Wstęp i cel

Rozwój nauk kryminalistycznych spowodowa³zwrócenie wiêkszej uwagi na pozostawione na miej-scu zdarzenia œlady biologiczne, które mo¿na poddaæbadaniom genetycznym. W ci¹gu ostatnich lat analizaDNA wyizolowanego z biologicznego materia³u dowo-dowego sta³a siê jednym z najsilniejszych narzêdzikryminalistyki. Obecnie badania genomowego DNA s¹metod¹ identyfikacji cz³owieka charakteryzuj¹c¹ siênajwy¿sz¹ si³¹ dyskryminacji. Ma ona zastosowaniezarówno w identyfikacji osobniczej, jak i w ustalaniupokrewieñstwa. Materia³em do badañ genetycznychmog¹ byæ: krew, nasienie, œlina, mocz, a tak¿e w³osy,koœci, paznokcie, zêby i fragmenty tkanek miêkkich[5]. W praktyce równie czêsto mamy do czynieniazarówno z próbkami dobrej jakoœci, jak i z materia³embardzo zdegradowanym i starym. Zdarza siê równie¿,¿e œlady biologiczne pozostawione na miejscu zdarze-nia zawieraj¹ niewielk¹ iloœæ materia³u genetycznego.Uzyskanie pe³nego profilu genetycznego z zabezpie-czonych œladów mo¿e stanowiæ dla eksperta krymina-listyki du¿e wyzwanie. Jednym z kluczowych etapówbadania DNA jest jego odzyskanie z pod³o¿a, na któ-rym zosta³o ujawnione, a nastêpnie oczyszczeniez substancji hamuj¹cych reakcjê amplifikacji (inhibito-ry reakcji PCR). Mo¿liwoœæ oznaczenia profilu gene-tycznego z zabezpieczonych œladów biologicznychjest uzale¿niona od jakoœci i iloœci DNA, które uzysku-je siê w procesie ekstrakcji. Zastosowanie odpowied-niej metody izolacji materia³u genetycznego ma za-sadniczy wp³yw na koñcowe wyniki badañ [3, 4, 8].W praktyce laboratoryjnej korzysta siê z wielu metodizolacji kwasów nukleinowych. W Wydziale BiologiiCentralnego Laboratorium Kryminalistycznego Ko-mendy G³ównej Policji do ekstrakcji DNA z zabezpie-czonych œladów stosuje siê obecnie metodê organicz-n¹ w uk³adzie fenol : chloroform : alkohol izoamylowy.Technologia badañ genetycznych w kryminalistycestale siê rozwija, wiêc pojawiaj¹ siê na rynku gotowezestawy przeznaczone do izolacji DNA z ró¿nego ro-dzaju próbek, w tym ze œladów zawieraj¹cych znikom¹iloœæ materia³u genetycznego. Nowo wprowadzane

metody charakteryzuj¹ siê coraz mniejsz¹ toksyczno-œci¹ stosowanych odczynników, dziêki czemu s¹ bar-dziej bezpieczne dla u¿ytkowników.

W Wydziale Biologii CLK KGP przeprowadzono te-sty skutecznoœci czterech nowych zestawów przezna-czonych do izolacji DNA ze œladów biologicznych.Do badañ wytypowano zestawy rekomendowane przezproducentów i innych u¿ytkowników – dwa wykorzystu-j¹ce technologiê separacji magnetycznej oraz dwa ko-lumienkowe, wykorzystuj¹ce technologiê separacjina membranie silikonowej. Uzyskane wyniki porówna-no z wynikami otrzymanymi dla próbek wyizolowanychmetod¹ organiczn¹ w uk³adzie fenol : chloroform : alko-hol izoamylowy. Testy pozwoli³y oceniæ ich w³aœciwoœcii przydatnoœæ do badañ prowadzonych w policyjnychlaboratoriach kryminalistycznych. Dodatkowym efek-tem testów jest mo¿liwoœæ doboru optymalnych metodbadañ materia³u genetycznego zapewniaj¹cych naj-wy¿sz¹ skutecznoœæ przy minimalizacji ponoszonychkosztów.

Testowana w doœwiadczeniu technologia separacjimagnetycznej opiera siê na powinowactwie cz¹ste-czek DNA do specjalnie zaprojektowanego liganduzwi¹zanego z kulk¹ paramagnetyczn¹. Ligandem mo-¿e byæ cz¹steczka pochodzenia naturalnego lub syn-tetycznego, wykazuj¹ca powinowactwo do izolowanejbiomoleku³y. W praktyce najczêœciej stosowane s¹monodyspersyjne kulki paramagnetyczne o jednako-wej œrednicy otoczone cienkimi warstwami polimeru.Polimer stanowi specyficzn¹ powierzchniê do przy³¹-czenia bioreaktywnego ligandu, w tym przypadkuskierowanego wobec kwasów nukleinowych. Proce-dura izolacji rozpoczyna siê od lizy komórek. Nastêp-nie do roztworu dodaje siê zawiesinê zawieraj¹c¹ kul-ki paramagnetyczne. Ligandy znajduj¹ce siê na po-wierzchni kulek wi¹¿¹ cz¹steczki DNA. Kulki parama-gnetyczne ze zwi¹zanym materia³em osadzaj¹ siêna œcianie probówki od strony magnesu. Supernatantusuwa siê za pomoc¹ pipety. DNA przytwierdzonedo kulek przemywa siê kilkakrotnie, a nastêpnie odzy-skuje w postaci eluatu [1, 2, 6]. Schemat proceduryprzedstawiono na rycinie 1.

PROBLEMY KRYMINALISTYKI 264 (kwiecieñ–czerwiec) 2009 11

Magdalena Dębska, Jacek Drabik

Porównanie efektywności

różnych metod izolacji genomowego

DNA ze śladów biologicznych

Metoda kolumienkowa bazuje na specjalnie zbudo-wanej membranie silikonowej, z któr¹ ³¹czy siê DNA.Procedura izolacji obejmuje cztery etapy: lizê komórek,zwi¹zanie DNA ze z³o¿em krzemionkowym, przemywa-nie oraz elucjê DNA z membrany (ryc. 2). Próbki pod-dawane s¹ lizie w obecnoœci proteinazy K i odpowied-niego buforu lizuj¹cego. Adsorpcjê DNA do matrycy si-

likonowej umo¿liwia obecnoœæ soli chaotropowej o wy-sokim stê¿eniu. Nastêpnie za pomoc¹ roztworów p³u-cz¹cych DNA przemywane jest z inhibitorów reakcjiPCR, bia³ek i innych zanieczyszczeñ. Uwolnienie DNAz silikonowej membrany nastêpuje dziêki dzia³aniu bu-foru o niskiej zawartoœci soli, który powoduje zmianêwarunków wi¹zania [7, 9].

Celem przeprowadzonych badañ by³o porównanieefektywnoœci ró¿nych metod izolacji kwasów nukleino-wych.

Zestawy przeznaczone do izolacji DNA zosta³y po-równane pod wzglêdem nastêpuj¹cych kryteriów:

• Wydajnoœæ metody (porównanie uzyskanych stê-¿eñ DNA).

• Jakoœæ uzyskanego DNA (porównanie uzyskanychprofili genetycznych).

• Stopieñ trudnoœci wykonania procesu izolacji.• Czas potrzebny do przeprowadzenia procedury

izolacji.• Czynniki ryzyka wyst¹pienia kontaminacji.• Zu¿ycie materia³ów i dodatkowych odczynników

niezbêdnych do przeprowadzenia procedury.• Koszt zestawu.

