu (NO), stao si jasne, e napicie cian naczy krwiononych znajduje si pod podwjn kontrol kotransmiterw uwalnianych przez nerwy obwodowe oraz rnych czynnikw uwalnia-nych przez komrki rdbonka [4]. Zanim opisano prze-syanie sygnau purynergicznego, opisane zostay receptory dla puryn: rodzina P1 aktywowana przez adenozyn oraz rodzina P2, dzielca si dalej na podrodziny P2X oraz P2Y [5], aktywowana ATP i ADP (adenozyno-2-fosforan) [6]. Niemal dekad pniej receptory P2 zostay zidentyfikowa-ne na miniach gadkich naczy oraz na komrkach rd-bonka [7], a niedugo pniej zaobserwowano uwalnianie ATP przez komrki rdbonka w odpowiedzi na zmiany siy cinajcej generowanej przez przepywajc krew lub hipoksj [8].

REGULACJA NAPICIA CIAN NACZY PRZEZ NERWY OKOONACZYNIOWE

W wielu naczyniach krwiononych zarwno mechanicz-ne jak i elektryczne przekazywanie sygnau po podranie-niu nerwu okoonaczyniowego jest czciowo niewraliwe na dziaanie agonistw receptora -adrenergicznego. Wy-niki wielu bada wskazuj na kotransmisj NA i ATP w zakoczeniach okoonaczyniowych nerww ukadu wsp-czulnego. Doniesienia te jednake rni si midzy sob proporcjami wydzielanych mediatorw.

Wydaje si, e NA i ATP s przechowywane oddzielnie w zakoczeniach nerww wspczulnych, poniewa uwal-nianie NA jest kontrolowane przez wapniowe kanay jono-we typu N oraz P/Q, podczas gdy uwalnianie ATP wyma-ga jedynie aktywnych kanaw typu N [9]. Efekt skurczu mini gadkich naczy krwiononych powodowany przez ATP uwalniane z zakocze nerww wspczulnych wy-daje si by przekazywany gwnie przez receptory P2X1, cho z rnych bada wynika, e w miniach gadkich na-czy produkowane s receptory z rodziny zarwno P2X jak i P2Y. Skupienie uwagi na receptorach P2X wynika z faktu, e udao si zidentyfikowa ich bezporedni rol w przeka-zywaniu sygnau od ATP jako neurotransmitera uwalniane-go przez okoonaczyniowe nerwy wspczulne, a badania nad tym receptorem stay si o wiele prostsze, kiedy odna-leziono dla niego selektywnych agonistw dostpnych ko-mercyjnie. Ponadto klastry receptorw P2X1 zostay ziden-tyfikowane w regionach mini gadkich naczy lecych w ssiedztwie nerww wspczulnych [10], co odpowiada na pytanie dlaczego na miniach gadkich receptory P2X, a nie P2Y s zaangaowane w kotransmisj sygnau od ze-wntrzkomrkowego ATP [4].

Aktywacja jonotropowych receptorw P2X prowadzi do szybkiego wpuszczenia do komrki jonw wapnia, co prowadzi do depolaryzacji bony i dalszego napywu jonw wapnia do komrki przez kanay wapniowe aktywowane napiciem. Noradrenalina natomiast dziaa wolniej, ponie-wa sygna od receptora adrenergicznego jest przekazywa-ny poprzez biaka G. Sygnay od ATP i NA mog dziaa synergistycznie dajc efekt nagego i dugotrwaego skur-czu [11].

W cigu ostatnich 3 lat opisano zjawisko aktywacji recep-torw 1-adrenergicznych w miniach gadkich naczy krwiononych, ktre prowadzio do otwarcia kanaw pa-neksyny 1 i uwolnienia ATP, co wywoywao zwikszony skurcz cian naczy. Na podstawie tych obserwacji mona wysnu wnioski o regulacji oporu obwodowego i cinienia krwi przez wspczulny ukad nerwowy [12].

Uywajc techniki obrazowania konfokalnego z wyko-rzystaniem jonw wapnia w ttnicach krezki szczura wyka-zano, e ATP uwalniane z zakocze nerwowych powodo-wao wczesne rozchodzenie si fal wapniowych przez po-czenia szczelinowe, po ktrym rozwijay si fale wapniowe spowodowane uwolnieniem NA [13].

Nifedypina, inhibitor kanaw wapniowych typu L ha-muje dziaanie sygnau nukleotydowego na skurcz naczy krwiononych stymulowany nerwami wspczulnymi w ttnicach krezki psa i szczura oraz ttnicach jelita krtego, okrnicy oraz odpiszczelowej krlika. Zjawisko to suge-ruje, e aktywacja receptorw P2X w miniach gadkich naczy krwiononych przez ATP wywouje napyw jonw wapniowych do komrki poprzez kanay wapniowe typu L zalene od potencjau bony. Niemniej jednak w ttniczkach podluzwkowych jelita cienkiego winki morskiej skurcz naczy krwiononych, w ktrym poredniczy P2X jest nie-wraliwy na dziaanie nifedypiny [4].


ATP jest istotnym skadnikiem przekanictwa neuronal-nego w nerwach wspczulnych w ttnicy odpiszczelowej krlika [14] oraz ttnicy krezki [15]. Szczeglnie w ttnicz-kach podluzwkowych jelita cienkiego winki morskiej i ttnicach jelita czczego krlika ATP wydaje si by gw-nym, jeli nie jedynym mediatorem skurczu naczy krwio-nonych w odpowiedzi na dranienie nerwem wspczul-nym, a wspwydzielana NA dziaa jako modulator presy-naptyczny [16]. ATP zostao rwnie opisane jako wany czynnik w adrenergiczno-purynergicznej kotransmisji sy-gnau w ttnicach: wtrobowej i jelitowej krlika [4].

Depolaryzacja mini gadkich wywoana pobudze-niem przez neurotransmitery znana jest jako synaptyczny potencja pobudzajcy (EJPs, ang. excitatory junction poten-tials). Wewntrz- i zewntrzkomrkowe zapisy z ttnicy udowej szczura zostay wykorzystane do zademonstro-wania przerywanego uwalniania pojedynczego kwantu ATP odpowiedzialnego za EJP i ukazania podobiestwa do zdarze wystpujcych podczas wspczulnej kotransmi-sji w nasieniowodach [17]. W ttnicach ogona szczura EJP s odporne na dziaanie prazosyny (ang. prazosin, bloker -adrenergiczny specyficzny dla receptorw 1) [18], ale blokowane przez dziaanie ,-metylenu ATP (,-meATP, ang. ,-methylene ATP) [19] oraz agonist receptorw z rodziny P2, suramin [20]. Jednak ilo uwalnianego ATP w stosunku do NA przez nerwy wspczulne unerwiajce to naczynie wydaje si by duo mniejsza, co sprawia, e zaobserwowanie opornego na prazosyn purynergicznego skadnika tego sygnau jest bardzo trudne. Na podstawie tych obserwacji stwierdzono, e NA moe by waniejszym kotransmiterem podczas umiarkowanej aktywnoci, pod-czas gdy ATP mogoby by istotniejsze podczas szybkich skurczy [21]. W ttnicy krezki szczura stymulacja EJP oraz uwalnianie NA moe by modulowane w sposb rozdziel-ny, co potwierdza teori mwic, e ATP i NA s magazy-nowane w rnych klasach pcherzykw i mog by uwal-niane w rnych wzajemnych proporcjach, w zalenoci od typu stymulacji [22].

Podczas ekspozycji na nisk temperatur zmniejsza si przepyw krwi do skry, co zapobiega zbyt duej utracie ciepa. U psa jest to osigane poprzez odruchowe zwik-szenie napicia podskrnych naczy krwiononych w od-powiedzi na stymulacj nerwami wspczulnymi. Zjawisko to jest odporne na dziaanie antagonistw receptora adre-nergicznego, a hamowane jest przez odczulenie receptorw P2X dziki ,-meATP. Moe to sugerowa, e przesyanie sygnau purynergicznego jest szczeglnie wane w proce-sie termoregulacji oraz wyjania fakt, czemu kotransmi-sja purynergiczna jest bardziej widoczna w podskrnych naczyniach krwiononych w stosunku do tych pooonych w wewntrznych partiach organizmu [4].

NA i ATP wywieraj efekt obkurczajcy na wik-szo naczy krwiononych dziaajc poprzez receptory -adrenergiczne i P2X1, istniej jednak badania, ktrych wy-niki ukazuj rozluniajce dziaanie tych transmiterw, NA dziaajca poprzez -adrenoreceptory oraz ATP dziaajca poprzez receptory P2Y w ttnicach wiecowych krlika po-woduj rozlunienie mini gadkich naczy [23].

Wikszo naczy krwiononych z wyjtkiem tych, kt-re docieraj do gruczow linowych i niektrych naczy krwiononych w mzgu, nie jest unerwiana przez nerwy przywspczulne [24]. Wci nie opisano funkcji ATP jako kotransmitera w przekazywaniu sygnau w okoonaczynio-wych nerwach przywspczulnych.

Wiele naczy krwiononych jest unerwianych przez ner-wy czuciowo-ruchowe (zarwno przez niezmielinizowa-ne wkna C, jak i zmielinizowane wkna A). Gwnym neurotransmiterem w okoonaczyniowych nerwach czucio-wo-ruchowych jest peptyd zwizany z genem kodujcym kalcytonin (CGRP, ang. calcitonin gene-related peptide), kt-ry uczestniczy w rozlunianiu cian naczy krwiononych. ATP wydaje si uczestniczy w naczyniowym refleksie ak-sonowym jako kotransmiter nerww czuciowo-ruchowych [25].

UDZIA KOMREK RDBONKA W REGULACJI NAPICIA CIANY NACZY

Komrki rdbonka z jednej strony eksprymuj recep-tory z rodziny P1 oraz P2 aktywowane przez nukleotydy, z drugiej s ich rdem (co oznacza, e mog aktywowa si w sposb autokrynny) i dodatkowo na ich powierzchni obecne s ektonukleotydazy, ktre reguluj stenie nukle-otydw w rodowisku zewntrznym komrki. Zasadnicz rol komrek rdbonka jest uczestniczenie w rozkurczu cian naczy krwiononych, przez co s naturalnym anta-gonist dziaa ATP i NA uwalnianych przez zakoczenia nerww wspczulnych. Poza moliwoci autokrynnej ak-tywacji, receptory P2 znajdujce si na komrkach wyciela-jcych wiato naczy krwiononych s celem nukleotydw i nukleozydw uwalnianych przez miocyty i komrki krwi po zadziaaniu rnych bodcw, co powoduje rozkurcz naczy krwiononych. Dominujc frakcj receptorw s A2A i A2B spord receptorw adenozynowych oraz P2Y1, P2Y2 i P2X4 spord nukleotydowych [26], przy tym nie mona jednak zapomnie o rnicy w izoformach recep-torw pomidzy rnymi gatunkami, jak i tkankami. Ak-tywacja komrek rdbonka przez puryny prowadzi do uwolnienia tlenku azotu i prostacykliny, PGI2, co prowadzi do zmniejszenia napicia cian naczy oraz zahamowania agregacji pytek krwi. Badania z ostatnich lat ukazuj, e poza dziaaniem rozkurczowym ATP na komrki rd-bonka poprzez wydzielanie NO i prostaglandyn, relaksacja zachodzi rwnie poprzez aktywacj kanaw potasowych [27]. rdbonek odgrywa bardzo wan rol w utrzymaniu homeostazy naczy krwiononych, uszkodzenie lub zabu-rzenie jego funkcji moe doprowadzi do aktywacji pytek krwi, akumulacji leukocytw w miejscu urazu, a aktywo-wane leukocyty i trombocyty mog wydziela ATP, ADP oraz UDP. W warunkach fizjologicznych nukleotydy te pro-muj rozkurcz naczy krwiononych, jednak w momencie przerwania cigoci tkanki czynniki te mog dotrze do mini gadkich otaczajcych naczynia krwionone i dziaa na nie poprzez receptory z rodziny P2Y powodujc skurcz. Z pierwotnych hodowli komrek rdbonka uzyskanych zarwno od zwierzt jak i czowieka ATP jest uwalniane w wyniku zmiany przepywu poywki, a co za tym idzie war-toci siy cinajcej [8] oraz zmiany osmotycznej rodowiska [28]. Najwaniejsz znan funkcj ATP uwalnianego przez


komrki rdbonka w odpowiedzi na zwikszon si ci-najc jest przyczanie si do receptorw z rodziny P2 i przekazanie sygnau lokalnego lub rozprzestrzeniajcego si, powodujcego skurcz naczy krwiononych. Istnieje sposb wyrzutu ATP z komrek rdbonka zaleny od stymulacji przez ATP [29], co zapewnia skoordynowan odpowied komrek wycielajcych wiato naczy krwio-nonych. ATP uwolnione z komrek rdbonka szczura po ekspozycji na zwikszon si cinajc powoduje wzrost wewntrzkomrkowego stenia jonw Ca2+, a nastpnie rozejcie si fali wapniowej. Rozchodzenie si fali wapnio-wej byo zablokowane przez suramin oraz apyraz, ktre rozkadaj zewntrzkomrkowe ATP, co sugeruje, e ATP uwalniane z komrek rdbonka jest przekanikiem w tym zjawisku [30].

