UNIWERSYTET TECHNOLOGICZNO-PRZYRODNICZY

IM. JANA I JĘDRZEJA ŚNIADECKICH W BYDGOSZCZY

WYDZIAŁ ROLNICTWA I BIOTECHNOLOGII

mgr inż. Magdalena Kroplewska

STRESZCZENIE

ROZPRAWY DOKTORSKIEJ PT.:

Charakterystyka szczepów Listeria monocytogenes

izolowanych ze środowiska wybranych zakładów przetwórstwa spożywczego

przy użyciu klasycznych metod mikrobiologicznych

oraz metod biologii molekularnej

PROMOTOR

PROF. DR HAB. ZBIGNIEW PALUSZAK, PROF. ZW. UTP

PROMOTOR POMOCNICZY

DR HAB. INŻ. KRZYSZTOF SKOWRON

BYDGOSZCZ, 2019

2

1. WPROWADZENIE I CEL BADAŃ

Bakterie Listeria monocytogenes to Gram-dodatnie pałeczki o szerokości 0,4 – 0,5 μm i długości

0,5 – 2,0 μm. Nie wytwarzają spor. Są względnymi beztlenowcami zdolnymi do ruchu w temperaturze

20 – 28°C. Hydrolizują eskulinę, wytwarzają katalazę, są oksydazo-ujemne, nie produkują ureazy,

nie rozkładają tryptofanu do indolu. Mają zdolność do wytworzenia β-hemolizyny, rozkładają

L-ramnozę do kwasu. Pałeczki L. monocytogenes mają szerszy zakres tolerancji pH (4,4 – 9,6), mogą

przeżyć przy większym stężeniu soli (10 – 20% NaCl), CO2 (do 30%) oraz niższej aw (0,90 – 0,93)

niż pozostałe gatunki z rodzaju Listeria. Mogą także przetrwać w obniżonej (−2°C) i podwyższonej

(60°C) temperaturze [Farber i wsp. 1992; Galińska i wsp., 2010; Hernandez-Milian i Payeras-Cifre,

2014; Kramarenko i wsp., 2013; Vallim i wsp., 2015].

Pałeczki L. monocytogenes w przyrodzie występują powszechnie, choć najczęściej w ilościach

niewielkich. Głównym źródłem tych bakterii jest gleba. Izolowano je również z prób wód

powierzchniowych i ścieków, roślin uprawnych i pastewnych, źle przygotowanych kiszonek. Pałeczki

mogą zasiedlać przewody pokarmowe zwierząt hodowlanych. Wykrywano je w próbach mięsa,

m. in. drobiu, ryb. L. monocytogenes mogą kolonizować tereny zurbanizowane, zwłaszcza obszary

robocze w zakładach produkujących żywność. Pałeczki bytujące w środowisku tych obiektów

są źródłem zanieczyszczenia gotowego asortymentu. Warunki panujące w wytwórniach artykułów

spożywczych – znaczna wilgotność, duży ruch powietrza, niekontrolowane przemieszczanie

się pracowników pomiędzy strefą brudną, a strefą produktów gotowych – sprzyjają występowaniu

w nich L. monocytogenes. Zjawisko to można obserwować w zakładach rybnych, mięsnych,

mleczarniach i przetwarzających warzywa. Pałeczki L. monocytogenes kolonizują w szczególności

powierzchnie i elementy urządzeń, których mycie i dezynfekcja jest utrudniona ze względu

na ograniczony lub niemożliwy do nich dostęp, tj. wnętrza maszyn pakujących, nastrzykiwarek i ostrza

krajalnic [Bortolussi, 2008; CFSPH i wsp., 2005; Hernandez-Milian i Payeras-Cifre, 2014]. Uporczywe

szczepy L. monocytogenes to poważny problem dla wytwórców żywności. Są obecne na liniach

technologicznych przez długi czas i bardziej oporne na środki dezynfekcyjne przede wszystkim dlatego,

że mogą tworzyć biofilm. Zagregowane w błonie biologicznej mają większą, niż w formie

planktonicznej, tolerancję na czynniki stresu środowiskowego [Colagiorgi i wsp., 2017; Linke i wsp.,

2014; Saunders i wsp., 2012].

L. monocytogenes – fakultatywny wewnątrzkomórkowy patogen – wywołuje u ludzi listeriozę.

Jak podaje wielu autorów, do tej pory najczęściej (96% przypadków) wykrywano cztery serotypy – 1/2a,

1/2b, 1/2c i 4b. Przyczyną choroby jest, z reguły, spożycie zanieczyszczonej pałeczkami żywności,

głównie tej niewymagającej dodatkowego przygotowania (ang. ready-to-eat, RTE), ale także ryb oraz

przetworów warzywnych. Zakażenia są wyjątkowo niebezpieczne dla noworodków, kobiet w ciąży,

osób po 60 roku życia, a także osób z osłabioną odpornością [Bortolussi, 2008; CFSPH i wsp., 2005;

Kuan i wsp., 2013a; Kuan i wsp., 2013b]. Nawet 10% populacji może być bezobjawowymi nosicielami

L. monocytogenes, a duża liczba zachorowań wciąż pozostaje niezarejestrowana [CFSPH i wsp., 2005;

Food Safety Magazine, 22.08.2018].

Podjęto próby eradykacji pałeczek L. monocytogenes z zakładów przetwarzających żywność,

aby ograniczyć ryzyko zachorowania konsumentów na listeriozę. Przeprowadzono trzyletnie badania,

których celem było:

1. określenie częstotliwości występowania L. monocytogenes w zakładach przetwórstwa warzyw i ryb,

2. ustalenie źródeł i dróg rozprzestrzeniania się pałeczek w obrębie monitorowanych obiektów, 3. oszacowanie potencjału chorobotwórczego wyizolowanych szczepów na podstawie

posiadanych przez nie genów wirulencji,

4. określenie właściwości adaptacyjnych L. monocytogenes w oparciu o ich zdolność do tworzenia biofilmu,

5. ocena oporności wyizolowanych szczepów na antybiotyki, 6. opracowanie i wdrożenie planu monitorowania występowania L. monocytogenes w wybranych

zakładach produkcji żywności.

3

2. MATERIAŁY I METODY BADAŃ

2.1. MATERIAŁY

Materiał do badań pobrano w latach 2015 – 2017 w trzech zakładach produkcji żywności,

zlokalizowanych w północnej części Polski. W obiekcie pierwszym od lipca do grudnia 2015 roku

pobrano 412 prób. Od stycznia do grudnia 2016 roku w obiekcie drugim pozyskano 1472 próby.

Z obiektu trzeciego, w którym obecność pałeczek wykrywano od stycznia do grudnia 2017 roku,

pochodziło 1325 prób (tabela 1).

Tabela 1. Próby pobrane w zakładach przetwórstwa warzyw i ryb w latach 2015 – 2017 [opracowanie własne]

Rodzaj prób

Liczba prób

obiekt pierwszy

– warzywa

obiekt drugi

– ryby

obiekt trzeci

– ryby

Przerabiany surowiec/ produkt świeży 53 140 615

Produkt mrożony 84 59 9

Linia produkcyjna/ linie produkcyjne 242 762 643

Pozostałe elementy i powierzchnie 33 511 58

Σ 412 1472 1325

Szczep L. monocytogenes ATCC® 7644™ (Amerykańska Kolekcja Hodowli Komórkowych) pełnił

rolę wzorca podczas identyfikacji L. monocytogenes za pomocą łańcuchowej reakcji polimerazy typu

dupleks (dPCR) oraz przy ocenie genetycznego podobieństwa wykrytych izolatów przy użyciu losowej

amplifikacji polimorficznych fragmentów DNA (RAPD). Szczep L. monocytogenes IW 41 (Polska

Kolekcja Mikroorganizmów), odpowiadający L. monocytogenes ATCC® 19113™, posłużył za kontrolę

pozytywną w trakcie oznaczania potencjału wirulencji. L. monocytogenes, a zbadane przez Wałecką-

Zacharską i wsp. (2013), były szczepami odniesienia w czasie serogrupowania molekularnego mPCR.