Materiał i metody

Schemat doświadczenia

Badania wykonywano w okresie od wrzeœnia 2008do marca 2009 roku na 280 próbkach krwi pobranychod oœmiu osób i umieszczonych w probówkach z hepa-ryn¹ jako œrodkiem antykoagulacyjnym. Materia³ do ba-dañ stanowi³a krew naniesiona na odpowiednie pod³o-¿e (ja³owe p³ótno, materia³ jeansowy) o wymiarachoko³o 5 x 5 mm. Do sprawdzenia zale¿noœci iloœci uzy-skanego DNA od iloœci materia³u wyjœciowego na ja³o-we p³ótno nanoszono kolejno 1 μl, 2,5 μl oraz 5 μl krwi.W celu zbadania efektywnoœci usuwania inhibitora re-akcji PCR z ekstraktu, na materia³ jeansowy zawieraj¹-cy barwnik indygo nanoszono 1 μl krwi. Dodatkowo izo-lowano materia³ zdegradowany stanowi¹cy 1 μl krwi

PROBLEMY KRYMINALISTYKI 264 (kwiecieñ–czerwiec) 200912

Ryc. 1. Procedura izolacji DNA metod¹ separacji magnetycznejFig. 1. Procedure of DNA isolation using separation based on magnetic beads

Ÿród³o (ryc. 1–11): autorzy

Ryc. 2. Procedura izolacji DNA metod¹ separacji na membranie silikonowejFig. 2. Procedure of DNA isolation using separation based on silica membrane

na ja³owym p³ótnie poddany dzia³aniu temperatury150oC przez 30 minut. Temperaturê i czas degradacjiustalono wczeœniej doœwiadczalnie. Wszystkie próbyod momentu przygotowania do czasu przeprowadze-nia procesu izolacji przechowywano przez okres 4 mie-siêcy w wyja³owionych, suchych, otwartych probów-kach w temperaturze pokojowej.

Plan doœwiadczenia zak³ada³ wykonanie izolacjiDNA w oœmiu powtórzeniach dla nastêpuj¹cych przy-padków:

• 1 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno.• 2,5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno.• 5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno.• Degradacja – 1 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ót-

no degradowanej 30 minut w temperaturze 150oC.• Inhibicja – 1 μl krwi naniesionej na materia³ jean-

sowy zawieraj¹cy barwnik indygo.• Kontrola pozytywna – 1 μl krwi naniesionej na ja³o-

we p³ótno.• Kontrola negatywna – ja³owe p³ótno bez naniesio-

nej krwi.

Wszystkie próbki przygotowane w opisany sposóbpoddano procesom izolacji piêcioma metodami:

Metody oparte na separacji magnetycznej:• NucleoMag 96 Trace • DNA IQ™ System Metody wykorzystuj¹ce silikonow¹ membranê:• NucleoSpin®Tissue XS • QIAamp® DNA Micro Metoda organiczna:• Metoda organiczna w uk³adzie fenol : chloroform :

alkohol izoamylowy (25 : 24 : 1).

W zale¿noœci od zastosowanej metody i zaleceñproducenta koñcowa objêtoœæ, w jakiej zawieszano izo-lowane DNA, wynosi³a:

• NucleoMag 96 Trace: 50 μl• DNA IQ™ System: 25 μl• NucleoSpin®Tissue XS: 20 μl• QIAamp® DNA Micro: 20 μl• Metoda organiczna: 20 μl

Oznaczenie uzyskanego stê¿enia DNA w izolaciewykonano metod¹ „Real Time PCR” z wykorzystaniemaparatu ABI PRISM 7500 Sequence Detection Systemi oprogramowania 7500 System Detection Softwarev. 1.2.3 z zastosowaniem zestawu odczynników Quan-tifiler™ Human DNA Quantification Kit. Otrzymane eks-trakty DNA amplifikowano przy u¿yciu zestawu odczyn-ników AmpFlSTR® SGM Plus™ i aparatu GeneAmpPCR System 9700. Produkty reakcji PCR poddawanoelektroforezie w sekwenatorze ABI PRISM® 3130 XL.

Do analizy wyników u¿ywano oprogramowania Gene-Mapper® ID v. 3.2.1 firmy Applied Biosystems.

Wszystkie badania przeprowadzono w obecnoœcikontroli dodatniej (DNA o znanym genotypie) i kontroliujemnej (próba odczynnikowa), otrzymuj¹c prawid³owedla nich wyniki.

Procedury badawcze

Procedura izolacji wykorzystuj¹ca wi¹zanie DNA

przez paramagnetyczne kulki (separacja magnetycz-

na) – NucleoMag 96 Trace:

1. Do probówki o pojemnoœci 1,5 ml z badanym ma-teria³em dodaæ 25 μl roztworu proteinazy K i 200μl buforu FLB, a nastêpnie zworteksowaæ przezoko³o 15 sekund i krótko zwirowaæ.

2. Inkubowaæ próbkê przez 1 godzinê w temperatu-rze 56oC.

3. Z probówki przenieœæ 225 μl lizatu do do³ka naplastikowej p³ytce Square-well Block (ryc. 3).

4. Do lizatu dodaæ 14 μl zawiesiny paramagnetycz-nych kulek oraz 360 μl buforu MB2. Ca³oœæ wy-mieszaæ przez 5 minut na wytrz¹sarce.

5. P³ytkê umieœciæ na separatorze magnetycznymNucleoMag SEP (ryc. 4, 5) i pozostawiæ na 2 mi-nuty w celu oddzielenia paramagnetycznych ku-

PROBLEMY KRYMINALISTYKI 264 (kwiecieñ–czerwiec) 2009 13

Ryc. 3. P³ytka Square-well Block (NucleoMag 96 Trace)Fig. 3. Square-well Block plate (NucleoMag 96 Trace)

Ryc. 4. Separator magnetyczny (NucleoMag 96 Trace)Fig. 4. Magnetic separator (NucleoMag 96 Trace)

lek od roztworu. Supernatant odci¹gn¹æ za pomo-c¹ pipety.

6. Zdj¹æ p³ytkê z separatora. Dodaæ 600 μl buforuMB3, a nastêpnie mieszaæ przez 5 minut na wy-trz¹sarce.

7. Ponownie umieœciæ p³ytkê na separatorze. Pozo-stawiæ na 2 minuty w celu oddzielenia parama-gnetycznych kulek od roztworu. Supernatant od-ci¹gn¹æ za pomoc¹ pipety.

8. Zdj¹æ p³ytkê z separatora. Dodaæ 600 μl buforuMB4, a nastêpnie mieszaæ przez 5 minut na wy-trz¹sarce.

9. Ponownie umieœciæ p³ytkê na separatorze. Pozo-stawiæ na 2 minuty w celu oddzielenia parama-gnetycznych kulek od roztworu. Supernatant od-ci¹gn¹æ za pomoc¹ pipety.

10. Pozostawiaj¹c p³ytkê na separatorze dodaæ 900μl buforu MB5 i inkubowaæ przez 60 sekund, a na-stêpnie odci¹gn¹æ za pomoc¹ pipety supernatant.

11. Zdj¹æ p³ytkê z separatora. Dodaæ 50 μl buforuMB5 podgrzanego do temperatury 56oC. Mieszaæprzez 10 minut na wytrz¹sarce.

12. Umieœciæ p³ytkê na separatorze. Pozostawiæ na 2minuty w celu oddzielenia paramagnetycznychkulek od roztworu. Uzyskany roztwór DNA odci¹-gn¹æ do probówki o pojemnoœci 1,5 ml za pomo-c¹ pipety.

Procedura izolacji wykorzystuj¹ca wi¹zanie DNA

przez paramagnetyczne kulki (separacja magnetycz-

na) – DNA IQ™ System:

1. Do probówki o pojemnoœci 1,5 ml zawieraj¹cejbadany materia³ dodaæ 150 μl buforu lizuj¹cego.

2. Inkubowaæ przez 30 minut w temperaturze 70oC.3. Lizat wraz z pod³o¿em przenieœæ na filtr DNA

IQ™ Spin Basket umieszczony w probówce o po-jemnoœci 1,5 ml.

4. Wirowaæ przez 2 minuty przy maksymalnych ob-rotach. Usun¹æ DNA IQ™ Spin Basket.

5. Do probówki dodaæ 7 μl homogennej zawiesinykulek paramagnetycznych. Inkubowaæ próbkêprzez 5 minut w temperaturze pokojowej, wortek-suj¹c co minutê.