Mechanizmy uwalniania ATP z komrki nie s w peni poznane. Istniej dowody mwice, e ATP jest uwalniane z komrek rdbonka po zadziaaniu zwikszonej siy ci-najcej na drodze egzocytozy [8]. Pniejsze badania udo-wodniy, e koneksyny oraz paneksyna 1 rwnie mog by zaangaowane w ten proces [2]. Wyciszenie genu dla ka-weoliny-1 (ang. caveolin-1) zahamowao wyrzut ATP przez komrki rdbonka, a uwalniane ATP rozpoczynao fale wapniowe w kaweolach [31].

Adenozyno-5-czteroforsforan jest silnym czynnikiem pochodzenia rdbonkowego wywoujcym skurcz ma-ych naczy krwiononych, u czowieka dziaajc gwnie poprzez aktywacj receptorw P2X1 na miniach gadkich [32]. Urydyno adenozyno czterofosforan (Up4A, ang. uridi-ne adenosine tetraphosphate) rwnie zosta zidentyfikowany jako czynnik obkurczajcy naczynia krwionone pochodze-nia rdbonkowego (EDCF, ang. endothelium-derived vaso-constricting factor) w hodowli komrek rdbonka skrnych maych naczy krwiononych czowieka [33] oraz z ttnicy pucnej szczura [34].

REGULACJA ZEWNTRZKOMRKOWEGO STENIA NUKLEOTYDW I NUKLEOZYDW

Na si sygnau przekazywanego od nukleotydw ma wpyw rodzaj i zagszczenie receptorw odbierajcych sy-gna oraz stenie nukleotydw i nukleozydw w rodowi-sku zewntrznym komrki. Mog si one pojawi w osoczu w nastpstwie uszkodzenia lub mierci komrek albo w wyniku procesw fizjologicznych. Di- i trifosforany nukle-ozydw mog by uwalniane z komrek w rnych proce-sach, np. egzocytozy pcherzykowej, aktywnego transportu poprzez semikanay koneksynowe lub kanay paneksynowe, transportery ABC, dodatkowo ATP moe by syntetyzowa-ny na zewntrz komrki poprzez F0F1 ATPaz. Na zewn-trzkomrkowe stenie nukleotydw oraz nukleozydw ma rwnie wpyw aktywno enzymw, ektonukleotydaz, do ktrych nale NTPDazy, kinaza difosfonukleozydowa, ki-naza adenylanowa oraz 5-nukleotydaza (CD73) (Ryc. 1) [4].

MECHANIZMY UWALNIANIA ATP Z KOMRKI

Egzocytoza pcherzykowa

Komrki rdbonka naczy krwiononych s poddane cigym zmianom przepywu krwi i siy cinajcej. Zjawi-

sko uwalniania czynnikw modulujcych napicie cian na-czy krwiononych (m.in. ATP) zostao szeroko opisane w literaturze, nie zosta jednak jeszcze poznany mechanizm za to odpowiedzialny.

Postulowanym mechanizmem jest egzocytoza pche-rzykowa. Aby udowodni t hipotez wykonano do-wiadczenie, w ktrym wyznakowano wewntrzkomr-kowe ATP w komrkach HUVEC quinakryn, ktra ma wysokie powinowactwo do ATP. Z obserwacji wyniko, e komrki barwi si w sposb zgodny z obecnoci wewntrzkomrkowych pcherzykw egzocytarnych [8]. Co wicej wstpna inkubacja komrek HUVEC z monenzyn, inhibitorem formowania si pcherzykw z aparatu Golgiego powodowaa znaczce obnienie fluorescencji quinakryny w stosunku do komrek kon-trolnych zgodne z lokalizacj ATP w wewntrzkomr-kowych pcherzykach. Stymulacja si cinajc od 10 do 25 dynw (1 dyn jest to sia nadajca ciau o masie 1 grama przyspieszenie rwne 1cm/s) komrek z wy-znakowanym ATP prowadzia do nagego zmniejszenia fluorescencji quinakryny i zwikszonego stenia ATP w rodowisku zewntrznym komrki, co sugerowaoby uwolnienie ATP metod egzocytozy pcherzykowej. W porwnaniu, komrki niestymulowane wykazyway nie-wielkie stenia ATP w medium zewntrzkomrkowym. Dodatkowo, monenzyna znosia uwalnianie ATP ze sty-mulowanych si cinajc komrek rdbonka. Dane te sugeruj, e podczas nasilenia przepywu krwi ATP jest uwalniane do rodowiska zewntrznego na drodze egzocytozy pcherzykowej. Dowody wykazuj, e ATP moe by uwalniane na drodze egzocytozy w rnych tkankach, jednak wci pozostaje pytanie, w jaki sposb nukleotyd dostaje si do pcherzyka? W ostatnich latach doszo do odkrycia pcherzykowego transportera nu-kleotydowego (VNUT, ang. vesicular nucleotide transpor-ter) w wielu komrkach wydzielniczych [35]. Transpor-ter ten lokalizuje si w bonie wewntrzkomrkowych pcherzykw i aktywnie pompuje ATP do ich wntrza uywajc gradientu protonw utrzymywanego przez wakuolarn ATPaz [35]. Wci jednak pozostaje niewia-dome, czy transporter ten eksprymowany jest w okoo-naczyniowych neuronach wspczulnych i komrkach rdbonka naczy krwiononych.

Transportery ABC

Transportery ABC nale do klasy integralnych biaek bonowych, ktre zuywaj energi pozyskan z ATP do transportu duych czsteczek w poprzek bony. Biaka nale-ce do grupy transporterw ABC maj dwie zachowane w ewolucji domeny wewntrzkomrkowe, ktre wi i hy-drolizuj ATP. Trzy z tych biaek: bonowy regulator prze-wodnictwa (CFTR, ang. cystic fibrosis transmembrane conduc-tance regulator), glikoproteina P oraz receptor dla pochod-nych sulfonylomocznika (SUR, ang. sulfonylurea receptor) zostay zidentyfikowane jako biaka nie tylko korzystajce z ATP jako energii dla aktywnego transportu, ale rwnie transportery nukleotydw purynowych dziaajcych na-stpnie auto- lub parakrynnie. W dobie poszukiwania ka-naw lub transporterw odpowiedzialnych za uwalnianie ATP z komrki, transportery ABC wydaj si by dobrym


kandydatem, jednak nie wiadomo, czy biaka te same trans-portuj nukleotydy, czy moe reguluj aktywno innych kanaw lub transporterw [2].

CFTR jest biakiem zaangaowanym w utrzymywanie homeostazy jonw chloru w komrce. Wydaje si, e ak-tywacja CFTR przez biakowa kinaz A zalen od cAMP

Rycina 1. Schemat uwalniania, metabolizmu i odbierania sygnau przez receptory dla nukleotydw w cianie naczy krwiononych. Zewntrzkomrkowe stenia nu-kleotydw i nukleozydw s wynikiem rwnowagi pomidzy ich uwalnianiem przez komrki oraz syntez na zewntrz komrki, a trawieniem przez ektonukleotydazy. Nukleotydy mog by uwalniane poprzez semikanay koneksynowe, kanay paneksynowe, transportery ABC, na drodze egzocytozy pcherzykowej, a samo ATP moe by rwnie syntetyzowane w rodowisku zewntrzkomrkowym dziki F0F1 ATPazie. Nukleotydazy obecne w cianie naczy krwiononych to ektonukleozydo-3-fosfo dihydrofosforhydrolaza 1 i 2 (1 NTPDaza1 i 2), ktre hydrolizuj ATP, UTP oraz UDP, ekto-5-nukleotydaza, ktra dalej hydrolizuje powstae AMP do adenozyny oraz ekto-nukleotydo-pyrofosfataza (ekto-nukleotydo fosfodiesteraza NPP1), ktra rwnie hydrolizuje ATP, UTP i ADP. ATP uwalniane jako kotransmiter przez zakocze-nia nerww wspczulnych i czuciowo-ruchowych powoduje proliferacj mini gadkich cian naczy poprzez oddziaywania na receptory P2Y2 oraz P2Y4 i aktywacj kaskady kinazy biakowej aktywowanej mitogenem (MAPK), natomiast adenozyna powstajca po rozkadzie ATP oddziauje na receptory z rodziny P1 i hamuje pro-liferacj mini gadkich poprzez wzrost wewntrzkomrkowego stenia cAMP lub moe by rwnie transportowana z powrotem do komrki, gdzie zostaje zuyta jako substrat do produkcji ATP lub, w komrkach rdbonka, moe wpywa na aktywacj AMPK. ATP i UTP uwalniane z komrek rdbonka stymuluj proliferacj zarwno komrek rdbonka jak i mini gadkich poprzez oddziaywanie na receptory P2Y1,2,4. Adenozyna stymuluje proliferacj komrek rdbonka, co wywouje uwolnienie pytkopochodnego czynnika wzrostu (PDGF) z pytek krwi. CGRP peptyd zwizany z genem kodujcym kalcytonin, AMPK kinaza biakowa aktywo-wana przez AMP.


(PKA) reguluje aktywno kanau usuwajcego jony chlor-kowe z komrki (ORCC, ang. outwardly rectifying chloride channel). Badania nad tym mechanizmem w komrkach rdbonka ukazay, e aktywacja CFTR zalena od cAMP powoduje uwolnienie ATP, ktre nastpnie wie si i akty-wuje receptory z rodziny P2 w sposb auto- lub parakrynny i stymuluje wypyw jonw chlorkowych z komrki poprzez aktywacj ORCC. Badania na komrkach transfekowanych CFTR potwierdziy te przypuszczenia, wydzielanie ATP byo zalene od cAMP oraz aktywacji PKA, ktre byy nie-obecne w komrkach niemajcych transporterw ABC. Po-dobne badania zostay wykonane w komrkach eksprymu-jcych glikoprotein P, co potwierdza suszno hipotezy, e transportery ABC odgrywaj kluczow rol w uwalnia-niu ATP na zewntrz komrki [2]. Badania nad uwalnia-niem ATP z komrek z udziaem biaka CFTR s szcze-glnie wane w poznaniu fizjologii komrek rdbonka, jednak transporter ten zosta zidentyfikowany rwnie na wielu innych typach komrek [37]: mini gadkich naczy [38], krcych erytrocytw [39] i na pytkach krwi [40], co sprawia, e s to potencjalne rda ATP w rodowisku ze-wntrznym komrek.

Erytrocyty pacjentw cierpicych na mukowiscydoz, majcych mutacj w genie CFTR wykazuj znacznie obni-one uwalnianie ATP w odpowiedzi na deformacj bony komrkowej, co jest dobrze poznanym bodcem pobudza-jcym uwalnianie ATP z tych komrek. Co wicej, inkubacja krwinek czerwonych od zdrowych pacjentw z pochodn sulfonylomocznika, ktra hamuje aktywno transporte-rw ABC oraz kanaw potasowych wraliwych na ATP (KATP) lub z kwasem niflumikowym, inhibitorem cyklook-sygenazy-2, ktry rwnie zosta opisany jako hamujcy aktywno CFTR, powodowaa znaczny spadek uwalniania ATP po deformacji bony komrkowej [39]. Wyniki te jed-nak trzeba interpretowa w szerszej perspektywie, ponie-wa moe na nie wpywa wiele niespecyficznych interakcji farmakologicznych innych ni z badanym biakiem. Tym niemniej na udzia CFTR w uwalnianiu ATP z erytrocy-tw wskazuj rwnie wyniki innych bada, gdzie ciga aktywacja PKA osignita poprzez inkubacj komrek z aktywnym S-stereoizomerem cAMP powoduje wzmoone uwalnianie ATP podczas gdy inkubacja z nieaktywnym R-stereoizomerem nie [41]. SUR formuje kompleksy funkcjonalne z kanaami KATP [42], a nagromadzenie we-wntrzkomrkowego ATP powoduje depolaryzacj bony komrkowej poprzez bezporednie hamowanie wypywu potasu poprzez konstytutywnie aktywny kana potasowy, KATP. Pochodna sulfonylomocznika, glibenklamid, hamuje napyw potasu indukowany kanaami KATP. Postuluje si, e SUR dziaa bezporednio na hamowanie wypywu ATP z komrki, przez co zwiksza si jego wewntrzkomrkowe stenie. I rzeczywicie, aktywacja kanaw KATP przez dia-zoksyd (ang. diazoxide), pochodn sulfonylomocznika akty-wujc kanay KATP w komrkach trzustki jest niezalena od obecnoci ATP [43]. W naczyniach krwiononych puc szczura uwolnienie ATP wywoane zmianami w przepy-wie krwi jest zniesione po perfuzji (ang. luminal perfusion) glibenklamidem [44]. Zjawisko to moe by spowodowane poprzez hamowanie uwalniania ATP przez SUR lub CFTR w komrkach rdbonka. Zahamowanie uwalniania ATP z ktregokolwiek z tych transporterw (lub obu) moe po-

wodowa zmniejszon si sygnau auto- lub parakrynnego wywieranego na receptory P2Y w komrkach rdbonka, co wyjaniaoby zmniejszone rozszerzenie cian naczy krwiononych. Uwalnianie ATP z komrek przez kanay CFTR nie zostao bezporednio zaobserwowane w komr-kach rdbonka naczyniowego, chocia zostaa opisana ich synteza i aktywno [37].

