Porównanie enzymatycznych metod redukcji z metodami ... · Utleniania. 3. Hydrolizy estrów. 4....

Porównanie enzymatycznych metod redukcji z

metodami redukcji klasycznej chemii

organicznej

Instrukcja do zajęć laboratoryjnych z przedmiotu

Chemia Bioorganiczna i Bionieorganiczna

Dla studentów kierunku Chemia specjalność Chemia Bioorganiczna

Opracowanie: mgr inż. Roman Komor

Materiały zostały wykonane w ramach realizowanego na Politechnice Śląskiej projektu nr UDA-POKL.04.01.01-00-114/09-01 pt.: „Unowocześnienie i rozszerzenie oferty edukacyjnej na kierunku Chemia na Wydziale Chemicznym Politechniki Śląskiej – otwarcie specjalności Chemia Bioorganiczna” współfinansowanego ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego.

Porównanie enzymatycznych metod redukcji z metodami redukcji klasycznej chemii organicznej

1

CEL ĆWICZENIA

Wykonanie ćwiczenia będzie polegało na przeprowadzeniu redukcji grupy karbonylowej w 2-metyloacetylooctanie etylu, redukcji podwójnego wiązania węgiel-węgiel w α-metylo-β-(2-furylo)akroleinie oraz redukcji grupy nitrowej w 1,2-dinitrobenzenie z zastosowaniem drożdży piekarniczych oraz innych odpowiednich chemicznych metod redukcji. Po wydzieleniu i analizie otrzymanych produktów zostanie dokonane porównanie tych metod.

PODSTAWY TEORETYCZNE Drożdże piekarnicze to powszechna nazwa szczepów drożdży używanych jako

spulchniacze w przemyśle piekarniczym. Należą one do gatunku Saccharomyces cerevisiae, podobnie jak gatunki używane do przeprowadzania fermentacji alkoholowej w przemyśle browarniczym i gorzelnianym. Pierwsze transformacje z udziałem mikroorganizmów (w tym drożdży) były przeprowadzane już w starożytnym Egipcie przy wyrobie chleba, produktów mlecznych i alkoholu. Ich wykorzystanie w syntezie organicznej miało miejsce już ponad sto lat temu – w 1874 roku Dumas zaobserwował wydzielanie się siarkowodoru po dodaniu siarki do zawiesiny drożdży w roztworze cukru. Redukcja furfuralu do alkoholu furfurylowego była pierwszą opisaną reakcją cząsteczki organicznej.

Na przestrzeni kolejnych lat drożdże zyskały coraz większe znaczenie w syntezie głównie ze względu na ich powszechną dostępność, niską cenę i łatwość zastosowania. Reakcje z ich udziałem dają zwykle produkty enancjomerycznie czyste. Dużą ich zaletą jest również fakt, że do przeprowadzenia reakcji z ich użyciem nie jest wymagana znajomość mikrobiologii. Drożdży piekarniczych używa się przede wszystkim jako całych komórek. Niestety, nie do pominięcia są w takim przypadku efekty związane ze stopniem penetracji i dyfuzji substratów do wnętrza komórek oraz produktów z wnętrza komórek do otaczającego je środowiska. Również mnogość enzymów występujących w komórkach drożdży powoduje powstawanie ubocznych produktów, które jednak zwykle powstają w niewielkich ilościach jeśli zachowane są odpowiednie warunki fermentacji. Wpływ na aktywność poszczególnych enzymów, a co za tym idzie kierunek reakcji oraz jej chemo- i enancjoselektywność mają następujące czynniki:

− poziom pH,

− temperatura,

− skład i postać pożywki,

− czas reakcji,

− stężenie substratu,

− stosunek biomasa/substrat,

− immobilizacja enzymu (komórek),

− obecność inhibitorów i stymulatorów,

− warunki wzrostu,

− przygotowanie mieszaniny. Najlepszym rozwiązaniem byłoby zastosowanie oczyszczonych enzymów, jednak ze

względu na niekiedy bardzo wysoką cenę ich użycie ogranicza się jedynie do zastosowań laboratoryjnych. Najczęściej napotykane problemy podczas przeprowadzania biotransformacji z udziałem drożdży zostały przedstawione na Schemacie 1. Podane rozwiązania nie ograniczają się jedynie do reakcji prowadzonych w małej skali. Są stosowane z powodzeniem w skali przemysłowej.