6. Probówkê umieœciæ w statywie magnetycznym,a nastêpnie ostro¿nie usun¹æ z probówki super-natant (ryc. 6).

7. Dodaæ 100 μl buforu lizuj¹cego. Wyj¹æ probówkêze statywu magnetycznego i zworteksowaæ.

8. Ponownie umieœciæ probówkê w statywie magne-tycznym i usun¹æ ca³y bufor lizuj¹cy.

9. Dodaæ 100 μl roztworu p³ucz¹cego. Wyj¹æ pro-bówkê ze statywu magnetycznego i zwortekso-waæ.

10. Ponownie umieœciæ probówkê w statywie magne-tycznym i usun¹æ ca³y roztwór p³ucz¹cy.

11. P³ukanie powtórzyæ jeszcze dwa razy. Upewniæsiê, ¿e ca³y roztwór zosta³ usuniêty po ostatnimp³ukaniu.

12. Osad suszyæ przez 5 minut w temperaturze poko-jowej przy otwartych probówkach.

13. Dodaæ 25 μl buforu elucyjnego i zworteksowaæ. 14. Inkubowaæ przez 5 minut w temperaturze 65oC.15. Wyj¹æ z cieplarki, zworteksowaæ, a nastêpnie

wstawiæ do statywu magnetycznego (osad musibyæ gor¹cy). Uzyskany roztwór DNA przenieœædo czystej probówki o pojemnoœci 1,5 ml.

Procedura izolacji wykorzystuj¹ca wi¹zanie DNA

przez silikonow¹ membranê – NucleoSpin®Tissue XS:

1. Do probówki z badanym materia³em o pojemno-œci 1,5 ml dodaæ 160 μl buforu T1, a nastêpniezworteksowaæ 2 x 5 sekund.

PROBLEMY KRYMINALISTYKI 264 (kwiecieñ–czerwiec) 200914

Ryc. 5. P³ytka Square-well Block umieszczona na separatorze magnetycz-nym (NucleoMag 96 Trace)Fig. 5. Square-well Block plate placed on the magnetic separator

(NucleoMag 96 Trace)

Ryc. 6. Usuwanie supernatantu po oddzieleniu siê kulek magnetycznychod roztworu (DNA IQ™ System)Fig. 6. Discarding of supernatant after magnetic beads separation (DNA

IQ™ System)

2. Inkubowaæ próbkê przez 10 minut w temperatu-rze 94oC. Po zakoñczonej inkubacji pozostawiæpróbki, aby ostyg³y.

3. Dodaæ 16 μl roztworu proteinazy K, zwortekso-waæ, a nastêpnie krótko zwirowaæ.

4. Inkubowaæ próbkê przez 1 godzinê w temperatu-rze 56oC.

5. Przenieœæ lizat wraz z pod³o¿em na filtr Nucleo-Spin®Filter umieszczony w probówce o pojemno-œci 1,5 ml. Zwirowaæ przez 1 minutê przy 11 000obr./min. Filtr z pod³o¿em odrzuciæ.

6. Dodaæ 160 μl buforu B3, a nastêpnie zwortekso-waæ 2 x 5 sekund.

7. Inkubowaæ przez 5 minut w temperaturze 70oC.8. Zworteksowaæ próbkê po wyjêciu z cieplarki i po-

zostawiæ do ostygniêcia.9. Dodaæ 160 μl etanolu, zworteksowaæ 2 x 5 se-

kund, a nastêpnie krótko zwirowaæ.10. Przenieœæ lizat na kolumienkê z membran¹ siliko-

now¹, umieszczon¹ w probówce o pojemnoœci 2ml i zwirowaæ przez 1 minutê przy 11 000 obr./min(je¿eli ca³a p³ynna zawartoœæ nie przes¹czy siêprzez membranê, powtórzyæ wirowanie). Odrzuciæprobówkê wraz z supernatantem, a kolumienkêprzenieœæ do nowej probówki o pojemnoœci 2 ml.

11. Dodaæ na membranê 50 μl buforu B5, a nastêpniezwirowaæ przez 1 minutê przy 11 000 obr./min.

12. Ponownie dodaæ 50 μl buforu B5 i zwirowaæprzez 2 minuty przy 11 000 obr./min.

13. Umieœciæ kolumienkê w nowej probówce o pojem-noœci 1,5 ml, a nastêpnie dodaæ 20 μl buforu BEdok³adnie na sam œrodek membrany silikonowej.Zwirowaæ przez 1 minutê przy 11 000 obr./min.

14. Inkubowaæ otwart¹ probówkê przez 8 minutw temperaturze 90oC w celu odparowania pozo-sta³oœci etanolu.

Procedura izolacji wykorzystuj¹ca wi¹zanie DNA

przez silikonow¹ membranê – QIAamp® DNA Micro:

1. Do probówki o pojemnoœci 1,5 ml z badanym ma-teria³em dodaæ 300 μl buforu ATL i 20 μl roztworuproteinazy K. Zworteksowaæ pulsacyjnie przez 10sekund.

2. Inkubowaæ próbkê przez 1 godzinê w temperatu-rze 56oC. Po wyjêciu z cieplarki krótko zwirowaæ.

3. Dodaæ 300 μl buforu AL, a nastêpnie zwortekso-waæ pulsacyjnie przez 10 sekund.

4. Inkubowaæ przez 10 minut w temperaturze 70oC.Zwirowaæ przez 1 minutê przy 14 000 obr./min.

Jeœli materia³ biologiczny znajduje siê na pod³o¿uch³onnym (np. tkaninie), nale¿y przenieœæ lizat wrazz pod³o¿em na kolumnê QIAshredder Spin (ryc. 7, 8)i zwirowaæ 2 minuty przy 14 000 obr./min.

5. Ostro¿nie przenieœæ supernatant na kolumnê QIA-amp® MinElute umieszczon¹ w probówce o po-jemnoœci 2 ml, bez zwil¿ania obwódki (ryc. 9).

6. Zwirowaæ przez 1 minutê przy 8000 obr./min. Pro-bówkê z przes¹czem odrzuciæ, a kolumnê QIA-amp® MinElute umieœciæ w nowej probówce o po-jemnoœci 2 ml.

PROBLEMY KRYMINALISTYKI 264 (kwiecieñ–czerwiec) 2009 15

Ryc. 7. Przenoszenie pod³o¿a na kolumnê QIAshredder Spin (QIAamp®

DNA Micro)Fig. 7. Transferring the solid sample material to the QIAshredder Spin co-

lumn (QIAamp® DNA Micro)

Ryc. 8. Pod³o¿e na kolumnie QIAshredder Spin po zwirowaniu (QIAamp®

DNA Micro)Fig. 8. The solid sample material on the QIAshredder Spin column after

centrifugation (QIAamp® DNA Micro)

Ryc. 9. Kolumna QIAamp® MinElute (QIAamp® DNA Micro)

Fig. 9. QIAamp® MinElute column (QIAamp® DNA Micro)

7. Na kolumnê dodaæ 500 μl buforu AW1, zwirowaæprzez 1 minutê przy 8000 obr./min. Probówkêz przes¹czem odrzuciæ, a kolumnê QIAamp®

MinElute umieœciæ w nowej probówce o pojem-noœci 2 ml.

8. Na kolumnê dodaæ 500 μl buforu AW2, zwirowaæprzez 1 minutê przy 8000 obr./min. Probówkê zprzes¹czem odrzuciæ, a kolumnê QIAamp® Min-Elute umieœciæ w nowej probówce o pojemnoœci 2ml.

9. Zwirowaæ przez 3 minuty przy 14 000 obr./min,probówkê z przes¹czem odrzuciæ, a kolumnêQIAamp® MinElute umieœciæ w nowej probówceo pojemnoœci 1,5 ml.

10. Dodaæ 20 μl buforu AE na œrodkow¹ czêœæ mem-brany.

11. Inkubowaæ przez 5 minut w temperaturze pokojo-wej, a nastêpnie zwirowaæ przez 1 minutê przy14 000 obr./min.

Procedura izolacji DNA metod¹ organiczn¹

w uk³adzie chloroform : fenol : alkohol izoamylowy

(25 : 24 : 1)

1. Do probówki o pojemnoœci 1,5 ml z badan¹ prób-k¹ dodaæ kolejno:– 300 μl 2% roztworu SDS w buforze ekstrakcyj-

nym,– 12 μl 1 M roztworu DTT w buforze ekstrakcyj-

nym,– 15 μl 20 mg/ml roztworu proteinazy K.

2. Inkubowaæ próbkê w temperaturze 56oC przeznoc.

3. Roz¿arzon¹ w p³omieniu palnika ig³¹ przek³uæwieczko i dno zawieraj¹cej materia³ probówki.Probówkê umieœciæ w nowej opisanej probówceo pojemnoœci 1,5 ml, a nastêpnie zwirowaæprzez 5 minut przy 9000 obr./min. Odrzuciæ górn¹probówkê z pod³o¿em.

