Chromatografia jest to metoda fizykochemicznego rozdziału składników mieszaniny związków w wyniku ich różnego podziału pomiędzy fazę ruchomą a nieruchomą. Fazą ruchomą może być gaz, ciecz lub ciecz w stanie nadkrytycznym, a fazą nieruchomą ciało stałe lub ciecz. Rozdział mieszaniny związków jest spowodowany procesem rozpuszczania lub procesem adsorpcji w zależności od rodzaju fazy nieruchomej. O czasie przebywania poszczególnych składników w układzie chromatograficznym decyduje energia adsorpcji lub wielkości stałej podziału pomiędzy fazę ruchomą a nieruchomą. Aby nastąpił pełen rozdział składników mieszaniny muszą one różnić się między sobą powyższymi parametrami. Proces rozdziału można opisać następująco: Próbka mieszaniny w postaci gazowej jest wprowadzona na początek kolumny chromatograficznej. W kolumnie znajduje się wypełnienie (faza nieruchoma) i przepływa przez nie gaz (faza ruchoma).

Gdy składniki mieszaniny rozdzielanej zetkną się z fazą nieruchomą np. fazą ciekłą (wypełnieniem) pewna część każdego z nich rozpuszcza się w tej fazie, reszta pozostaje w fazie gazowej. Bezwzględna ilość rozpuszczającego się składnika zależy od jego stężenia w gazie nośnym oraz od wartości współczynnika podziału pomiędzy fazę gazową a fazę ciekłą. Zakłada się, że podział każdej substancji pomiędzy dwie fazy jest niezależny od obecności innych substancji i zależy jedynie od temperatury kolumn i rodzaju fazy ciekłej. Pomiędzy fazą ruchomą a nieruchomą ustala się równowaga dynamiczna z ciągłym przechodzeniem danego związku z jednej fazy do drugiej. Przenoszenie odbywa się tylko w fazie gazowej z szybkością powiązaną ze stałą podziału. Jeżeli różnice w wartościach stałych podziału są odpowiednio duże otrzymujemy pełny rozdział składników W przypadku wypełnienia stałego podczas przejścia rozdzielanej mieszaniny następują ciągłe procesy adsorpcji i desorpcji na powierzchni wypełnienia kolumny. W zależności od energii adsorpcji poszczególne składniki przesuwają się wzdłuż kolumny z różną szybkością. Związki o dużej energii adsorpcji wędrują wolno, a o małej szybko. Jeżeli różnica w energii adsorpcji jest wystarczająco duża to proces rozdziału jest całkowity.

Ze względu na naturę zjawisk chromatografię dzielimy na:

adsorpcyjną - rozdział odbywa się w wyniku różnego powinowactwa

adsorpcyjnego składników mieszaniny do powierzchni fazy stacjonarnej,

zwanej adsorbentem;

podziałową rozdział związany jest z rożnymi wartościami współczynnika podziału składników mieszaniny między dwie nie

mieszające się fazy, z których jedną jest faza stacjonarna (ciecz na

nośniku), a drugą faza ruchoma (gaz, ciecz lub płyn w stanie

nadkrytycznym);

jonowymienną - podstawą rozdzielania są różnice w sile oddziaływań międzycząsteczkowych pomiędzy jonami z roztworu a jonami

związanymi z fazą stacjonarną (zwaną jonitem);

sitową, - zwaną żelową lub chromatografią wykluczania, w której

o rozdzielaniu składników mieszaniny decydują rozmiary cząsteczek.

Ze względu na stosowane techniki eksperymentalne chromatografię możemy podzielić na:

planarną (możliwa jedynie w chromatografii cieczowej, którą można

podzielić na chromatografię bibułową i cienkowarstwową;

kolumnową (stosowaną we wszystkich metodach

chromatograficznych).