Obecnie biotransformacje przy użyciu mikroorganizmów stosuje się (lub próbuje się zastosować) wszędzie tam, gdzie dany etap reakcji jest trudny do pokonania przy


2

zastosowaniu metod klasycznej chemii organicznej. Drożdże piekarnicze można zastosować m.in. w procesach rozdzielania racematów, selektywnego przekształcania jednej spośród wielu grup funkcyjnych cząsteczki związku chemicznego o podobnej reaktywności, wprowadzania centrum asymetrii i funkcjonalizacji łańcucha węglowego.

Schemat 1 W chemii organicznej drożdże piekarnicze stosuje się najczęściej w czterech typach reakcji:

1. Tworzenia wiązania węgiel-węgiel.

2. Utleniania.

3. Hydrolizy estrów.

4. Redukcji. W tej grupie możemy wyróżnić reakcje redukcji β-ketoestrów i innych pochodnych ketokwasów, β-diketonów, α-hydroksyaldehydów i α,β-hydroksyketonów do α,β-dioli, związków zawierających wiązanie C=C, aromatycznych i nienasyconych ketonów oraz związków nitrowych.


3

Reakcje redukcji z użyciem drożdży wymagają obecności węglowodanów (niekiedy dodaje się etanolu i przedmuchuje tlenem) oraz wydajnego mieszania. W takich warunkach mikroorganizmy zużywają cukier jako źródło energii potrzebne do regeneracji koenzymu. Redukcja przez reduktazy jest ściśle związana z systemami odnawiania NADPH z jego postaci utlenionej (NADP+) (Schemat 2). W związku z tym nie jest konieczne dodawanie kofaktora do środowiska reakcji, ponieważ znajduje się on we wnętrzu komórek drożdżowych.

Schemat 2

Gdy zamiast cukru użyje się alkoholu, regeneracja następuje przez utlenianie go do aldehydu i następnie kwasu. Otrzymuje się wtedy protonowaną postać koenzymu, która może być zawrócona do reakcji redukcji. Badania wykazały, że zmiana węglowodanu na alkohol etylowy nie ma znaczącego wpływu na wydajność i czystość optyczną produktów.

Redukcja związków karbonylowych

W klasycznej chemii organicznej, podobnie jak w chemii nieorganicznej, pojęcie redukcja oznacza proces, w którym substrat zostaje obdarzony elektronami. Reakcje redukcji ketonów do alkoholi można przeprowadzić na kilka sposobów, a najpopularniejsze odczynniki stosowane w tym procesie to:

• Wodorki metali. Najczęściej używanymi związkami są glinowodorek litu (LiAlH4) oraz borowodorek sodu (NaBH4). Reakcja z użyciem LiAlH4 jest mało selektywna - poza grupą karbonylową redukowane są także inne grupy obecne w substracie np. NO2, CN, COOR itd. Borowodorek sodu wykazuje większą selektywność i nie redukuje grup takich jak nitrowa czy halogenowa. Dodatkową jego zaletą jest możliwość stosowania w roztworach wodnych. Wodorki metali nie uwodorniają podwójnych ani potrójnych wiązań węgiel – węgiel (za wyjątkiem wiązań C=C sprzężonych z grupą COOR).


4

Reagent Preferowany

rozpuszczalnik Substrat → produkt

Przerób mieszaniny

reakcyjnej

NaBH4

Etanol i jego wodne roztwory, roztwory NaOH, należy unikać mocnych kwasów

Aldehyd→1o alkohol Keton → 2o alkohol Obojętny dla większości grup funkcyjnych

Łatwa neutralizacja Łatwa ekstrakcja produktu

LiAlH4

Eter dietylowy, THF, należy unikać mocnych kwasów, fluorowców, alkoholi i amin

Aldehyd → 1o alkohol Keton → 2o alkohol Kwas → 1o alkohol Ester → alkohol Epoksyd -> alkohol

Ostrożnie dodawać wodę Należy usunąć sole glinu

• Wodór gazowy i katalizator metaliczny (platyna, ruten, pallad, nikiel itp.). To rozwiązanie obciążone jest najmniejszą selektywnością – w tych warunkach zredukowane zostają także wiązania wielokrotne.

• Etanolan sodu w alkoholu etylowym. Stosowana zanim odkryto LiAlH4, częściej używana do redukcji estrów niż ketonów.