Podczas gdy powysze badania sugeruj wan rol transporterw ABC w uwalnianiu ATP z komrek, to jednak ukazay si rwnie prace przeczce temu zjawisku. Zostao udowodnione, i CTFR rekonstytuowane w dwuwarstwie lipidowej nie przenosio ATP, a w stabilnie trasfekowanych komrkach ssakw jak rwnie w komrkach z puca czo-wieka z endogennym biakiem, CFTR nie brao udziau w uwalnianiu ATP [45]. Prace te osabiy teori mwic, e transportery ABC bior udzia w transporcie ATP z kom-rek. Jednak pojawio si kolejne badanie, w ktrym autorzy sugeruj zaangaowanie kanaw CFTR w uwalnianiu ATP indukowanym kwasic mleczanow. Badanie to sugeruje rol CFTR oraz innych transporterw ABC w uwalnianiu ATP [46].

F1F0-ATPaza

W procesie fosforylacji oksydacyjnej w mitochondriach powstaje elektrochemiczny gradient protonowy w poprzek wewntrznej bony organellum, jest on wykorzystywany przez F1F0 syntaz ATP (nazywan rwnie syntaz ATP), ktra produkuje ATP w matriks mitochondrialnym. Enzym ten skada si z podjednostki F0 zwizanej z bon, ktra utrzymuje ca czsteczk zaczepion w wewntrznej bonie mitochondrialnej oraz katalitycznej podjednostki F1, ktra w matriks mitochondrialnym katalizuje powstawanie ATP z ADP i nieorganicznego fosforu [47]. Pocztkowo sdzono, e enzym ten lokalizuje si w formie aktywnej jedynie w mitochondrium, jednak okazao si, e zidentyfikowano go rwnie w bonie komrkowej komrek rnych typw, m.in. rdbonka naczy krwiononych [47]. Angiostaty-na, produkt cicia plazminogenu wykazuje wysokie powi-nowactwo do wizania podjednostek i podjednostki F1 ATP syntazy w komrkach HUVEC i zostaa opisana jako skuteczny inhibitor angiogenezy i rozwoju nowotworu [47]. Antyangiogenne waciwoci angiostatyny s przypisywane hamowaniu uwalniania ATP, poniewa zewntrzkomrko-wy ATP jest uwaany za czynnik proangiogenny dla kom-rek rdbonka [50]. Wizanie angiostatyny do podjednost-ki F1 syntazy ATP w komrkach rdbonka hamuje jej ak-tywno, a przez to produkcj zewntrzkomrkowego ATP [49]. W naczyniach krwiononych podczas zwikszonego przepywu krwi, ktry generuje zwikszon si cinajc zostaje uwolnione ATP, ktre powoduje rozlunianie cian naczy krwiononych. W hodowli komrek rdbonka z ludzkiej ttnicy pucnej naraonych na zwikszony prze-pyw pynu efekt ten mg by zahamowany poprzez doda-nie do poywki angiostatyny lub bezporedniego agonisty podjednostki F1 [50]. Na podstawie tej pracy mona wyci-gn wnioski o mechanizmach uwalniania ATP z komrek rdbonka pod wpywem si hemodynamicznych. Syntaza ATP do produkcji ATP wymaga gradientu protonowego, dlatego jego aktywacja pod wpywem zmiany przepywu krwi przez naczynie krwionone pozostaje do wyjanie-


nia. Osignicie gradientu protonowego w poprzek bony komrkowej mogoby spowodowa miejscowe zakwasze-nie cytoplazmy, co mogoby wpyn na aktywno biaek znajdujcych si w tym obszarze, co wicej syntaza ATP produkuje nukleotyd z ADP oraz fosforu nieorganicznego, co oznacza, e substraty te musz si znajdowa w wietle naczynia krwiononego w odpowiednim steniu, aby za-pewni odpowiedni aktywno enzymu. Aktywno ekto-nukleotydaz moe zapewnia dostpno tych substratw. Nietypowa produkcja syntazy ATP w bonie komrkowej rdbonka naczy krwiononych moe sugerowa, e bia-ko to jest zaangaowane w przekazywanie sygnau od ze-wntrzkomrkowych nukleotydw. Niezbdne s kolejne badania do odkrycia mechanizmu i stopnia zaangaowania syntazy ATP w uwalnianiu ATP w rodowisku zewntrz-komrkowym.

Koneksyny

Koneksyny (Cx, ang. connexins) s biakami wystpuj-cymi u krgowcw, formujcymi heksameryczne oligomery (nazywane koneksonami) w siateczce endoplazmatycznej lub aparacie Golgiego, ktre nastpnie transportowane s do bony komrkowej, z ktr si integruj [52]. Konekson z jednej komrki znajdujcy si w niewielkiej odlegoci od koneksona z komrki ssiedniej moe utworzy niekowa-lencyjne poczenie pomidzy ich zewntrzkomrkowymi ptlami tworzc midzykomrkowe poczenie szczelinowe czce cytosol dwch komrek. Poczenia szczelinowe za-pewniaj komunikacj midzy dwiema komrkami, trans-port czsteczek sygnalizacyjnych i wtrnych przekanikw nie wikszych ni 1 kDa oraz uatwiaj przekazywanie fal depolaryzacji bony. Do dzi opisano okoo 20 izoform ko-neksyn ssakw, a ich komunikacja przez poczenia szcze-linowe, zostaa szeroko zbadana i opisana. Pojawiy si jed-nak rwnie doniesienia o niezadokowanych semikanaach koneksynowych na powierzchni wielu rnych typw ko-mrek, np. astrocytw i komrek glejowych w centralnym ukadzie nerwowym [53], krcych polimorfojdrowych granulocytw [54] i monocytw [55], komrek rdbonka naczy krwiononych [56] i komrek mini gadkich na-czy krwiononych [57]. Sugeruje si, e te semikay mog funkcjonowa jako kanay do transportu czsteczek, m.in. ATP, pomidzy cytosolem komrki a jej rodowiskiem ze-wntrznym [58]. Podczas fizjologicznego stanu spoczynko-wego, semikay koneksyn pozostaj zamknite, jednak pod wpywem bodca, jak np. spadek stenia zewntrzkomr-kowych jonw wapnia [59], silnej depolaryzacji bony ko-mrkowej [60], stymulacji mechanicznej [61], czy metabo-licznego modelu ischemii [62] s w stanie doprowadzi do otwarcia tych kanaw. Rwnie inne badania [53] sugeruj rol semikaw koneksyn w uwalnianiu ATP z wielu typw komrek.

Do dzi opisano 4 izoformy koneksyn licznie wystpu-jce na komrkach mini gadkich naczy krwiononych oraz komrkach rdbonka: Cx37, Cx40, Cx43 i Cx45 [63]. Poczenia szczelinowe formowane przez te izoformy od-grywaj wan rol w regulacji komunikacji pomidzy ko-mrkami mini gadkich naczy krwiononych (VSMC, ang. vascular smooth muscle cells) a komrkami rdbonka (EC, ang. endothelial cells), jak rwnie pomidzy dwiema

komrkami na poczeniach mioendotelialnych [64]. W szczeglnoci wane s poczenia szczelinowe zbudowane z Cx40 w rdbonku ze wzgldu na rol w przekazywa-niu fali wapniowej w rozlunianiu cian naczy krwiono-nych [65]. Na poziomie pocze mioendotelialnych miej-sca, gdzie komrki mini gadkich i rdbonka kontaktuj si ze sob poprzez zewntrzn, elastyczn blaszk Cx40 i Cx43 formuj poczenia szczelinowe, ktre umoliwiaj transport drugorzdowych czsteczek sygnaowych i jo-nw midzy tymi dwoma komrkami, aby kontrolowa odpowiedzi naczynioruchowe [66]. Poniewa komrki naczy krwiononych silnie eksprymuj koneksyny, ist-nieje moliwo, e obecna jest pewna populacja niezado-kowanych semikaw koneksyn, ktra mogaby zapewni drog dla uwalniania ATP do wiata naczy lub niszy komrek tworzcych naczynie krwionone. Przesuwanie fali wapniowej w konfluentnych monowarstwach kom-rek rdbonka z rogwki byda pojawia si w odpowiedzi na mechaniczn stymulacj [61]. W badaniach tych, doda-nie blokera pocze szczelinowych i peptydu imitujcego koneksyn, Gap26, znaczco obniao posuwanie si fali wapniowej. Pobieranie barwnika nie zostao zmienione, co sugeruje, e uwalnianie parakrynnie dziaajcej czsteczki sygnaowej z koneksyn wywouje odpowied wapniow w komrce przylegajcej, a nie bezporedni transport wap-nia z jednej komrki do drugiej. Dalsze badanie ujawnio uwalnianie ATP z tych komrek po stymulacji mechanicz-nej oraz zwikszon propagacj fali wapniowej w obecnoci inhibitora CD39 ARL67156. Wyniki tych bada sugeruj rol rnych frakcji semikaw koneksyn na bonie komr-kowej niezaangaowanej w tworzenie pocze szczelino-wych w komrkach rdbonka siatkwki, ktre s w stanie uwalnia ATP, aby promowa fal wapniow przez prze-kazywanie sygnau parakrynnego podczas stresu mecha-nicznego. W naczyniach aparatu przykbuszkowego nerek kbuszkowe komrki rdbonka (GENCs, ang. glomerular endothelial cells) bior udzia w przekazywaniu fal wapnio-wych w celu regulowania nerkowego przepywu krwi i filtracji kbuszkowej poprzez uwalnianie ATP i mechani-zmy przekazywania sygnau nukleotydowego [67]. Mecha-niczna stymulacja komrek GENC rosncych w hodowli spowodowaa zapocztkowanie fal wapniowych, ktre za-hamowao dodanie rozprzgacza pocze szczelinowych oraz wyciszenie Cx40 przez siRNA w tych komrkach. Cx40 jest produkowane w komrkach GENC wytwarzajc midzy nimi poczenia szczelinowe. Aby zaobserwowa stopie, w jakim uwalniane jest ATP i przekazywany sygna od nukleotydu powodujcy fal wapniow dodano miesza-niny wychwytujcej ATP skadajcej si z heksokinazy, en-zymu glikolitycznego, ktry zuywa due iloci ATP oraz apyrazy, ktra degraduje zewntrzkomrkowe ATP. Pod-czas stymulacji mechanicznej w obecnoci tej mieszaniny, przekazywanie fali wapniowej do komrek ssiadujcych byo zahamowane bez znaczcej zmiany w przekazywaniu barwnika midzy komrkami, co sugeruje rol zewntrzko-mrkowego ATP w przekazywaniu fali wapniowej. Auto-rzy tej pracy uyli biosensora ATP do zmierzenia poziomu uwalnianego nukleotydu z komrek GENC. Badanie pole-gao na podaniu indykatora wapnia (Fluo-4) do komrek PC12 eksprymujcych wiele rnych receptorw nukleoty-dowych i dodaniu ich do konfluentnej jednowarstwowej


hodowli GENC. W odpowiedzi na mechaniczn stymulacj komrki GENC uwalniay ATP, ktre wizao si z recep-torami na komrkach PC12 powodujc wzrost stenia we-wntrzkomrkowego wapnia, ktre byo wykrywane przez pomiar fluorescencji Fluo-4, co umoliwio bezporedni po-miar uwolnionego ATP z komrek rdbonka. Odpowied ta bya obniona przez hamowanie aktywnoci receptorw nukleotydowych na komrkach PC12 nieselektywnym inhibitorem receptorw P2, suramin, co zweryfikowao specyficzno biosensora do zewntrzkomrkowego ATP. Uwolnienie ATP pod wpywem stymulacji mechanicznej byo zahamowane poprzez wyciszenie genu Cx40 poprzez siRNA i mogo by przywrcone poprzez dodanie egzo-gennego ATP [68]. Podsumowujc, badania te sugeruj, e komrki rdbonka eksprymuj na swojej powierzchni nie-zadokowane semikanay koneksynowe, ktre s zdolne do uwalniania ATP w odpowiedzi na stymulacj mechaniczn. Wydaje si, e niedotlenienie zwiksza uwalnianie ATP z komrek rdbonka wywoane zmienionym przepywem [69], ale rwnie pojawia si hipoteza, e niedotlenienie hamuje uwalnianie ATP z komrek poprzez semikanay Cx43 w rdbonku [56]. Autorzy tej ostatniej pracy wy-wnioskowali, e niedotlenienie zmniejsza uwalnianie ATP z hodowli komrek rdbonka poprzez zmniejszone wy-stpowanie Cx43 w bonie plazmatycznej, obniony poziom mRNA tego biaka oraz podwyszon fosforylacj Cx43 na Ser368 [70], ktra hamuje aktywno kanau. Obserwacje te sugeruj, e semikanay koneksyn mog by zaangao-wane w uwalnianie ATP w niektrych sytuacjach, jednak raczej nie bior udziau w uwalnianiu tego nukleotydu pod wpywem niedotlenienia z komrek rdbonka. Kanay te mog odgrywa istotn rol podczas rnych stanw patologicznych, np. ostrych infekcji, stanw zapalnych i miadycy. Komrki rdbonka wystawione na dziaanie skadnika cian komrkowych bakterii gram-dodatnich, peptydoglikanu (PDG) uwalniay ATP poprze kanay Cx43 [71]. Badanie to ujawnio wzrost stenia mRNA Cx43, jak rwnie indukcj cytokiny prozapalnej IL6 i receptora TLR2 w komrkach rdbonka w odpowiedzi na PDG. Indukcja prozapalnej kaskady zdarze spowodowaa zwikszenie aktywnoci semikanau Cx43 w bonie komrkowej, co do-prowadzio do uwolnienia ATP do medium hodowlanego.