Posiewy wykonywano na podłożach płynnych: pół-Frasera (Merck, Niemcy), Frasera (Merck,

Niemcy), BHI (BD, USA), MHB (Sigma-Aldrich, USA) i stałych: ALOA (Merck, Niemcy), TSA

(Merck, Niemcy), CAB (BD, USA). Podobnie, jak odczynniki użyte do przeprowadzenia oznaczeń

molekularnych, określenia zdolności do wytwarzania biofilmu, oceny antybiotykooporności, a także

aparatura i sprzęt laboratoryjny, pochodziły z zasobów Katedry Mikrobiologii i Technologii Żywności,

UTP.

Podstawowe informacje, charakteryzujące pobrane próby katalogowano w programie Excel

(Microsoft Office, USA). Statystyczną analizę danych przeprowadzono w programie Statistica 13.1

(StatSoft, USA) oraz PQStat 1.6.8 (PQStat Software, Polska). Wyniki rozdziału elektroforetycznego

dokumentowano za pomocą programu Image LabTM 4.0.1 (Bio-Rad, USA). Pozostałe fotografie,

zaprezentowane w niniejszej rozprawie, edytowano z użyciem PhotoScape 3.7 (MOOII Tech, Korea).

2.2. METODY

Wymazy z linii technologicznych oraz z elementów i powierzchni niemających kontaktu

z przetwarzanym surowcem pobierano podczas produkcji i po dezynfekcji według wytycznych PN-ISO

18593:2005. Zgodnie z PN-EN ISO 11290-1:1999/A1:2005 i zastępującą ją PN-EN ISO 11290-1:2017-

07 przygotowano próby przerabianych surowców, produktów świeżych i mrożonych. Obecność

Listeria spp. w próbach wykrywano, opierając się na wytycznych zawartych w PN-EN ISO 11290-

1:1999/A1:2005 i zastępującej ją PN-EN ISO 11290-1:2017-07 [PN-EN ISO 11290-1:1999/A1:2005;

PN-EN ISO 11290-1:2017-07; PN-ISO 18593:2005].

Izolaty bakteryjne wstępnie zidentyfikowane jako Listeria spp. i/ lub L. monocytogenes poddano

oznaczeniom molekularnym. W tym celu, genomowe DNA izolowano metodą kolumienkową,

postępując zgodnie z instrukcją dołączoną przez producenta do zestawów Genomic Mini AX Bacteria

Spin (A&A Biotechnology, Polska) oraz Genomic Mini AX Bacteria+ Spin (A&A Biotechnology,

Polska). Wyizolowane DNA bakteryjne (150 μl) przechowywano w temperaturze 4°C.

Chorobotwórczą L. monocytogenes odróżniano od pozostałych gatunków należących do rodzaju

Listeria z użyciem reakcji dPCR. Wykrywano obecność genu rrs kodującego 16S rRNA,

4

rekomendowanego do identyfikacji rodzaju oraz genu hlyA kodującego LLO, charakterystycznego

dla gatunku L. monocytogenes [Churchill i wsp., 2006; Kuan i wsp., 2013a; Skowron i wsp., 2018a].

Elektroforezę prowadzono na 1,5-procentowym żelu agarozowym przez 85 minut pod napięciem 80 V.

Procedurą opracowaną przez Doumitha i wsp. (2004) posłużono się podczas ustalania

przynależności do serogrup izolatów zidentyfikowanych jako L. monocytogenes. Wykrywano

charakterystyczną dla serogrup obecność pięciu wybranych genów (prs, ORF2819, ORF2110, lmo0737

i lmo1118) [Doumith i wsp., 2004]. Elektroforezę wykonywano na 2-procentowym żelu agarozowym

pod napięciem 80 V przez 80 minut.

Obecność wybranych 10 genów, kodujących czynniki wirulencji u L. monocytogenes, ustalono

z zastosowaniem trzech wielostarterowych reakcji PCR. Pierwsza polegała na wykrywaniu genu fbpA,

plcA oraz hlyA. Podczas drugiej wykrywano obecność plcB, inlB, actA oraz iap. W trakcie trzeciej zaś

– inlA, mpl oraz prfA [Suo i wsp., 2010; Franciosa i wsp., 2005; Rawool i wsp., 2007; Grudlewska

i wsp., dane nieopublikowane]. Elektroforeza przebiegała na 1,5-procentowym żelu agarozowym

pod napięciem 90 V przez 60 minut.

Stopień genetycznego podobieństwa izolatów określano przy użyciu RAPD z zastosowaniem

startera HLWL74 w warunkach opisanych przez Atila i wsp. (2011) [Atil i wsp., 2011]. Produkty reakcji

rozdzielano elektroforetycznie na 2-procentowym żelu agarozowym pod napięciem 80 V przez

115 minut.

Zdolność do tworzenia biofilmu przez L. monocytogenes określano w oparciu o procedurę opisaną

przez Kwiecińską-Piróg i wsp. (2014). Pomiar absorbancji wykonywano przy długości fali λ = 570 nm

[Kwiecińska-Piróg i wsp., 2014].

Oporność L. monocytogenes na antybiotyki oceniano przy zastosowaniu metody krążkowo-

dyfuzyjnej, w oparciu o Tabele interpretacji wartości granicznych minimalnych stężeń hamujących

(MIC) oraz wielkości stref zahamowania wzrostu (wersja 8.0, obowiązująca od 1.01.2018 roku)

opracowane przez Europejski Komitet ds. Oznaczania Lekowrażliwości (ang. European Committee

on Antimicrobial Susceptibility Testing, EUCAST). Zbadano wrażliwość L. monocytogenes

na ampicylinę, erytromycynę, meropenem, penicylinę i sulfametoksazol z trimetoprimem (wszystkie

z BD, USA) [EUCAST, 2018].

Odsetek izolatów L. monocytogenes wyodrębnionych z prób danego typu (przerabiany surowiec/

produkt świeży, produkt mrożony, linia produkcyjna/ linie produkcyjne, pozostałe elementy

i powierzchnie) w każdym z obiektów, w poszczególnych porach roku, miesiącach i halach

produkcyjnych porównywano z zastosowaniem testu Z dla dwóch frakcji (dla prób niezależnych). Tego

samego testu użyto do porównania odsetków szczepów, wykazujących zdolność do tworzenia biofilmu

(bardzo silną, silną, umiarkowaną lub słabą), odsetków szczepów o danym profilu antybiotykooporności

(oporność rozszerzona, wielolekooporność, oporność całkowita) oraz odsetków szczepów wrażliwych

na dany antybiotyk. Istotność różnic określano przy p < 0,05.

Zależność odsetków L. monocytogenes [%] izolowanych w każdym z obiektów od pory roku

i miesiąca, w którym realizowano badania określano obliczając współczynnik rang Spearmana.

Zależność oporności wybranych szczepów na antybiotyki od ich zdolności do tworzenia biofilmu,

obliczano zgodnie ze wzorem Spearmana dla rang wiązanych.

Dendrogramy podobieństwa konstruowano z zastosowaniem metody nieważonej grupowania

parami ze średnią arytmetyczną (ang. unweighted pair group method with arithmetic mean, UPGMA)

z euklidesową miarą odległości. Dla każdego z badanych izolatów ustalano profil, odczytując obecność

(1) lub brak (0) każdego z 21 produktów amplifikacji (prążków). Dystans genetyczny między szczepami

określano przy użyciu współczynnika Nei i Li [Lamboy, 1994].