4. Do przes¹czu dodaæ 300 μl mieszaniny fenol :chloroform : alkohol izoamylowy (25 : 24 : 1) roz-puszczonej w 10 mM roztworze Tris pH 8 z 1 mMEDTA i zworteksowaæ do uzyskania mlecznej za-wiesiny.

5. Próbkê odwirowaæ przez 5 minut przy 13 500obr./min.

6. Górn¹ fazê ekstraktu (wodn¹) przenieœæ na filtrzestawiony z opisan¹ probówk¹ mikrokoncentra-tora Microcon® YM-100, na który wczeœniej wpi-petowano 100 μl wody (ryc. 10, 11). Zwirowaæprzez 10 minut przy 5500 obr./min.

7. Mikrokoncentrator wyj¹æ ostro¿nie z probówki,usun¹æ z niej przefiltrowany p³yn i ponownie ze-stawiæ mikrokoncentrator z probówk¹.

8. Na filtr mikrokoncentratora wpipetowaæ 200 μlwody.

9. Odwirowaæ przez 10 minut przy 5500 obr./min. 10. Na filtr mikrokoncentratora wpipetowaæ 20 μl wo-

dy, a nastêpnie zestawiæ go w pozycji odwróconejz now¹ opisan¹ probówk¹ o pojemnoœci 1,5 ml.

11. Zwirowaæ przez 5 minut przy 2500 obr./min.

Opracowanie wyników

Wyniki uzyskane z oznaczenia iloœciowego opraco-wano z u¿yciem analizy wariancji testem Tukeya za po-moc¹ wersji demo oprogramowania GraphPad Prismv. 5 przeznaczonego do obliczeñ biostatystycznych(zgodnie z obwi¹zuj¹c¹ licencj¹ producenta).

Omówienie wyników badań

Testowane w doœwiadczeniu zestawy przeznaczonedo izolacji DNA analizowano w nastêpuj¹cych aspek-tach:

• Wydajnoœæ metody (uzyskane stê¿enie DNA).• Jakoœæ uzyskanego DNA (obraz profilu genetycz-

nego).• Ryzyko wyst¹pienia kontaminacji.

PROBLEMY KRYMINALISTYKI 264 (kwiecieñ–czerwiec) 200916

Ryc. 10. Przenoszenie fazy wodnej ekstraktu (metoda organiczna):a – faza wodna z widoczn¹ zawartoœci¹ barwnika indygo,b – faza wodna bez zawartoœci barwnika indygo.Fig. 10. Transferring the non-organic phase of the extract (organic me-thod): a – non-organic phase containing indigo,b – non-organic phase without indigo

Ryc. 11. Filtr mikrokoncentratora Microcon® YM-100 (metoda organiczna)Fig. 11. Microcon® Centrifugal Filter Units (organic method)

• Ekonomika przeprowadzenia procesu izolacji(iloœæ zu¿ytych materia³ów i dodatkowych odczyn-ników, czas niezbêdny do przeprowadzenia proce-dury, koszt zestawu) oraz stopieñ trudnoœci danejtechniki.

Analiza ilościowa uzyskanego DNA

w zależności od zastosowanej metody izolacji

Efektywnoœæ wybranych metod izolacji DNA porów-nano i omówiono dla nastêpuj¹cych przypadków:

– objêtoœæ krwi naniesionej na ja³owe p³ótno (1μl; 2,5 μl; 5 μl),

– czynnik degraduj¹cy (wysoka temperatura),– wp³yw inhibitora (barwnik indygo).Wyniki przedstawiaj¹ce stê¿enie DNA w zale¿noœci

od iloœci naniesionej na ja³owe p³ótno krwi przedsta-wiono w tabelach 1–3.

Przy izolacji DNA z 1 μl krwi naniesionej na ja³owep³ótno najwy¿sz¹ œredni¹ ze stê¿enia [ng/μl] otrzyma-no, stosuj¹c metodê organiczn¹ (w uk³adzie fenol :chloroform : alkohol izoamylowy). Œrednie stê¿enieDNA otrzymane przy zastosowaniu technik separacjimagnetycznej (NucleoMag 96 Trace i DNA IQ™ Sys-tem) oraz separacji przy u¿yciu membrany silikonowej

(NucleoSpin®Tissue XS) utrzymywa³o siê na podob-nym poziomie. Wynik ten zosta³ potwierdzony staty-stycznie. Najni¿sze stê¿enie DNA otrzymano przy u¿y-ciu metody QIAamp® DNA Micro.

Porównawszy stê¿enie DNA [ng/μl] uzyskanepo izolacji z 1 μl krwi naniesionego na ja³owe p³ótno,przy zastosowaniu ró¿nych metod, stwierdzono ró¿ni-ce statystycznie istotne pomiêdzy wy¿szym stê¿eniemDNA uzyskanym przy zastosowaniu metody organicz-nej w porównaniu z:

– metod¹ QIAamp® DNA Micro (p ≤ 0,01)– metodami: DNA IQ™ System, NucleoSpin®Tissue

XS (p ≤ 0,05)

Porównuj¹c œrednie stê¿enia DNA uzyskane ró¿-nymi metodami, nale¿y mieæ na uwadze tak¿e wynikicz¹stkowe. Daje siê bowiem zauwa¿yæ du¿¹ rozbie¿-noœæ pomiêdzy pojedynczymi wynikami, co potwier-dza du¿e odchylenie standardowe – zbli¿one do œred-

niej, a nawet j¹ przewy¿szaj¹ce w przypadku metodopartych na separacji magnetycznej. Taka sytuacjamo¿e potwierdzaæ nisk¹ powtarzalnoœæ otrzymywa-nych wyników przy zastosowaniu wymienionych me-tod. Najwiêksze rozbie¿noœci w otrzymanych stê¿e-niach zanotowano w przypadku metody Nucleo-Mag 96 Trace.

PROBLEMY KRYMINALISTYKI 264 (kwiecieñ–czerwiec) 2009 17

Tabela 1

Stê¿enie DNA [ng/μl] uzyskane w zale¿noœci od zastosowanej metody izolacji z materia³u stanowi¹cego 1 μl krwi

naniesionej na ja³owe p³ótno

Concentration of DNA [ng/μl] obtained from 1 μl of blood taken from the linen, depending on the extraction’s method

Ÿród³o (tabele 1–7): autorzyS.D. – odchylenie standardoweŒrednie stê¿enia DNA [ng/μl] oznaczone parami liter ró¿ni¹ siê statystycznie:AB przy p ≤ 0,01 [p – poziom istotnoœci]ab przy p ≤ 0,05[…] – wartoœæ podana w nawiasie zosta³a wyeliminowana z obliczeñ statystycznych za pomoc¹ testu Grubbsa

W przypadku izolacji DNA z 2,5 μl krwi naniesionejna ja³owe p³ótno, najwy¿sze œrednie stê¿enie [ng/μl]otrzymano przy zastosowaniu metody NucleoMag 96

Trace. Rozpatruj¹c wyniki cz¹stkowe przy zastosowa-niu tej metody, w próbce numer 3 otrzymano stê¿enieznacznie przewy¿szaj¹ce inne wyniki (19,54 ng/μl).

