Predykcja glikanów syntetyzowanych w komórkach poddanych działaniu

promieniowania jonizującego

Institute of AutomationSilesian University of TechnologyGliwice, Poland

Reakcje glikotransferazy

Budowa glikanów produkowanych w procesie glikozylacji jest uzależniona od tzw. kodu biosyntetycznego - zestawu różnorodnych biosyntetycznych reakcji katalizowanych przez enzymy – glikotransferazy.

98 genów glikotransferaz (GT)

42 reakcje glikozylacji

Ponad 10,000 różnych struktur glikanówNa podstawie informacji o poziomie ekspresji genów

GT powinno być możliwe określenie zestawu struktur pojawiających się z największym prawdopodobieństwem.

Eksperymentalne określenie koncentracji poszczególnych glikanów

jest aktualnie niezwykle trudnym zadaniem.

Pojawienie się „osobliwych” glikanów na powierzchni komórki jest wykorzystywane w diagnostyce, gdyż stanowią one znacznik (marker) komórek nowotworowych, ich obecność często świadczy o szybkim rozwoju choroby.

Predykcja struktur glikanów

Informacje o budowie znanych glikanów

Informacje o ekspresji genów glikotransferaz

Zestaw struktur glikanów

predykcja

(Kawano et al. 2005)

Struktury glikanów opisane w bazie danych KEGG Glycan rozbito na pojedyncze pary monosacharydów połączonych określonym wiązaniem

Predykcja struktur glikanów

ENTRY G00001 GlycanNAME N-Acetyl-D-glucosaminyldiphosphodolicholCOMPOSITION (GlcNAc)1 (PP-Dol)1MASS 203.2 (PP-Dol)REMARK Same as: C04500REACTION R05969 R05970PATHWAY ko00510 N-Glycan biosynthesis ko01100 Metabolic pathwaysENZYME 2.4.1.141 2.7.8.15NODE 2 1 PP-Dol 3 0 2 GlcNAc -4 0EDGE 1 1 2:a1 1///

Baza danych KEGG Glycan

| GlcNAc a1 PP-Dol | GlcNAc b1-4 GlcNAc | Man b1-4 GlcNAc | ...--------+------------------+--------------------+-----------------+----G00001 | 1 | 0 | 0 |G00002 | 1 | 1 | 0 |G00003 | 1 | 1 | 1 | ....

Macierz reakcji

| GlcNAc a1 PP-Dol | GlcNAc b1-4 GlcNAc | Man b1-4 GlcNAc | ...-------------------+------------------+--------------------+-----------------+----GlcNAc a1 PP-Dol | 1 | 0.456 | 0.364 |GlcNAc b1-4 GlcNAc | 0.456 | 1 | 0.743 |Man b1-4 GlcNAc | 0.364 | 0.743 | 1 | ....

Macierz korelacji

Budowa bazy danych

Dla każdej struktury zliczono ilość wystąpień każdej możliwej pary

Pomiędzy każdymi dwiema parami monosacharydów obliczono miarę podobieństwa (Cosine) określającą jak często dane dwie pary wiązań występują razem w jednym glikanie

Predykcja struktur glikanów

Informacje o budowie znanych glikanów

Informacje o ekspresji genów glikotransferaz

Zestaw struktur glikanów

predykcja

(Kawano et al. 2005)

Predykcja struktur glikanów

EntrezGeneID | K562 0h.1 | K562 0h.2 | K562 24h.1 | ...-------------+-----------+-----------+------------+--- 2523 | 5.98 | 6.01 | 6.31 | 79087 | 5.63 | 5.27 | 5.35 | 2527 | 4.17 | 4.46 | 4.28 | 6482 | 3.63 | 3.60 | 3.60 | ....

| fold change | p-value |EntrezGeneID | K562 0h/C | K562 24h/C | K562 0h/C | K562 24h/C |-------------+------------+------------+-----------+------------+ 2523 | 1.3589 | 1.2610 | 0.0342 | 0.0009 | 10678 | 1.3457 | 1.1593 | 0.0346 | 0.0023 | 56886 | 1.4818 | 1.2026 | 0.0442 | 0.0205 | ....

przetworzone dane ekspresyjne

geny GT o zmienionym

poziomie ekspresjiLFuc a1-3 GlcNAcGlcNAc b1-3 Gal GlcNAc b1-4 ManGal b1-4 Xyl GlcNAc b1-4 Man....

lista reakcji katalizowanych

przez stymulowane geny

surowe dane ekspresji genów

K562 K.1 K562 0h.1 K562 K.2 K562 0h.2K562 24h.1 K562 24h.2

Ekspresja genów glikotransferaz (GT)

Ekspresje genów GT zmierzono za pomocą 6 mikromacierzy oligonukleotydowych dla komórek nowotworowych poddanych działaniu 4Gy promieniowania jonizującego.