3. OMÓWIENIE WYNIKÓW

3.1. WYSTĘPOWANIE LISTERIA SPP. W PRZETWÓRNIACH SPOŻYWCZYCH

Obecność Listeria spp. stwierdzono w 358 z 3209 prób (11,2%). Do gatunku L. monocytogenes

należały 293 wyodrębnione izolaty, czyli 81,8% prób pozytywnych (9,1% pobranych), a do innych

Listeria spp. – 65 izolatów (18,2% pozytywnych, 2,0% pobranych) – tabela 2.

5

Tabela 2. Liczba izolatów L. monocytogenes, które wyodrębniono z prób pobranych w zakładach przetwórstwa

warzyw i ryb [opracowanie własne]

Rodzaj prób

Liczba izolatów/ liczba prób (odsetek [%])

obiekt pierwszy –

warzywa

obiekt drugi

– ryby

obiekt trzeci

– ryby

Przerabiany surowiec/ produkt świeży 0/ 53 (0,0)1, 8 4/ 140 (2,9)3, 8 25/ 615 (4,1)5, 8

Produkt mrożony 3/ 84 (3,6)1, 9 3/ 59 (5,1)3, 9 0/ 9 (0,0)5, 9

Linia produkcyjna/ linie produkcyjne 4/ 242 (1,7)1, 10 38/ 762 (5,0)3, 11 44/ 643 (6,9)6, 11

Pozostałe elementy i powierzchnie 4/ 33 (12,1)2, 12 143/ 511 (28,0)4, 12 25/ 58 (43,1)7, 13

Σ 11/ 412 (2,7)14 188/ 1472 (12,8)15 94/ 1325 (7,1)14, 15

1 – 15 – statystycznie istotne różnice (p < 0,05)

Podobnie jak w badaniach własnych również Aguado i wsp. (2004) stwierdziły, że odsetek

pałeczek zidentyfikowanych w próbach pobranych w zakładzie przetwórstwa warzyw jest niższy

niż L. monocytogenes izolowanych w przemyśle rybnym, co wykazał m. in. Thimothe i wsp. (2004)

oraz Skowron i wsp. (2019) [Aguado i wsp., 2004; Thimothe i wsp., 2004; Skowron i wsp., 2019]. Wielu

innych autorów wynikami swoich badań potwierdza, że obecność L. monocytogenes można wykryć

na każdym etapie łańcucha żywnościowego, co jest ogromnym problemem.

W toku badań własnych, przeprowadzonych w trzech zakładach przetwórstwa, z upływem czasu

zaobserwowano spadek liczby prób zanieczyszczonych L. monocytogenes, co mogło być skutkiem

zmian wprowadzonych w procedurach dezynfekcji. Duże odsetki prób pozytywnych notowano

w terminach intensywnej produkcji i związanego z nią zwiększenia obsady na halach produkcyjnych.

We wrześniu (5,6%) w obiekcie pierwszym, w marcu (19,0%) i lipcu (19,0%) w obiekcie drugim,

a w obiekcie trzecim – w styczniu (18,0%).

3.2. MIEJSCA BYTOWANIA L. MONOCYTOGENES

Ustalono, w której z hal w każdym z zakładów L. monocytogenes bytowały najczęściej – tabela 3.

Tabela 3. L. monocytogenes izolowane w halach roboczych [opracowanie własne]

HALA

Liczba prób pozytywnych/ liczba prób pobranych (odsetek [%])

obiekt pierwszy

– warzywa

obiekt drugi

– ryby

obiekt trzeci

– ryby

Odbioru surowca n. d. 0/ 8 (0,00)2 0/ 108 (0,00)8, 9, 10

Obróbki n. d. 22/ 201 (10,95)3, 4 1/ 150 (0,67)8, 9, 10

Filetowania n. d. 11/ 230 (4,78)2 10/ 248 (4,03)8, 9

Dojrzewania (magazyn) n. d. 0/ 19 (0,00)2 14/ 75 (18,67)11

Wyrobów formowalnych n. d. n. d. 0/ 42 (0,00)8, 9

Wędzenia n. d. 34/ 199 (16,19)4, 5 4/ 92 (4,35)8

Detekcji metali ciężkich n. d. 37/ 178 (20,79)4, 5, 6 n. d.

Konfekcjonowania 8/ 240 (3,33)1 68/ 478 (14,23)4 59/ 516 (11,43)12

Odbioru produktu 0/ 88 (0,00)1 n. d. n. d.

Mycia n. d. 13/ 100 (13,00)4 6/ 85 (7,06)8, 13

Produkt mrożony 3/ 84 (3,57)1 3/ 59 (5,08)7 0/ 9 (0,00)8

Σ 11/ 412 (2,67)14 188/ 1472 (12,77)15 94/ 1325 (7,09)14, 15

n. d. – nie dotyczy (pomieszczenie w danym obiekcie nie istniało, lub nie uzyskano do niego dostępu), 1 – 15

– statystycznie istotne różnice (p < 0,05)

Pałeczki w obiekcie pierwszym wyizolowano w hali konfekcjonowania: 2-krotnie z tunelu

schładzania i oczyszczania (linia I, po myciu i dezynfekcji), 2-krotnie z taśmy transportowej między

tunelami (linia I, tok pracy), kratki ściekowej (w toku pracy: z linii I – 3-krotnie, z linii II – 1-krotnie),

mrożonego kalafiora (7 dni), brokułów (7 dni) oraz cukinii (9 dni). W obiekcie drugim, w hali obróbki,

pałeczki często izolowano z blatu roboczego (17,4% pobranych w tym miejscu) oraz taśmy

6

transportowej z PE (12,5%). W hali filetowania, L. monocytogenes bytowała najczęściej na panelu

sterowania nastrzykiwarką (5,6%), zewnętrznych (4,6%) i wewnętrznych (50,0%) elementach

nastrzykiwarki, w plastikowym pojemniku (8,3%), a także przerabianym surowcu (2,9%). W hali

detekcji metali ciężkich, pałeczki były obecne na taśmie z PE transportującej półprodukt z tunelu

mrożącego (16,0%), taśmie z PVC transportującej półprodukt do detektora (36,4%), folii (4,2%)

i plastikowym pojemniku (8,3%). W hali konfekcjonowania produktu, L. monocytogenes wyosobniono

z rękawic roboczych (8,0%), blatu z PE (6,3%), taśmy transportowej z PE (4,0%), noży (4,8%) oraz

stalowego blatu (4,6%). Ponadto, pałeczki wyizolowano z prób pobranych z konfekcjonowanego

półproduktu (6,5%). W obiekcie trzecim, w hali filetowania pałeczki często izolowano ze stalowego

blatu (5,3%), taśmy transportowej z PVC przed nastrzykiwarką (13,6%) oraz za nastrzykiwarką

i krajalnicą (19,1%). W hali konfekcjonowania produktu – L. monocytogenes często występowały

na taśmie transportowej z PVC przez krajalnicą (10,5%), taśmie transportowej z PVC za krajalnicą

(47,4%), stalowych ostrzach krajalnicy (26,3%), blacie z PE przy wadze (26,3%), szali wagi (15,0%),

taśmie transportowej z PVC przy wadze (15,8%), nożu (6,3%), stalowym blacie (6,5%) oraz rękawicach

roboczych (5,7%). Oprócz tego, L. monocytogenes wykryto w próbach surowca poddawanego wstępnej

obróbce (1,7%), półproduktu dojrzewającego przed wędzeniem (9,1%), konfekcjonowanego produktu:

przed krojeniem (13,3%), po krojeniu (9,5%), przed ważeniem (4,9%), podczas ważenia (5,3%),

transportowanego po ważeniu (17,7%) oraz produktu bezpośrednio przed zapakowaniem (1,9%).