• Diborowodór (B2H6). Sam odczynnik jest bardzo reaktywny. Najczęściej syntezuje się go bezpośrednio przed dodaniem do środowiska reakcji. Redukuje również wiązania wielokrotne obecne w cząsteczce

Opisane układy przez lata zyskały wiele modyfikacji. Ich najczęstszym celem było uzyskanie chemoselektywności reakcji. Uzyskuje się ją dzięki stosowaniu różnych warunków: kombinacji metal - jon wodorkowy, różnym katalizatorom i rozpuszczalnikom. Jednakże stosowane wodorki metali, jak i katalizatory metaliczne są drogim i nierzadko niewygodnym w pracy surowcem. Także praca z wodorem niesie za sobą niebezpieczeństwo wybuchu.

Redukcja wiązania podwójnego węgiel-węgiel

Redukcję wiązania podwójnego węgiel-węgiel najczęściej i najłatwiej przeprowadza

się używając do tego celu gazowego wodoru i katalizatora heterogenicznego (Rh/C, Pd/C, nikiel Raney’a) lub tlenków metali (PtO2) w kombinacji z różnymi rozpuszczalnikami (acetonitryl ,woda, THF, metanol, octan etylu). Niestety, nie można ich stosować jeśli w cząsteczce obecne są grupy zabezpieczające (benzylowa, benzoilowa, alliloksykarbonylowa). Redukują one także grupę nitrową, ketony benzylowe i arylowe pochodne fluorowców.

Redukcja grupy nitrowej

W reakcjach redukcji grupy nitrowej najczęściej stosowane są:

• Katalizator metaliczny (Zn, Sn, Fe i inne) w obecności kwasu.

• Siarczki (NaHS, (NH4)2S).

• Hydrazyna w obecności katalizatora.

• Glinowodorek litu LiAlH4. Powstają zanieczyszczenia w postaci oksymów i hydroksyloamin.


5

W reakcjach redukcji grupy nitrowej w związkach aromatycznych oprócz wyżej wymienionych reagentów stosuje się również:

• Siarczek sodu Na2S. Selektywnie redukuje grupy nitrowe przy pierścieniu aromatycznym nie redukując przy tym grup nitrowych przyłączonych do łańcucha węglowego związku.

• Nikiel elektrochemiczny. Elektrochemicznie generowany nikiel selektywnie redukuje aromatyczne grupy nitrowe, nie redukując obecnych w związku ugrupowań alkenylowych, alkinylowych, cyjanowych, formylowych, halogenowych i benzoksylowych.

• Związki samaru. Selektywne w stosunku do grup nitrowych.

• Ditionian sodu Na2S2O4.

• Chlorek tytanu TiCl3


6

PRZEBIEG ĆWICZENIA

Redukcja grupy karbonylowej Część A: Redukcja 2-metyloacetylooctanu etylu przy użyciu drożdży piekarniczych

Ta część ćwiczenia obejmuje reakcję redukcji 2-metyloacetylooctanu etylu przy użyciu drożdży piekarniczych prowadzącą do mieszaniny (2R,3S) i (2S,3S)-3-hydroksy-2-metylomaślanu etylu w stosunku izomerów 3:1 (Schemat 3).

Schemat 3 Odczynniki:

• 2-metyloacetylooctan etylu (0,50 g; 3,85 mmol)

• drożdże piekarnicze Saccharomyces

cerevisiae (30 g*)

• sacharoza (7,5 g)

• woda destylowana (100 cm3)

• Celite®

• etanol (1 cm3)

• octan etylu

• 2 M wodny roztwór wodorotlenku sodu

• chlorek sodu

• bezwodny siarczan(VI) magnezu

• eter naftowy

• eter dietylowy * Jeżeli używane są drożdże z pożywką należy doliczyć 50% masy

Szkło i inne materiały oraz potrzebny sprzęt laboratoryjny:

• łaźnia wodna

• cieplarka

• wyparka rotacyjna

• kolba stożkowa 500 cm3

• zlewka 25 cm3

• kolba okrągłodenna 250 cm3

• lejek Büchnera

• kolba ssawkowa 250 cm3

• cylinder 100 cm3

• rozdzielacz 500 cm3

• lejek

• pipeta

• płytki TLC

• komora chromatograficzna

• łyżka

• bagietka

• bibuła filtracyjna

• wata

• papierek uniwersalny Wykonanie ćwiczenia:

1. Drożdże, sacharozę oraz wodę umieszcza się w kolbie stożkowej (500 ml) i zatyka wylot kolby watą, a następnie umieszcza w łaźni wodnej (30°C) na około 20 minut w celu zapoczątkowania fermentacji. Co jakiś czas energicznie miesza się zawartość kolby.