Aparatura do chromatografii gazowej

Analizę chromatograficzną zarówno ilościową jak i jakościową prowadzi się za pomocą chromatografu.

l - butla z gazem nośnym; 2 - zawór redukcyjny; 3 - zawór dokładnej

regulacji; 4 - układ oczyszczający gaz nośny; 5 - blok dozownika wraz z

dzielnikiem strumienia; 6 - układ regulujący przepływ i mierzący ciśnienie

gazu; 7 - komora z kolumnami chromatograficznymi; 8 - detektor; 9 -

elektroniczny układ zasilający; l0 – urządzenie rejestrujące; 11- przepływomierz; 12 - komory termostatujące

Zasada działania chromatografu jest następująca: gaz nośny ze

zbiornika lub wytwornicy poprzez system zaworów i regulatorów oraz

układ oczyszczający przepływa do dozownika, a następnie kolumny i

detektora. Mieszaninę substancji wprowadza się w dozowniku do

strumienia gazu nośnego, który transportuje ją do kolumny. W kolumnie chromatograficznej następuje rozdział i poszczególne składniki

docierają do detektora, gdzie są wykrywane i przetwarzane na sygnał

elektryczny. Sygnał ten jest wzmacniany i rejestrowany przez rejestrator

w postaci pików chromatograficznych.

Gazy nośne Gaz nośny w chromatografii gazowej nie bierze udziału w procesie

rozdziału, a jego rola sprowadza się do mechanicznego przenoszenia

substancji rozdzielanych. W związku z tym o wyborze rodzaju gazu

decydują czynniki niezwiązane bezpośrednio z rozdziałem. Gazy nośne powinny charakteryzować się następującymi cechami: obojętność w

stosunku do badanej próbki, wysoka czystość, powinny spełniać

wymagania stawiane przez detektor. Ponadto gazy te powinny być

bezpieczne, tanie i łatwo dostępne. Najczęściej stosowane gazy

w chromatografii to hel, argon, azot oraz wodór.

Wypełnienia i fazy ciekłe stosowane w chromatografii

Wypełnienia stałe w chromatografii gazowej powinny charakteryzować

się powierzchniami właściwymi rzędu kilkudziesięciu do kilkuset m2/g.

Powierzchnie nie mogą być zbyt małe ponieważ nie uzyska się rozdziału, ani zbyt duże, gdyż proces adsorpcji będzie procesem nieodwracalnym.

Inne cechy to: bierność chemiczna w stosunku do substancji i gazu

nośnego, jednorodność powierzchni. Ziarna adsorbentu powinny

posiadać określoną granulację pozwalającą na przepływ gazu nośnego

oraz dużą wytrzymałość mechaniczną. Najczęściej jako adsorbenty stosuje się sita molekularne, tlenki glinu,

krzemionkę, węgle aktywne lub porowate polimery.

Na wypełnieniach stałych najczęściej rozdziela się mieszaniny gazowe

lub związki ciekłe o niskich masach cząsteczkowych.

Rozdzielanie składników mieszaniny na ciekłych fazach stacjonarnych następuje na skutek różnic w ich rozpuszczalności. Najważniejszym

wymogiem w stosunku do fazy ciekłej jest jej selektywność w stosunku do

składników rozdzielanej mieszaniny. Ponadto faza ciekła musi być cieczą

w warunkach pracy kolumny. Jednocześnie powinna być możliwie

najmniej lotna. Faza ciekła powinna być trwała i nie reagować z rozdzielanymi związkami.

Detektory Do najczęściej stosowanych detektorów należą: detektor

przewodnictwa cieplnego - katarometr (TDC) oraz detektor

płomieniowo-jonizacyjny (FID). Schemat i układ elektryczny

katarometu przedstawiono na rys.2

Tego typu detektor mierzy zmiany przewodnictwa cieplnego

przepływającego gazu. Poszczególne gazy różnią się znacznie

przewodnictwem cieplnym.

Dla mieszanin gazowych wartość przewodnictwa jest funkcją ich

składu.

Detektor płomieniowo- jonizacyjny (FiD)

Detektor ten mierzy zmianę natężenia prądu jonowego płomienia

wodorowopowietrznego, do którego wprowadza się gaz opuszczający

kolumnę chromatograficzną - rys. 3.