PROBLEMY KRYMINALISTYKI 264 (kwiecieñ–czerwiec) 200918

Tabela 2

Stê¿enie DNA [ng/μl] uzyskane w zale¿noœci od zastosowanej metody izolacji z materia³u stanowi¹cego 2,5 μl krwi

naniesionej na ja³owe p³ótno

Concentration of DNA [ng/μl] obtained from 2,5 μl of blood taken from the linen, depending on the extraction’s method

Œrednie stê¿enia DNA [ng/μl] oznaczone parami liter ró¿ni¹ siê statystycznie:AB przy p ≤ 0,01ab przy p ≤ 0,05[…] – wartoœæ podana w nawiasie zosta³a wyeliminowana z obliczeñ statystycznych za pomoc¹ testu Grubbsa

Tabela 3

Stê¿enie DNA [ng/μl] uzyskane w zale¿noœci od zastosowanej metody izolacji z materia³u stanowi¹cego 5 μl krwi

naniesionej na ja³owe p³ótno

Concentration of DNA [ng/μl] obtained from 5 μl of blood taken from the linen, depending on the extraction’s method

Œrednie stê¿enia DNA [ng/μl] oznaczone parami liter ró¿ni¹ siê statystycznie:AB przy p ≤ 0,001AB przy p ≤ 0,01[…] – wartoœæ podana w nawiasie zosta³a wyeliminowana z obliczeñ statystycznych za pomoc¹ testu Grubbsa

Przy wyeliminowaniu tego wyniku do celów statystycz-nych œrednia stê¿enia DNA w metodzie NucleoMag 96Trace by³a zbli¿ona do œredniego stê¿enia uzyskanegometod¹ organiczn¹. Wynik ten zosta³ potwierdzonystatystycznie. Podobnie jak w przypadku omawianejwczeœniej izolacji z 1 μl krwi, tak¿e i w tym przypadkurozbie¿noœci uzyskanych wyników w metodzie NucleoMag 96 Trace by³y bardzo du¿e (od 1,33 ng/μl do 19,54ng/μl). Odchylenie standardowe w metodzie opartejna separacji za pomoc¹ matrycy silikonowej przewy¿-sza³o œredni¹. Najni¿sze stê¿enie DNA otrzymanoprzy u¿yciu metody QIAamp® DNA Micro, co potwier-dza wynik uzyskany w doœwiadczeniu przy przeprowa-dzaniu izolacji z 1 μl.

Porównuj¹c stê¿enie DNA [ng/μll] uzyskane po izo-lacji z 2,5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno, przy za-stosowaniu ró¿nych metod, stwierdzono ró¿nice staty-stycznie istotne pomiêdzy wiêkszym stê¿eniem DNA,przy zastosowaniu metody NucleoMag 96 Trace, w po-równaniu z:

– metod¹ DNA IQ™ System (p ≤ 0,05)– metod¹ QIAamp® DNA Micro (p ≤ 0,01) Zanotowano tak¿e wy¿sze stê¿enie DNA otrzymane

metod¹ organiczn¹ w porównaniu z metod¹ QIAamp®

DNA Micro (p ≤ 0,05). Wyniki œrednich stê¿eñ DNAprzy zastosowaniu pozosta³ych metod nie ró¿ni³y siêod siebie statystycznie.

Przy izolacji DNA z 5 μl krwi naniesionej na ja³owep³ótno najwy¿sze œrednie stê¿enie [ng/μl] zanotowano

przy zastosowaniu metody NucleoMag 96 Trace. Dru-g¹ pod wzglêdem wydajnoœci metod¹ by³a metoda or-ganiczna. Najni¿sze stê¿enie DNA uzyskano, stosuj¹cmetodê QIAamp® DNA Micro (podobny wynik zanoto-wano w przypadku izolacji z 1 μl i 2,5 μl krwi).

Porównuj¹c stê¿enie DNA [ng/μl] uzyskane po izola-cji z 5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno, przy zasto-sowaniu ró¿nych metod, stwierdzono ró¿nice staty-stycznie istotne pomiêdzy wiêkszym stê¿eniem DNAprzy zastosowaniu metody Nucleomag 96 Trace w po-równaniu z metodami: DNA IQ™ System, Nucleo-Spin®Tissue XS oraz QIAamp® DNA Micro (p ≤ 0,01).Potwierdzono tak¿e statystycznie wy¿sze œrednie stê-¿enie DNA [ng/μl] uzyskane metod¹ organiczn¹ w po-równaniu z nastêpuj¹cymi metodami:

– DNA IQ™ System i NucleoSpin®Tissue XS(p ≤ 0,01)

– QIAamp® DNA Micro (p ≤ 0,001)

W tabeli 4 przedstawiono stê¿enie DNA otrzymaneró¿nymi metodami izolacji w przypadku dzia³ania czyn-nika degraduj¹cego, jakim by³a wysoka temperatura.

W przypadku izolowania DNA z materia³u zdegrado-wanego najwy¿sze œrednie stê¿enie DNA [ng/μl] uda³osiê uzyskaæ stosuj¹c metodê organiczn¹. Podobniewysokie stê¿enie otrzymano, izoluj¹c materia³ metod¹NucleoSpin®Tissue XS. Porównuj¹c stê¿enie DNA[ng/μl] uzyskane po izolacji z 1 μl zdegradowanej krwina p³ótnie, przy zastosowaniu ró¿nych metod, stwier-

PROBLEMY KRYMINALISTYKI 264 (kwiecieñ–czerwiec) 2009 19

Tabela 4

Stê¿enie DNA [ng/μl] uzyskane w zale¿noœci od zastosowanej metody izolacji z materia³u zdegradowanego, stanowi¹cego

1 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno

Concentration of DNA [ng/μl] obtained from 1 μl of degraded blood taken from the linen, depending on the extraction’s method

Œrednie stê¿enia DNA [ng/μl] oznaczone parami liter ró¿ni¹ siê statystycznie:AB przy p ≤ 0,001AB przy p ≤ 0,01ab przy p ≤ 0,05

dzono ró¿nice statystycznie istotne pomiêdzy ni¿szymstê¿eniem DNA po zastosowaniu metody QIAamp®

DNA Micro w porównaniu z metodami:– organiczn¹ (p ≤ 0,001)– NucleoSpin®Tissue XS (p ≤ 0,01)– DNA IQ™ System (p ≤ 0,05).

W tabeli 5 przedstawiono stê¿enie DNA otrzymaneró¿nymi metodami izolacji w przypadku obecnoœci inhi-bitora reakcji PCR w pod³o¿u.

Izoluj¹c DNA z 1 μl krwi naniesionej na jeans zawie-raj¹cy inhibitor reakcji PCR (barwnik indygo), najwy¿-sze œrednie stê¿enie DNA [ng/μl] otrzymano, stosuj¹c

PROBLEMY KRYMINALISTYKI 264 (kwiecieñ–czerwiec) 200920

Tabela 5

Stê¿enie DNA [ng/μl] uzyskane w zale¿noœci od zastosowanej metody izolacji z materia³u stanowi¹cego 1 μl krwi

naniesionej na jeans z barwnikiem indygo (pod³o¿e z inhibitorem reakcji PCR)

Concentration of DNA [ng/μl] obtained from 1 μl of blood taken from the jeans (PCR inhibitor), depending on the extraction’s method

Œrednie stê¿enia DNA [ng/μl] oznaczone parami liter ró¿ni¹ siê statystycznie:AB przy p ≤ 0,001AB przy p ≤ 0,01[…] – wartoœæ podana w nawiasie zosta³a wyeliminowana z obliczeñ statystycznych za pomoc¹ testu Grubbsa

Tabela 6

Stê¿enie DNA [ng/μl] stanowi¹cego próbê kontroln¹ uzyskane w zale¿noœci od zastosowanej metody izolacji

z 1 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno

Concentration of DNA [ng/μl] obtained from the control – 1 μl of blood taken from the linen, depending on the extraction’s method

Œrednie stê¿enia DNA [ng/μl] oznaczone parami liter ró¿ni¹ siê statystycznie:AB przy p ≤ 0,01; ab przy p ≤ 0,05

metodê NucleoSpin®Tissue XS. W przypadku metodyQIAamp® DNA Micro nie stwierdzono wystêpowaniainhibitora reakcji PCR w koñcowym izolacie, jednakDNA nie uda³o siê wyizolowaæ. Ekstrakcja DNA meto-d¹ organiczn¹ w uk³adzie fenol : chloroform : alkoholizoamylowy skutkowa³a obecnoœci¹ inhibitora reakcjiPCR w koñcowym izolacie. Odchylenie standardowew metodzie opartej na separacji magnetycznej DNAIQ™ System przewy¿sza³o œrednie stê¿enie.

Przy izolacji DNA z pod³o¿a zawieraj¹cego inhibitorreakcji PCR stwierdzono wy¿sze stê¿enie DNAprzy zastosowaniu metody NucleoSpin®Tissue XSw porównaniu z:

– QIAamp® DNA Micro (p ≤ 0,001)– DNA IQ™ System (p ≤ 0,01)

Wszystkie badania przeprowadzono w obecnoœcikontroli pozytywnej – próbki o znanym genotypie, sta-nowi¹cej 1 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno. Wyni-ki przedstawiono w tabeli 6.