7

2. 2-Metyloacetylooctan etylu rozpuszcza się w 1 cm3 etanolu i dodaje jednorazowo do kolby z fermentującymi drożdżami. Mieszaninę reakcyjną pozostawia się w cieplarce na 48h w temperaturze 30°C.

3. Zakładając odpowiedni stopień przereagowania, reakcję przerywa się doprowadzając mieszaninę do temperatury pokojowej. Następnie dodaje się 2 łyżki celitu i dokładnie miesza. Tak przygotowaną mieszaninę pozostawia się na ok. 30 minut od czasu do czasu mieszając.

4. Zawiesinę drożdży odsącza się na lejku Büchnera przez 3 mm złoże celitu. Operację powtarza się, jeśli w przesączu stwierdzi się obecność drożdży. Przesącz zobojętnia się przy użyciu 2 M wodnego roztworu NaOH. Tak powstały żółty filtrat poddaje się ekstrakcji octanem etylu (4x60 ml). W przypadku trudności z rozdzielaniem warstw, mieszaninę wysala się lub/oraz odwirowuje w wirówce laboratoryjnej.

5. Zlane ekstrakty organiczne suszy się nad bezwodnym siarczanem(VI) magnezu, który odsącza się na lejku z sączkiem karbowanym, a przesącz odparowuje w wytarowanej kolbie okrągłodennej na wyparce rotacyjnej do uzyskania żółtej pozostałości.

6. Przebieg reakcji sprawdza się metodą TLC. W tym celu pobiera się próbkę mieszaniny reakcyjnej i rozcieńcza ją w octanie etylu (ok. 25 mg/ml). Jako układ rozwijający stosuje się mieszaninę eter naftowy - eter dietylowy 3:1 (v/v). Jako wzorzec stosuje się roztwór substratu. Płytki obserwuje się pod lampą UV.

7. Surowy produkt można oczyścić metodą chromatografii kolumnowej. Jako wypełnienie kolumny stosuje się żel krzemionkowy, a jako eluent układ eter naftowy - eter dietylowy 3:1 (v/v).

Część B: Redukcja 2-metyloacetyooctanu etylu przy użyciu borowodorku sodu w metanolu

Ta część ćwiczenia obejmuje redukcję 2-metyloacetylooctanu etylu przy użyciu borowodorku sodu w metanolu prowadzącą do mieszaniny 2-metylobutano-1,3-diolu oraz 3-hydroksy-2-metylomaślanu etylu (Schemat 4).

Schemat 4

Odczynniki:

• 2-metyloacetylooctan etylu (0,50 g; 3,85 mmol)

• metanol (20 cm3)

• borowodorek sodu (0,43 g; 11,5 mmol)

• 5 M wodny roztwór kwasu solnego

• żel krzemionkowy

• metanol

• chloroform

• solanka


• mieszadło magnetyczne



• cylinder 50 cm3

• rozdzielacz

• pipeta

• płytki TLC


• łyżka

• papierek uniwersalny


8

Wykonanie ćwiczenia: 1. W kolbie okrągłodennej umieszcza się metanol oraz 2-metyloacetylooctan etylu

i miesza na mieszadle magnetycznym. Do kolby dodaje się borowodorku sodu w trzech równych porcjach co 1 minutę.

2. Po 5, 10, 20 i 30 minutach reakcji pobiera się próbkę mieszaniny reakcyjnej, rozcieńcza w niewielkiej ilości octanu etylu i nakłada na płytkę TLC wraz z wzorcem substratu. Jako układ rozwijający stosuje się mieszaninę eter naftowy - eter dietylowy 3:1 (v/v).

3. Po stwierdzeniu całkowitego przereagowania substratu, mieszaninę doprowadza się do pH 6 przy użyciu 5 M kwasu solnego.