Podczas miadycy krce monocyty przylegaj do i migruj w poprzek rdbonka naczyniowego, gdzie r-nicuj w makrofagi i komrki piankowe, co ostatecznie pro-wadzi do rozwoju pytki miadycowej i zwenia wia-ta naczynia [72]. Badanie przeprowadzone przez Wong i wsppracownikw [55] sugeruje, e ATP uwalniane z krcych monocytw poprzez kanay Cx37 ma ochronny wpyw na naczynia podczas miadycy. Kompletne wy-ciszenie Cx37 u myszy ApoE2/2 ze skonnoci do rozwoju miadycy spowodowao znaczny wzrost w formowaniu patologicznych zmian podczas miadycy. Dalsze badania wykazay, e myszy Cx372/2/ApoE2/2 miay znaczco nisze podstawowe poziomy uwalnianego ATP w porwnaniu do myszy z funkcjonalnym Cx37. Spadek uwalnianego ATP przez krce monocyty pozbawione Cx37 spowodowa znaczny wzrost w adhezji monocytw do hodowanych komrek rdbonka, co wspiera dowody uzyskane in vivo wzrostu formowania pytki miadycowej i jej rozmia-ru. Adhezja monocytw bya rwnie zwikszona po do-

daniu blokerw semikanau koneksynowego i koneksyno-wego peptydu mimetycznego. W innym badaniu aktywacja neutrofili przez fMLP (N-formyl Met-Leu-Pro) indukowaa uwalnianie ATP, co skutkowao zmniejszon przepuszczal-noci komrek rdbonka [54]. Uwalnianie ATP z tych komrek byo znacznie obnione po dodaniu specyficznego dla Cx43 peptydu mimetycznego Gap26 [73], jak rwnie u neutrofili Cx432/2, co sugeruje, e uwalnianie nukleotydu jest w pewien sposb zalene od kanaw Cx43. Uwalniany ATP by aktywnie degradowany do adenozyny dziki ak-tywnoci CD39 eksprymowanej na powierzchni neutrofili i CD37 eksprymowanej na komrkach rdbonka. Wizanie adenozyny do receptorw z A2A na komrkach rdbonka powodowao spadek przepuszczalnoci rdbonka [74]. Podczas gdy dane zaprezentowane powyej sugeruj rol uwalniania ATP przez semikanay Cx w krcych komr-kach zapalnych w ochronnym mechanizmie przeciwko roz-szczelnianiu ciany naczynia, wiele przykadw z literatu-ry sugeruje, e ATP sprzyja migracji i proliferacji komrek mini gadkich [75]. Zostao rwnie udowodnione, e fi-broblasty uwalniaj ATP z semikanaw koneksynowych, co sprzyja odpowiedzi profibrotycznej w sercu [76], sugeru-jc, e fibroblasty rezydujce w naczyniach krwiononych uwalniaj ATP poprzez koneksyny, aby promowa przeka-zywanie sygnau purynergicznego w cianie naczy krwio-nonych.

Podsumowujc, semikanay koneksyn mog bra udzia w uwalnianiu ATP w stanach patologicznych (stany za-palne, miadyca obnione stenie jonw wapnia) oraz, prawdopodobnie, podczas stanw fizjologicznych. Jednak pozostaje do wyjanienia czy semikanay koneksyn odgry-waj rol w uwalnianiu ATP z komrek naczy, aby regulo-wa napicie cian naczy i cinienie krwi.

Kanay pankesyny

W roku 2000 zostaa zidentyfikowana nowa rodzina bia-ek nazwanych paneksynami (Panx), ktre s ortologami biaek tworzcych poczenia szczelinowe u bezkrgow-cw, ineksyn (innexins), maj podobn topologi do ssa-czych biaek budujcych poczenia szczelinowe koneksyn [77]. Do dzi zostay opisane 3 izoformy paneksyn (Panx1, Panx2 i Panx3), a ich wystpowanie na rnych typach ko-mrek i w rnych tkankach jest celem wielu bada. Wydaje si, e biaka Panx1 i Panx3 skadaj si w heksamery, pod-czas gdy Panx2 moe formowa hapta- lub oktamery [78]. Paneksyny formowane s w siateczce endoplazmatycznej i aparacie Golgiego, nastpnie transportowane s do bony plazmatycznej, podobnie jak koneksyny. Jednak paneksy-ny nie tworz pocze szczelinowych, dlatego formowane przez nie kanay nazywane s kanaami paneksynowymi, a nie semikanaami [79]. Podstawow rnic midzy tymi biakami jest fakt, e zewntrzkomrkowe ptle paneksyn maj wiele uglikozylowanych reszt aminokwasowych, co moe utrudnia zakotwiczanie ich w kanaach paneksyno-wych ssiadujcych komrek [80]. Wydaje si, e paneksy-ny tworz kanay umoliwiajce transport czsteczek mi-dzy rodowiskiem zewntrz- i wewntrzkomrkowym. Na podstawie charakterystyki kanaw paneksyny w systemie ekspresji heterologicznej zaobserwowano, e w przeciwie-stwie do koneksyn, aktywno paneksyn nie jest zalena od


stenia jonw wapnia, co umoliwia otwarcie tych kana-w podczas ich fizjologicznych ste [81]. Ekspresja ge-nw Panx1 w oocytach Xenopus ujawnia maksymalny prd anionowy po depolaryzacji bony, a badania patch clamp zademonstroway przepuszczalno tych kanaw dla ATP [82]. Obserwacja ta zapocztkowaa seri bada nad rol Panx1 w uwalnianiu ATP z wielu typw komrek, m.in. komrek mini gadkich i rdbonka naczy krwiono-nych [83,84]. Podczas gdy kanay Panx1 przyczyniaj si do uwalniania ATP w warunkach fizjologicznych, istniej rwnie doniesienia, e bior udzia w apoptozie i mierci komrki [85] oraz aktywacji limfocytw T podczas stanw zapalnych [86]. Wanie dlatego jest to takie wane, aby zi-dentyfikowa mechanizm, ktry reguluje przepuszczalno kanaw paneksyn dla nukleotydw i innych czsteczek wewntrzkomrkowych, jak rwnie okrelenie potencjal-nych partnerw biakowych, ktrzy poprzez wizanie si z paneksynami mogliby regulowa ich aktywno (np. uwal-nianie ATP).

Podczas apoptozy umierajce komrki uwalniaj nu-kleotydy do przestrzeni zewntrzkomrkowej, promujc chemotaksj fagocytw. Wydaje si, e Panx1 jest zaan-gaowany w ten proces. Kana jest aktywowany poprzez obcicie wewntrzkomrkowego koca C przez kaspaz. Powoduje to uwolnienie ATP do macierzy zewntrzko-mrkowej i rekrutacj fagocytw. Uwalnianie ATP, rekru-tacja monocytw oraz leukocytw jest stymulowana przez anty-Fas lub wiato UV, ktre s znanymi bodcami wy-woujcymi apoptoz, a byy znaczco obnione podczas wyciszenia genu Panx1 przy uyciu siRNA, co sugeruje, e kanay te porednicz w uwalnianiu ATP z komrek ulega-jcych apoptozie [85]. Podczas gdy to badanie potwierdza rol uwalniania ATP przez Panx1 podczas mierci komrki, ten sam mechanizm moe mie rwnie ochronny wpyw podczas stanw patologicznych, takich jak niedokrwienie. W astrocytach stres wywoany niedokrwieniem hamu-je uwalnianie ATP aby ochroni komrk przed mierci. Wydaje si, e mechanizm ten zachodzi poprzez hamowa-nie uwolnienia ATP przez kanay Panx1 na drodze nega-tywnej ptli sprzenia zwrotnego od receptora P2X7 [87]. Wyduona aktywacja receptora P2X7 powoduje otwarcie duych porw przepuszczalnych dla jonw dwuwartocio-wych, takich jak Ca2+, ktrych napyw ostatecznie prowa-dzi do mierci komrki [88]. Badanie to pokazao, e stres wywoany niedokrwieniem w hodowli astrocytw koro-wych powodowa pocztkowe uwalnianie ATP poprzez kanay Panx1, co w efekcie aktywowao receptory P2X7 i prowadzio do zamknicia Panx1 oraz zapobiegao utracie skadnikw wewntrzkomrkowych i mierci komrki. Ra-zem badania te pokazuj zrnicowane funkcje, ktre peni Panx1 w komrce. Pocztkowe badania nad paneksynami okreliy ich kluczow rol w regulacji uwalniania ATP z krcych erytrocytw podczas stresu wywoanego niedo-krwieniem lub deformacj bony komrkowej [89] komrek mini gadkich po aktywacji receptorw adrenergicznych [83] oraz komrek rdbonka po stymulacji trombin [84]. Uwalnianie ATP z tych komrek zachodzi w fizjologicz-nych steniach wapnia i moe odgrywa kluczow rol w regulacji napicia cian naczy i oporu obwodowego. Po-cztkowo sdzono, e uwalnianie ATP z krcych erytro-cytw w odpowiedzi na nisk zawarto tlenu zachodzi po-

przez transporter ABC, CFTR [90], jednak pniejsze bada-nia podday w wtpliwo czy transportery z rodziny ABC mog uwalnia ATP [91]. Locovei i wsp. [63] udowodnili, e uwolnienie ATP, podczas depolaryzacji bony komrkowej erytrocytw, spowodowane wysokim steniem zewntrz-komrkowych jonw potasu oraz obnion zawartoci tle-nu byo hamowane przez inhibitor pocze szczelinowych, kabrenoksolon. Autorzy zauwayli rwnie, e nie mona byo wykry ekspresji genw kodujcych Cx43 w uytych w badaniu erytrocytach, co dodatkowo sugeruje, e inhibi-tor ten zahamowa aktywno Panx1, a nie semikanaw Cx [81].

Minie gadkie w maych naczyniach krwiononych, ktre s zaangaowane w regulacj przepywu i cinienia krwi ulegaj skurczowi w odpowiedzi na stymulacj recep-torw -adrenergicznych. Impulsy przekazywane przez nerwy wspczulne powoduj uwolnienie NA z zakocze unerwiajcych oyska naczyniowe, co wywouje aktywacj receptora 1D-adrenericznego, wzrost stenia jonw wap-nia w komrkach mini i ostatecznie skurcz, co daje efekt wzrostu oporu obwodowego i cinienia krwi [35]. Niedaw-no odkryto now rol kanaw Panx1 w regulacji odpowie-dzi angaujcej receptor 1-adrenergiczny [83]. W badaniu tym stymulacja wyizolowanych ttnic selektywnym ago-nist receptora 1-adrenergicznego, fenylefryn (PE, ang. phenylephrine) spowodowaa silny skurcz naczy, co jest zgodne z poprzednimi obserwacjami. Badania ttnicy pier-siowo-grzbietowej wykazay, e jest ona silnie unerwiona przez nerwy adrenergiczne, rozwija spontaniczne napicie cian naczy i jest podatna na stymulacj rnymi wazo-ak-tywnymi czynnikami [92]. W obecnoci trzech rnych in-hibitorw paneksyn: probenecydu (ang. probenecid), meflo-chiny (ang. mefloquine) i peptydu blokujcego 10Panx1 (ang. 10Panx1 blocking peptide), skurcz wywoany PE by znacznie obniony. Ponadto, dodanie apyrazy do ukadu, w ktrym odbywao si pukanie naczynia krwiononego skutkowa-o podobnym hamowaniem skurczu. Wreszcie, stymulacja komrek mini gadkich z ttnic wiecowych PE induko-waa uwalnianie ATP z tych komrek, efekt ten by hamo-wany po dodaniu peptydu blokujcego 10Panx1. Wsplnie te wyniki wiadcz o nowej roli kanaw Panx1 w komr-kach naczyniowych mini gadkich w uwalnianiu ATP podczas aktywacji receptorw 1-adenergicznych, procesu niezbdnego do prawidowej regulacji napicia cian na-czy krwiononych i cinienia krwi. W oparciu o te obser-wacje mona opracowa nowe podejcie do terapeutycznej regulacji cinienia. Zaobserwowano rwnie, e produkcja Panx1 w komrkach rdbonka naczy bya znaczco pod-wyszona. Dodatkowo Godecke i wsppracownicy [84] udowodnili, e ATP jest uwalniane z komrek HUVEC w odpowiedzi na trombin, co byo hamowane przez carbeno-xolone oraz wyciszenie endogennego Panx1. Ponadto, ana-liza wzorw ekspresji genw rnych izoform paneksyn w miniach gadkich i komrkach rdbonka ttnic sugeruje wzrost poziomu ekspresji w komrkach mini gadkich wraz ze spadkiem rednicy naczynia, co wspiera hipotez uwalniania ATP poprzez Panx1 w regulacji przepywu krwi w maych ttnicach i ttniczkach [93].