Palnik znajduje się pomiędzy dwiema elektrodami. Jeżeli do płomienia dociera czysty gaz nośny to wytwarzana jest niewielka ilość termojonów

tego gazu. Jony te docierają do elektrody, powodując powstanie prądu

jonowego o niewielkim natężeniu. Jest to prąd podstawowy. Gdy z

kolumny do palnika dopływają związki organiczne to proces jonizacji

zachodzi w znacznym stopniu i obserwujemy wzrost prądu jonowego. Jest on wzmacniany i rejestrowany w postaci piku chromatograficznego.

Schemat detektor plomieniowo-

jonizacyjnego

A - wlot gazu nośnego; B - wlot

wodorowy; C - wlot powietrza; D -

dyfuzor; E - palnik; F - kominek; G- elementy chłodzące; 1- gniazdo

współosiowe; K - elektroda zbierająca

Wielkości mierzone w chromatografii Krzywe elucji

Całkowity czas retencji tR (odcinek OB) - jest to czas przebywania

danego składnika w kolumnie od momentu zadozowania do momentu

zarejestrowania piku tego składnika. Jest to suma czasu, w którym

związek oddziałuje z wypełnieniem kolumny i czasu przejścia przez układ

chromatograficzny. Czas retencji substancji niezatrzymywanej tm (odcinek OA) jest to czas

przejścia przez układ chromatograficzny substancji, która nie oddziałuje

z wypełnieniem kolumny chromatograficznej.

Zredukowany czas retencji t' R (odcinek OB - OA) jest to czas, w którym

dany związek oddziałuje z wypełnieniem kolumny chromatograficznej, charakterystyczny dla danego związku i danego wypełnienia.

Jeżeli wartości poszczególnych czasów retencji pomnożymy przez

objętościową szybkość przepływu to otrzymamy odpowiednie wielkości

objętości retencji.

współczynnik retencji

(tR-tm)/tm

Współczynnik podziału możemy wyrazić wzorem Nernsta

K=Cs/Cm

Wzrost współczynnika K wydłuża czas retencji

Wzrost objętości fazy stacjonarnej wydłuża czas retencji Vs=10% Vr Wzrost szybkości przepływu fazy ruchomej zmniejszenie czasu retencji

Czas retencji zależy od długości kolumny

Oddziaływania międzycząsteczkowe:

Kulombowskie, dipol-dipol, dipol-dipol indukowany, siły dyspersyjne, siły związane z tworzeniem wiązań wodorowych, oddziaływania

akceptorowo-donorowe,

Kształt pików-

izoterma

sorpcji

Sprawność kolumny chromatograficznej= wysokość równoważna półce

teoretycznej

Półka teoretyczna-objętość kolumny, w której osiąga się stan równowagi

między stężeniami substancji chromatografowanej w fazie ruchomej i

nieruchomej.

Kolumny chromatograficzne:

kolumny z wypełnieniem (analityczne o średnicy wew. 2-6mm i dł-0,5-3m,

mikropakowane 0,8-2 mm, kilkanaście metrów, preparatywne 2,5-5 cm, 1-16m); stal nierdzewna, szkło, aluminium, miedź, teflon

kolumny o przekroju otwartym (kapilary ze szkła lub kwarcu średnicy 0,1-1

mm, dł. 10-300m

Kolumny z warstwą porowatą adsorbentu na ściankach Kolumny z naniesionym na ścianki nośnikiem nasyconym ciekłą fazą

stacjonarną

Kolumny z ciekłą fazą stacjonarną na ściankach

Wybór parametrów analizy- wybór fazy stacjonarnej-wybór wypełnienia, długość kolumny, temperatura pieca, wybór detektora, wielkość próbki,

szybkość przepływu gazu nośnego.