Powierzchnie stołów roboczych, taśmy transportowe, elementy aparatury (m. in. ostrza krajalnic),

a także posadzki i kratki ściekowe należą do potencjalnych źródeł, z których L. monocytogenes może

rozprzestrzeniać się na pozostałe obszary w przedsiębiorstwach spożywczych. Dodatkowo, w miejscach

trudno dostępnych (np. uszczelki) może dochodzić do akumulacji biofilmu bakteryjnego, który może

być przyczyną zanieczyszczeń krzyżowych [Colagiorgi i wsp., 2017; Lundén i wsp., 2002].

3.3. PRZYNALEŻNOŚĆ DO GRUP SEROTYPOWYCH

Badaniom poddano 121 wybranych izolatów L. monocytogenes, które wykryto w próbach

pobranych w trzech wytwórniach.

7 izolatów wyosobnionych w przetwórni warzyw (obiekt pierwszy) należało do serogrupy II.1 (4b,

4d, 4e), zaś 45 i 69 pozyskanych w zakładach produkcji rybnej (obiekt drugi i trzeci)

– przyporządkowano do serogrupy I.1 (1/2a, 3a). Odsetek izolatów zaklasyfikowanych do serogrupy

I.1, 94,2%, był statystycznie istotnie większy (p < 0,05) niż odsetek izolatów należących do serogrupy

II.1, 5,8%. Zbliżone rezultaty uzyskało wielu badaczy, w tym: de Vasconcelos Byrne i wsp. (2016),

Skowron i wsp. (2019), Soni i wsp. (2014) oraz Wieczorek i Osek (2017) [de Vasconcelos Byrne i wsp.,

2016; Skowron i wsp., 2019; Soni i wsp., 2014; Wieczorek i Osek, 2017].

U ludzi zakażenia najczęściej wywoływane są przez L. monocytogenes należące do serotypu 1/2a,

1/2b, 1/2c i 4b. Przyporządkowane zostały one odpowiednio do serogrupy I.1, II.2, I.2 oraz II.1

[Doumith i wsp., 2004; Kwong i wsp., 2016; Tamburro i wsp., 2010; Toledo i wsp., 2018; Vanegas

i wsp., 2012]. Najczęściej izolowanym serotypem epidemicznym jest 4b. W próbach żywności oraz

środowiska, a także pobranych w przypadku sporadycznych zachorowań na listeriozę, wykrywano

głównie trzy serotypy – 1/2a, 1/2b oraz 1/2c [Montero i wsp., 2015; Tamburro i wsp., 2010; Vanegas

i wsp., 2012]. Wyniki badań własnych są tego potwierdzeniem.

3.4. OBECNOŚĆ WYBRANYCH GENÓW WIRULENCJI

Wszystkie zbadane L. monocytogenes (121 izolatów) posiadały dziesięć oznaczanych genów

wirulencji (actA, fbpA, hlyA, iap, inlA, inlB, mpl, plcA, plcB, prfA). Podobnie, obecność

poszukiwanych genów potwierdzili wynikami badań, między innymi, Chen i wsp. (2018), Gelbíčová

i Karpíšková (2012) oraz Skowron i wsp. (2018b, 2019) [Chen i wsp., 2018; Gelbíčová i Karpíšková,

2012; Skowron i wsp., 2018b; Skowron i wsp., 2019].

Zjadliwość L. monocytogenes uzależniona jest od genów kodujących czynniki wirulencji. Jeżeli

geny te są obecne – jak w przypadku izolatów własnych – i funkcjonują prawidłowo, oznacza to,

że pałeczki są wysoce chorobotwórcze i mogą wywoływać listeriozę [Maury i wsp., 2017; Poimenidou

i wsp., 2018; Témoin i wsp., 2008].

7

3.5. STOPIEŃ GENETYCZNEGO PODOBIEŃSTWA

Zbadano stopień genetycznego podobieństwa 121 wybranych izolatów L. monocytogenes.

Na podstawie uzyskanych wyników, dla wyizolowanych w obiekcie pierwszym, możliwe było

rozróżnienie pięciu elektroforetycznych profili RAPD. Jeden szczep tworzyły trzy identyczne izolaty.

Pierwszy raz został on wykryty w próbie pobranej ze stalowych elementów w tunelu schładzania

i oczyszczania surowca w hali konfekcjonowania (izolat 1, seria czwarta), po raz drugi i trzeci

wyizolowano go po miesiącu z mrożonego (−10ºC) przez siedem dni kalafiora (izolat 3, seria siódma)

oraz dziewięć dni cukinii (izolat 5, seria siódma). Wyodrębnione w obiekcie drugim izolaty

L. monocytogenes, poddane ocenie stopnia genetycznego podobieństwa, charakteryzowały się dużym

zróżnicowaniem. Nie zanotowano wśród nich izolatów identycznych. L. monocytogenes, które wybrano

do oceny stopnia podobieństwa genetycznego spośród wyosobnionych w obiekcie trzecim, utworzyły

dwie różnoliczne linie monofiletyczne, przy czym wśród nich znajdowało się sześć par izolatów

identycznych. Jeden szczep pozyskano po raz pierwszy z wymazu z zabrudzonego plastikowego

pojemnika znajdującego się w hali mycia (izolat 56, seria pierwsza) i po miesiącu z próby pobranej

z rękawic roboczych używanych w hali konfekcjonowania (izolat 75, seria czwarta). Drugi

wyizolowano w odstępie czterech miesięcy z próby dojrzewającego półproduktu (izolat 73, seria

czwarta) oraz wymazu z blatu z PE, znajdującego się obok wagi w hali konfekcjonowania (izolat 89,

seria jedenasta). Trzeci, czwarty i piąty szczep wykryto w próbach pobranych podczas jednej serii.

Reprezentowały je odpowiednio: para wyosobniona z wymazu z taśmy transportowej z PVC

za nastrzykiwarką i krajalnicą w hali filetowania (izolat 94, seria trzynasta) oraz wymazu z taśmy

transportowej z PVC przed krajalnicą w hali konfekcjonowania (izolat 96, seria trzynasta), para

wyizolowana z prób pozyskanych w tej samej hali ‒ z taśmy transportowej z PVC za krajalnicą (izolat

103, seria trzynasta) oraz z ostrzy krajalnicy (izolat 104, seria trzynasta), a także para wyodrębniona

z rękawic roboczych (izolat 105, seria trzynasta) oraz ze stalowej szali wagi (izolat 106, seria trzynasta)

również w hali konfekcjonowania. Szósty szczep wykryto dwa tygodnie później, ponownie w próbach

pobranych w hali konfekcjonowania – ze stalowych ostrzy krajalnicy (izolat 110, seria czternasta) oraz

z używanych rękawic roboczych (izolat 112, seria czternasta).

Tak, jak dowiodła tego Aguado i wsp. (2004), na podstawie wyników badań własnych stwierdzono,

że istniała możliwość krzyżowego zanieczyszczenia przetwarzanych surowców. Genetyczne

zróżnicowanie szczepów wskazywało na istnienie wielu potencjalnych źródeł pałeczek.

L. monocytogenes mogły pochodzić z dostarczanych do zakładów surowców, jak na przykład

u Skowrona i wsp. (2018b), a także z obszarów roboczych, co wykazała Prazak i wsp. (2002) [Aguado

i wsp., 2004; Prazak i wsp., 2002; Skowron i wsp., 2018b].

Z uwagi na ograniczoną liczbę izolatów identycznych wyosobnionych w toku badań własnych,

wyznaczenie dróg transferu pałeczek w zakładach było utrudnione, podobnie jak u Aguado i wsp.