W próbie kontrolnej najwy¿sze stê¿enia DNA [ng/μl],potwierdzone statystycznie, zanotowano w przypad-kach izolacji metodami NucleoMag 96 Trace oraz orga-niczn¹. Najni¿sze stê¿enie DNA uzyskano metod¹QIAamp® DNA Micro. Porównuj¹c stê¿enie DNA[ng/μl] uzyskane po izolacji z próby kontrolnej, przy za-stosowaniu ró¿nych metod, stwierdzono ró¿nice staty-stycznie istotne pomiêdzy wy¿szym stê¿eniem DNAuzyskanym metod¹ NucleoMag 96 Trace w porówna-niu z:

– metod¹ QIAamp® DNA Micro (p ≤ 0,01)

– metodami: DNA IQ™ System, NucleoSpin®TissueXS (p ≤ 0,05)

Ponadto zanotowano statystycznie wy¿sze stê¿enieDNA przy zastosowaniu metody organicznej w porów-naniu z metod¹ QIAamp® DNA Micro (p ≤ 0,05).

Analiza jakościowa uzyskanego DNA

w zależności od zastosowanej metody izolacji

Po izolacji DNA z materia³u wyjœciowego, jaki stano-wi³y próbki krwi o objêtoœci: 1 μl, 2,5 μl oraz 5 μl stwier-dzono, ¿e tylko przy zastosowaniu metody NucleoSpin®Tissue XS oraz metody organicznej uda³o siêuzyskaæ pe³ne profile w przypadku wszystkich analizo-wanych próbek. Izoluj¹c metod¹ DNA IQ™ System z 1μl krwi, uzyskano dwa profile czêœciowe (wypadniêciuuleg³y allele z uk³adu D18S51) oraz 6 pe³nych profili.Najmniejsz¹ liczbê pe³nych profili uzyskano przy zasto-sowaniu metod: NucleoMag 96 Trace (3FP) i QIAamp®

DNA Micro (4FP). W obu tych metodach uzyskano tak-¿e profile czêœciowe: w metodzie NucleoMag 96 Tracewypadniêciu uleg³y allele z uk³adów D16S539,D2S1338, D21S11, D18S51 i FGA w jednej próbceoraz TH01 w drugiej. W przypadku metody QIAamp®

DNA Micro wypad³y uk³ady: D18S51 w jednej próbceoraz D3S1358, vWA, D16S539, D2S1338, D21S11,D18S51, D19, TH01 i FGA w kolejnych. Przy zastoso-waniu metod: NucleoMag 96 Trace, DNA IQ™ Systemoraz QIAamp® DNA Micro wraz ze wzrostem iloœci ma-teria³u wyjœciowego uzyskiwano wiêcej pe³nych profiligenetycznych.

PROBLEMY KRYMINALISTYKI 264 (kwiecieñ–czerwiec) 2009 21

Tabela 7

Analiza uzyskanych profili genetycznych w zale¿noœci od zastosowanej metody izolacji

Analysis of the genetic profiles depending on the the extraction’s method

Zastosowane w tabeli oznaczenia:FP – pe³ny profil (ang. full profile)PP – czêœciowy profil (ang. partial profile)NEG – brak profilu

W przypadku analizy materia³u zdegradowanegostwierdzono, ¿e przy zastosowaniu metod: DNA IQ™System, NucleoSpin®Tissue XS oraz organicznej uzy-skano profile, w których wypadniêciu uleg³y tylko allelew loci o wysokiej masie cz¹steczkowej. Dla DNA IQ™System by³y to uk³ady: D2S1338 i D18S51 (w jednymprzypadku tak¿e D16S539 i FGA), dla Nucleo-Spin®Tissue XS: D2S1338, D18S51 (w dwóch przy-padkach dodatkowo D16S539 i D21S11, a tak¿e w jed-nym przypadku FGA), dla metody organicznej:D16S539, D2S1338, D18S51 (w jednym przypadkutak¿e D21S11 i FGA). Stosuj¹c metody izolacji z zasto-sowaniem systemów NucleoMag 96 Trace i QIAamp®

DNA Micro, uda³o siê uzyskaæ tylko profile czêœciowe,w których wypadniêciu uleg³y allele z wiêkszoœci loci.W przypadku metody QIAamp® DNA Micro nie uzyska-no profili genetycznych dla piêciu na osiem badanychpróbek.

Analiza profili DNA z materia³u izolowanego z pod-³o¿a zawieraj¹cego inhibitor reakcji PCR wskaza³a, ¿ejedynie stosuj¹c metodê opart¹ na separacji za pomo-c¹ paramagnetycznych kulek – DNA IQ™ System– uda³o siê uzyskaæ wszystkie profile genetyczne (czte-ry pe³ne profile i cztery czêœciowe). W pozosta³ych sto-sowanych metodach wielokrotnie obserwowano braksygna³u: dla QIAamp® DNA Micro nie uda³o siê uzy-skaæ profili genetycznych we wszystkich oœmiu przy-padkach, dla NucleoMag 96 Trace w siedmiu, oraz dlaNucleoSpin®Tissue XS w szeœciu.

Próba kontrolna potwierdzi³a wyniki uzyskane z izo-lacji przeprowadzonej z 1 μl krwi naniesionej na ja³owep³ótno w przypadku metod: DNA IQ™ System, NucleoSpin®Tissue XS oraz metody organicznej. Natomiastdla metody NucleoMag 96 Trace otrzymano w przypad-ku próby kontrolnej znacznie lepszy wynik – osiem pe³-nych profili. Podobnie w przypadku systemu QIAamp®

DNA Micro otrzymano wiêcej pe³nych profili.W ¿adnym z analizowanych przypadków nie stwier-

dzono profilu mieszanego, co œwiadczy o braku wyst¹-pienia kontaminacji.

Ekonomika procesów izolacji DNA

oraz ocena stopnia trudności ich stosowania

Podsumowanie ekonomiki wykonania izolacji DNAposzczególnymi metodami uwzglêdnia czas etapówniezbêdnych do przeprowadzenia procesu, iloœæ dodat-kowych materia³ów i odczynników, a tak¿e ceny bruttozestawów. Podane kwoty odnosz¹ siê do cen rynko-wych z I kwarta³u 2009 r.

NucleoMag 96 Trace:Czas inkubacji: 60 minCzas wytrz¹sania: 26 minCzas separacji: 8 min

Zu¿ycie materia³ów: 2 x probówka o poj. 1,5 ml,10 x koñcówka 1000 μl

4 x koñcówka 100 μlPlastikowa 96-do³kowa p³ytka Square-well blockDodatkowe odczynniki: brakKoszt zestawu (96 izolacji): 900 PLNCena separatora magnetycznego: 2240 PLNKoszt w przeliczeniu na 1 próbkê: 9,40 PLN

£¹czny czas operacji niezbêdnych do przeprowa-dzenia izolacji DNA zestawem NucleoMag 96 Trace(inkubacja, wytrz¹sanie i separacja) wynosi 94 minuty.Zestaw zawiera wszystkie odczynniki potrzebne do wy-konania procedury. Niezbêdne jest zabezpieczenie do-datkowych materia³ów w postaci probówek o pojemno-œci 1,5 ml i plastikowych 96-do³kowych p³ytek Square--well block. S¹ one sprzedawane oddzielnie w zesta-wach po 4 lub 20 sztuk. Dodatkowym kosztem jest za-kup separatora magnetycznego, na którym umieszczasiê p³ytkê Square-well block. Separator nie ma bezpo-œredniego kontaktu z próbkami, wiêc mo¿e byæ stoso-wany wielokrotnie. Jednorazowo mo¿na umieœciæna separatorze jedn¹ p³ytkê. W ca³ym procesie zu¿y-wanych jest 14 ró¿nych koñcówek do pipet.

Metoda jest bardzo trudna do wykonania manualne-go. Istnieje du¿e ryzyko wyst¹pienia kontaminacji zewzglêdu na to, ¿e ca³y proces izolacji odbywa siêprzy otwartej p³ytce Square-well block. Szczególne nie-bezpieczeñstwo zanieczyszczenia próbek wystêpujena etapie wytrz¹sania. Operator musi zachowaæ przezca³y czas szczególn¹ ostro¿noœæ. Ponadto niemo¿liwejest rêczne wykonanie izolacji z pe³nym wykorzysta-niem p³ytki 96-do³kowej, co w przypadku mniejszej ilo-œci próbek czyni metodê ma³o op³acaln¹. Zestaw Nuc-leoMag 96 Trace jest dedykowany do izolacji DNAza pomoc¹ automatycznych stacji (robotów).