Analiza jakościowa w chromatografii

Analizę jakościową w chromatografii można prowadzić dwojako. Pierwsze

to wykorzystanie czasu lub objętości retencji drugie zaś zastosowanie

chemicznych lub fizykochemicznych metod identyfikacji.

Analiza ilościowa w chromatografii

Powierzchnia piku jest proporcjonalna do całkowitej ilości związku

opuszczającego kolumnę. Jakikolwiek przyrost tej powierzchni musi być

również proporcjonalny do przyrostu ilości tego związku.

Metoda kalibracji bezwzględnej, metoda wzorca wewnętrznego, metoda

normalizacji wewnętrznej

Molowy

współczynnik korekcji

Względne powierzchnie

molowe

Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC - High Performance Liquid Chromatography; High Pressure Liquid Chromatography) jest dziś

popularną i najbardziej uniwersalną techniką chromatograficzną. Jest

to technika kolumnowa, ciśnieniowa, w której faza ruchoma przepływa

przez kolumnę wypełnioną drobnoziarnistą fazą stacjonarną pod dużym ciśnieniem (najczęściej 200-400 atm.). Dzięki temu faza

stacjonarna może być drobnoziarnista i gęsto upakowana (duża

powierzchnia styku z fazą ruchomą, ale i duże opory dla

przepływu fazy ruchomej), a faza ruchoma przepływa z prędkością

kilkunastu mililitrów na minutę (w standardowych kolumnach) co pozwala skrócić czas analizy. Stałość przepływu i wysokie ciśnienie

zapewnia specjalna pompa, a jako detektor najczęściej stosuje się

spektrofotometr UV, który sprzężony z komputerem rejestruje

chromatogram, na podstawie którego można

jakościowo i ilościowo określić konkretny składnik mieszaniny. HPLC jest stosowana jako chromatografia podziałowa, adsorpcyjna

HPLC jest stosowana jako chromatografia podziałowa, adsorpcyjna,

w układzie faz odwróconych, zarówno izokratycznie (taki sam skład fazy

ruchomej przez cały proces) jak i gradientowo. Ten ostatni sposób polega

na tym, że w czasie procesu faza ruchoma zmienia swój skład (w sposób

kontrolowany) tak, aby wszystkie składniki uległy rozdzieleniu, a czas analizy nie był zbyt długi. Elucja gradientowa ma szerokie zastosowanie w

przypadku chromatografowania mieszanin złożonych, które zawierają

składniki różniące się polarnością. W elucji gradientowej proces

chromatografowania rozpoczyna się eluentem o małej mocy elucyjnej, a

następnie, dodając rozpuszczalnika o dużej mocy elucyjnej, zwiększa się moc elucyjną mieszaniny w czasie.

W chromatografii cieczowej występują dwa pojęcia: eluent (faza ruchoma

wprowadzana do kolumny) oraz eluat (faza ruchoma wypływająca z

kolumny).

Analiza jakościowa

Analiza jakościowa polega na identyfikacji pików

odpowiadających poszczególnym składnikom próbki. Analiza

opiera się na porównaniu czasu retencji piku identyfikowanej

substancji z czasem retencji piku wzorca, ale pod warunkiem zachowania jednakowych warunków chromatograficznych.

Korzy tając z wielkości retencyjnych, należy pamiętać, że retencja

może się zmieniać przy niewielkich zmianach składu fazy ruchomej.

Analiza ilościowa

Ilościową zawartość składników w próbce oblicza się, wiedząc, że

ilość składników jest proporcjonalna do powierzchni lub wysokości

pików im odpowiadających (przy założeniu, że są symetryczne). Na

wyniki analizy chromatograficznej wpływ ma jakość zastosowanego przyrządu oraz stałość warunków prowadzenia analizy. W czasie

analizy temperatura kolumny, skład fazy ruchomej i wielkość

próbek dozowanych do kolumny nie powinny ulegać

zmianie. W chromatografii cieczowej analizę można wykonać przez

porównywanie powierzchni lub wysokości piku składnika analizowanej próbki i powierzchni bądź wysokości piku wzorca

zewnętrznego.