(2004). Wskazano jednak prawdopodobne kierunki rozprzestrzeniania bakterii oraz ich główne

rezerwuary [Aguado i wsp., 2004]. Lundén i wsp. (2002) opisali przypadek transferu L. monocytogenes

pomiędzy zakładami produkującymi żywność. Jego przyczyną było wykorzystanie tej samej krajalnicy,

skolonizowanej przez szczepy uporczywe [Lundén i wsp., 2002]. Oceniając stopień genetycznego

podobieństwa L. monocytogenes, w badaniach własnych nie stwierdzono istnienia szczepów

„wspólnych” dla trzech zakładów, w których pobierano próby. Mogło to wynikać z tego, że wytwórcy

wykorzystywali odmienne surowce. Drugą prawdopodobną tego przyczyną była odległość, w jakiej

zlokalizowane były obiekty i związana z tym konieczność korzystania z usług różnych dostawców.

3.6. ZDOLNOŚĆ DO TWORZENIA BIOFILMU

Zdolność do tworzenia biofilmu oceniano dla 60 wybranych szczepów wyosobnionych z prób

pobranych w obiekcie trzecim. Wszystkie należały do serogrupy I.1 (1/2a, 3a), a stopień

ich genetycznego podobieństwa był zróżnicowany.

Bardzo silną zdolność do tworzenia błony biologicznej miały dwa szczepy (3,3%). Wyosobnione

zostały one z próby półproduktu przed krojeniem w hali konfekcjonowania (szczep 53, seria pierwsza)

oraz próby półproduktu dojrzewającego w magazynie przed wędzeniem (szczep 59, seria druga).

Odsetek szczepów należących do tej grupy nie różnił się statystycznie istotnie (p > 0,05) od odsetka

szczepów wykazujących silną zdolność do tworzenia biofilmu (6,7%). Statystycznie istotnie (p < 0,05)

8

najwięcej szczepów, 58,3%, miało umiarkowaną zdolność do tworzenia błony biologicznej. Słabą

zdolnością do tworzenia biofilmu charakteryzowało się 31,7% szczepów. Było ich statystycznie istotnie

(p < 0,05) mniej niż szczepów o zdolności umiarkowanej, ale statystycznie istotnie (p < 0,05) więcej

niż tych o zdolności silnej i bardzo silnej.

Pary izolatów identycznych wykazały taką samą zdolność do tworzenia biofilmu, 56 i 75

– umiarkowaną, zaś 73 i 89 – słabą. Pierwsza z wymienionych została wyosobniona w odstępie

miesiąca, druga – czterech miesięcy. Wyłączając wspomniane, stopień podobieństwa genetycznego

szczepów należących do każdej z grup był zróżnicowany. U 83,3% szczepów wykrywanych

dwukrotnie, zdolność do tworzenia biofilmu była słaba, zaś u 16,7% umiarkowana. Formowanie

biofilmu nie miało zatem znaczącego wpływu na przeżywalność L. monocytogenes w tym otoczeniu.

Wszystkie badane szczepy należały do tej samej serogrupy, I.1 (1/2a, 3a), dlatego stwierdzono,

że poziom zdolności do tworzenia biofilmu nie zależał od przynależności do grupy serologicznej.

Zdolność do tworzenia biofilmu uzależniona jest od fazy wzrostu, warunków otoczenia (w tym

temperatury, rodzaju powierzchni, obecności innych mikroorganizmów) oraz dostępności składników

odżywczych w środowisku. Jest typowa dla szczepu, a nie grupy serologicznej czy gatunku [Doijad

i wsp., 2015; Heir i wsp., 2018; Koreňová i wsp., 2016; Russo i wsp., 2018].

3.7. ANTYBIOTYKOOPORNOŚĆ

Antybiotykooporność oznaczono dla 32 szczepów L. monocytogenes wyizolowanych z prób

produktów świeżych i mrożonych, pobranych w obiekcie drugim (7) i trzecim (25). Należały

one do serogrupy I.1 (1/2a, 3a).

Rozszerzoną opornością (XDR) charakteryzowało się 37,5% szczepów. Wielolekoopornych

(MDR) było 56,3%. Całkowitą oporność (PDR) wykazały tylko 2 szczepy (6,3%) pozyskane w obiekcie

trzecim. Pierwszy, zdolny do tworzenia biofilmu w stopniu umiarkowanym, wyosobniono z próby

pobranej w hali konfekcjonowania z półproduktu leżącego na blacie z PE obok wagi (szczep 78, seria

piąta), a drugi – o słabej zdolności do tworzenia błony biologicznej – z próby półproduktu, pozyskanej

w hali wstępnej obróbki (szczep 93, seria trzynasta). Odsetek szczepów PDR był statystycznie istotnie

najmniejszy (p < 0,05). Inni naukowcy w tych profilach klasyfikowali badane L. monocytogenes,

przy czym przeważnie pałeczki należały do XDR lub MDR [Abdellrazeq i wsp., 2014; Abdollahzadeh

i wsp., 2016; Jamali i wsp., 2015; Lee i wsp., 2017; Obaidat i wsp., 2015; Rodas-Suárez i wsp., 2006;

Skowron i wsp., 2019].

Pałeczki L. monocytogenes są na ogół podatne na działanie antybiotyków, stosowanych wobec

bakterii Gram-dodatnich, np. ampicyliny, penicyliny [Allen i wsp., 2016; Jeyasanta i Patterson, 2016;

Morvan i wsp., 2010]. W próbach żywności i pobranych na obszarze produkcyjnym, wykrywano jednak

również szczepy antybiotykooporne [Allen i wsp., 2016]. Oporność niektórych mikroorganizmów jest

uwarunkowana genetycznie, inne mogą ją nabyć (horyzontalny transfer genów, indukcja mechanizmów

oporności [Allen i wsp., 2016; Olaimat i wsp., 2018]. Zjawisko oporności L. monocytogenes

na antybiotyki stanowi istotne zagrożenie dla zdrowia publicznego, zwłaszcza w ostatnich latach, kiedy

rejestrowano wzrost liczby pacjentów z rozpoznaną listeriozą [EFSA i ECDC, 2018].

Na ampicylinę wrażliwych było 93,8% szczepów – statystycznie istotnie więcej (p < 0,05)

niż na erytromycynę, meropenem oraz penicylinę, która była drugim antybiotykiem skutecznie

działającym na 68,8% szczepów. Ponadto, antagonistyczne działanie penicyliny było statystycznie

istotnie większe (p < 0,05) zarówno od erytromycyny, jak i od meropenemu. Zaobserwowano,

że na erytromycynę wrażliwych było 40,6% szczepów, zaś na meropenem – 28,1%, przy czym różnica

między tymi dwoma odsetkami była statystycznie nieistotna (p > 0,05). Wszystkie poddane oznaczeniu

szczepy były oporne na sulfametoksazol z trimetoprimem. Inni badacze uzyskiwali wyniki zarówno

zbliżone, jak i odmienne od otrzymanych w oznaczeniach własnych [Abdellrazeq i wsp., 2014;

Abdollahzadeh i wsp., 2016; Jamali i wsp., 2015; Korsak i wsp., 2012; Lee i wsp., 2017; Obaidat i wsp.,

2015; Rodas-Suárez i wsp., 2006; Skowron i wsp., 2019]. Co oznacza, że oporność na antybiotyki może

być zależna od uwarunkowań genetycznych oraz środowiskowych, specyficznych dla badanych

L. monocytogenes. Sprawdzono, czy istnieje korelacja pomiędzy zdolnością do tworzenia biofilmu a opornością

na antybiotyki dla 24 szczepów L. monocytogenes, pozyskanych z prób przetwarzanych surowców

9

i gotowych produktów pobranych w obiekcie trzecim. Dowiedziono, że antybiotykooporność szczepów

nie zależała od ich zdolności do tworzenia biofilmu.