DNA IQ™ System:Czas wirowania: 2 minCzas inkubacji: 45 minZu¿ycie materia³ów: 3 x probówka o poj. 1,5 ml

7 x koñcówka 300 μl6 x koñcówka 100 μl1 x koñcówka 10 μl

Dodatkowe odczynniki: 0,3 ml EtOH0,3 ml iPrOH2,5 μl 1M DTT

Koszt zestawu(100 izolacji): 1874 PLNKoszt w przeliczeniuna 1 próbkê: 18,75 PLN

Metoda izolacji z zastosowaniem zestawu DNA IQ™System wymaga przeprowadzenia etapów wirowania

PROBLEMY KRYMINALISTYKI 264 (kwiecieñ–czerwiec) 200922

i inkubacji, których ³¹czny czas wynosi 45 minut. Ze-staw zawiera zarówno statyw magnetyczny, jak i wy-starczaj¹c¹ iloœæ probówek o pojemnoœci 1,5 ml, jed-nak niektóre odczynniki nale¿y zabezpieczyæ we w³a-snym zakresie (etanol, izopropanol, 1 M roztwór DTTw buforze lizuj¹cym). W procesie zu¿ywanych jest 14ró¿nych koñcówek do pipet.

Metoda jest doœæ ³atwa do wykonania manualnegow przypadku niewielkiej liczby próbek. Statyw magne-tyczny przewidziany jest na 12 probówek. Ryzyko kon-taminacji wystêpuje w niewielkim zakresie z tegowzglêdu, ¿e wszystkie próbki znajduj¹ siê w oddziel-nych probówkach typu safe-lock. Proces mo¿na prze-prowadzaæ równie¿ z zastosowaniem robota do izola-cji.

NucleoSpin®Tissue XS:Czas wirowania: 6 minCzas inkubacji: 83 minZu¿ycie materia³ów: 2 x probówka o poj. 1,5 ml

2 x probówka o poj. 2 ml2 x koñcówka 1000 μl3 x koñcówka 300 μl4 x koñcówka 100 μlFiltry NucleoSpin

Dodatkowe odczynniki: 0,4 ml EtOHKoszt zestawu(50 izolacji): 974 PLNKoszt w przeliczeniuna 1 próbkê: 19,50 PLN

£¹czny czas inkubacji i wirowania w procedurze izo-lacji DNA za pomog¹ zestawu NucleoSpin Tissue XSwynosi 89 minut. Niezbêdne jest zabezpieczenie do-datkowych materia³ów w postaci probówek o pojemno-œci 1,5 ml i 2 ml oraz filtrów NucleoSpin s³u¿¹cychdo oddzielania lizatu od pod³o¿a. Nale¿y równie¿ przy-gotowaæ etanol do sporz¹dzenia buforu p³ucz¹cego.W ca³ym procesie zu¿ywanych jest dziewiêæ ró¿nychkoñcówek do pipet.

Zestaw NucleoSpin Tissue XS jest dedykowanydo manualnego wykonywania. Izolacja DNA t¹ metod¹jest ³atwa do przeprowadzenia. Ryzyko kontaminacjipróbek wystêpuje w bardzo niewielkim stopniu.

QIAamp® DNA Micro Kit:Czas wirowania: 10 minCzas inkubacji: 75 minZu¿ycie materia³ów: 2 x probówka o poj. 1,5 ml

6 x koñcówka 1000 μl2 x koñcówka 100 μlKolumna QIAshredder Spin

Dodatkowe odczynniki: 1,1 ml EtOH

Koszt zestawu(50 izolacji): 1574 PLNKoszt w przeliczeniuna 1 próbkê: 31,50 PLN

Izolacja DNA za pomog¹ zestawu QIAamp® DNAMicro wi¹¿e siê z przeprowadzeniem inkubacji i wiro-wania, których ³¹czny czas wynosi 85 minut. Niezbêd-ne jest zabezpieczenie etanolu wchodz¹cego w sk³adroztworów p³ucz¹cych, równie¿ dodatkowych materia-³ów w postaci probówek o pojemnoœci 1,5 ml oraz ko-lumn QIAshredder Spin s³u¿¹cych do oddzielania liza-tu od pod³o¿a. Probówki o pojemnoœci 2 ml znajduj¹siê w zestawie. W ca³ym procesie zu¿ywanych jestosiem ró¿nych koñcówek do pipet.

Ryzyko wyst¹pienia kontaminacji w procesie izolacjiDNA za pomoc¹ zestawu QIAamp® DNA Micro jestbardzo ma³e. Procedura jest ³atwa do przeprowadze-nia manualnie.

Metoda organiczna w uk³adzie fenol : chloroform :alkohol izoamylowy (25 : 24 : 1)

Czas wirowania: 35 minCzas inkubacji: > 150 minZu¿ycie materia³ów: 4 x probówka o poj. 1,5 ml

2 x koñcówka 1000 μl1 x koñcówka 300 μl5 x koñcówka 100 μlMikrokoncentrator Micro-con® YM-100

Dodatkowe odczynniki: 300 μl 2% SDS12 μl 1M DTT15 μl proteinazy K (20 mg/ml)

Koszt w przeliczeniuna 1 próbkê: oko³o 15 PLN

Izolacja z zastosowaniem metody organicznej wy-maga przeprowadzenia etapów wirowania i inkubacji,których ³¹czny czas wynosi co najmniej 185 minut. Wy-maga ona wczeœniejszego przygotowania odczynni-ków. Na ka¿d¹ próbkê nale¿y zabezpieczyæ 4 probów-ki o pojemnoœci 1,5 ml, zestaw mikrokoncentratora Mi-crocon® YM-100 firmy Millipore i osiem ró¿nych koñcó-wek do pipet.

Stosowanie metody organicznej do izolacji DNA jestdosyæ ³atwe, jednak¿e stwarza niebezpieczeñstwo na-ra¿enia operatora na dzia³anie par niebezpiecznychsubstancji organicznych: fenolu – substancji silnie ¿r¹-cej i toksycznej, chloroformu – substancji szkodliwejoraz groŸnej dla œrodowiska, a tak¿e alkoholu izoamy-lowego o dzia³aniu szkodliwym i dra¿ni¹cym. Ponadtozachodzi ryzyko wyst¹pienia kontaminacji krzy¿owejpróbek przy operowaniu filtrami mikrokoncentratorana etapie elucji DNA.

PROBLEMY KRYMINALISTYKI 264 (kwiecieñ–czerwiec) 2009 23

Wnioski

1. W przypadku izolacji DNA z materia³u stanowi¹-cego 1 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótnostwierdzono statystycznie istotne wy¿sze stê¿e-nie DNA przy zastosowaniu metody organicznejw porównaniu z metodami DNA IQ™ System,NucleoSpin®Tissue XS oraz QIAamp® DNA Mi-cro.

2. W przypadku izolacji DNA z materia³u stanowi¹-cego 2,5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótnostwierdzono statystycznie istotne wy¿sze stê¿e-nie DNA przy zastosowaniu metody Nucleo-Mag 96 Trace w porównaniu z metodami DNAIQ™ System oraz QIAamp® DNA Micro, a tak¿emetody organicznej w odniesieniu do QIAamp®

DNA Micro.3. W przypadku izolacji DNA z materia³u stanowi¹-

cego 5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótnostwierdzono statystycznie istotne wy¿sze stê¿e-nie DNA przy zastosowaniu metody NucleoMag 96 Trace i metody organicznej, w porówna-niu z pozosta³ymi metodami.

4. Najwy¿sz¹ wydajnoœæ izolacji DNA z materia³uzdegradowanego uzyskano przy zastosowaniumetody organicznej oraz NucleoSpin®Tissue XS.Stwierdzono statystycznie istotne ni¿sze stê¿enieDNA w przypadku zastosowania zestawu QIA-amp® DNA Micro w porównaniu z pozosta³ymimetodami z wyj¹tkiem NucleoMag 96 Trace.