Do dzi niewiele jest wiadomo o roli kanaw Panx w re-gulacji procesw fizjologicznych, w szczeglnoci tych, w


ktre zaangaowana jest dynamika naczy krwiononych i przepywu krwi. Jednak, analiza waciwoci fizjolo-gicznych poprzez badanie rnymi inhibitorami pocze szczelinowych sugeruje, e niektre wczeniejsze wyniki identyfikujce semikanay koneksyn jako drogi uwalnia-nia ATP, mog w rzeczywistoci zawdzicza swoj ak-tywno paneksynom [94]. Dalsze badania nad wzorami ekspresji genw i regulacj ekspresji genw kodujcych kanay paneksyn moe pozwoli na odkrycie nowych szlakw sygnaowych, ktre uczestnicz w regulacji na-picia cian naczy krwiononych, oporu obwodowego i cinienia krwi, co z kolei moe dostarczy nowych celw terapeutycznych w leczeniu nadcinienia i niedocinie-nia.

Ektonukleotydazy

Aktywacja receptorw nukleotydowych utrzymuje si do chwili zmetabolizowania substratw przez zewntrz-komrkowe enzymy lub odczulenia na sygna. Degradacja nukleotydw ma dwojakie skutki: z jednej strony zmniej-sza stenie substratu do aktywacji receptorw wrali-wych na tri- lub difosforany, z drugiej zwiksza stenie odpowiednio di- lub monofosforanw, a w kocu rwnie adenozyny.

Ektonukleotydazy s enzymami zakotwiczonymi po zewntrznej stronie bony komrkowej. Odgrywaj zna-czc rol w regulowaniu zewntrzkomrkowych ste nukleotydw i nukleozydw [3]. Wczesne badania nad hydroliz nukleotydw ukazay szybk przemian ATP do ADP i dalej do AMP, ale duo wolniejsz do samej adenozyny [95].

W cianie naczy krwiononych wystpuj 4 ektonukle-otydazy z 17 obecnych u czowieka: ektonukleozydo-3-fosfo dihydrofosforhydrolaza 1 i 2 (1 NTPDaza1 i 2), ekto-5-nu-kleotydaza oraz ekto-nukleotydo-pyrofosfataza (NPP1, ek-to-nukleotydo fosfodiesteraza) (Tab. 1) [3]. Najistotniejsz rol w metabolizmie nukleotydw odgrywaj i najinten-sywniej badane s dwa enzymy: NTPDaza 1 oraz ekto-5--nukleotydaza i one zostan omwione w poniszym pod-rozdziale (Ryc. 1).

Synteza ektonukleozydo-3-fosfo difosfohydrolazy 1 (E-NTPDaza1/CD39) zachodzi w komrkach rdbon-ka naczy krwiononych [96], a enzym ten jest gwnym czonkiem rodziny E-NTPaz zaangaowanym w hydroliz zewntrzkomrkowych nukleotydw na powierzchni tych komrek. Formy rozpuszczalne kinazy adenylanowej 1 oraz E-NTPDazy 1/CD39 s gwnymi regulatorami kr-cych nukleotydw [97]. U myszy z wyciszonym Entpd1 ko-dujcym E-NTPDaz1/CD39 zaobserwowano zwikszon relaksacj mini gadkich aorty, w ktrej poredniczyy re-ceptory P2Y1 i P2Y2, co sugeruje, e E-NTPDaza1/CD39 re-guluje relaksacj naczy krwiononych zalen od wymie-nionych receptorw [98]. Odwrotny efekt zaobserwowano w komrkach rdbonka yy ppowinowej (HUVECs, ang. human umbilical vein endothelial cells) zwikszona ak-tywno E-NTPDazy1/CD39 hamowaa odpowied kom-rek rdbonka (sekrecj czynnika von Willebranda) wywo-ywan przez aktywacj receptorw P2Y do tego stopnia, e komrki ulegay apoptozie ze wzgldu na zwikszona ilo ATP (prawdopodobnie poprzez receptory P2X7) [99]. Poda-nie dootrzewnowe rozpuszczalnej E-NTPDazy 1 hamowao odkadanie si pytek krwi i rekrutacj leukocytw wywo-ane zranieniem oraz odwracao przerost intimy. Autorzy sugeruj, e ludzka E-NTPDaza1 moe odgrywa znaczc rol w supresji odpowiedzi pytkowej, zapalnej i prolife-racyjnej komrek po uszkodzeniu naczynia krwiononego [100].

AMP moe ulega dalszej przemianie do adenozyny po-przez odcicie grupy 5-fosforanowej przez enzym ekto-5--nukleotydaz CD73 [56]. E-NTPDaza1/CD39 zlokalizowa-na na powierzchni mini gadkich ttnic zmniejsza stenia zewntrzkomrkowych ATP, ADP, UTP oraz UDP, ktre w innym przypadku mogyby aktywowa receptory z rodziny P2, wic zmniejszaj czas skurczu naczy. Wykazano, e po-danie UDP do krwiobiegu krwi myszy pozbawionej CD39 powodowao pocztkowe rozlunienie naczy, a nastpnie silny skurcz oraz znaczne podwyszenie redniego cinie-nia ttniczego. Ponadto, pozyskane z tych myszy krki aorty wykazyway znacznie podwyszon si skurczu wy-woan adenozyn i urydyn w porwnaniu do myszy kon-trolnych z funkcjonalnym enzymem [98]. W innym badaniu

Tabela 1. Ektonukleotydazy wystpujce w cianie naczy krwiononych czowieka i ich wybrane waciwosci biochemiczne. Na podstawie [3].

Nazwa rodziny, numer EC Nazwa enzymu Pena nazwa Gwne substraty Produkt kocowy

Powinowactwo do substratu (Km), m

Ektonukleozydo-3-fosfo difos-fohydrolazy (EC 3.6.1.5)

NTPAza 1 CD3, ATPDaza, ekto-apyraza NTP, NDP NMP, Pi ATP ~ 10-200

NTPAza 2 CD39L1, ekto-ATPaza NTP, (NDP) NMP, Pi ATP ~ 70

Ekto-5-nukleotydazy (EC 3.1.3.5) eN

CD73, ekto-5-nukleotydaza, eNT, 5-NT o niskim Km

NMP nukleozyd, Pi AMP 1-50

Ekto-nukleotydo pyrofosfa-taza/fosfodiesteraza (EC 3.6.1.9) (EC 3.1.4.1)

NPP1 PC-1, NPP, PDNP1

NTP, NDP, NMP, Ppi, Pi NMP + Npn-1 AMP + mononukleotyd nikotynamidu

ATP ~ 50-500 ApnA ~1-20dinukleozydy

polifosfatanw, NAD+

NMP monofosforany nukleozydw, NDP difosforany nukleozydw, NTP trifosforany nukleozydw.


Kauffenstein i wsp. [98] zaobserwowa wyrany spadek w cinieniu krwi po podaniu doylnym UTP w steniach podprogowych wywoujcych skurcz naczy krwiono-nych oraz, konsekwentnie, z obnionym rozkadem nu-kleotydw i wzmoonej sile sygnau przechodzcego przez receptory P2Y w rdbonku. Badania te sugeruj kluczow rol ektonukleotydaz w regulacji stenia ATP w wietle naczy krwiononych, jak rwnie w rodowisku zewn-trzkomrkowym komrek budujcych ciany naczy, co wzmacnia podwjny efekt nukleotydw w regulacji oporu obwodowego i cinienia krwi. W komrkach HUVEC sil-nym aktywatorem CD37 jest interferon- [102]. Atrovasta-tyna, lek obniajcy poziom cholesterolu dziaajcy poprzez hamowanie aktywnoci reduktazy 3-hydroksy-3-metylo-grutarylo koenzymu A aktywuje degradacj zewntrzko-mrkowych nukleotydw, co moe dawa ochronne dzia-anie we wczesnych stadiach dysfunkcji rdbonka, ktre poprzedzaj rozwj miadycy [103]. Istniej przesanki, mwice, e po ekspozycji na dziaanie ludzkiej krwi nast-pia utrata ekto-5-nukleotydazy na powierzchni komrek rdbonka u wini, co moe by jednym z gwnych powo-dw odrzutw po przeszczepach ksenograficznych [104]. W ludzkim osoczu zostay zidentyfikowane dwa dziaajce przeciwstawne szlaki: generujcy ATP (w ktry zaangao-wana jest kinaza ektoadenylowa) oraz zuywajcy ATP, to one kontroluj rwnowag, czas trwania i si sygnau pu-rynergicznego we krwi [105]. Wiele bada in vivo pokazao wpyw puryn poprzez rdbonek na regulacj homeostazy w ukadzie naczyniowym. Ze wzgldu na brak selektyw-nych agonistw mogcych posuy w badaniach in vivo nad podtypami receptorw, ciko jest okreli, ktre z nich i w jakim stopniu s zaangaowane w przekazywanie sygnau. Rwnie rnice midzy poszczeglnymi naczyniami oraz rnice gatunkowe utrudniaj znalezienie jednoznacznej odpowiedzi na postawione pytanie.

RECEPTORY NUKLEOTYDOWE

Receptory nukleotydowe zostay zaklasyfikowane do dwch gwnych rodzin: P1 i P2 (P oznacza purynergiczne, ang. purinergic, co zwizane jest z faktem, e dopiero z cza-sem odkryto, e receptory te aktywowane s nie tylko przez puryny ATP i jego pochodne, ale rwnie pirymidyny UTP i jego pochodne). Receptory P1 dalej ulegaj klasyfi-kacji na A1, A2A, A2B oraz A3, ktre s zwizane z biakami Gs lub Gi i selektywnie wi si z adenozyn po zewntrznej stronie komrki, aby regulowa wewntrzkomrkowe st-enie cAMP. Receptory P2 s podzielone na receptory P2X zwizane z kanaami jonowymi dla Na+, K+ oraz Ca2+, do ktrych naley 7 izoform (P2X1-7) oraz metabotropowe re-ceptory P2Y zwizane z biakami Gq lub Gi, do ktrych na-ley 8 izoform (P2Y1,2,4,6,11-14) (Tab. 2) [4]. Istotnymi cechami odrniajcymi receptory z rodziny P2 s m.in. odmienni agonici, rne powinowactwo do substratw oraz wpyw na metabolizm komrki. Receptory P2X s aktywowane je-dynie poprzez ATP i maj wpyw na aktywno kanaw jonowych, receptory P2Y s aktywowane zarwno poprzez nukleotydy purynowe, ATP, ADP, jak i pirymidynowe UTP, UDP oraz UDP-glukoz. Zwizanie substratw z receptora-mi nukleotydowymi zwizanymi z biakiem Gq, P2Y1,2,4,6,11 prowadzi do aktywacji fosfolipazy C, wzrostu stenia tri-fosforanu inozytolu (IP3) i uwolnienia zmagazynowanych

wewntrzkomrkowych jonw wapnia [106]. Wzrost we-wntrzkomrkowego stenia jonw wapnia prowadzi do aktywacji rdbonkowej syntazy tlenku azotu i produkcji NO, ktry przekazuje sygna do VSMC, aby zaindukowa rozlunienie naczy krwiononych [107]. Podczas aktywacji P2Y11 dodatkowo zwiksza si aktywno cyklazy adenyla-nowej, co prowadzi do wzrostu stenia cAMP w komrce. P2Y12,13,14 s zwizane z biakiem Gi i ich aktywacja prowa-dzi do zahamowania aktywnoci cyklazy adenylanowej i w konsekwencji spadku stenia cAMP [106].