4. WNIOSKI

1. Pałeczki Listeria spp., w tym gatunek L. monocytogenes, były obecne w każdym z monitorowanych zakładów przemysłu spożywczego. Odsetek pałeczek wyizolowanych w przetwórni warzyw

(obiekt pierwszy) był niższy niż w przedsiębiorstwach produkcji rybnej (obiekt drugi i trzeci).

2. W oparciu o rezultaty badań własnych dowiedziono, że pałeczki L. monocytogenes mogą bytować na elementach aparatury produkcyjnej, powierzchniach roboczych, przerabianych surowcach,

produktach świeżych oraz mrożonych.

3. Częściej niż w przetwarzanych surowcach i asortymencie mrożonym, bakterie wykrywano w próbach pozyskanych z linii produkcyjnych. Wskazuje to na możliwość wtórnego

zanieczyszczenia produkowanej żywności.

4. Liczba izolatów wyodrębnionych w toku badań nie zależała od pory roku. Największe odsetki L. monocytogenes rejestrowano w terminach zintensyfikowanej produkcji. Związane z tym

zwiększenie zatrudnienia mogło być jednym z czynników prowadzących do rozprzestrzeniania

pałeczek na obszarze roboczym.

5. W obiektach, w których realizowano badania, L. monocytogenes często izolowano z prób pozyskiwanych w halach konfekcjonowania. Pałeczki obecne w tych pomieszczeniach

na elementach linii technologicznych mogą zostać przeniesione z powierzchni roboczych

na wytwarzane produkty i potencjalnie stwarzać ryzyko infekcji dla konsumentów.

6. Na podstawie wykonanych oznaczeń stwierdzono, iż ustanowienie dodatkowych punktów kontroli czystości nie było konieczne w żadnym z zakładów. Celem utrzymania wysokiej jakości

mikrobiologicznej obszarów roboczych oraz produktów, zalecono jednak zwiększenie częstości

monitorowania hal technologicznych.

7. Zaobserwowano, że odsetek pozyskiwanych izolatów bakteryjnych był większy niż w sezonie poprzedzającym rozpoczęcie badań, deklarowany przez wytwórców. Prawdopodobnie, mogło

to być wynikiem zaadaptowania L. monocytogenes do stosowanych wówczas środków

dezynfekcyjnych. Pozytywnym skutkiem wprowadzenia zalecanych modyfikacji w procedurach

mycia i dezynfekcji było stopniowe ograniczanie obecności Listeria spp. na liniach produkcyjnych.

8. Wyizolowane pałeczki należały do typowo identyfikowanych serogrup. L. monocytogenes wyosobnione z prób pobranych w zakładzie przetwórstwa warzyw należały do II.1 (4b, 4d, 4e),

a w zakładach produkcji rybnej – I.1 (1/2a, 3a).

9. W oparciu o wyniki wykonanych oznaczeń, u przebadanych pod tym kątem izolatów potwierdzono obecność wszystkich wybranych genów kodujących czynniki wirulencji. Co wskazywało na to,

iż wykryte pałeczki były wysoce chorobotwórcze.

10. Izolaty L. monocytogenes należące do serogrupy I.1 (1/2 a, 3a) posiadały słabą, umiarkowaną, silną lub bardzo silną zdolność do tworzenia biofilmu. Funkcjonowanie w błonie biologicznej chroni

bakterie przed niekorzystnym wpływem otoczenia.

11. Genetyczne zróżnicowanie szczepów poddanych RAPD świadczyło o występowaniu wielu źródeł L. monocytogenes w monitorowanych przedsiębiorstwach, szczególnie w obiekcie drugim

i trzecim. Badane szczepy L. monocytogenes nie były uporczywe.

12. Z przeprowadzonych oznaczeń wynikało, iż obecność izolatów identycznych ograniczona była do danego zakładu (obiekt pierwszy, obiekt trzeci). Z prób pobranych z linii produkcyjnych

nie wyosobniono ani jednego szczepu, który w okresie prowadzonych badań występowałby

we wszystkich monitorowanych obiektach. W obiekcie pierwszym, jeden ze szczepów

wyizolowano trzykrotnie – raz w próbie pobranej z linii technologicznej i dwa razy w próbach

produktu mrożonego. Dwukrotnie notowano natomiast każdy z sześciu szczepów pojawiających

się w obiekcie trzecim. Na tej podstawie ustalono potencjalne drogi transferu L. monocytogenes

oraz prawdopodobne rezerwuary pałeczek na obszarach roboczych.

13. Zbadano antybiotykooporność L. monocytogenes wyizolowanych z prób przetwarzanych surowców i/ lub produktów mrożonych. Większość z nich zaklasyfikowano do grupy szczepów

o oporności rozszerzonej (XDR) lub wielolekoopornych (MDR). 2 szczepy charakteryzowały

się całkowitą opornością (PDR). Podczas leczenia choroby wywołanej przez jeden z badanych

10

szczepów wskazane byłoby zastosowanie ampicyliny. Sulfametoksazol z trimetoprimem wobec

żadnego z L. monocytogenes nie był skuteczny.

11

PIŚMIENNICTWO [1] Abdellrazeq G. S., Kamar A. M., El-Houshy S. M., 2014. Molecular characterization of Listeria species isolated

from frozen fish. Alexandria Journal of Veterinary Sciences, 40, 1 – 15.

[2] Abdollahzadeh E., Ojagh S. M., Hosseini H., Ghaemi E. A., Irajian G., Naghizadeh Heidarlo M., 2016. Antimicrobial resistance of Listeria monocytogenes isolated from seafood and humans in Iran. Microbial

Pathogenesis, 100, 70 – 74.

[3] Aguado V., Vitas A. I., García-Jalón I., 2004. Characterization of Listeria monocytogenes and Listeria innocua from a vegetable processing plant by RAPD and REA. International Journal of Food Microbiology, 90, 341

– 347.

[4] Allen K. J., Wałecka-Zacharska E., Chen J. C., Kosek-Paszkowska K., Devlieghere F., Van Meervenne E., Osek J., Wieczorek K., Bania J., 2016. Listeria monocytogenes – an examination of food chain factors potentially

contributing to antimicrobial resistance. Food Microbiology, 54, 178 – 189.

[5] Atil E., Ertas H. B., Ozbey G., 2011. Isolation and molecular characterization of Listeria spp. from animals, food and environmental samples. Veterinarni Medicina, 56, 386 – 394.

[6] Bortolussi R., 2008. Listeriosis: a primer. Canadian Medical Association Journal, 179, 795 – 797. [7] CFSPH, IICAB, OIE, USDA, 2005. Listeriosis [online]. Center for Food Security & Public Health – Iowa State

University, Institute for International Cooperation in Animal Biologics – Iowa State University, OIE

Collaborating Centre, United States Department of Agriculture, 1 – 5. Dostęp: www.cfsph.iastate.edu/Factshee

ts/pdfs/listeriosis.pdf [przeczytano: 7.06.2014].

[8] Chen M., Cheng J., Wu Q., Zhang J., Chen Y., Xue L., Lei T., Zeng H., Wu S., Ye Q., Bai J., Wang J., 2018. Occurrence, antibiotic resistance, and population diversity of Listeria monocytogenes isolated from fresh aquatic

products in China. Frontiers in Microbiology, 9: 2215. DOI: 10.3389/fmicb.2018.02215.

[9] Churchill R. L., Lee H., Hall J. C., 2006. Detection of Listeria monocytogenes and the toxin listeriolysin O in food. Journal of Microbiological Methods, 64, 141 – 170.