4. Rozpuszczalnik odparowuje się na wyparce rotacyjnej do uzyskania jasnobrązowej pozostałości, którą rozpuszcza się w niewielkiej ilości metanolu i przepuszcza przez 3 cm warstwę żelu krzemionkowego. Produkt wymywa się układem metanol - chloroform 1:4 (v/v).

5. Surowy produkt można oczyścić metodą chromatografii kolumnowej. Jako wypełnienie kolumny stosuje się żel krzemionkowy, a jako eluent układ heksan -octan etylu.

Redukcja podwójnego wiązania węgiel-węgiel Część A: Redukcja α-metylo-β-(2-furylo)akroleiny przy użyciu drożdży piekarniczych

Ta część ćwiczenia obejmuje reakcję redukcji α-metylo-β-(2-furylo)akroleiny przy użyciu drożdży piekarniczych prowadzącą do nasyconego alkoholu (Schemat 5).

Schemat 5

Mechanizm tej reakcji jest trójetapowy: redukcja – utlenianie – redukcja. Wyjściowy aldehyd pozostaje w równowadze z pochodną alkoholu allilowego, przy czym równowaga jest przesunięta w stronę alkoholu. Jednakże już małe (równowagowe) ilości α-metylo-β-(2-furylo)akroleiny ulegają powolnej trans-addycji wodoru w poprzek wiązania podwójnego, do nasyconego aldehydu. Nasycony aldehyd jest wówczas szybko redukowany do nasyconego alkoholu.


9

Odczynniki:

• α-metylo-β-(2-furylo)akroleina (0,45 g; 3,30 mmol)


cerevisiae (12 g*)

• glukoza (4 g)


• Celite®

• etanol (2 cm3)

• octan etylu

• nasycony roztwór węglanu sodu

• chlorek sodu


• 2 M wodny roztwór kwasu solnego

• chlorek metylenu * Jeżeli używane są drożdże z pożywką należy doliczyć 50% masy


• łaźnia wodna

• cieplarka



• zlewka 25 cm3


• lejek Büchnera




• lejek

• pipeta

• płytki TLC


• łyżka

• bagietka


• wata

• papierek uniwersalny Wykonanie ćwiczenia:

1. Drożdże, glukozę oraz wodę umieszcza się w kolbie stożkowej (500 ml) i zatyka wylot kolby watą, a następnie umieszcza w łaźni wodnej (30°C) na około 45 minut w celu zapoczątkowania fermentacji. Co jakiś czas energicznie miesza się zawartość kolby.

2. pH fermentującej mieszaniny podnosi się następnie do wartości ok. 5,5 przez dodanie nasyconego roztworu węglanu sodu.

3. α-Metylo-β-(2-furylo)akroleinę rozpuszcza się w 2 cm3 etanolu i dodaje jednorazowo do kolby z fermentującymi drożdżami delikatnie mieszając zawartość kolby. Mieszaninę reakcyjną pozostawia się w cieplarce na 48h w temperaturze 30°C. Co 12 – 15 godzin sprawdza się pH mieszaniny i utrzymuje je na poziomie ok. 5 przez dodatek 5 M roztworu kwasu solnego.


5. Zawiesinę drożdży odsącza się na lejku Büchnera przez 3 mm złoże celitu. Operację powtarza się, jeśli w przesączu stwierdzi się obecność drożdży. Klarowny, jasnobrązowy filtrat poddaje się ekstrakcji octanem etylu (4x60 ml). W przypadku trudności z rozdzielaniem warstw, mieszaninę wysala się lub/oraz odwirowuje w wirówce laboratoryjnej.

6. Zlane ekstrakty organiczne suszy się nad bezwodnym siarczanem magnezu, który odsącza się na lejku z sączkiem karbowanym, a przesącz odparowuje w wytarowanej kolbie okrągłodennej na wyparce rotacyjnej do uzyskania żółtej, oleistej pozostałości.


10

7. Przebieg reakcji sprawdza się metodą TLC. W tym celu pobiera się próbkę mieszaniny reakcyjnej i rozcieńcza ją w octanie etylu (ok. 25 mg/ml). Jako układ rozwijający stosuje się chlorek metylenu. Jako wzorzec stosuje się roztwór substratu. Płytki obserwuje się pod lampą UV. Ponieważ aldehyd szybko przechodzi w nienasycony alkohol, na płytce przy Rf=0,38 mogą być widoczne 2 plamy w kształcie ósemki (nasycony i nienasycony alkohol). Świadczy to o niecałkowitym przereagowaniu substratu. Jeżeli obecna jest tylko 1 plamka przy Rf=0.34 pochodząca od produktu, można uznać całkowite przereagowanie substratu.