Receptory P2Y

Wikszo komrek rdbonka naczy krwiononych eksprymuje receptory P2Y1, ktre s aktywowane przez ATP i ADP oraz receptory P2Y2 aktywowane w rwnym stopniu przez UTP co ATP. P2Y4 aktywowane przez UTP oraz P2Y6, ktre s celem dla UDP ulegaj produkcji w komrkach rdbonka niektrych naczy krwiononych [108]. Pocztkowo zaobserwowano rny efekt dziaania ADP oraz UTP/ATP na komrki rdbonka aorty wou, dlatego receptory odpowiedzialne za przekazywane po-szczeglnych sygnaw zostay nazwane P2Y oraz P2U, dzi te nazwy odpowiadaj receptorom P2Y1 oraz P2Y2 lub P2Y4. Koprodukcja wyej wymienionych receptorw w ko-mrkach rdbonka wielu typw naczy krwiononych u rnych gatunkw zwierzt zostaa ju wielokrotnie opisa-na, jednak jedynie receptory P2Y1 zostay zidentyfikowane na komrkach rdbonka maych naczy krwiononych mzgu szczura [109]. Zwizanie si odpowiednich substra-tw z waciwymi dla nich receptorami nukleotydowymi na komrkach rdbonka prowadzi do wzrostu stenia Ca2+, co uruchamia jednoczesne uwolnienie NO, EDHF oraz PGI2 [110]. Produkcja NO oraz EDHF wywoywana przez aktywacj rdbonkowych receptorw P2Y1 oraz P2Y2 i/lub P2Y4 powoduje rozkurcz naczy krwiononych [111]. Poziom zaangaowania PGI2 w zalenym od nukleotydw rozkurczu jest rny w zalenoci od rodzaju naczynia krwiononego oraz podtypu receptora.

Wydzielane rdbonkowo NO oraz PGI2 hamuj agrega-cj pytek, jednake ATP i ADP mog stymulowa uwalnia-nie czynnika von Willebranda (ang. von Willebrand factor) w hodowli ludzkich komrek rdbonka, co sprzyja utrzy-maniu homeostazy. Co wicej, aktywacja receptorw P2Y2 w komrkach rdbonka ludzkiej ttnicy sercowej inicju-je kaskad koagulacji. Wida wic, e poza bezporednim efektem ATP i ADP w stymulacji agregacji pytek krwi po-przez dziaanie receptorw P2Y1, P2Y12 i P2X1, nukleotydy te mog wywiera zarwno pro- i antykoagulacyjny efekt na komrki rdbonka [112].

W komrkach rdbonka mechanizm uwalniania NO za-leny od ATP moe angaowa kanay chlorkowe aktywowa-ne jonami wapnia [110]. Zaangaowana w ten proces rwnie moe by kinaza biakowa aktywowana przez AMP (AMPK). AMPK odgrywa kluczow rol w regulowaniu homeostazy energetycznej komrki i moe by aktywowana przez stres ko-mrkowy, wywoany np. niedotlenieniem/niedokrwieniem lub hiperglikemi. Stany stresowe powoduj nage uwolnienie ATP z uszkodzonych tkanek (komrek rdbonka lub py-tek krwi). W dowiadczeniu sprawdzajcym przekazywanie


sygnau ADP w komrkach rdbonka aorty wou poprzez receptory P2Y1 wykazano, i synteza AMPK oraz kinazy kinaz zalenych od Ca2+ i kalmoduliny (CAMKK) jest niezbdna do przekazania sygnau do syntazy tlenku azotu (NOS) i uwal-niania NO [113]. ATP, ADP, UTP (ale nie UDP) aktywoway fosforylacj AMPK w komrkach HUVEC poprzez receptory P2Y1, P2Y2 i/lub P2Y4 [114]. W komrkach rdbonka aorty aktywacja receptorw P2Y poprzez ATP powoduje utrzymu-jc si aktywacj fosfolipazy D zalen od biakowej kinazy C (PKC) [115]. Fosforylacja NOS indukowana przez zewntrzko-mrkowe nukleotydy angaujca receptory P2Y1, P2Y2 i, by moe, P2Y4 zalena jest od jonw wapnia oraz PKC-. Wydaje si, i ta cieka sygnaowa moe sta si nowym celem tera-peutycznym w chorobach zwizanych z zaburzeniami funkcji rdbonka [73].

FAD jest uwalniany z komrek podczas stanw zapal-nych oraz jest odpowiedzialny za ochron przeciw urazom spowodowanym poprzez niedotlenienie w miniu serco-wym szczura. Wywouje rwnie rozkurcz naczy krwio-nonych zaleny od rdbonka w oysku krezki szczu-ra poprzez aktywacj receptorw z rodziny P2Y. Nie jest poznany mechanizm tego zjawiska, ale postuluje si, e proces ten angauje czynnik rozkurczowy lub hiperpola-ryzujcy pochodzenia rdbonkowego inny ni NO i PGI2 [116]. Na rdbonku mysiej aorty obecne s funkcjonalne receptory P2Y, jednak rozkurcz wywoany nukleotydami uwolnionymi przez rdbonek spada wraz z akumulacj pytki miadycowej, co wie si ze zmniejszon dostp-noci NO [117]. Sia rozkurczu naczy krwiononych zalenego od rdbonka, a wywoanego przez acety-

Tabela 2. Receptory purynergiczne i ich agonici oraz antagonici. Na podstawie [4]

Rodzina Nazwa biaka Agonici Selektywni Agonici Selektywni Antagonici Typ

P1 (A)

A1 adenozyna Gi/oA2A adenozyna GsA2B adenozyna Gs

A3 adenozyna Gi/o

P2Y

P2Y1 ADP > ATP 2-MeSADP, ADPbS, MRS2365 MRS2179, MRS2500 Gq/11

P2Y2 UTP=ATP UTPgS, PSB1114 Gq/11P2Y4 UTP>ATP UTPgS, MRS4062 MRS2578 Gq/11

P2Y6 UDP>>UTP>ATPUDP, PSB 0474 ([ 3- phenacylUDP), MRS2957 Gq/11

P2Y11 ATP>UTP NF546, NAD+ NAADP+ NF157, NF340 Gs, Gq/11P2Y12 ADP>>ATP ADP, 2-MeSADP AR-C 66096 Gi/oP2Y13 ADP>>ATP MRS2211 Gi/o

P2Y14UDP-glukoza UDP-galaktoza MRS2690 PPTN Gi/o

P2X

P2X1 ATP a,b-meATP, L-b,g-meATP NF023, NF449 Ro 0437626 kana jonowy

P2X2 ATP kana jonowy

P2X3 ATP A317491 Ro51, RO3 kana jonowy




P2X7 ATP A839977, A740003, A438079, AZ 11645373 kana jonowy


locholin spada wraz z wiekiem, w przeciwiestwie do siy rozkurczu wywoanego przez ATP, ktra nie ulega zmianie u zdrowych osobnikw [118]. Wykazano antago-nistyczne dziaanie acylowych pochodnych koenzymu A na rozkurcz naczy krwiononych poprzez rdbonkowe receptory P2Y1, w ktrym poredniczy ADP . Koenzym A moe by uwalniany z komrek podczas niektrych stanw patologicznych, takich jak niedokrwienie czy cu-krzyca, co moe wiadczy, e jest to endogenny regulator przekazywania sygnau nukleotydowego [119]. Troficz-na rola receptorw P2Y zostaa zaproponowana, kiedy w 2003 roku zaobserwowano, e rozmiar komrek rd-bonka jest regulowany wanie przez ich aktywno [120]. Pniejsze badanie porwnawcze analizujce odpowiedzi pojedynczych komrek rdbonka wyizolowanych z by-dlcej siatkwki i komrek HUVEC wykazao rol rnic we wzorach odwraliwienia receptorw P2Y2 oraz czyn-nikw wzrostu [121]. W jednym z bada nad wzmocnie-niem bariery rdbonka ukazano, e zjawisko to moe by zwizane z aktywacj cytoszkieletu wywoan przez ATP, ktre jest zalene zarwno od aktywacji biaka Rac (biako o aktywnoci GTPazy z rodziny biaek Rho), jak i kortak-tyny [122]. Ponadto zewntrzkomrkowe ATP powoduje aktywacj fosfatazy lekkich acuchw miozyny w komr-kach rdbonka, ktry to enzym jest bezporednio zaan-gaowany w regulacj funkcji bariery rdbonka [123]. Wykazano, e B-NAD promuje funkcje bariery rdbonka w hodowlach wyprowadzonych z ludzkiej ttnicy pucnej, a proces ten angaowa zarwno receptory P2Y1 oraz P2Y11 jak i rearanacj cytoszkieletu aktynowego zalenego od PKA oraz EPAC1/Rac1 [74].

Receptory P2X

Mimo e to receptory P2Y s gwnym obiektem bada przekazywania sygnau nukleotydowego w naczyniach krwiononych, zostay opisane rwnie izoformy recep-torw P2X obecne w rdbonku wielu typw naczy krwiononych. Za pomoc metod immunohistochemicz-nych na komrkach rdbonka ttnicy piersiowej, ttni-cy promieniowej i yy odpiszczelowej zidentyfikowano receptory P2X1, P2X4, P2X7 oraz P2Y2, z kolei receptory P2X4 ulegay stosunkowo silnej syntezie w naczyniach ylnych w porwnaniu do ttnic [124]. W eksperymencie badajcym obecno receptorw z rodziny P2 w ttnicach piersiowych i komrkach HUVEC, zaobserwowano, e w miniach gadkich dominowa receptor P2X1, natomiast P2X4, P2Y1 oraz P2Y11 byy najpowszechniejsze w rd-bonku, dodatkowo P2Y2 oraz P2Y6 byy rwnie obecne na niskich poziomach w obu lokalizacjach [108]. W bada-niu komrek rdbonka w hodowlach wyprowadzonych z ttnic wiecowych, pucnych oraz aorty i komrek HU-VEC rwnie zaobserwowano syntez receptora P2X4, ale rwnie P2X5 [28]. Synteza tych receptorw rni si nie tylko midzy rnymi komrkami budujcymi naczynie krwionone, ale rwnie lokalizacj w samej komrce, na komrkach HUVEC wystpowanie receptorw P2X4 oraz P2X6 byo ograniczone do miejsc styku komrka-ko-mrka, co pozwolio wnioskowa, e obecno tych re-ceptorw jest skorelowana z VE-kadheryn, znacznikiem adhezji komrkowej w poczeniach komrek HUVEC [125].

Nadal niewiele jest wiadomo o funkcji rdbonkowych receptorw P2X. Najlepiej poznanym receptorem jest P2X4, a jego najbardziej znan funkcj jest poredniczenie w roz-kurczu mini w odpowiedzi na ATP uwalniane z komrek rdbonka. Wykazano, e myszy z uszkodzonym genem kodujcym P2X4 wykazyway nieprawidow odpowied rdbonka na zmiany w przepywie krwi, zmniejszon rozszerzalno naczy. Zwierzta te rwnie miay pod-wyszone cinienie krwi i uwalniay mniejsze iloci NO. Wydaje si, e nadcinienie u tych myszy moe by spowo-dowane nieobecnoci rozkurczu naczy spowodowanego interakcj ATP z P2X4 oraz obnion produkcj NO w od-powiedzi na ten bodziec, a jednoczenie brakiem negatyw-nego wpywu NO na proliferacj mini gadkich naczy [126]. Aktywacja receptorw P2X1 eksprymowanych w rdbonku ttnic krezki szczura prowadzi do rozlunienia naczy krwiononych, gwnie poprzez EDHF [127]. P-niejsze badania nad myszami z wyciszonym genem kodu-jcym P2X1 potwierdziy wyniki osignite na szczurach, co zasugerowao badaczom, e rozkurcz naczy zaleny od tego receptora jest szczeglnie wany w stanach zapalnych lub uszkodzeniach naczy [128].

Komrki HUVEC poddane laminarnej sile cinajcej zmniejszay poziom mRNA kodujcego receptor P2X4, aby po 24 godzinach osign 60% wyjciowej iloci [129]. Pro-dukcja P2X4 oraz P2X7 jest podwyszona w odpowiedzi na warunki stanu zapalnego, a aktywacja P2X7 wywoaa uwolnienie zarwno pro- jak i przeciwzapalnych ligandw dla receptora interlukiny-1. Zaburzenie rwnowagi pomi-dzy tymi czynnikami moe doprowadzi do zmiany stanw zapalnych ciany naczynia [130].

Receptory P1 (dla adenozyny)

Adenozyna wywouje wzrost przepywu krwi do tkanki niedokrwionej lub niedotlenionej, np. hamuje uwalnianie z zakocze nerww sympatycznych neurotransmiterw poprzez oddziaywanie na receptory presynaptyczne lub rozszerza wiato naczy krwiononych poprzez oddziay-wanie na rdbonek lub minie gadkie. Wszystkie 4 izo-formy receptorw dla adenozyny, A1, A2A, A2B, A3, zostay zidentyfikowane zarwno na rdbonku jak i na komr-kach mini gadkich, najczciej wystpuj izoformy A2A i A2B (Tab. 2) [4].