[10] Colagiorgi A., Bruini I., Di Ciccio P. A., Zanardi E., Ghidini S., Ianieri A., 2017. Listeria monocytogenes biofilms in the wonderland of food industry. Pathogens, 6: 41. DOI: 10.3390/pathogens6030041.

[11] de Vasconcelos Byrne V., Hofer E., Vallim D. C., Comastri de Castro Almeida R., 2016. Occurrence

and antimicrobial resistance patterns of Listeria monocytogenes isolated from vegetables. Brazilian Journal

of Microbiology, 47, 438 – 443.

[12] Doijad S. P., Barbuddhe S. B., Garg S., Poharkar K. V., Kalorey D. R., Kurkure N. V., Rawool D. B., Chakraborty T., 2015. Biofilm-forming abilities of Listeria monocytogenes serotypes isolated from different

sources. Public Library of Science One, 10: e0137046. DOI: 10.1371/journal.pone.0137046.

[13] Doumith M., Buchrieser C., Glaser P., Jacquet C., Martin P., 2004. Differentiation of the major Listeria monocytogenes serovars by multiplex PCR. Journal of Clinical Microbiology, 42, 3819 – 3822.

[14] EFSA, ECDC, 2018. The European Union summary report on trends and sources of zoonoses, zoonotic agents and food-borne outbreaks in 2017. EFSA Journal, 16, 67 – 84.

[15] EUCAST, 2018. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameter [online], 8.0, 1 – 95. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Dostęp: www.eucast.org/clinical_breakpoints/

[przeczytano: 10.01.2018].

[16] Farber J. M., Coates F., Daley E., 1992. Minimum water activity requirements for the growth of Listeria monocytogenes. Letters in Applied Microbiology, 15, 103 – 105.

[17] Food Safety Magazine, 22.08.2018. Study: listeriosis outbreaks go undetected in the EU; whole genome sequencing can help [online]. Food Safety Magazine. Dostęp: www.foodsafetymagazine.com/news/study-

listeriosis-outbreaks-go-undetected-in-the-eu-whole-genome-sequencing-can-help/ [przeczytano: 24.08.2018].

[18] Franciosa G., Maugliani A., Floridi F., Aureli P., 2005. Molecular and experimental virulence of Listeria monocytogenes strains isolated from cases with invasive listeriosis and febrile gastroenteritis. FEMS Immunology

and Medical Microbiology, 43, 431 – 439.

[19] Galińska E., Knap J. P., Stroczyńska-Sikorska M., 2010. Listerioza – mało znana, niebezpieczna choroba zakaźna. Medycyna Ogólna, 16, 516 – 527.

[20] Gelbíčová T., Karpíšková R., 2012. Outdoor environment as a source of Listeria monocytogenes in food chain. Czech Journal of Food Sciences, 30, 83 – 88.

[21] Heir E., Møretrø T., Simensen A., Langsrud S., 2018. Listeria monocytogenes strains show large variations in competitive growth in mixed culture biofilms and suspensions with bacteria from food processing

environments. International Journal of Food Microbiology, 275, 46 – 55.

[22] Hernandez-Milian A., Payeras-Cifre A., 2014. What is new in listeriosis? BioMed Research International, 2014: 358051. DOI: 10.1155/2014/358051.

[23] Jamali H., Paydar M., Ismail S., Looi C. Y., Wong W. F., Radmehr B., Abedini A., 2015. Prevalence, antimicrobial susceptibility and virulotyping of Listeria species and Listeria monocytogenes isolated from open-

air fish markets. BMC Microbiology, 15: 144. DOI: 10.1186/s12866-015-0476-7.

[24] Jeyasanta K. I., Patterson J., 2016. Prevalence of antibiotic resistant Listeria monocytogenes in sea foods of Tuticorin Coast, Southeastern India. European Journal of Applied Sciences, 8, 356 – 364.

12

[25] Koreňová J., Oravcová K., Véghová A., Karpíšková R., Kuchta T., 2016. Biofilm formation in various conditions is not a key factor of persistence potential of Listeria monocytogenes in food-processing environment. Journal

of Food and Nutrition Research, 55, 189 – 193.

[26] Korsak D., Borek A., Daniluk S., Grabowska A., Pappelbaum K., 2012. Antimicrobial susceptibilities of Listeria monocytogenes strains isolated from food and food processing environment in Poland. International Journal

of Food Microbiology, 158, 203 – 208.

[27] Kramarenko T., Roasto M., Meremäe K., Kuningas M., Põltsama P., Elias T., 2013. Listeria monocytogenes prevalence and serotype diversity in various foods. Food Control, 30, 24 – 29.

[28] Kuan C. H., Goh S. G., Loo Y. Y., Chang W. S., Lye Y. L., Puspanadan S., Tang J. Y. H., Nakaguchi Y., Nishibuchi M., Mahyudin N. A., Radu S., 2013a. Prevalence and quantification of Listeria monocytogenes

in chicken offal at the retail level in Malaysia. Poultry Science, 92, 1664 – 1669.

[29] Kuan C. H., Wong W. C., Pui C. F., Mahyudin N. A., Tang J. Y. H., Nishibuchi M., Radu S., 2013b. Prevalence and quantification of Listeria monocytogenes in beef offal at retail level in Selangor, Malaysia. Brazilian Journal

of Microbiology, 44, 1169 – 1172.

[30] Kwiecińska-Piróg J., Bogiel T., Skowron K., Więckowska E., Gospodarek E., 2014. Proteus mirabilis biofilm – qualitative and quantitative colorimetric methods-based evaluation. Brazilian Journal of Microbiology, 45,

1415 – 1421.

[31] Kwong J. C., Mercoulia K., Tomita T., Easton M., Li H. Y., Bulach D. M., Stinear T. P., Seemann T., Howdena B. P., 2016. Prospective whole genome sequencing enhances national surveillance of Listeria

monocytogenes. Journal of Clinical Microbiology, 54, 333 – 342.

[32] Lamboy W. F., 1994. Computing genetic similarity coefficients from RAPD data: the effects of PCR artifacts. PCR Methods and Applications, 4, 31 – 37.

[33] Lee D. Y., Ha J. H., Lee M. K., Cho Y. S., 2017. Antimicrobial susceptibility and serotyping of Listeria monocytogenes isolated from ready-to-eat seafood and food processing environments in Korea. Food Science

and Biotechnology, 26, 287 – 291.

[34] Linke K., Rückerl I., Brugger K., Karpíšková R., Walland J., Muri-Klinger S., Tichy A., Wagner M., Stessl B., 2014. Reservoirs of Listeria species in three environmental ecosystems. Applied and Environmental

Microbiology, 80, 5583 – 5592.

[35] Lundén J. M., Autio T. J., Korkeala H. J., 2002. Transfer of persistent Listeria monocytogenes contamination between food-processing plants associated with a dicing machine. Journal of Food Protection, 65, 1129 – 1133.

[36] Maury M. M., Chenal-Francisque V., Bracq-Dieye H., Han L., Leclercq A., Vales G., Moura A., Gouin E., Scortti M., Disson O., Vázquez-Boland J. A., Lecuit M., 2017. Spontaneous loss of virulence in natural

populations of Listeria monocytogenes. Infection and Immunity, 85: e00541-17. DOI: 10.1128/IAI.00541-17.

[37] Montero D., Bodero M., Riveros G., Lapierre L., Gaggero A., Vidal R. M., Vidal M., 2015. Molecular epidemiology and genetic diversity of Listeria monocytogenes isolates from a wide variety of ready-to-eat foods

and their relationship to clinical strains from listeriosis outbreaks in Chile. Frontiers in Microbiology, 6: 384.

DOI: 10.3389/fmicb.2015.00384.