Dane poddano niestandardowemu przetwarzaniu dzięki któremu określono grupę genów GT których ekspresja zmienia się w sposób znamienny statystycznie na skutek promieniowania.Na podstawie informacji z literatury określono jakie wiązania katalizowane są przez glikotransferazy będące produktem wybranych genów

Predykcja struktur glikanów

Informacje o budowie znanych glikanów

Informacje o ekspresji genów glikotransferaz

Zestaw struktur glikanów

predykcja

(Kawano et al. 2005)

Predykcja struktur glikanów

Dla każdej struktury w oparciu o macierz podobieństwa miedzy parami glikotransferaz obliczany jest współczynnik predykcji

Współczynnik predykcji

LFuc a1-3 GlcNAcGlcNAc b1-3 Gal GlcNAc b1-4 ManGal b1-4 Xyl GlcNAc b1-4 Man...

| GlcNAc a1 PP-Dol | GlcNAc b1-4 GlcNAc | ...------------------+------------------+--------------------+GlcNAc a1 PP-Dol | 1 | 0.456 |GlcNAc b1-4 GlcNAc | 0.456 | 1 |Man b1-4 GlcNAc | 0.364 | 0.743 | ...

…

Predykcja struktur glikanówWspółczynnik predykcji

))(

)(),((1

,0,1

)(

))(),((1

1

1

1

1 1

n

in

iig

igji

m

jCE

i

ii

n

iiji

m

jCE

qE

qEbqS

mS

absentqpresentq

qh

qhbqSm

S

• SC (qi,bj)–współczynnik korelacji pomiedzy wiązaniami katalizowanymi przez glikotransferaze qi oraz element badanej struktury bj

• Eg(qi) – poziom ekspresji genu qi• n – liczba genów GT analizowanych za pomocą mikromacierzy• m – liczba wiązań w aktualnie analizowanej strukturze

1

2

0

50

100

150

200

250

300

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112 13 14 15 16 1718 1920 2122 2324 2526 27 28 2930 31 32 3334 35 36 3738 39

0

100

200

300

400

500

1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112 1314 1516 17 18 192021 22 2324 2526 272829 3031 3233 343536 37 383940

Exp

ress

ion

leve

l

GT gene

Predykcja struktur glikanówZmiany ekspresji genów GT – K562

Predykcja struktur glikanów

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 10040

50

60

70

80

90

Rank

Per

cent

age

procent struktur jakie zostały zidentyfikowane na określonym miejscu 4036 elementów listy predykcyjnej lub ponad nim

Weryfikacja metodą leave-one-out

Specyficzności algorytmu zweryfikowano metodą leave-one-out tworząc macierz podobieństwa dla wszystkich struktur poza jedną która użyta została jako wzorzec reakcji w miejsce reakcji katalizowanych przez zbiór genów glikotransferaz.

Wyniki predykcji

1st rank

Structure: G04183

Score: 2,404

2nd rank

Structure: G04804

Score: 2,389

3rd rank

Structure: G05226

Score: 2,389

3 struktury o największym współczynniku predykcji tj. o największym prawdopodobieństwie pojawiania się na powierzchni badanych komórek w wyniku działania promieniowania jonizującego wg. zastosowanej metody

Weryfikacja wyników

Do charakterystyki glikanów na powierzchni komórki użyto lektyn znakowanych barwnikiem fluoroscencyjnym oraz czytnika mikropłytek mierzącego poziom fluorescencji.

Lektyna Specyficzność FC 24hGSL-I α-D-GalNAc 0,64WGA (dGlcNAc)2NeuNAc 1,23UEA-I Fucose 1,34

Badanie wykonano 24 godziny po poddaniu komórek działaniu promieniowania jonizującego.

Zmiany na poziomie glikanów określone za pomocą znakowanych lektyn nie odzwierciedlają bezpośrednio zmian na poziomie transkryptów genów glikotransferaz z uwagi na długi czas potrzebny na ich zsyntetyzowanie.

DNA mRNA Białka (GT) Glikany

transportglikozylacjatranslacjatranskrypcja

~ 24 godziny

Podsumowanie

W wielu sytuacjach zestaw glikanów może nie odzwierciedlać teraźniejszego bądź przeszłego stanu transkryptomu z powodu skomplikowanych mechanizmów regulacyjnych pojawiających się na wielu etapach procesu powstawania i transportu glikanów.

Planowane udoskonalenia metody: Opracowanie lepszych metod weryfikacji w oparciu o dane

uzyskane za pomocą znakowanych lektyn Możliwość definiowania zestawu aktywnych reakcji na podstawie

danych innego typu niż mikomacierzowe (np. real-time PCR) Uwzględnienie kinetyki reakcji glikozylacji podczas wyznaczania

współczynnika predykcji

Dziękuje za uwagę

Predykcja struktur glikanówZmiany ekspresji genów GT

0

200

400

600

800

1000

1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112 131415 16 17 18 1920 21 2223 24 2526 2728 293031 32 33 3435 36 37 38 3940GT gene

expr

essi

on le

vel

0

100

200

300

400

500

600

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112 13 14 1516 17 181920 2122 23 24 2526 27 2829 30 31 32 33 3435 36 37 38 39GT gene

expr

essi

on le

vel

Wyniki predykcji

K562  Próba Glc Man Gal GlcNAc GalNAc Xyl Neu5Ac Glca LFuc 3

rozgałęzienia4

rozgałęzienia5

rozgałęzień

Zliczenie podjednostek dla 

strukturw rankingu: 

1:10

K 0 31 21 45 0 0 2 0 14 26 2 0

0h 0 31 21 45 0 0 2 0 14 26 2 0

24h 0 34 15 36 0 0 7 0 4 15 0 0

36h 0 34 15 36 0 0 7 0 4 15 0 0

Zmiana [%] 0 9,7 -28,6 -20,0 0,0 0,0 250,0 0,0 -71,4 -42,3 -100,0 0