8. Surowy produkt można oczyścić metodą chromatografii kolumnowej. Jako wypełnienie kolumny stosuje się żel krzemionkowy, a jako eluent układ eter naftowy - eter dietylowy 3:1 (v/v).

Część B: Redukcja α-metylo-β-(2-furylo)akroleiny przy użyciu katalizatora metalicznego

Ta część ćwiczenia obejmuje redukcję α-metylo-β-(2-furylo)akroleiny przy użyciu katalizatora platynowego na węglu aktywnym (Schemat 6).

Schemat 6

Odczynniki:

• α-metylo-β-(2-furylo)akroleina (0,90 g; 6,60 mmol)

• metanol (5 cm3)

• katalizator platynowy na węglu aktywnym

• wodór gazowy






• cylinder 25 cm3



• balon z wężem gumowym i zaworem

• korek gumowy

• igła

• lejek

• pipeta

• płytki TLC


• łyżka

• bagietka

• bibuła filtracyjna Wykonanie ćwiczenia:

1. W kolbie okrągłodennej umieszcza się metanol oraz 2 α-metylo-β-(2-furylo)akroleinę i miesza na mieszadle magnetycznym. Do kolby dodaje się niewielką ilość katalizatora platynowego i zaopatruje kolbę w gumowy korek z igłą.


11

2. Kolbę zaopatruje się następnie w balon z wężem gumowym i zaworem wypełniony wodorem. Przepływ wodoru powinien powodować pojawianie się niewielkiej ilości pęcherzyków na powierzchni roztworu.

3. Po 1, 2 i 3 godzinach reakcji pobiera się próbkę mieszaniny reakcyjnej, rozcieńcza w niewielkiej ilości octanu etylu i nakłada na płytkę TLC wraz z wzorcem substratu. Jako układ rozwijający stosuje się chlorek metylenu.

4. Po stwierdzeniu całkowitego przereagowania substratu katalizator odsącza się, a przesącz zatęża na wyparce rotacyjnej. Pozostałość rozpuszcza się w niewielkiej ilości eteru dietylowego i oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej. Jako wypełnienie kolumny stosuje się żel krzemionkowy, a jako eluent eter dietylowy.

Redukcja grupy nitrowej Część A: Redukcja 1,2-dinitrobenzenu przy użyciu drożdży piekarniczych

Ta część ćwiczenia obejmuje redukcję grupy nitrowej 1,2-dinitrobenzenu przy użyciu drożdży piekarniczych prowadzącą do 2-nitroaniliny (Schemat 7).

Schemat 7

Badania wykazały, że przebieg redukcji monopodstawionych nitrobenzenów silnie zależy od charakteru podstawnika. Jeśli związek zawiera grupę elektronodonorową (np.: NH2, OH, SH, OCH3, CH3, Br) to wydajność reakcji redukcji jest niska lub reakcja nie zachodzi wogóle. Jeżeli podstawnik ma charakter elektronoakceptorowy (np.: NO2, CN, CF3, COOEt) redukcja nitrobenzenów zachodzi łatwo z dobrymi wydajnościami. Przykładem tego jest katalizowana drożdżami redukcja 1,2-dinitrobenzenu, w rezultacie której powstaje 2-nitoranilina z wysoką wydajnością, porównywalną z otrzymywanymi w redukcji metodami chemicznymi

Odczynniki:

• 1,2-dinitrobenzen (0,25 g; 1,49 mmol)


cerevisiae (25 g*)

• sacharoza (7,5 g)


• Celite®

• etanol (2,5 - 3 cm3)

• octan etylu

• 2 M wodny roztwór wodorotlenku sodu

• chlorek sodu



• łaźnia wodna

• cieplarka



• zlewka 25 cm3


• lejek Büchnera





12

• eter naftowy * Jeżeli używane są drożdże z pożywką należy doliczyć 50% masy

• lejek

• pipeta

• probówka

• płytki TLC


• łyżka

• bagietka


• wata


Wykonanie ćwiczenia:

1. Drożdże, sacharozę i wodę umieszcza się w kolbie stożkowej (500ml) i zatyka wylot kolby watą, a następnie umieszcza w łaźni wodnej (30°C) na około 1 godzinę w celu zapoczątkowania fermentacji. Co jakiś czas energicznie miesza się zawartość kolby.