Analiza mechanizmw odpowiedzialnych za uwalnia-nie NO wywoanego adenozyn z rdbonka aorty szczu-ra sugeruje, e zjawisko to wymagajce porednictwa receptora A1, jest zalene od napywu zewntrzkomr-kowych jonw wapnia, aktywacji fosfolipazy A2 i ATP--wraliwych kanaw potasowych, natomiast to, w ktrym uczestniczy receptor A2A wymaga napywu zewntrzko-mrkowych jonw wapnia oraz aktywacji kanaw pota-sowych zalenych od potencjau bony [131]. Poza dziaa-niem rozkurczowym adenozyny w sytuacji niedotlenienia, istniej przesanki mwice o jej zdolnoci do promowa-nia angiogenezy podczas niedokrwienia lub niedotlenie-nia, co pomaga zapewni wystarczajce natlenienie tka-nek w stresowych warunkach [132]. Receptory A2B obecne na rdbonku naczy kapilarnych czowieka moduluj


produkcj czynnikw angiogennych [133], ich aktywacja zwiksza produkcj VEGF i proliferacj komrek, istniej rwnie przesanki, e s zaangaowane indukcj syntezy VEGF przez niedotlenienie [134]. Ze wzgldu na t nie-zwykle wan rol receptorw A2B, wydaje si zrozumiae, e w okresie niedotlenienia zmienia si produkcja recep-torw w komrkach rdbonka z A2A na A2B [133].Wyst-puj rnice w odpowiedzi na aktywacj receptorw dla adenozyny i -adrenoreceptorw podczas niedotlenienia w duych i maych naczyniach krwiononych [135]. Wy-daje si, e adenozyna moe wywiera dziaanie antyko-agulacyjne na komrki rdbonka poprzez aktywacj re-ceptorw A2A i A3, ktre powoduj zmniejszenie syntezy rdbonkowego czynnika tkankowego, szczeglnie pod-czas niedotlenienia i miadycy procesw, ktre koja-rzone s ze zwikszonym poziomem puryn w krwioobie-gu. Cytokiny mog modulowa produkcj receptorw A2A i A2B w rdbonku ludzkich naczy wosowatych [136]. Zaobserwowano regulacj produkcji reaktywnych form tlenu indukowanych Ang-II poprzez receptory A2A w ko-mrkach rdbonka. Hamowanie aktywnoci A2A moe chroni komrki rdbonka przed stresem oksydacyjnym wywoanym Ang-II i dysfunkcj rdbonka [137]. Leu-kocyty adherentne zapobiegaj powstawaniu adenozyny, czego konsekwencj jest osabiona funkcja bariery rd-bonka zalena od mechanizmu zalenego od CD37 [138].

Niedawne doniesienia sugeruj, e adenozyna moe by gwnym regulatorem rdbonkowych komrek progenitorowych [139]. Adenozyna powoduje wzrost syn-tezy receptora dla chemokin CXCR4 i stymuluje rekrutacj w pozawaowym miniu sercowym oraz przyspiesza jego napraw. Inna grupa badaczy z kolei zidentyfikowaa re-ceptory A2A i A3, jako mediatory dla migracji progenitoro-wych komrek rdbonka [140].

Receptory te rni si iloci i powinowactwem do substratw oraz s specyficzne tkankowo. Brak kolejnych receptorw z rodziny P2Y (P2Y3, P2Y5, P2Y7, P2Y8, P2Y9, P2Y10) jest spowodowany bdem opisu podczas ich iden-tyfikacji. Pocztkowo zaliczono je do tej rodziny, z cza-sem jednak okazao si, e do niej nie nale.

PRZEKAZYWANIE SYGNAU PURYNERGICZNEGO W CHOROBACH SERCOWO-NACZYNIOWYCH

Choroby sercowo-naczyniowe stanowi przyczyn bli-sko 50% zgonw we wspczesnych spoeczestwach za-chodnich. Poniewa receptory dla nukleotydw i adeno-zyny odgrywaj ogromn rol w utrzymaniu prawidowej struktury i funkcji naczy krwiononych coraz wiksz uwag przyciga wykorzystanie ich jako celu farmakolo-gicznego w terapii chorb naczyniowych [4].

Cinienie krwi pozostaje w dynamicznej rwnowadze utrzymywanej przez ATP i UTP uwalniane od strony wiata naczynia przez krce komrki krwi oraz ko-mrki rdbonka, co stymuluje rozkurcz oraz nukleoty-dy uwalniane przez nerwy z zewntrz naczynia, co z ko-lei pobudza minie gadkie do skurczu. ATP moe rw-nie regulowa cinienie krwi poprzez oddziaywanie na prac nerki oraz pnia mzgu [141].

Diadenozyno fosforany, takie jak Ap4A, Ap5A oraz Ap6A s to czsteczki, ktre skadaj si z dwch czsteczek ade-nozyny zczonych od 4 do 6 grupami fosforanowymi. Wy-kazuj one dziaanie skurczowe na naczynia krwionone [142], najprawdopodobniej poprzez mechanizm angaujcy receptory P2X1 oraz P2Y2. U chorych cierpicych na nadci-nienie obserwuje si znaczco wysze poziomy Ap5A oraz Ap6A w pytkach krwi, co moe przyczynia si do zwik-szonego oporu obwodowego u tych osb [143]. Up4A to czynnik skurczowy pochodzenia rdbonkowego, ktry wykazuje silniejsze dziaanie na skurcz naczy nerki ni endotelina [144]. Jest uwalniany po zadziaaniu acetylocho-liny, trombiny lub stresu mechanicznego na komrki rd-bonka, a nastpnie moe ulec zmetabolizowaniu do ATP lub UTP i dalej stymulowa odpowiednio receptor P2X1 lub P2Y2 i w konsekwencji zwiksza cinienie krwi [33].

Miadyca jest gwn przyczyn zawaw serca i obec-nie postrzegana jest jako choroba o podou zapalnym. For-mowanie si pytki miadycowej zaczyna si od akumu-lacji czsteczek LDL, po ktrym nastpuje migracja makro-fagw, ktre pobieraj LDL do swojego wntrza stajc si komrkami piankowymi. Pytka taka moe zosta ustabili-zowana poprzez obudowanie si miniami gadkimi, jed-nak utleniony LDL generuje dalszy rozwj stanu zapalnego, co dalej aktywuje makrofagi i komrki dendrytyczne, a w konsekwencji rwnie limfocyty T, ktre nastpnie uwal-niaj cytokiny oraz metaloproteinazy, ktre rozpuszczaj pytk. Wiele bada sugeruje zaangaowanie szlakw prze-kazywania sygnau nukleotydowego na wielu poziomach rozwoju miadycy. Zawarte w olejach z ryb kwasy tusz-czowe omega-3 powoduj uwalnianie ATP [145], podczas gdy wysokie stenie cholesterolu we krwi zmniejsza uwal-nianie tego nukleotydu w ttnicach [146].

Wiele komrek biorcych udzia w odpowiedzi na stan zapalny ma na swojej powierzchni receptory nukleotydowe. W przypadku miadycy najwaniejszymi komrkami zaan-gaowanymi w proces tworzenia pytki s monocyty, ktre dalej rnicuj w makrofagi lub komrki dendrytyczne oraz limfocyty T-helperowe i supresorowe, poniewa s odpowie-dzialne za odpowied ukadu odpornociowego na tworz-c si zmian w naczyniu [147]. Wiele receptorw z rodziny P2 jest eksprymowanych na makrofagach i limfocytach T [148], jednak najwaniejsz rol graj najprawdopodobniej 3: P2X7, P2Y2 oraz P2Y11. Aktywacja receptora P2X7 odgrywa wan rol podczas uwalniania IL-1 [149], TNF [150] i L-se-lektyny, czsteczki adhezyjnej, niezbdnej do zwizania si limfocytw do komrek rdbonka. Prawidowe uwalnianie i dziaanie tych zwizkw jest zaburzone podczas miady-cy. Z kolei aktywowany receptor P2Y2 stymuluje wybuch tle-nowy w ludzkich makrofagach [151]. ATP hamuje aktywacj limfocytw CD4+ poprzez zwikszanie stenia wewntrz-komrkowego cAMP, prawdopodobnie w proces ten zaan-gaowany jest receptor P2Y11 [152].

Wykazano, e w miadycy zwiksza si rwnie aktyw-no E-NTPDazy1/CD39, co powoduje zwikszon hydro-liz ATP do ADP [153]. Autorzy pracy sugeruj, e zjawisko to moe mie zarwno dobre jak i ze skutki. Z jednej stro-


ny moe zmniejsza formowanie skrzepu, a z drugiej moe przyczynia si do niestabilnoci pytki miadycowej i za-waw serca [153].

Zewntrzkomrkowe nukleotydy s mediatorami stanu zapalnego naczy krwiononych i zakrzepicy [154]. ATP uwalniane do wiata naczynia moe by zmetabolizowane do ADP, ktre bdzie oddziaywao na receptory P2Y1 i P2Y12 obecne na pytkach krwi, co doprowadzi do ich agregacji. Clopidogrel jest agonist receptora P2Y12, hamuje agregacj pytek krwi i dlatego jest uywany jako lek zapobiegajcy udarom mzgu i zakrzepicom [155]. Adenozyna wykazuje dziaanie przeciw zakrzepowe hamujc indukcj czynnika tkankowego poprzez aktywacj receptorw A2A i A3 [156].

Zaburzenia funkcji nerww wspczulnych naczy krwiononych w modzieczej cukrzycy zostay opisane ju wiele lat temu. W dwa tygodnie po podaniu straptozytocy-ny (substancji niszczcej trzustk) szczurom obserwowano nieprawidow neurotransmisj oraz funkcj rdbonka zalen od ATP w naczyniach krezki [157]. Jak ju wcze-niej wspominano, erytrocyty mog przyczynia si do roz-kurczu naczy poprzez uwalnianie ATP. W czerwonych krwinkach osb cierpicych na cukrzyc uwalnianie ATP jest obnione [90]. Wysokie pozakomrkowe stenie glu-kozy uwalnia ATP i/lub UTP z komrek rdbonka oraz trzustki [1586]. Wzrost stenia glukozy z 5 do 15 mmol/l (co odpowiada wzrostowi stenia cukru w normoglikemii do hiperglikemii) powoduje promiadycow aktywacj limfocytw T [158]. ATP i UTP uwalniane w odpowiedzi na wysokie stenie glukozy aktywuj receptory P2Y2, a po de-gradacji do UDP, rwnie P2Y6. Wynika z tego, e uwalnia-ne nukleotydy mog odgrywa rol czujnika w naczyniach krwiononych poredniczc w odpowiedzi na hiperglike-mi. U pacjentw z cukrzyc czsto obserwuje si zwik-szony stosunek gruboci ciany naczynia do jego wiata, gwnie z powodu przerostu VSMC i wyszy odsetek reste-nozy po angioplastyce. Uwalnianie zewntrzkomrkowych nukleotydw w odpowiedzi na wysokie stenie glukozy we krwi, ktre nastpnie wi si do receptorw P2Y i sty-muluj VSMC do wzrostu i proliferacji poprzez aktywacj czynnika jdrowego aktywowanych limfocytw T (NFAT, ang. nuclear factor of activated T cells) moe okaza si braku-jcym etapem w zrozumieniu zalenoci midzy cukrzyc a towarzyszcymi im patologiami naczy krwiononych [158].

PODSUMOWANIE

Przedstawiona w powyszej pracy rnorodno recep-torw oraz mnogo mechanizmw utrzymujcych ste-nie zewntrzkomrkowych nukleotydw w dynamicznej rwnowadze, wskazuje jak fundamentalny jest sposb ko-munikacji dziki nim. W chwili obecnej przekazywanie sy-gnau nukleotydowego jest bardzo intensywnie badane, a mimo to, jeszcze nie wszystkie procesy z nim zwizane s wyjanione. Badania nad funkcjami receptorw nukleoty-dowych s utrudnione przez fakt powinowactwa rnych receptorw do tego samego agonisty (porwnaj tabela 2), wzajemne przemiany nukleotydw i nukleozydw na ze-wntrz komrki oraz szybkie odrnicowanie si skadu re-ceptorw wraz z kolejnym pasaem w hodowlach komrek

pierwotnych [106]. Tym niemniej, obecnie oczywistym jest, e przekazywanie sygnau purynergicznego odgrywa zna-czca rol w kontroli napicia cian i remodelingu naczy, a sia i efekt tego sygnau s zalene od produkujcych go komrek i integralnoci rdbonka. Uoglniajc, sygnay przekazywane od zewntrz, przez nerwy wspczulne, po-woduj skurcz mini gadkich, podczas gdy sygna idcy z wewntrz naczynia, od komrek krcych we krwi i ko-mrek rdbonka, powoduje jego rozkurcz [4].

Poza regulacj funkcji bariery rdbonka i napicia cian naczy aktywacja receptorw purynergicznych moe zna-czco wpywa na metabolizm komrek, np. aktywacj szlakw kinaz aktywowanych mitogenami (MAPK, ERK, p38, JNK), a rwnie kinazy biakowej aktywowanej przez AMP (AMPK) i rdbonkowej kinazy tlenku azotu (eNOS) [73,114].

Ze wzgldu na to, e przekazywanie sygnau nukleoty-dowego wydaje si by zmienione w przebiegu wielu cho-rb naczyniowych, receptory nukleotydowe mog okaza si dobrymi celami farmakologicznymi w ich terapii [159].