[38] Morvan A., Moubareck C., Leclercq A., Hervé-Bazin M., Bremont S., Lecuit M., Courvalin P., Le Monnier A., 2010. Antimicrobial resistance of Listeria monocytogenes strains isolated from humans in France. Antimicrobial Agents

and Chemotherapy, 54, 2728 – 2731.

[39] Obaidat M. M., Bani Salman A. E., Lafi S. Q., Al-Abboodi A. R., 2015. Characterization of Listeria monocytogenes from three countries and antibiotic resistance differences among countries and Listeria

monocytogenes serogroups. Letters in Applied Microbiology, 60, 609 – 614.

[40] Olaimat A. N., Al‐Holy M. A., Shahbaz H. M., Al‐Nabulsi A. A., Abu Ghoush M. H., Osaili T. M., Ayyash M. M., Holley R. A., 2018. Emergence of antibiotic resistance in Listeria monocytogenes isolated from

food products: a comprehensive review. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 17, 1277

– 1292.

[41] PN-EN ISO 11290-1:1999/A1:2005. Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzontalna metoda wykrywania obecności i oznaczania liczby Listeria monocytogenes. Metoda wykrywania obecności [online]. Polski Komitet

Normalizacyjny. Dostęp: sklep.pkn.pl/pn-en-iso-11290-1-1999-a1-2005p.html [przeczytano: 3.02.2015].

[42] PN-EN ISO 11290-1:2017-07. Mikrobiologia łańcucha żywnościowego. Horyzontalna metoda wykrywania i oznaczania liczby Listeria monocytogenes i innych Listeria spp. Część 1. Metoda wykrywania [online]. Polski

Komitet Normalizacyjny. Dostęp: sklep.pkn.pl/pn-en-iso-11290-1-2017-07e.html [przeczytano: 20.07.2017].

[43] PN-ISO 18593:2005. Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzontalne metody pobierania próbek z powierzchni z użyciem płytek kontaktowych i wymazów [online]. Polski Komitet Normalizacyjny. Dostęp: sklep.pkn.pl/pn-

iso-18593-2005p.html [przeczytano: 3.02.2015].

[44] Poimenidou S. V., Dalmasso M., Papadimitriou K., Fox E. M., Skandamis P. N., Jordan K., 2018. Virulence gene sequencing highlights similarities and differences in sequences in Listeria monocytogenes serotype 1/2a

and 4b strains of clinical and food origin from 3 different geographic locations. Frontiers in Microbiology, 9:

1103. DOI: 10.3389/fmicb.2018.01103.

[45] Prazak A. M., Murano E. A., Mercado I., Acuff G. R., 2002. Prevalence of Listeria monocytogenes during production and postharvest processing of cabbage. Journal of Food Protection, 65, 1728 – 1734.

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0956713512003799https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0956713512003799

13

[46] Rawool D. B., Malik S. V. S., Barbuddhe S. B., Shakuntala I., Aurora R., 2007. A multiplex PCR for detection of virulence associated genes in Listeria monocytogenes. Internet Journal of Food Safety, 9, 56 – 62.

[47] Rodas-Suárez O. R., Flores-Pedroche J. F., Betancourt-Rule J., M., Quiñones-Ramírez E. I., Vázquez-Salinas C., 2006. Occurrence and antibiotic sensitivity of Listeria monocytogenes strains isolated from oysters, fish,

and estuarine water. Applied and Environmental Microbiology, 72, 7410 – 7412.

[48] Russo P., Hadjilouka A., Beneduce L., Capozzi V., Paramithiotis S., Drosinos E. H., Spano G., 2018. Effect of different conditions on Listeria monocytogenes biofilm formation and removal. Czech Journal of Food

Sciences, 36, 208 – 214.

[49] Saunders B. D., Overdevest J., Fortes E., Windham K., Schukken Y., Lembo A., Wiedmann M., 2012. Diversity of Listeria species in urban and natural environments. Applied and Environmental Microbiology, 78, 4420

– 4433.

[50] Skowron K., Hulisz K., Gryń G., Olszewska H., Wiktorczyk N., Paluszak Z., 2018a. Comparison of selected disinfectants efficiency against Listeria monocytogenes biofilm formed on various surfaces. International

Microbiology, 21, 23 – 33.

[51] Skowron K., Kwiecińska-Piróg J., Grudlewska K., Świeca A., Paluszak Z., Bauza-Kaszewska J., Wałecka-Zacharska E., Gospodarek-Komkowska E., 2018b. The occurrence, transmission, virulence and antibiotic

resistance of Listeria monocytogenes in fish processing plant. International Journal of Food Microbiology, 282,

71 – 83.

[52] Skowron K., Wiktorczyk N., Grudlewska K., Wałecka-Zacharska E., Paluszak Z., Kruszewski S., Gospodarek-Komkowska E., 2019. Phenotypic and genotypic evaluation of Listeria monocytogenes strains isolated

from fish and fish processing plants. Annals of Microbiology, 69, 469 – 482.

[53] Soni D. K., Singh M., Singh D. V., Dubey S. K., 2014. Virulence and genotypic characterization of Listeria monocytogenes isolated from vegetable and soil samples. BMC Microbiology, 14: 241. DOI: 10.1186/s12866-

014-0241-3.

[54] Suo B., He Y., Tu S.-I., Shi X., 2010. A multiplex real-time polymerase chain reaction for simultaneous detection of Salmonella spp., Escherichia coli O157, and Listeria monocytogenes in meat products. Foodborne Pathogens

and Disease, 7, 619 – 628.

[55] Tamburro M., Ripabelli G., Fanelli I., Grasso G. M., Sammarco M. L., 2010. Typing of Listeria monocytogenes strains isolated in Italy by inlA gene characterization and evaluation of a new cost-effective approach to antisera

selection for serotyping. Journal of Applied Microbiology, 108, 1602 – 1611.

[56] Témoin S., Roche S. M., Grépinet O., Fardini Y., Velge P., 2008. Multiple point mutations in virulence genes explain the low virulence of Listeria monocytogenes field strains. Microbiology, 154, 939 – 948.

[57] Thimothe J., Kerr Nightingale K., Gall K., Scott V. N., Wiedmann M., 2004. Tracking of Listeria monocytogenes in smoked fish processing plants. Journal of Food Protection, 67, 328 – 341.

[58] Toledo V., den Bakker H. C., Hormazábal J. C., González-Rocha G., Bello-Toledo H., Toro M., Moreno-Switt A. I., 2018. Genomic diversity of Listeria monocytogenes isolated from clinical and non-clinical

samples in Chile. Genes, 9: 396. DOI: 10.3390/genes9080396.

[59] Vallim D. C., Barroso Hofer C., de Castro Lisbôa R., Barbosa A. V., Alves Rusak L., dos Reis C. M. F., Hofer E., 2015. Twenty years of Listeria in Brazil: occurrence of Listeria species and Listeria monocytogenes serovars

in food samples in Brazil between 1990 and 2012. BioMed Research International, 2015: 540204. DOI:

10.1155/2015/540204.

[60] Vanegas M. C., Medrano M. V., Martínez A. J., Arévalo S. A., 2012. Molecular serotyping and identification of the 85M arrangement in different Colombian isolates of Listeria monocytogenes strains: a descriptive study.

Colombia Médica, 43, 38 – 45.

[61] Wałecka-Zacharska E., Kosek-Paszkowska K., Bania J., Karpíšková R., Stefaniak T., 2013. Salt stress-induced invasiveness of major Listeria monocytogenes serotypes. Letters in Applied Microbiology, 56, 216 – 221.

[62] Wieczorek K., Osek J., 2017. Prevalence, genetic diversity and antimicrobial resistance of Listeria monocytogenes isolated from fresh and smoked fish in Poland. Food Microbiology, 64, 164 – 171.