2. 1,2-Dinitrobenzen rozpuszcza się w jak najmniejszej objętości etanolu (ok. 2,5 – 3 cm3) i dodaje jednorazowo do kolby z fermentującymi drożdżami. Mieszaninę reakcyjną pozostawia się w cieplarce na 24h w temperaturze 30°C.


4. Zawiesinę drożdży odsącza się na lejku Büchnera przez 3 mm złoże celitu. Operację powtarza się, jeśli w przesączu stwierdzi się obecność drożdży. Przesącz zobojętnia się przy użyciu 2 M wodnego roztworu NaOH. Tak powstały żółty filtrat poddaje się ekstrakcji octanem etylu (4x60 ml). W przypadku trudności z rozdzielaniem warstw, mieszaninę wysala się lub/oraz odwirowuje w wirówce laboratoryjnej.

5. Zlane ekstrakty organiczne suszy się nad bezwodnym siarczanem(VI) magnezu, który odsącza się na lejku z sączkiem karbowanym, a przesącz odparowuje w wytarowanej kolbie okrągłodennej na wyparce rotacyjnej do uzyskania bladożółtej pozostałości.

6. Przebieg reakcji sprawdza się metodą TLC. W tym celu pobiera się próbkę mieszaniny reakcyjnej i rozcieńcza ją w octanie etylu (ok. 25 mg/ml). Jako układ rozwijający stosuje się mieszaninę eter naftowy – octan etylu 1:1 (v/v). Jako wzorzec stosuje się roztwór substratu (Rf 1,2-dinitrobenzenu wynosi 0,4, a Rf 2-nitroaniliny 0,55). Płytki obserwuje się pod lampą UV.

7. Surowy produkt można oczyścić metodą chromatografii kolumnowej. Jako wypełnienie kolumny stosuje się żel krzemionkowy, a jako eluent układ eter naftowy – octan etylu 10:1 → 4:1 (v/v).


13

Część B: Redukcja 1,2-dinitrobenzenu przy użyciu chlorku amonu i glinu

Ta część ćwiczenia obejmuje redukcję grupy nitrowej 1,2-dinitrobenzenu przy użyciu chlorku amonu w obecności glinu prowadzącą do mieszaniny 2-nitroaniliny i 1,2-diaminobenzenu (Schemat 8).

Schemat 8

Odczynniki:

• 1,2-dinitrobenzen (0,25 g; 1,49 mmol)

• chlorek amonu (0,40 g; 7,5 mmol)

• glin (0,25 g)

• metanol (30 cm3)

• eter dietylowy

• woda destylowana

• aceton

• heksan

• bezwodny siarczan(VI) magnezu * Jeżeli używane są drożdże z pożywką

należy doliczyć 50% masy

Szkło i inne materiały oraz potrzebny sprzęt

laboratoryjny:


• łaźnia ultradźwiękowa


• lejek

• cylinder 50 cm3


• pipeta

• probówka

• płytki TLC


• łyżka

• bagietka


• wata


Wykonanie ćwiczenia: 1. W kolbie okrągłodennej umieszcza się metanol oraz 1,2-dinitrobenzen i miesza na

mieszadle magnetycznym. Do kolby dodaje się chlorku amonu oraz drobno pociętej folii aluminiowej. Następnie kolbę umieszcza w łaźni ultradźwiękowej w temperaturze pokojowej.

2. Po 15, 30 i 60 minutach reakcji pobiera się próbkę mieszaniny reakcyjnej, rozcieńcza w niewielkiej ilości octanu etylu i nakłada na płytkę TLC wraz z wzorcem substratu. Jako układ rozwijający stosuje się mieszaninę aceton – heksan 1:20 (v/v).

3. Po stwierdzeniu całkowitego przereagowania substratu, mieszaninę sączy się na sączku karbowanym wprost do kolby okrągłodennej.

4. Rozpuszczalnik odparowuje się na wyparce rotacyjnej do uzyskania jasnobrązowej pozostałości, którą rozpuszcza się w eterze dietylowym i przemywa wodą destylowaną.