PIMIENNICTWO1. Gribble FM, Loussouarn G, Tucker SJ, Zhao C, Nichols CG, Ashcroft

FM (2000) A novelmethod for measurement of submembrane ATP concentration. J Biol Chem 275: 30046-30049

2. Lohman AW, Billaud M, Isakson BE (2012) Mechanisms of ATP re-lease and signalling in the blood vessel wall. Cardiovasc Res 95: 269-80

3. Zimmermann H, Zebisch M, Strter N (2012) Cellular function and molecular structure of ecto-nucleotidases. Purinergic Signal 8: 437-502

4. Burnstock G, Ralevic V (2013) Purinergic signaling and blood vessels in health and disease. Pharmacol Rev 66: 102-92

5. Burnstock G, Kennedy C (1985) Is there a basis for distinguishing two types of P2- purinoceptor? Gen Pharmacol 16: 433-440

6. Burnstock G (1978) A basis for distinguishing two types of puriner-gic receptor, in Cell Membrane Receptors for Drugs and Hormones: A Multidisciplinary Approach (Straub RW and Bolis L, eds, ed) pp 107-118, Raven Press, New York

7. Pearson JD, Gordon JL (1989) P2 purinoceptors in the blood vessel wall. BiochemPharmacol 38: 4157-4163

8. Bodin P, Burnstock G (2001) Evidence that release of adenosine tri-phosphate from endothelial cells during increased shear stress is ve-sicular. J Cardiovasc Pharmacol 38: 900-908

9. Demel SL, Dong H, Swain GM, Wang X, Kreulen DL, Galligan JJ (2010) Antioxidant treatment restores prejunctional regulation of purinergic transmission in mesenteric arteries of deoxycorticosterone acetate-salt hypertensive rats. Neuroscience 168: 335-345

10. Vial C, Evans RJ (2005) Disruption of lipid rafts inhibits P2X1 recep-tor-mediated currents and arterial vasoconstriction. J Biol Chem 280: 30705-30711

11. Johnson CD, Coney AM, Marshall JM (2001) Roles of norepinephrine and ATP in sympathetically evoked vasoconstriction in rat tail and hindlimb in vivo. Am J Physiol Heart Circ Physiol 281: H2432-H2440

12. Billaud M, Lohman AW, Straub AC, Parpaite T, Johnstone SR, Isakson BE (2012) Characterization of the thoracodorsal artery: morphology and reactivity. Microcirculation 19: 360-372

13. Wier WG, Zang WJ, Lamont C, Raina H (2009) Sympathetic neurogen-ic Ca2+ signaling in rat arteries: ATP, noradrenaline and neuropeptide Y. Exp Physiol 94: 31-37

14. Burnstock G, Warland JJI (1987) A pharmacological study of the rabbit saphenous artery in vitro: a vessel with a large purinergic contractile response to sympathetic nerve stimulation. Br J Pharmacol 90: 111-120


15. Ralevic V, Burnstock G (1990) Postjunctional synergism of noradren-aline and adenosine 59-triphosphate in the mesenteric arterial bed of the rat. Eur J Pharmacol 175: 291-299

16. Evans RJ, Surprenant A (1992) Vasoconstriction of guinea-pig submu-cosal arterioles following sympathetic nerve stimulation is mediated by the release of ATP. Br J Pharmacol 106: 242-249

17. strand P, Stjrne L (1989) ATP as a sympathetic co-transmitter in rat vasomotor nerves - further evidence that individual release sites re-spond to nerve impulses by intermittent release of single quanta. Acta Physiol Scand 136: 355-365

18. Cheung DW (1982) Two components in the cellular response of rat tail arteries to nerve stimulation. J Physiol 328: 461-468

19. Sneddon P, Burnstock G (1984) Inhibition of excitatory junction po-tentials in guinea-pig vas deferens by a, b-methylene-ATP: further ev-idence for ATP and noradrenaline as cotransmitters. Eur J Pharmacol 100: 85-90

20. Jobling P, McLachlan EM (1992) The effect of the purinoceptor antago-nist suramin on neurotransmission in the main caudal artery of the rat. Proc Aust Physiol Pharmacol Soc 23: 69

21. Burnstock G (1988) Sympathetic purinergic transmission in small blood vessels. Trends Pharmacol Sci 9: 116-117

22. Brock JA, Dunn WR, Boyd NS, Wong DK (2000) Spontaneous release of large packets of noradrenaline from sympathetic nerve terminals in rat mesenteric arteries in vitro. Br J Pharmacol 131: 1507-1511

23. Keef KD, Pasco JS, Eckman DM (1992) Purinergic relaxation and hy-perpolarization in guinea pig and rabbit coronary artery: role of the endothelium. J Pharmacol Exp Ther 260: 592-600

24. Lundberg JM (1996) Pharmacology of cotransmission in the autonom-ic nervous system: integrative aspects on amines, neuropeptides, ade-nosine triphosphate, amino acids and nitric oxide. Pharmacol Rev 48: 113-178

25. Burnstock G (2009) Purines and sensory nerves, (Handbook Exp Phar-macol), Vol. 194, pp 333-392, Springer-Verlag, Berlin

26. Burnstock G (2009) Purinergic regulation of vascular tone and remod-elling. Auton Autacoid Pharmacol 29: 63-72

27. Crecelius AR, Kirby BS, Luckasen GJ, Larson DG, Dinenno FA (2012) ATPmediated vasodilatation occurs via activation of inwardly rectify-ing potassium channels in humans. J Physiol 590: 5349-5359

28. Schwiebert LM, Rice WC, Kudlow BA, Taylor AL, Schwiebert EM (2002) Extracellular ATP signaling and P2X nucleotide receptors in monolayers of primary human vascular endothelial cells. Am J Phy-siol Cell Physiol 282: C289-C301

29. Bodin P, Burnstock G (1996) ATP-stimulated release of ATP by human endothelial cells. J Cardiovasc Pharmacol 27: 872-875

30. Hong D, Jaron D, Buerk DG, Barbee KA (2006) Heterogeneous re-sponse of microvascular endothelial cells to shear stress. Am J Physiol Heart Circ Physiol 290: H2498-H2508

31. Yamamoto K, Furuya K, Nakamura M, Kobatake E, Sokabe M, Ando J (2011) Visualization of flow-induced ATP release and triggering of Ca2+ waves at caveolae in vascular endothelial cells. J Cell Sci 124: 3477-3483

32. Tlle M, Jankowski V, Schuchardt M, Wiedon A, Huang T, Hub F, Kowalska J, Jemielity J, Guranowski A, Loddenkemper C (2008) Ad-enosine 59-tetraphosphate is a highly potent purinergic endotheli-um-derived vasoconstrictor. Circ Res 103: 1100-1108

33. Jankowski V, Tlle M, Vanholder R, Schnfelder G, van der Giet M, Henning L, Schlter H, Paul M, Zidek W, Jankowski J (2005) Uridine adenosine tetraphosphate: a novel endothelium- derived vasocon-strictive factor. Nat Med 11: 223-227

34. Gui Y, Walsh MP, Jankowski V, Jankowski J, Zheng XL (2008) Up4A stimulates endothelium-independent contraction of isolated rat pul-monary artery. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 294: L733-L738

35. Sawada K, Echigo N, Juge N, Miyaji T, Otsuka M, Omote H (2008) Identification of a vesicular nucleotide transporter. Proc Natl Acad Sci USA 105: 5683-5686

36. Nelson N, Perzov N, Cohen A, Hagai K, Padler V, Nelson H (2000) The cellular biology of proton-motive force generation by V-ATPases. J Exp Biol 203: 89-95

37. Tousson A, Van Tine BA, Naren AP, Shaw GM, Schwiebert LM (1998) Characterization of CFTR expression and chloride channel activity in human endothelia. Am J Physiol 275: C1555-C1564

38. Robert R, Norez C, Becq F (2005) Disruption of CFTR chloride channel alters mechanical properties and cAMP-dependent Cl- transport of mouse aortic smooth muscle cells. J Physiol 568: 483-495

39. Sprague RS, Ellsworth ML, Stephenson AH, Kleinhenz ME, Lonigro AJ (1998) Deformation-induced ATP release from red blood cells re-quires CFTR activity. Am J Physiol 275: H1726-H1732

40. Mattoscio D, Evangelista V, De Cristofaro R, Recchiuti A, Pandolfi A, Di Silvestre S (2010) Cystic fibrosis transmembrane conductance regu-lator (CFTR) expression in human platelets: impact on mediators and mechanisms of the inflammatory response. FASEB J 24: 3970-3980

41. Sprague RS, Ellsworth ML, Stephenson AH, Lonigro AJ (2001) Partici-pation of cAMP in a signal-transduction pathway relating erythrocyte deformation to ATP release. Am J Physiol Cell Physiol 281: C1158--C1164

42. Aguilar-Bryan L, Nichols CG, Rajan AS, Parker C, Bryan J (1992) Co-expression of sulfonylurea receptors and KATP channels in ham-ster insulinoma tumor (HIT) cells. Evidence for direct association of the receptor with the channel. J Biol Chem 267: 14934-14940

43. Larsson O, Ammala C, Bokvist K, Fredholm B, Rorsman P (1993) Stim-ulation of the KATP channel by ADP and diazoxide requires nucleotide hydrolysis in mouse pancreatic beta-cells. J Physiol 463: 349-365

44. Hassessian H, Bodin P, Burnstock G (1993) Blockade by glibenclamide of the flow-evoked endothelial release of ATP that contributes to va-sodilatation in the pulmonary vascular bed of the rat. Br J Pharmacol 109: 466-472

45. Reddy MM, Quinton PM, Haws C, Wine JJ, Grygorczyk R, Tabchara-ni JA (1996) Failure of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator to conduct ATP. Science 271: 1876-1879

46. Tu J, Le G, Ballard HJ (2010) Involvement of the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator in the acidosis-induced efflux of ATP from rat skeletal muscle. J Physiol 588: 4563-4578

47. Devenish RJ, Prescott M, Rodgers AJ (2008) The structure and function of mitochondrial F1F0-ATP synthases. Int Rev Cell Mol Biol 267: 1-58

48. Moser TL, Stack MS, Asplin I, Enghild JJ, Hojrup P, Everitt L (1999) Angiostatin binds ATP synthase on the surface of human endothelial cells. Proc Natl Acad Sci USA 96: 2811-2816

49. Moser TL, Kenan DJ, Ashley TA, Roy JA, Goodman MD, Misra UK (2001) Endothelial cell surface F1-F0 ATP synthase is active in ATP synthesis and is inhibited by angiostatin. Proc Natl Acad Sci USA 98: 6656-6661

50. Gerasimovskaya EV,Woodward HN, Tucker DA, Stenmark KR (2008) Extracellular ATP is a pro-angiogenic factor for pulmonary artery vasa vasorum endothelial cells. Angiogenesis 11: 169-182

51. Yamamoto K, Shimizu N, Obi S, Kumagaya S, Taketani Y, Kamiya A (2007) Involvement of cell surface ATP synthase in flow-induced ATP release by vascular endothelial cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol 293: H1646-H1653

52. Koval M (2006) Pathways and control of connexin oligomerization. Trends Cell Biol 16: 159-166

53. Orellana JA, Froger N, Ezan P, Jiang JX, Bennett MV, Naus CC (2011) ATP and glutamate released via astroglial connexin 43 hemichannels mediate neuronal death through activation of pannexin 1 hemichan-nels. J Neurochem 118: 826-840

54. Eltzschig HK, Eckle T, Mager A, Kuper N, Karcher C, Weissmuller T (2006) ATP release from activated neutrophils occurs via connexin 43 and modulates adenosinedependent endothelial cell function. Circ Res 99: 1100-1108

55. Wong CW, Christen T, Roth I, Chadjichristos CE, Derouette JP, Foglia BF (2006) Connexin37 protects against atherosclerosis by regulating monocyte adhesion. Nat Med 12: 950-954


56. Faigle M, Seessle J, Zug S, El Kasmi KC, Eltzschig HK (2008) ATP re-lease from vascular endothelia occurs across Cx43 hemichannels and is attenuated during hypoxia. PLoS ONE 3:e2801

57. Song M, Yu X, Cui X, Zhu G, Zhao G, Chen J (2009) Blockade of con-nexin 43 hemichannels reduces neointima formation after vascular in-jury by inhibiting proliferation and phenotypic modulation of smooth muscle cells. Exp Biol Med 234: 1192-1200

58. Stout CE, Costantin JL, Naus CC, Charles AC (2002) Intercellular cal-cium signaling in astrocytes via ATP release through connexin hemi-channels. J Biol Chem 277: 10482-10488

59. Lamont C, Vial C, Evans RJ, Wier WG (2006) P2X1 receptors mediate sympathetic postjunctional Ca2+ transients in mesenteric small arter-ies. Am J Physiol Heart Circ Physiol 291: H3106-H

STRESZCZENIE Zofia Magier N - Postępy Biochemii · niem przez neurotransmitery znana jest jako...

Documents

Transcript of STRESZCZENIE Zofia Magier N - Postępy Biochemii · niem przez neurotransmitery znana jest jako...