5. Izolacja DNA z materia³u stanowi¹cego 1 μl krwinaniesionej na pod³o¿e zawieraj¹ce inhibitor re-akcji PCR wykaza³a najwiêksz¹ skutecznoœæ ze-stawu NucleoSpin®Tissue XS. Stwierdzono staty-stycznie istotne wy¿sze stê¿enie DNA w izolacieprzy zastosowaniu tej metody w porównaniuz metodami DNA IQ™ System oraz QIAamp®

DNA Micro. Ekstrakcja DNA metod¹ organiczn¹skutkowa³a obecnoœci¹ inhibitora reakcji PCRw uzyskanym izolacie.

6. Stê¿enia DNA uzyskane w próbie kontrolnej po-twierdzaj¹ wyniki otrzymane w przypadkach eks-trakcji DNA z 1 μl, 2,5 μl oraz 5 μl krwi naniesio-nej na ja³owe p³ótno. Ró¿nice w iloœci wyizolowa-nego DNA, pomiêdzy prób¹ kontroln¹ a prób¹stanowi¹c¹ 1 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótnow przypadku izolacji zestawem NucleoMag 96Trace, œwiadcz¹ o niskiej powtarzalnoœci tej me-tody wykonywanej technik¹ manualn¹.

7. Pe³ne profile genetyczne uzyskano we wszyst-kich przypadkach izolacji DNA z materia³u wyj-œciowego, jaki stanowi³y próbki o ró¿nej objêtoœcikrwi naniesione na ja³owe p³ótno, tylko przy za-

stosowaniu metody organicznej oraz Nucleo--Spin®Tissue XS.

8. Najwiêkszy odsetek pe³nych profili genetycznychw izolacji DNA zdegradowanego oraz z pod³o¿azawieraj¹cego inhibitor reakcji PCR uzyskanoprzy zastosowaniu zestawu DNA IQ™ System.

9. Najtrudniejsz¹ do wykonania manualnego okaza-³a siê procedura ekstrakcji DNA metod¹ NucleoMag 96 Trace. Zestaw ten, w odró¿nieniu od in-nych, posiada wszystkie odczynniki niezbêdnedo przeprowadzenia procedury. Koszt wykonaniaizolacji jednej próbki zestawem NucleoMag 96Trace jest najni¿szy.

10. Najkrótszy czas wykonania ca³ego procesu eks-trakcji uzyskano dla zestawu DNA IQ™ System.Metoda ta jest ³atwa do rêcznego przeprowadze-nia przy niewielkiej iloœci próbek.

11. Najmniejsze zu¿ycie materia³ów wystêpujew przypadku zestawu QIAamp® DNA Micro. Wewszystkich analizowanych przypadkach zestawQIAamp® DNA Micro charakteryzowa³ siê najni¿-sz¹ wydajnoœci¹ zarówno w aspekcie iloœciowymjak i pod wzglêdem jakoœci uzyskanych profili ge-netycznych.

12. W ¿adnej z opisanych metod ekstrakcji DNA niestwierdzono wyst¹pienia kontaminacji.

Streszczenie

Celem przeprowadzonych badañ by³o porównanie efektyw-

noœci ró¿nych metod izolacji kwasów nukleinowych w aspekcie

iloœciowym, jakoœciowym i ekonomicznym. Przetestowano dwa

zestawy przeznaczone do izolacji DNA opieraj¹ce siê na separa-

cji magnetycznej: NucleoMag 96 Trace i DNA IQ™ System

oraz dwa zestawy kolumienkowe z membran¹ silikonow¹: Nuc-

leoSpin®Tissue XS i QIAamp® DNA Micro. W artykule przed-

stawiono wyniki analizy testowanych zestawów do izolacji

DNA. Badanym materia³em biologicznym by³a wysuszona krew

na pod³o¿u ja³owym oraz na pod³o¿u zawieraj¹cym inhibitor re-

akcji PCR, a tak¿e materia³ zdegradowany. Po izolacji DNA

z ró¿nych objêtoœci krwi na ja³owym pod³o¿u najbardziej wydaj-

nymi pod wzglêdem jakoœciowym by³y metody organiczna oraz

Nucleospin®Tissue XS. W przypadku materia³u zdegradowane-

go oraz przy ekstrakcji DNA z pod³o¿a zawieraj¹cego inhibitor

reakcji PCR najwiêcej pe³nych profili uzyskano przy zastosowa-

niu metody DNA IQ™ System. Badania t¹ metod¹ wykonano

w najkrótszym czasie. Najni¿szy koszt w przeliczeniu na jedn¹

próbkê uzyskano dla zestawu NucleoMag 96 Trace.

S³owa kluczowe: metody izolacji DNA, separacja magne-

tyczna, kulki paramagnetyczne, membrana silikonowa, œlady

biologiczne, kryminalistyczne badania DNA.

Summary

The purpose of the research was to compare the efficiency of

different DNA extraction methods from arranged forensic sam-

PROBLEMY KRYMINALISTYKI 264 (kwiecieñ–czerwiec) 200924

ples. There were tested four commercial kits: two of them based

on magnetic separation: NucleoMag 96 Trace i DNA IQ™ Sys-

tem and two of them based on silica membrane: Nucleo-

-Spin®Tissue XS and QIAamp® DNA Micro. In the article

were presented results of extraction from dried blood spots on

sterile linen as well as on jeans contained PCR inhibitor and

also from degraded DNA. The best results in the quality aspect

were obtained from dried blood spots on sterile linen using

Nucleospin®Tissue XS and organic method. DNA IQ™ Sys-

tem was the most effective method in case of degraded DNA and

samples contained PCR inhibitor. These method required also

the shortest time to perform the whole procedure of extraction.

The lowest overall cost per one sample were in NucleoMag 96

Trace.

Keywords: DNA extraction methods, magnetic separation,

paramagnetic beads, silica membrane, forensic biology.

BIBLIOGRAFIA

1. http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/brands/Dy-nal.html

2. Macherey-Nagel User Manual, NucleoMag 96 Trace –Genomic DNA from Forensic Samples, Germany 2006, 1–29.

3. Montpetit S.A., Fitch I.T., O’Donnell P.T.: A simple au-tomated instrument for DNA extraction in forensic casework,Journal of Forensic Science 2005, 50, 1–9.

4. Nagy M., Otremba P., Krüger C. [et al.]: Optimizationand validation of a fully automated silica-coated magnetic be-ads purification technology in forensics, Forensic Science In-ternational 2005, 152,13–22.

5. Paw³owski R.: Medyczno-s¹dowe badanie œladów bio-logicznych, Wydawnictwo IES, Kraków 1997.

6. Promega Technical Bulletin, DNA IQTM System – SmallSample Casework Protocol, USA 2006, 1–14.

7. Qiagen QIAamp® DNA Micro Handbook, Germa-ny 2003, 1–47.

8. Skagestad V., Reitan E., Stacy R. [et al.]: Innovativeautomated nucleic acid isolation by the key use of magneticsilica particles, European Cells and Materials 2002, 3, 199.

9. Macherey-Nagel User Manual, NucleoSpin®Tissue XS– Genomic DNA from Tissue, Germany 2007, 1–29.

PROBLEMY KRYMINALISTYKI 264 (kwiecieñ–czerwiec) 2009 25

Nagrody w konkursie prof. Tadeusza Hanauska

Z przyjemnoœci¹ informujemy, ¿e decyzj¹ Jury X Edycji Konkursu im. T. Hanauska na Pracê Roku

z Dziedziny Kryminalistyki z dnia 27 marca 2009 r. nagrodzone zosta³y w kategorii publikacje

nastêpuj¹ce artyku³y pracowników Centralnego Laboratorium Kryminalistycznego KGP:

„N,N-dietylobenzyloamina – produkt utleniania benzoesanu denatonium podchlorynem sodu”

– nagrodê otrzyma³ £ukasz Matyjasek, specjalista Wydzia³u Fizykochemii

„Analiza sekwencji nowego markera STR zlokalizowanego w lokus ludzkiego hormonu wzrostu

i jego wykorzystanie w identyfikacji osobniczej”

– wyró¿nienie otrzyma³a dr Magdalena Spólnicka, ekspert Wydzia³u Biologii

„Badania zawartoœci morfiny w p³ynach ustrojowych osób po spo¿yciu produktów spo¿ywczych

zawieraj¹cych mak oraz jej oznaczanie w tych wyrobach

– dyplom Polskiego Towarzystwa Kryminalistycznego otrzyma³a

Mariola Burstein, specjalista Wydzia³u Fizykochemii.