14

5. Zlane ekstrakty organiczne suszy się nad bezwodnym siarczanem(VI) magnezu, który odsącza się na lejku z sączkiem karbowanym, a przesącz odparowuje w wytarowanej kolbie okrągłodennej na wyparce rotacyjnej do uzyskania żółtej pozostałości.

6. Surowy produkt można oczyścić metodą chromatografii kolumnowej. Jako wypełnienie kolumny stosuje się żel krzemionkowy, a jako eluent układ heksan -aceton.

PRZYGOTOWANIE DO ZAJĘĆ

Przed przystąpieniem do ćwiczenia student powinien zapoznać się z niniejszą instrukcją

oraz sposobem wykonania ćwiczenia. Powinien również zapoznać się z podstawami teoretycznymi technik laboratoryjnych wykorzystywanych ćwiczeniu oraz z zagrożeniami mogącymi wystąpić podczas ich wykonywania. Student powinien zaznajomić się również następującymi zagadnieniami i pojęciami:

• współczynnik retencji Rf, stereoselektywność, stereospecyficzność, regioselektywność, regiospecyficzność, nadmiar enancjomeryczny (wraz ze sposobem jego obliczania), enancjomer, diastereoizomer, katalizator, enzym, koenzym, kataliza enzymatyczna, utlenienie, redukcja, wady i zalety katalizy enzymatycznej.

Ponadto powinien znać i przestrzegać ogólne zasady BHP. Powinien znać i wiedzieć jak zapobiegać zagrożeniom wynikającym z pracy z odczynnikami chemicznymi oraz aparaturą wykorzystywaną w ćwiczeniu.

OPRACOWANIE WYNIKÓW

Po zakończeniu ćwiczenia każda grupa laboratoryjna sporządza sprawozdanie, które

oddaje prowadzącemu do dwóch tygodni od daty zajęć. W sprawozdaniu powinny znaleźć się:

• opis wykonywanych czynności,

• obliczenia (ilości, masy, objętości odczynników, wydajności otrzymanych produktów),

• obserwacje,

• wnioski. Warunkiem zaliczenia ćwiczenia jest obecność na zajęciach, zaliczenie kartkówki (tzw.

wejściówki), czynny udział w ćwiczeniu (aktywność będzie oceniana przez prowadzącego) oraz poprawne sporządzenie sprawozdania i oddanie go w terminie.


15

LITERATURA R. Csuk; Chem. Rev., 91 (1991) 49-97

S. Servi; Synthesis, (1990) 1-25

S. D. Burke, R. L. Danheiser Handbook of Reagents for Organic Synthesis, Oxidizing and

Reducing Agents, John Wiley and Sons Ltd., (1999)

C. Smit, M. W. Fraaije, A. J. Minnaard; J. Org. Chem., 73 (2008) 9482–9485

C. F. Lane; Chemical Reviews, 76 (1976) 6

R. Bruckner, M. Harmata; Organic Mechanisms – Reactions, Stereochemistry and Synthesis, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, (2010)

C. Fuganti; Pure & Appl. Chern., 62 7 (1990) 1449-1452

S. M. Roberts, G. Poignant; Catalysts for Fine Chemical Synthesis: Hydrolysis, Oxidation and

Reduction. Volume 1, John Wiley & Sons, Ltd, (2002)

M. C. Flickinger, S. W. Drew; Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation,

Biocatalysis, and Bioseparation, John Wiley & Sons, Inc., (1999)

N. Ono; The Nitro Group in Organic Synthesis, John Wiley-VCH, (2001)

G. Fràter, U. Müller, W. Günter, S.M. Roberts; Preparative Biotransformations. Whole Cells

and Isolated enzymes in Organic Synthesis, Wiley, London, (1992)

J. Kim et al.; Tetrahedron, 66 (2010) 3995-4001

C. Ravia; Tetrahedron: Asymmetry, 20 (2009) 1393–1397

G. D. Gamalevich, A. V. Ignatenko, E. P. Serebryakov, N. E. Voishvillo; Russian Chemical

Bulletin, 44 4 (1995) 743 D. Nagaraja, M. A. Pasha; Tetrahedron letters, 40 (1999) 7855-7856

Porównanie enzymatycznych metod redukcji z metodami ... · Utleniania. 3. Hydrolizy estrów. 4....

Documents

Transcript of Porównanie enzymatycznych metod redukcji z metodami ... · Utleniania. 3. Hydrolizy estrów. 4....